CN117929350A - 基于超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性的方法。第一步，将待测混合细菌样本在含有不同抗生素的培养液中孵育1小时；第二步，将待测样本在含有活细胞指示剂的培养液中孵育1小时；第三步，将待测样本离心清洗后涂在基片上，进行超光谱成像检测；第四步，结合训练好的细菌数据库，进行单细菌识别分类；第五步，判断单细菌光谱中是否含有活细胞指示剂的光谱信号，确定该细菌的活性；第六步，分别计算处理组和对照组的活细菌数和总细菌数的比值，并以处理组和对照组的比值作为耐药性判别标准。本发明的检测方法具有操作简便、检测速度快、准确度高、可重复性好等优点，对于临床诊断和治疗具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于超光谱技术领域，涉及一种基于超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性的方法。
背景技术
病原微生物的诊断，尤其是临床常见的细菌诊断，是体外诊断技术的一大应用领域。目前细菌感染的临床诊断方法需要先对样本进行富集培养和分纯，再分别对样本中的病原菌进行种属鉴定和药敏测试(或称抗生素敏感性测试，AST)。临床细菌检测的过程极其缓慢，即使在最先进的实验室条件下也可能需要两天以上的时间。血液样本的表型抗生素敏感性测试因为涉及3个过夜培养步骤，其全流程的周转时间通常至少需要3-4天。而对于尿路感染这样的样本细菌密度较高的感染而言，即使其体外诊断不需要对原始样本进行扩增培养，但其耗时仍然长达36小时。由此可见，现行的病原菌感染临床体外诊断过程较为漫长，以上的方法无法在关键的感染早期对抗生素治疗进行指导。
临床病原菌诊断的主要瓶颈在于病原菌的诊断和药敏测试往往需要经过长时间的富集培养，或者需要通过牺牲准确性和成本来提升检测速度。因此，开发一种快速、无需培养、低成本的病原菌感染检测新方法，对于指导临床正确用药、延缓病原菌耐药性问题的发展至关重要。基于超光谱成像的病原菌检测：其符合临床病原菌检测快速、无需培养的技术需求，可以同时获得细菌的形貌信息以及光谱信息。同时，我们也要了解目前99%以上已知的微生物不能够在实验室条件下进行培养和鉴定。因此，单细胞水平病原微生物的鉴定无论是对临床感染的快速诊断还是对微生物学的研究都有着重要意义。此外，结合重水等稳定同位素标记的单细胞拉曼光谱检测方法以及结合活细胞染色剂的超光谱成像检测方法，在微生物检测这一领域的研究展示了其表征单细胞水平代谢的巨大潜力。因此，可快速地对单细胞水平的代谢状态进行定性或定量分析的单细胞超光谱技术是我们检测混合菌耐药性的不二之选。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提出了一种基于超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性的方法，利用超光谱成像系统的高分辨率和高灵敏度特性，实现了对混合细菌耐药性的快速、准确检测。
第一步，将待测混合细菌样本在含有不同抗生素的培养液中孵育1小时，并设立不含抗生素的作为对照组。
第二步，将待测样本在含有活细胞指示剂的培养液中孵育1小时。
第三步，将待测样本离心清洗后涂在基片上，进行超光谱成像检测，实现单细菌二维形貌和一维光谱的获取。
第四步，结合训练好的细菌数据库，进行单细菌识别分类。
第五步，判断单细菌光谱中是否含有活细胞指示剂的光谱信号，确定该细菌的活性。
第六步，分别计算处理组和对照组的活细菌数和总细菌数的比值，并以处理组和对照组的比值作为判别标准，小于等于某个阈值判断为对抗生素敏感，大于某个阈值判别为对抗生素耐药。
所述的快速检测混合细菌耐药性的方法采用自开发的色散超光谱成像模块作为检测装置，提供高信噪比的透射/反射/荧光/拉曼超光谱图像，空间分辨率优于2µm，光谱分辨率优于1 nm，可以实现单个细菌物种的识别。
所述的快速检测混合细菌耐药性的方法是一种无需培养的致病菌种及其耐药性检测的新方法，超光谱成像扫描时间可快至数分钟，结合计算机断层扫描成像系统(Computed Tomography Imaging System)甚至可为快照式。
所述的超光谱成像模块的工作波段在400nm-1700nm。
所述的快速检测混合细菌耐药性的方法中活细胞指示剂可以是重水（D2O），活细菌会吸收D2O中的氘元素，生成碳-氘键，从而产生2040-2300cm-1处的拉曼峰，直接被超光谱成像系统探测到或者被集成于系统的的拉曼探头探测到。
所述的拉曼探头的激发波长为532nm，聚焦后的激光光斑直径小于2μm，通过共聚焦的方式，避免有效区域外信号的干扰，提高单细菌拉曼信号的信噪比。
所述的快速检测混合细菌耐药性的方法中抗生素可以包括多种不同类型的抗生素，以检测混合细菌对不同抗生素的耐药性。
所述的快速检测混合细菌耐药性的方法中还包括对耐药性检测结果的验证，包括通过传统培养方法和药敏试验验证超光谱成像系统检测结果的准确性。
所述的快速检测混合细菌耐药性的方法中为了避免环境、存放时间等的干扰，设立了未添加抗生素的空白对照组，分别计算抗生素处理组和对照组的活细菌数和总细菌数的比值，并以处理组和对照组的比值作为判别标准，小于等于某一阈值判断为对抗生素敏感，大于某一阈值判别为对抗生素耐药。
所述的快速检测混合细菌耐药性的方法中开发配套的软件系统，包括数据处理模块、细菌识别分类模块和耐药性检测模块，能够实现超光谱成像数据的自动化处理和分析，提供快速、准确的细菌耐药性检测结果。
所述的软件系统还包括对超光谱成像数据的预处理，包括噪声去除、光谱校准和图像分割，以提高细菌识别分类和耐药性检测的准确性。
所述的软件系统通过超光谱成像同时获得混合细菌的二维形貌信息和一维光谱信息，PCA-SVM算法对细菌进行单细胞水平的识别分类及耐药性检测。
所述的软件系统还包括数据库管理模块，用于存储和管理细菌数据库，以便进行细菌识别和耐药性检测。
本发明的有益效果
本发明提出的一种基于超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性的方法，通过巧妙地融合超光谱成像技术，不仅集高分辨的二维形貌与一维光谱于一体，实现了单细胞水平的精准分析，还为细菌的快速检测开辟了新的途径。更重要的是，结合活细胞染色剂的超光谱成像检测方法，使得临床病原菌药敏检测得以迅速实现，显著提升了检测效率。这一创新方法的实施，对于优化当前临床依赖经验用药的现状、指导制定精准治疗方案以及及时挽救患者生命具有极其重要的意义。通过本发明的应用，我们有望为医疗领域带来革命性的改变，使得细菌感染的治疗更加科学、高效和个性化。
附图说明
图1为基于超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性的方法步骤图。
图2为基于透射超光谱成像实现单细菌识别分类。
图3 基于拉曼超光谱成像实现单细菌识别分类：(a) 聚焦后的光斑直径优于2um；(b) 不同细菌的拉曼光谱；(c) PCA-SVM分类预测结果。
图4为基于拉曼超光谱成像实现单细菌活性判断。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
如附图1所示，基于超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性的方法，利用超光谱成像系统的高分辨率和高灵敏度特性，实现了对混合细菌耐药性的快速、准确检测。
将待测混合细菌样本在含有不同抗生素的培养液中孵育1小时，并设立不含抗生素的作为对照组。
将待测样本在含有活细胞指示剂的培养液中孵育1小时。
将待测样本离心清洗后涂在基片上，进行超光谱成像检测，实现单细菌二维形貌和一维光谱的获取。
结合训练好的细菌数据库，进行单细菌识别分类。
判断单细菌光谱中是否含有活细胞指示剂的光谱信号，确定该细菌的活性。
分别计算处理组和对照组的活细菌数和总细菌数的比值，并以处理组和对照组的比值作为判别标准，小于等于0.25判断为对抗生素敏感，大于0.25判别为对抗生素耐药。
本实施例中，通过自研的透射式超光谱显微系统对混合细菌进行检测和成像，采用色散超光谱成像模块作为检测装置，提供高信噪比的光谱图像，空间分辨率为2µm和光谱分辨率为1nm。从图像中提取单细菌的光谱和形貌，结合机器学习算法，将获取到的单细菌的特征数据与数据集中预先采集的大量细菌样本的光谱形貌特征进行比对，实现了混合多种细菌种类的快速检测识别分类计数，如附图2所示。
实施例2
本实施例中，通过自研的共聚焦拉曼超光谱显微系统对混合细菌进行检测和成像，提供高信噪比的光谱图像，空间分辨率为2µm和光谱分辨率为1nm，聚焦后的激发光光斑小于2μm。从图像中提取单细菌的光谱和形貌，结合机器学习算法，将获取到的单细菌的特征数据与数据集中预先采集的大量细菌样本的光谱形貌特征进行比对，实现了混合多种细菌种类的快速检测识别分类计数，如附图3所示。
本实施例中，抗生素选用环丙沙星，活细胞指示剂选用重水（D2O），活细菌会吸收D2O中的氘元素，生成碳-氘键（C-D键），从而产生2040-2300cm-1处的拉曼峰，进而区分死细菌和活细菌，判断抗生素对细菌样本是否有效，如附图4所示，当抗生素含量≤0.4μg/ml时，该细菌仍然有代谢活性，而当抗生素含量≥0.8μg/ml时，细菌就不存在活性了。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种基于活细胞指示剂的超光谱成像系统快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，利用超光谱成像系统的超光谱分辨率和高灵敏度特性，实现对混合细菌耐药性的快速、准确检测；
第一步，将待测混合细菌样本在含有不同抗生素的培养液中孵育1小时，并设立不含抗生素的作为对照组；
第二步，将待测样本在含有活细胞指示剂的培养液中孵育1小时；
第三步，将待测样本离心清洗后涂在基片上，进行超光谱成像检测，实现单细菌二维形貌和一维光谱的获取；
第四步，结合训练好的细菌数据库，进行单细菌识别分类；
第五步，判断单细菌光谱中是否含有活细胞指示剂的光谱信号，确定该细菌的活性；
第六步，分别计算处理组和对照组的活细菌数和总细菌数的比值，并以处理组和对照组的比值作为判别标准，小于等于某个阈值判断为对抗生素敏感，大于某个阈值判别为对抗生素耐药。
2.根据权利要求1所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于采用自开发的色散超光谱成像模块作为检测装置，提供高信噪比的透射/反射/荧光/拉曼超光谱图像，空间分辨率优于2µm，光谱分辨率优于1 nm，工作波段在400nm-1700nm，可以实现单个细菌物种的识别。
3.根据权利要求1所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，是一种无需致病菌培养的快速检测致病菌种及其耐药性的新方法，超光谱成像扫描时间可快至数分钟，结合计算机断层扫描成像系统(Computed Tomography Imaging System)甚至可为快照式。
4.根据权利要求1所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，活细胞指示剂可以是重水（D2O），活细菌会吸收D2O中的氘元素，生成碳-氘键，从而产生2040-2300cm-1处的拉曼峰，直接被超光谱成像系统探测到或者被集成于系统的的拉曼探头探测到。
5.根据权利要求4所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，拉曼信号的激发波长为532nm，聚焦后的激光光斑直径小于2μm，通过共聚焦的方式，避免有效区域外信号的干扰，提高单细菌拉曼信号的信噪比。
6.根据权利要求1所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，为了避免环境、存放时间等的干扰，设立了未添加抗生素的空白对照组，分别计算抗生素处理组和对照组的活细菌数和总细菌数的比值，并以处理组和对照组的比值作为判别标准，小于等于某个阈值判断为对抗生素敏感，大于某个阈值判别为对抗生素耐药。
7.根据权利要求1所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，开发配套的软件系统，包括数据处理模块、数据库管理模块、细菌识别分类及耐药性检测模块，能够实现超光谱成像数据的自动化处理和分析，提供快速、准确的细菌耐药性检测结果。
8.根据权利要求7所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，利用数据库管理模块对超光谱成像数据的预处理，包括噪声去除、光谱校准和图像分割，以提高细菌识别分类和耐药性检测的准确性。
9.根据权利要求7所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，超光谱成像同时获得混合细菌的二维形貌信息和一维光谱信息，细菌识别分类及耐药性检测模块通过PCA-SVM算法对细菌进行单细胞水平的识别分类及耐药性检测。
10.根据权利要求7所述的快速检测混合细菌耐药性的方法，其特征在于，开发数据库管理模块用于存储和管理细菌数据库，以便进行细菌识别和耐药性检测。
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