CN114858777A - 一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法及其应用 - Google Patents

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CN114858777A CN202210439874.1A CN202210439874A CN114858777A CN 114858777 A CN114858777 A CN 114858777A CN 202210439874 A CN202210439874 A CN 202210439874A CN 114858777 A CN114858777 A CN 114858777A
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Abstract

一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法及其应用，本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法及其应用。本发明的目的是为了解决现有表面增强拉曼光谱技术检测细菌的方法不具有通用性的问题，本发明用硼氢化钠还原硝酸银生成银溶胶，加入卤化物孵育制备增强基底，将增强基底与细菌样品混合，然后加入硼氢化钠溶液充分混合，再进行SERS检测。本发明的方法通过特征峰不但能区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，还能区分同种类型细菌分子的敏感株和耐药株。并首次利用其拉曼峰值比例，得到了抗生素作用后细菌死亡速度加快的拐点。本发明应用于细菌检测领域。

Description

一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法及其应用。
背景技术
近年来随着抗生素的滥用，出现了大量的超级细菌和多重耐药菌对人类健康已造成极大的危害。所以细菌的快速检测尤为重要，目前传统的细菌检测流程，首先细菌进行分离、富集和扩增。然后在细菌培养后通过形态学特征、显微镜和简单试剂的快速生化测试来确定属。其次通过有针对性的生化或血清学试验对物种水平进行鉴定。耐药性细菌可能携带不同的耐药性基因，检测方法需要高度的特异性，尽可能准确地识别细菌属和种类，以及敏感性特征。
利用表面增强拉曼光谱很难直接获得生物分子本身的SERS信号。在微生物领域SERS的应用还停留在利用探针分子定性识别某种生物分子(细菌或者真菌)，这种带标签的检测技术设计复杂、通用性差，很难推广。目前无标签SERS检测技术针对某种特征的生物分子设计了不同类型的增强基底，虽然这些方法兼具灵敏性和信号稳定性，但却只能针对单一的生物分子，例如，钙离子引导的银纳米颗粒和盐酸羟胺包裹的正电荷银溶胶颗粒增强基非常适合检测DNA单链和双链结构，但很难应用于检测DNA四链结构如(i-motif和G-quadruplex结构)；而传统的DNA检测方法，又很难获得RNA结构的特征指纹图谱(由于RNA极易水解，需要保证其特征结构的条件下检测)；在蛋白质分子检测领域，由于不同的蛋白质表面所携带的电荷水平不同，即使同一种方法也需要针对不同的蛋白质改变检测条件，才能获得良好的增强信号，并且传统的纳米颗粒引导的聚集方法获得的蛋白质特征SERS信号很容易被含有苯环的特征氨基酸信号主导，这也造成了很多蛋白质分子的特征谱图信号相似难以区分。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有表面增强拉曼光谱技术检测细菌的方法不具有通用性的问题，提供了一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法及其应用。
本发明一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、制备浓度为0.05-0.25g/L的硼氢化钠溶液，然后制备浓度为1-15g/L的硝酸银溶液，再在搅拌条件下，将硝酸银溶液加入到硼氢化钠溶液中，得到银溶胶，其中硝酸银溶液与硼氢化钠溶液的体积比为1：(50-150)；b、将银溶胶离心，去上清，离心产物与卤化物溶液在室温下孵育30-180min，得到增强基底；离心产物与卤化物溶液的体积比为10：(0.5-5)；
二、将增强基底与细菌样品混合，然后加入1.4-2.4g/L的硼氢化钠溶液充分混合，再进行SERS检测，检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为10-60s，激光能量20mW；其中增强基底、细菌样品与硼氢化钠溶液的体积比为10：(0.5-5)：(0.5-5)。
本发明一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
本发明一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于区分同种类型细菌的敏感株和耐药株。
本发明一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于确定抗生素作用后细菌死亡速度加快的拐点。
本发明采用“两步清洗法”制备增强基底检测细菌。首先利用不具有拉曼活性的硼氢化钠代替柠檬酸根还原生成银纳米颗粒(Ag@BO)。然后第一步“清洗”，加入卤化物可以完全取代银溶胶表面的硼酸根，可以观察到细菌清晰的SERS信号。说明孵育后的银纳米颗粒，可以消除硼酸根干扰信号的影响，产生的SERS信号全部来源于细菌本身。同时说明Ag@C易吸附在细菌表面，不但得到细菌本身的SERS信号，还可以无差别的增强细菌组分的SERS信号，该方法可以清晰的观察到属于细菌组分肽聚糖、DNA信号和蛋白质分子的SERS信号。第二步“清洗”，引入过量的硼氢化钠，可以防止银纳米颗粒表面继续氧化，使待测细菌分子获得更好的增强拉曼信号，同时在引入的钠离子的作用下，银纳米颗粒可以吸附到细菌表面，从而进一步增强细菌的拉曼信号。该发明制备的增强基底可以无标签快速识别不同的细菌，具有较好的通用性。
本发明在消除了传统细菌检测时间长，操作复杂、易受其他因素干扰等不利条件。本发明能快速的检测细菌(<5min)，有较好的稳定性和特异性，成功获得了细菌DNA的碱基、氨基酸和表面肽聚糖得到SERS信号。本发明的方法通过特征峰不但能区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，还能区分同种类型细菌分子的敏感株和耐药株。并首次利用其拉曼峰值比例，得到了抗生素作用后细菌死亡速度加快的拐点，可以快速判断抗菌药物的效果。这种方法极大提升了SERS在生命科学领域的应用范围，简化了传统耐药细菌检测流程，为快速检测提供了一种强有力的新工具。
附图说明
图1为实例1中大肠埃希菌ATCC 25922、大肠埃希菌HM 1019和肺炎克雷伯菌HM5015的SERS谱；其中a为肺炎克雷伯菌HM 5015，b为大肠埃希菌HM 1019，c为大肠埃希菌ATCC 25922；
图2为实例1中金黄色葡萄球菌ATCC 25923、金黄色葡萄球菌HM 4004和白葡萄球菌HM 1001的SERS谱；d为白葡萄球菌HM 1001，e为金黄色葡萄球菌HM 4004，f为金黄色葡萄球菌ATCC 25923；
图3为实施例1中层次聚类分析所有组分聚类结果；
图4为实施例3中大肠埃希菌ATCC 25922供试样品与不同浓度左氧氟沙星混合后的SERS谱；其中1为4.88μg/L、2为2.44μg/L、3为1.22μg/L、4为0.61μg/L、5为0.31μg/L、6为0.18μg/L、7为0.08μg/L；
图5为实施例3中大肠埃希菌HM 1019供试样品与不同浓度左氧氟沙星混合后的SERS谱；1为4.88μg/L、2为2.44μg/L、3为1.22μg/L、4为0.61μg/L、5为0.31μg/L、6为0.18μg/L、7为0.08μg/L；
图6为实施例3的I718/I757比值随左氧氟沙星浓度变化的折线图；其中x为大肠埃希菌ATCC 25922，y为大肠埃希菌HM 1019；
图7为实施例3大肠埃希菌ATCC 25922不同体系的SERS谱图；其中8是细菌样品；9是细菌样品与柠檬酸钠还原的银溶胶；10是硼氢化钠还原的银溶胶；11是氯离子孵育硼氢化钠还原的银溶胶；12是细菌样品和氯离子孵育硼氢化钠还原的银溶胶；13是细菌样品、氯离子孵育硼氢化钠还原的银溶胶和硼氢化钠；
图8为实施例4大肠埃希菌HM 1019的SERS谱；
图9为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、制备浓度为0.05-0.25g/L的硼氢化钠溶液，然后制备浓度为1-15g/L的硝酸银溶液，再在搅拌条件下，将硝酸银溶液加入到硼氢化钠溶液中，得到银溶胶，其中硝酸银溶液与硼氢化钠溶液的体积比为1：(50-150)；b、将银溶胶离心，去上清，离心产物与卤化物溶液在室温下孵育30-180min，得到增强基底；离心产物与卤化物溶液的体积比为10：(0.5-5)；
二、将增强基底与细菌样品混合，然后加入1.4-2.4g/L的硼氢化钠溶液充分混合，再进行SERS检测，检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为10-60s，激光能量20mW；其中增强基底、细菌样品与硼氢化钠溶液的体积比为10：(0.5-5)：(0.5-5)。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中0.05-0.25g/L的硼氢化钠溶液的制备方法为：称取硼氢化钠溶于去离子水中，在1500-2000转/分钟条件下搅拌8分钟。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中硝酸银溶液直接倒入或滴加到硼氢化钠溶液中，若是滴加到硼氢化钠溶液中，则滴加速度为8-12滴/秒。其它与具体实施方式一或二相同。
本实施方式的滴加是在搅拌速度为1800-2200转/分钟的条件下滴加的。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中银溶胶的离心是在20℃、6500转/分钟的条件下离心20min。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中卤化物溶液的浓度为1mM，卤化物为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠或碘化钾。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的方法为观察革兰氏阳性菌SERS特征峰：G+：718cm-1、998cm-1、1023cm-1、1202cm-1和1427cm-1，革兰氏阴性菌SERS特征峰：G-：718cm-1、756cm-1、1021cm-1、1201cm-1和1438cm-1；若756cm-1和845cm-1的峰强于718cm-1，则为革兰氏阳性菌；若718cm-1的峰强于756cm-1和845cm-1，则为革兰氏阴性菌。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于区分同种类型细菌的敏感株和耐药株。
具体实施方式九：本实施方式一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于确定抗生素作用后细菌死亡速度加快的拐点。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是：确定抗生素作用后细菌死亡速度加快的拐点的方法为：利用拉曼峰值比例，若I718/I756的比值最小，则细菌死亡速度出现拐点。其它与具体实施方式九相同。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
实施例1、
一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、称取0.0660g硼氢化钠溶于495mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的转速搅拌8分钟，得到硼氢化钠溶液；称取0.0330g硝酸银溶于5mL去离子水，然后在转速2050转/分钟的条件下，倒入到硼氢化钠溶液中，反应过程中溶液颜色从黑色、黄色、蓝色、最后变为黑色，得到银溶胶，避光保存；b、将银溶胶离心，6500转/分钟，20min，20℃去上清，然后取10μL离心产物与1μL浓度为1mM的氯化钠溶液在室温下孵育60min，得到增强基底；
二、将10μL增强基底分别与六种1μL供试菌细菌样品混合，然后加入2μL 1.89g/L的硼氢化钠溶液充分混合，再进行SERS检测，激光波长为633nm，扫描时间为35s，激光能量20mW。
供试菌为大肠埃希菌ATCC 25922、大肠埃希菌HM 1019、肺炎克雷伯菌HM 5015、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、金黄色葡萄球菌HM 4004和白葡萄球菌HM 1001。
图1和2中可以清楚地观察到阳性菌和阴性菌SERS特征峰(G+：718，998，1023，1202和1427cm-1；G-：718，756，1021，1201和1438cm-1)，且其特征峰位置和强度存在显著差异。革兰氏阳性菌中756和845cm-1的峰明显强于718cm-1，而革兰氏阴性菌相反。通过特征可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
利用层次聚类(HCA)分析技术，将6种细菌在400-1800cm-1全波数范围内进行一致性聚类，如图3所示。聚类结果表明，样本可以分为六组。聚类得到的六组样本的样本分类与原始的六组样本的样本分类完全一致，因此六组样本的准确性均为100％。图3展示了所有组分聚类结果，通过两大组可以区分革兰氏阴性菌(左侧方框)和革兰氏阳性菌(右侧方框)，图中可以清晰的观察到六种(每种10组)细菌样本归类在不同的小组内，可以对同一类细菌分子的标准株与耐药株得到了灵敏度100％和特异性100％的识别。(EH：为大肠埃希菌的耐药菌株；E：为大肠埃希菌敏感菌；KH：为肺炎克雷伯菌耐药菌株；SH：为金黄色葡萄球菌耐药菌；S：金黄色葡萄球菌敏感菌；SAH：为白色葡萄球菌耐药菌)。实验结果表明，利用目前方法，对细菌具有较高的辨识度和重现性，通过特征峰的峰位和峰强能区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌并精准鉴定普通菌株和耐药菌。
实施例2
一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、称取0.0660g硼氢化钠溶于495mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的转速搅拌8分钟，得到硼氢化钠溶液；称取0.0330g硝酸银溶于5mL去离子水，然后倒入到硼氢化钠溶液中(转速提高至2050转/分钟)，反应过程中溶液颜色从黑色、黄色、蓝色、最后变为黑色，得到银溶胶，避光保存；b、将银溶胶离心，6500转/分钟，20min，20℃去上清，然后取10μL离心产物与1μL浓度为1mM的碘化钠溶液在室温下孵育60min，得到增强基底；
二、将10μL增强基底分别与不同浓度左氧氟沙星处理后的供试菌细菌样品(1μL)混合，然后加入2μL 1.89g/L的硼氢化钠溶液充分混合，再进行SERS检测，激光波长为633nm，扫描时间为35s，激光能量20mW。
供试菌为大肠埃希菌ATCC 25922和大肠埃希菌HM 1019，根据美国CLSI M1002018标准测定大肠埃希菌ATCC 25922和大肠埃希菌HM 1019的MIC(最小抑制浓度)值为4.88μg/L和20mg/mL。设置了从4.88到0.08μg/L 7个浓度梯度的左氧氟沙星处理细菌分子。图4和5展示了两种细菌(大肠埃希菌ATCC 25922和大肠埃希菌HM 1019)的供试菌样品与不同浓度的左氧氟沙星混合后的SERS谱。大肠埃希菌ATCC 25922在亚抑制浓度时，特征峰上I843/I998信号比值几乎没有变化。而在大肠埃希菌HM 1019中亚抑菌浓度和接近MIC值时，I843/I 998的比值都几乎不变(图6)。而当大肠埃希菌ATCC 25922中接近MIC值时(左氧氟沙星的浓度0.31μg/L时)I718/I756的比值出现最小值(图6)，说明在该浓度下细菌死亡速度开始明显加快。
实施例3、
利用不同银溶胶对大肠埃希菌(108CFU/ml)进行SERS检测
柠檬酸钠还原制备的银溶胶：0.036g硝酸银放入装有200mL超纯水的三颈烧瓶中，加热至微沸。然后加入6ml 1％柠檬酸钠溶液，停止加热。溶液从无色变成暗黄色，最后变成绿色。
硼氢化钠还原制备的的银溶胶：称取66mg硼氢化钠溶于495mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的搅拌速度搅拌8分钟。称取33mg硝酸银，溶于5mL水中。然后倒入到硼氢化钠溶液中(转速提高至2050转/分钟)，反应过程中溶液颜色从黑色、黄色、蓝色、最后变为黑色，得到银溶胶，避光保存。
5mL上述银溶胶离心(6500转/分钟，20min，20℃)，除去上清液后，离心产物备用。取10μL上述离心产物与1μL氯化钠溶液(1mM)在室温下孵育60min，得到增强基底(氯离子孵育硼氢化钠还原的银溶胶)备用。
检测条件：
取上述三种银溶胶10μL，分别加入1μL的细菌样品充分混合，然后再分别加入2μL1.89g/L的硼氢化钠溶液充分混合，进行SERS检测。
结果如图7所示，由于生物分子的弱拉曼活性，大肠埃希菌(108CFU/ml)本身几乎没有任何信号(图中线条13)。细菌中加入传统的柠檬酸钠还原制备的银纳米颗粒后，仍然观察不到细菌分子的特征拉曼信号，相反可以观察到较强的柠檬酸根基团的SERS信号(图中线条12，906cm-1；923cm-1；951cm-1)。由于柠檬酸钠本身有拉曼信号，因此无法区分获得的信号来自样品还是杂质，这意味着Ag@cit增强基底下无法用来增强细菌分子的拉曼信号。传统硼氢化钠还原制备银纳米颗粒(Ag@BO)有拉曼信号(图中线条11)，且反应较剧烈需要添加保护剂。本发明中引入氯离子修饰Ag@BO，得到的溶胶体系(Ag@C)几乎没有任何的杂质拉曼信号(图中线条10)，添加到体系中能观察到细菌微弱但清晰的的SERS信号(图中线条9)。加入少量硼氢化钠后，可以清晰的观察到属于DNA信号和蛋白质分子的SERS信号，所产生的信号全部来源于细菌本身(图中线条8).
利用不具有拉曼活性的硼氢化钠代替柠檬酸根还原生成银纳米颗粒Ag@BO，加入氯离子可以完全取代银溶胶表面的硼酸根，避免干扰峰的影响。过量的硼氢化钠的引入，不仅可以防止银纳米颗粒表面继续氧化，使待测细菌分子获得更好的增强拉曼信号，同时在引入的钠离子的作用下，银纳米颗粒可以吸附到细菌表面，从而进一步增强细菌的拉曼信号。
实施例4
一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、称取0.0660g硼氢化钠溶于495mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的转速搅拌8分钟，得到硼氢化钠溶液；称取0.0330g硝酸银溶于5mL去离子水，然后在转速2050转/分钟的条件下，以8-12滴/秒的速度逐滴加入到硼氢化钠溶液中，反应过程中溶液颜色从黑色、黄色、蓝色、最后变为黑色，得到银溶胶，避光保存；b、将银溶胶离心，6500转/分钟，20min，20℃去上清，然后取10μL离心产物与1μL浓度为1mM的碘化钠溶液在室温下孵育60min，得到增强基底；
二、将10μL增强基底分别与1μL供试菌细菌样品混合，然后加入2μL 1.89g/L的硼氢化钠溶液充分混合，再进行SERS检测，激光波长为633nm，扫描时间为35s，激光能量20mW。
供试菌为：大肠埃希菌HM 1019；SERS谱由图8所示，由图8可知，718、1024cm-1可以归属为腺嘌呤；998cm-1归属为苯丙氨酸；845、1095和1266cm-1归属为细胞壁主要成分肽聚糖；653、718、756、845和1528cm-1归属为代谢产物吲哚。本实施例制备的增强基底成功获得了细菌DNA的碱基、氨基酸、细胞壁成分肽聚糖和代谢产物的ERS信号。
图9为本发明的工艺流程图，由上述实施例可知，本发明制备的增强基底成功获得了细菌DNA的碱基、氨基酸和表面肽聚糖得到SERS信号，可以无标签快速识别多种不同的细菌，具有较好的通用性。

Claims (10)

1.一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、制备浓度为0.05-0.25g/L的硼氢化钠溶液，然后制备浓度为1-15g/L的硝酸银溶液，再在搅拌条件下，将硝酸银溶液加入到硼氢化钠溶液中，得到银溶胶，其中硝酸银溶液与硼氢化钠溶液的体积比为1：(50-150)；b、将银溶胶离心，去上清，离心产物与卤化物溶液在室温下孵育30-180min，得到增强基底；离心产物与卤化物溶液的体积比为10：(0.5-5)；
二、将增强基底与细菌样品混合，然后加入1.4-2.4g/L的硼氢化钠溶液充分混合，再进行SERS检测，检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为10-60s，激光能量20mW；其中增强基底、细菌样品与硼氢化钠溶液的体积比为10：(0.5-5)：(0.5-5)。
2.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，其特征在于步骤一中0.05-0.25g/L的硼氢化钠溶液的制备方法为：称取硼氢化钠溶于去离子水中，在1500-2000转/分钟条件下搅拌8分钟。
3.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，其特征在于步骤一中硝酸银溶液直接倒入或滴加到硼氢化钠溶液中，若是滴加到硼氢化钠溶液中，则滴加速度为8-12滴/秒。
4.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，其特征在于步骤一中银溶胶的离心是在20℃、6500转/分钟的条件下离心20min。
5.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法，其特征在于步骤一中卤化物溶液的浓度为1mM，其中卤化物为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠或碘化钾。
6.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的方法为观察革兰氏阳性菌SERS特征峰：G+：718cm-1、998cm-1、1023cm-1、1202cm-1和1427cm-1，革兰氏阴性菌SERS特征峰：G-：718cm-1、756cm-1、1021cm-1、1201cm-1和1438cm-1；若756cm-1和845cm-1的峰强于718cm-1，则为革兰氏阳性菌；若718cm-1的峰强于756cm-1和845cm-1，则为革兰氏阴性菌。
8.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于区分同种类型细菌的敏感株和耐药株。
9.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术无标签检测细菌的方法应用于确定抗生素作用后细菌死亡速度加快的拐点。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于确定抗生素作用后细菌死亡速度加快的拐点的方法为：利用拉曼峰值比例，若I718/I756的比值最小，则细菌死亡速度出现拐点。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115184339A (zh) * 2022-09-08 2022-10-14 海澳华(黑龙江)生物医药技术有限公司 一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104458694A (zh) * 2014-11-28 2015-03-25 中国科学院合肥物质科学研究院 一种通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法
CN104785776A (zh) * 2015-05-11 2015-07-22 厦门大学 一种以硼氢化钠水溶液对银纳米粒子进行表面清洁的方法
CN106885797A (zh) * 2017-03-16 2017-06-23 安徽中科赛飞尔科技有限公司 一种基于高活性位点的定向表面增强拉曼光谱检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104458694A (zh) * 2014-11-28 2015-03-25 中国科学院合肥物质科学研究院 一种通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法
CN104785776A (zh) * 2015-05-11 2015-07-22 厦门大学 一种以硼氢化钠水溶液对银纳米粒子进行表面清洁的方法
CN106885797A (zh) * 2017-03-16 2017-06-23 安徽中科赛飞尔科技有限公司 一种基于高活性位点的定向表面增强拉曼光谱检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈寿椿, 上海科学技术出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115184339A (zh) * 2022-09-08 2022-10-14 海澳华(黑龙江)生物医药技术有限公司 一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法

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