CN110702664A - 一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，拉曼采集多株革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌质控菌的单细胞拉曼图谱，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram‑negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram‑positive，将这两组数据作为训练组，做主成分分析，然后基于主成分分析结果建立DFA分析模型，然后采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱，对原始图谱数据进行去背景、归一化处理，将数据输入DFA分析模型，对待鉴定细菌进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。与现有技术相比，本发明操作简单，节省时间，节省试剂及耗材。

Description

一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法
技术领域
本发明涉及细菌的鉴定方法，尤其是涉及一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法。
背景技术
临床微生物学中革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的正确快速鉴定是进行药物敏感性分析进而治疗患者的第一步(O’Hara,C.M.,M.P.Weinstein,and J.M.Miller.Manualand automated systems for detection and identification ofmicroorganisms.Manual of clinical microbiology,8,185-207(2003))。临床可根据革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的致病物质不同及对不同抗生素的敏感性不同来参考用药。现有的临床病原菌革兰氏阴阳性鉴定方法主要是革兰氏染色法。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。革兰氏染色法阳性反应和阴性反应是细菌鉴定和分离最重要最基本的方法，但缺点在于操作复杂耗时，需要经过三次染色和数次洗涤脱色步骤才能得到结果，且使用革兰氏染色时经常发现某些革兰氏阳性菌会褪色，某些革兰氏阴性菌会由于菌龄或培养基的不同而导致染色反应不准确。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法。
拉曼光谱可以反映化学键的能量，对化合物的结构进行判断。细菌的单细胞拉曼光谱，可以反应细菌胞内、细胞膜、细胞壁上的生物大分子及代谢物的成份和浓度，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的细胞壁结构有显著性的差异，因此其拉曼图谱也分别具有相应的特点，于是构成了通过细菌拉曼图谱进行革兰氏阴阳性鉴定的基础前提。然而这种拉曼图谱的差异依靠肉眼很难观察到，因此本发明利用机器学习的方法对两类细菌的拉曼光谱进行训练，从而建立可以正确鉴定分类的算法模型。细菌分为两类：Gram-positive和Gram-negative，对训练组数据进行PCA分析，然后基于PCA结果建立DFA分析模型。最后用测试组数据进行验证。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，拉曼采集多株含有革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的质控菌的单细胞拉曼图谱，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive，将这两组数据作为训练组，做主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，然后基于主成分分析结果建立DFA(Discrimation Function Analysis)分析模型，然后采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱，对原始图谱数据进行归一化(/面积)处理，将数据输入DFA分析模型，对待鉴定细菌进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。
在本发明的一个实施方式中，选择8株质控菌作为训练组建库，其中包含4株革兰氏阴性菌，4株革兰氏阳性菌。光谱范围280～2187cm-1，包含细胞指纹区600～1800cm-1。
在本发明的一个实施方式中，所用的训练组的菌株均为质控菌株，训练组8株质控菌分别为：大肠埃希氏菌(ATCC-25922)、鲍曼不动杆菌(ATCC-19606)、肺炎克雷伯菌(ATCC-700603)、铜绿假单胞菌(ATCC-27853)、金黄葡萄球菌(ATCC-29213)、金黄葡萄球菌(ATCC-25923)、粪肠球菌(ATCC-29212)、表面葡萄球菌(ATCC-12228)。
在本发明的一个实施方式中，拉曼采集图谱前，细菌进行以下处理：将待测细菌从TSB平板转接到TSB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养，然后将菌液以1：1000的比例再转接一次到TSB液体培养基中，37℃，180rpm培养1h，取1ml菌液，7000rpm离心2min，去上清，加1ml无菌水洗涤沉淀，7000rpm离心2min，去上清，重复洗涤步骤1次，加0.5ml无菌水重悬，移取2μl点样到有金属镀层的载玻片上，干燥后进行拉曼光谱采集。
在本发明的一个实施方式中，进行拉曼光谱采集的方法为：选用共聚焦拉曼光谱仪，532nm激光器，设置激光功率1～20mW，光谱仪光栅选择1200g/mm，在100x物镜下找到待测微生物单细胞设定用单谱采集时间1～20s，训练组每株细菌采集1000条光谱。
在本发明的一个实施方式中，建立DFA分析模型的方法为：
对原始图谱数据进行去背景、归一化处理，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive，肉眼直接观察革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的图谱，很难观察到二者之间存在明显差异(图1-1与图1-2)；
使用R软件(版本号3.5.1)下基础包中prcomp函数，对两类数据进行PCA分析并利用第1、2主成分作图(图2)，两类数据也不能明显区分开。然后利用R软件下的MASS包，基于PCA结果建立DFA分析模型并作图(图3)。
原始图谱数据是仪器采集得到的每个细胞的拉曼图谱，对原始图谱数据进行去背景、归一化处理的原因在于：原始数据图谱基线和信号强度不一致，对原始图谱数据去背景、归一化处理后得到基线和信号强度一致的图谱，用于后续建模；归一化之后的数据包括波数和对应的强度。
如果把每个波数看做一个变量的话，每一个图谱就是一个维度很大的数据，这样的数据很难做定性和定量分析，所以需要一些降维的方法帮助我们进行可视化分析和定性定量分析，DFA(discrimination functions analysis)可以帮助我们把复杂的变量进行线性重组，使变量变少，由此可以看到两个或多个组别之间的最大变化。这些变化是可传递的，在测试新的数据时也可套用。
本发明中，采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱前，待鉴定细菌采用与训练组菌株相同的处理方法处理，对待鉴定细菌进行拉曼光谱采集的方法与对训练组菌株进行拉曼光谱采集的方法相同。
在本发明的一个实施方式中，采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱时，每株细菌采集100条光谱，对原始图谱数据进行归一化(/面积)处理，将数据输入建立好的DFA分析模型，对测试组数据进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。
DFA分析模型里含有两组数据，革兰氏阴性菌的数据和革兰氏阳性菌的数据，测试数据已知革兰氏属性，当对测试数据进行测试时，模型会输出该测试数据分别被鉴定为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的百分比，当一株菌大于80％被鉴定为革兰氏阳性菌，说明该菌株为革兰氏阳性菌，当一株菌大于80％被鉴定为革兰氏阴性菌，说明该菌株为革兰氏阴性菌。
本发明采集尿液分离菌(分别为金黄葡萄球菌、表面葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌，3株革兰氏阳性菌和3株革兰氏阴性)的单细胞拉曼图谱，光谱范围与训练组一致。为避免其他因素如培养温度、培养时间、离心等对细胞拉曼图谱的影响，本发明中所有细菌的样品准备与训练组保持一致，采集条件与训练组数据一致，测试组每株细菌采集100条光谱。对原始图谱数据进行归一化(/面积)处理。将数据输入建立好的模型，对测试组数据进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性，准确率可达90％以上，如表1。
表1
测试菌株 Gram-positive Gram-negative Accuracy
金黄葡萄球菌 97.9％ 2.1％ 97.9％
表面葡萄球菌 98.9％ 1.1％ 98.9％
粪肠球菌 99.6 0.4％ 99.6％
大肠埃希氏菌 8.9％ 91.1％ 91.1％
鲍曼不动杆菌 7.3％ 92.7％ 92.7％
肺炎克雷伯菌 1％ 99％ 99％
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、操作简单：省去传统细菌革兰氏染色法需要3次然后和多次洗涤的步骤，只需对样品中的细菌进行两次洗涤得到干净的单细胞即可进行图谱采集并鉴定细菌革兰氏阴阳性。
2、节省时间：样品中细菌无需培养16～24h，只需在培养基中孵育1h使细菌达到指数生长期即可进行检测。
3、节省试剂及耗材：传统染色法需要使用染液且每个样品需要一张载玻片，浪费试剂和耗材，本方法不需要染色且一张载玻片可以检测40～60个样品，检测造价低。
附图说明
图1-1为4株革兰氏阳性质控菌的均值图谱。
图1-2为4株革兰氏阴性质控菌的均值图谱。
图2为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类数据的PCA分析图。
图3为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类数据的DFA分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，拉曼采集多株含有革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的质控菌的单细胞拉曼图谱，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive，将这两组数据作为训练组，做主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，然后基于主成分分析结果建立DFA分析模型，然后采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱，对原始图谱数据进行归一化(/面积)处理，将数据输入DFA分析模型，对待鉴定细菌进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。
本实施例中，选择8株细菌作为训练组建库，其中包含4株革兰氏阴性菌，4株革兰氏阳性菌。；拉曼图谱范围280～2187cm-1，包含细胞指纹区600～1800cm-1。训练组8株质控菌分别为：大肠埃希氏菌(ATCC-25922)、鲍曼不动杆菌(ATCC-19606)、肺炎克雷伯菌(ATCC-700603)、铜绿假单胞菌(ATCC-27853)、金黄葡萄球菌(ATCC-29213)、金黄葡萄球菌(ATCC-25923)、粪肠球菌(ATCC-29212)、表面葡萄球菌(ATCC-12228)。
本实施例中，采集细菌拉曼图谱前，对细菌进行以下处理：将待测细菌TSB平板上转接到TSB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养，然后将菌液以1：1000的比例再转接一次到TSB液体培养基中，37℃，180rpm培养1h，取1ml菌液，7000rpm离心2min，去上清，加1ml无菌水洗涤沉淀，7000rpm离心2min，去上清，重复洗涤步骤1次，加0.5ml无菌水重悬，移取2μl点样到有金属镀层的载玻片上，干燥后进行拉曼光谱采集。
本实施例中，进行拉曼光谱采集的方法为：选用共聚焦拉曼光谱仪，532nm激光器，设置激光功率1～20mW，光谱仪光栅选择1200g/mm，在100x物镜下找到待测微生物单细胞设定用单谱采集时间1～20s，训练组每株细菌采集1000条光谱。
本实施例中，建立DFA分析模型的方法为：对原始图谱数据进行归一化处理，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive，肉眼直接观察革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的图谱，很难观察到二者之间存在明显差异(图1-1与图1-2)；使用R软件(版本号3.5.1)下基础包中prcomp函数，对两类数据进行PCA分析并利用第1、2主成分作图(图2)，两类数据也不能明显区分开。然后利用R软件下的MASS包，基于PCA结果建立DFA分析模型并作图(图3)。
原始图谱数据是仪器采集得到的每个细胞的拉曼图谱，对原始图谱数据进行去背景、归一化处理的原因在于：原始数据图谱基线和信号强度不一致，对原始图谱数据去背景、归一化处理后得到基线和信号强度一致的图谱，用于后续建模；归一化之后的数据包括波数和对应的强度。
如果把每个波数看做一个变量的话，每一个图谱就是一个维度很大的数据，这样的数据很难做定性和定量分析，所以需要一些降维的方法帮助我们进行可视化分析和定性定量分析，DFA(discrimination functions analysis)可以帮助我们把复杂的变量进行线性重组，使变量变少，由此可以看到两个或多个组别之间的最大变化。这些变化是可传递的，在测试新的数据时也可套用。
本实施例中，采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱前，待鉴定细菌采用与训练组菌株相同的处理方法处理，对待鉴定细菌进行拉曼光谱采集的方法与对训练组菌相互进行拉曼光谱采集的方法相同。
本实施例中，采集尿液分离菌(分别为金黄葡萄球菌、表面葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌，3株革兰氏阳性菌和3株革兰氏阴性)的单细胞拉曼图谱，光谱范围与训练组一致。为避免其他因素如培养温度、培养时间、离心等对细胞拉曼图谱的影响，本发明中所有细菌的样品准备与训练组保持一致，采集条件与训练组数据一致，测试组每株细菌采集100条光谱。对原始图谱数据进行归一化(/面积)处理。将数据输入建立好的模型，对测试组数据进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性，准确率可达90％以上，如表1。
表1
测试菌株 Gram-positive Gram-negative Accuracy
金黄葡萄球菌 97.9％ 2.1％ 97.9％
表面葡萄球菌 98.9％ 1.1％ 98.9％
粪肠球菌 99.6 0.4％ 99.6％
大肠埃希氏菌 8.9％ 91.1％ 91.1％
鲍曼不动杆菌 7.3％ 92.7％ 92.7％
肺炎克雷伯菌 1％ 99％ 99％
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，
拉曼采集多株含有革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的质控菌的单细胞拉曼图谱，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive，
将这两组数据作为训练组，做主成分分析，然后基于主成分分析结果建立DFA分析模型，
然后采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱，对原始图谱数据进行去背景、归一化处理，将数据输入DFA分析模型，对待鉴定细菌进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，选择8株细菌训练建库，其中包含4株革兰氏阴性菌，4株革兰氏阳性菌，光谱范围280～2187cm-1，包含细胞指纹区600～1800cm-1。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，训练组8株质控菌分别为：大肠埃希氏菌(ATCC-25922)、鲍曼不动杆菌(ATCC-19606)、肺炎克雷伯菌(ATCC-700603)、铜绿假单胞菌(ATCC-27853)、金黄葡萄球菌(ATCC-29213)、金黄葡萄球菌(ATCC-25923)、粪肠球菌(ATCC-29212)、表面葡萄球菌(ATCC-12228)。
4.根据权利要求1或2所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，拉曼采集图谱前，对细菌进行以下处理：
将待测细菌从TSB平板转接到TSB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养，然后将菌液以1：1000的比例再转接一次到TSB液体培养基中，37℃，180rpm培养1h，取1ml菌液，7000rpm离心2min，去上清，加1ml无菌水洗涤沉淀，7000rpm离心2min，去上清，重复洗涤步骤1次，加0.5ml无菌水重悬，移取2μl点样到低拉曼背景芯片上进行拉曼检测，低背景拉曼芯片采用含有金属镀层的玻璃载玻片；低拉曼背景芯片购于上海氘峰医疗器械有限公司，Cat No1001，干燥后进行拉曼光谱采集。
5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，进行拉曼光谱采集的方法为：选用共聚焦拉曼光谱仪，532nm激光器，设置激光功率1～20mW，光谱仪光栅选择1200g/mm，在100x物镜下找到待测微生物单细胞，设定单谱采集时间1～20s，训练组每株细菌采集1000条光谱。
6.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，建立DFA分析模型的方法为：
对原始图谱数据进行去背景、归一化处理，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive；
使用R软件下基础包中prcomp函数，对两类数据进行PCA分析并利用第1、2主成分作图，然后利用R软件下的MASS包，基于PCA结果建立DFA分析模型并作图。
7.根据权利要求1或6所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，原始图谱数据是仪器采集得到的每个细胞的拉曼图谱，
对原始图谱数据去背景、归一化处理后得到基线和信号强度一致的图谱，用于后续建模；归一化之后的数据包括波数和对应的强度。
8.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱前，待鉴定细菌采用与训练组菌株相同的处理方法处理，对待鉴定细菌进行拉曼光谱采集的方法与对训练组菌株进行拉曼光谱采集的方法相同。
9.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，采集已知菌种的待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱时，每株细菌采集100条光谱，对原始图谱数据进行归一化处理，将数据输入建立好的DFA分析模型，对测试组数据进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。
10.根据权利要求9所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，DFA分析模型里含有两组数据，革兰氏阴性菌的数据和革兰氏阳性菌的数据，测试数据已知革兰氏属性，当对测试数据进行测试时，模型会输出该测试数据分别被鉴定为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的百分比，当一株菌大于80％被鉴定为革兰氏阳性菌，说明该菌株为革兰氏阳性菌，当一株菌大于80％被鉴定为革兰氏阴性菌，说明该菌株为革兰氏阴性菌。
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