CN118090564A - 一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，属于细菌的测定或检验方法技术领域，用于尿路感染的细菌检测，包括检测芯片预处理，将其放置于显微镜载物台上，将待测样品加入静置孵育，细菌游至载玻片表面，会被抗体特异性捕获，借助相机拍摄细菌的时序图像，使用拉普拉斯‑高斯滤波器识别图像中的单个细菌光斑，归一化时序图像内单个光斑的光学波动幅度，根据单个光斑的光学波动幅度，可分析细菌生理代谢活性的变化。本发明在15分钟内判断尿样是否为细菌感染阳性样本；60分钟内可完成病原菌对药物敏感程度的进一步评估；检测耗时短，快速进行尿路感染的判断，大大缩短了指导用药时间；无需昂贵仪器，造价低廉，操作简单。
Description
技术领域
本发明公开一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，属于细菌的测定或检验方法技术领域。
背景技术
尿路细菌感染是由细菌侵入泌尿系统引起的感染，常见症状包括尿频、尿急、尿痛等。在临床实践中，准确快速地检测尿路细菌感染对于及时诊断和治疗至关重要。目前，临床上常用的金标准方法是尿液培养。尿液培养是通过将患者采集的尿液样本放置在含有营养物质的培养基中，利用培养基中的营养物质促进细菌生长，最终观察培养皿中是否出现细菌菌落，从而确定感染的细菌种类和数量，对于确定细菌感染的阳性尿液，还需要分组进行不同抗生素的敏感性测试，用以判断最佳的尿路感染治疗药物，培养法具有准确性高，可靠性性强等优点，根据尿液培养可以明确细菌种类和数量，有助于医生制定针对性的治疗方案。
由于培养法的原理基于细菌的分裂繁殖，因此其检测过程时间消耗长，尿液培养通常需要24-48小时甚至更长时间才能得出结果，容易延误治疗时机，也不适用于急诊或者频繁检测的情况。因此，尽管尿液培养作为金标准方法具有较高的准确性和可靠性，但在实际应用中也需要权衡其时间成本和治疗指导的及时性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，以解决现有技术中，常规尿液培养进行细菌检测的方法速度较慢的问题。
一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，包括进行检测芯片预处理，将检测芯片置于显微镜载物台上，将待测样品加入检测芯片静置孵育15分钟，细菌游到载玻片表面后，抗体特异性捕获细菌，使用相机成像形成细菌图像，使用高斯检测器的拉普拉斯算子进行细菌图像的光斑检测，对时间序列内单个细菌的光学波动幅度进行归一化，量化后的光学波动幅度为：
；
式中，是量化后的单个光斑的光学波动幅度，/>是光斑强度变化的标准偏差，/>是光斑的平均强度，/>是标准差，/>是平均值，/>是随时间/>变化的描述光斑波动的强度变化曲线；
根据单个细菌的光学波动幅度，判断细菌有无分裂繁殖能力。
检测芯片预处理包括烷基化修饰载玻片、形成检测芯片、对检测芯片进行羧基化处理。
载玻片先进行烷基化修饰，包括用乙醇和去离子水分别清洁载玻片，将清洁后的载玻片浸没在1毫摩尔AA-PEG-AA乙醇溶液中，将载玻片在黑暗中放置8小时，以包被AA-PEG-AA自组装单层，然后用乙醇和去离子水再次清洗载玻片，随后用氮气干燥载玻片，完成载玻片的烷基化修饰。
烷基化修饰载玻片后，用无毒橡胶将聚二甲基硅氧烷分析腔粘贴在干燥后的载玻片表面，形成检测芯片，将检测芯片密封并储存在-4℃下。
对检测芯片进行羧基化处理，以连接检测抗体；
使用新鲜制备的1:1摩尔比的磺基-NHS和EDC的混合溶液浸泡烷基化后的载玻片40分钟，使载玻片表面形成羧基，用去离子水清洗载玻片上残留的羧基活化试剂，用氮气吹干载玻片备用；
将pH为载玻片6.0，30μg/mL且溶于10毫摩尔MES的多克隆抗大肠杆菌抗体立即应用于载玻片表面并孵育45分钟，将检测芯片与1.0mg/mL载玻片的牛血清白蛋白一起孵育10分钟，封闭检测芯片表面的非特异性结合位点，再次用氮气干燥检测芯片。
使用相机成像形成细菌图像包括，将检测芯片放置在具有40×相位对比度物镜的倒置显微镜上，并用CMOS相机成像。
细菌图像序列记录为图像堆栈，光斑检测时，计算大于光斑强度阈值的光斑数量。
光斑强度阈值为10，光斑数量和单个光斑强度由TrackMate程序计算。
单细菌运强度分析中，对于大肠杆菌，光学波动幅度达到0.72认为细菌有分裂繁殖能力。
单细菌运强度分析中，对于金黄色葡萄球菌，光学波动幅度达到0.28认为细菌有分裂繁殖能力。
相对比现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明无需长时间检测等待，可以快速进行尿路感染的判断，同时大大缩短了指导用药时间；无需昂贵的检测仪器，只需要借助普通光学显微镜即可进行，操作简便。
附图说明
图1是本发明的技术流程图；
图2是本发明在分析细菌尿路感染中的应用流程。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，包括进行检测芯片预处理，将检测芯片置于显微镜载物台上，将待测样品加入检测芯片静置孵育15分钟，细菌游到载玻片表面后，抗体特异性捕获细菌，使用相机成像形成细菌图像，使用高斯检测器的拉普拉斯算子进行细菌图像的光斑检测，对时间序列内单个细菌的光学波动幅度进行归一化，量化后的光学波动幅度为：
；
式中，是量化后的单个光斑的光学波动幅度，/>是光斑强度变化的标准偏差，/>是光斑的平均强度，/>是标准差，/>是平均值，/>是随时间/>变化的描述光斑波动的强度变化曲线；
根据单个细菌的光学波动幅度，判断细菌有无分裂繁殖能力。
检测芯片预处理包括烷基化修饰载玻片、形成检测芯片、对检测芯片进行羧基化处理。
载玻片先进行烷基化修饰，包括用乙醇和去离子水分别清洁载玻片，将清洁后的载玻片浸没在1毫摩尔AA-PEG-AA乙醇溶液中，将载玻片在黑暗中放置8小时，以包被AA-PEG-AA自组装单层，然后用乙醇和去离子水再次清洗载玻片，随后用氮气干燥载玻片，完成载玻片的烷基化修饰。
烷基化修饰载玻片后，用无毒橡胶将聚二甲基硅氧烷分析腔粘贴在干燥后的载玻片表面，形成检测芯片，将检测芯片密封并储存在-4℃下。
对检测芯片进行羧基化处理，以连接检测抗体；
使用新鲜制备的1:1摩尔比的磺基-NHS和EDC的混合溶液浸泡烷基化后的载玻片40分钟，使载玻片表面形成羧基，用去离子水清洗载玻片上残留的羧基活化试剂，用氮气吹干载玻片备用；
将pH为载玻片6.0，30μg/mL且溶于10毫摩尔MES的多克隆抗大肠杆菌抗体立即应用于载玻片表面并孵育45分钟，将检测芯片与1.0mg/mL载玻片的牛血清白蛋白一起孵育10分钟，封闭检测芯片表面的非特异性结合位点，再次用氮气干燥检测芯片。
使用相机成像形成细菌图像包括，将检测芯片放置在具有40×相位对比度物镜的倒置显微镜上，并用CMOS相机成像。
细菌图像序列记录为图像堆栈，光斑检测时，计算大于光斑强度阈值的光斑数量。
光斑强度阈值为10，光斑数量和单个光斑强度由TrackMate程序计算。
单细菌运强度分析中，对于大肠杆菌，光学波动幅度达到0.72认为细菌有分裂繁殖能力。
单细菌运强度分析中，对于金黄色葡萄球菌，光学波动幅度达到0.28认为细菌有分裂繁殖能力。
常规的细菌检测需要通过培养的方式来区分细菌的活性，从而精确定量样品中的活细菌，但是依赖于分裂的检测方法耗时长，不利于及时检测诊断尿路感染。为了使尿路感染的诊断方法更加快捷，开发了单细胞光学波动检测技术，借助于普通的光学显微镜，对尿样进行观察，并进行图像的连续采集，可以判断尿液样本中的活细菌数量。因为被抗体捕获的单个细菌在图像表现为一个个明暗不同的光斑亮点，由于细菌不断进行空间运动，导致图像中的光斑亮度产生波动，量化一段时间内光斑波动的强度，根据光斑波动强度可以得出单个细菌的运动强弱，而细菌的运动能力在一定程度上可以反映其代谢活性的高低，可以作为判断细菌有无分裂繁殖能力的依据。在实验过程中我们以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为例，分别得出了区分两种细菌活、死的运动强度阈值，在对样品中的其它个体进行活、死分类时只需要与标准阈值作比较即可确定样品中活细菌的数量，根据一定体积样品内活细菌的数量，可以推断出原有样本中的细菌数量，将这一数量与临床标准细菌感染阈值作比较从而准确诊断出细菌感染的阳性样品。
对于细菌感染的阳性样品，还需要进一步测定其中致病菌的抗生素敏感性，以便指导用药治疗，不同种类的抗生素对同一菌株的作用效果不同，需要根据表型耐药性来对细菌进行抗生素敏感性分级。将受测试的细菌样品加入检测腔室后孵育15min，再加入等体积的某一浓度的抗生素溶液，之后每间隔20min进行细菌运动数据的图像采集，分别计算药物加入后0min，20min，40min，60min，80min的细菌运动强度，根据每一时刻样本中单个细菌运动状态的变化，可以得出对应时刻样本中活细菌的数量，通常对同一抗生素测试四组不同浓度后，即可绘制抗生素对细菌活性的抑制曲线，以细菌半数致死率为基准，可以得出抗生素对该细菌的最小抑制浓度（抗生素抑制曲线与半数致死率基线的交点）。将测得的最小抑制浓度与相关标准文件中的参考数据作对比，可以对细菌敏感程度进行分级（敏感、中介、耐受）。
本发明的技术流程如图1所示，首先对检测芯片表面功能化处理，然后加入待测样品静置孵育15分钟，对单个细菌的表型特征进行分析，得到单个细菌的异质性信息。本发明在分析细菌尿路感染中的应用流程如图2所示，首先基于单细胞光学波动法判断尿液样品中的活细菌数，然后与尿路细菌感染阳性阈值作比较，确定是否需要进一步分析。若否，则得到尿路感染阴性样品。若是，则得到尿路感染阳性样品，然后基于本发明对细菌活性冯分析能力判断不同药物的治疗效果，得到目标病原菌的药物敏感性分级和初步的治疗方案。
实施例一，本发明对大肠杆菌造成的尿路感染进行监测，包括：
S1首先确定区分大肠杆菌活、死细胞运动强度的分离阈值；
步骤①，将正常培养至对数期的大肠杆菌培养物分成两份，一份为正常组，一份为热灭活组。正常组不做处理，热灭活组需在75℃下水浴加热30分钟进行灭活。样品使用前以用无菌液体培养基稀释至适宜浓度，借助细胞计数板，将两组细菌样品的浓度分别调整为5×103cell/mL。
步骤②，准备好检测芯片，从两组细菌样品中各取100μL样品分别加入到不同的检测腔中，静置孵育15分钟，之后借助显微镜观察，记录视野内细菌运动的时序图像，并对两组中单个细菌的运动强度进行定量统计。
步骤③，平行重复三次步骤②将所有统计的数据进行可视化分析对比，以ROC曲线的分离效能数据，确定区分活、死大肠杆菌的最佳分离阈值。
实验结果显示活、死细菌的运动强度差异显著，活细菌组单个细菌运动强度的量化均值为1.16±0.42，而灭活组统计得出的均值为0.38±0.15。根据ROC曲线可得出最佳分离阈值为δS=0.72，方法灵敏度90%，特异性98.3%，效能为0.95。
S2基于细菌活性分析原理实现更加科学的细菌定量；
步骤①，使用【S1步骤①】中的方法，准备两份活性不同的细菌样品，按照不同的体积比分别混合两份细菌样品，其中活细菌占总细菌数的比例分别为0%，25%，50%，75%。分别使用传统的单张图像计数方法和本发明开发的光学波动法对这四组样本进行区分，再以金标准培养法确定实际的单菌落形成数。
步骤②，取正处于对数生长期的细菌培养物一份，借助于麦氏浊度计，将原菌液浓度调整至0.5MCF，之后再用无菌液体培养基，进行梯度稀释，得到一组细菌含量约为1×102~5×105CFU/mL的标准待测菌液。
步骤③，将每个浓度的菌液分为两份，一份采用“金标准”培养法检测，确定每毫升液体中实际能生长的单菌落数量；另一份则应用光学波动法进行分析，每个浓度取100μL样本置于检测腔中，分别孵育15分钟并记录时序图像，采用“五点取样法”计算每个视野中活性大肠杆菌的平均数量。最后以平均值，作为该浓度下，单位视野内最大可能出现的活细菌数。
步骤④，两种方法得到的数据分别进行对数变换后，建立线性关系模型，最终形成标准曲线。
实验结果表明普通计数法无法对活菌含量不同的四组样品进行区分，而光学波动法则可以区分出不同组内活细菌含量的变化，进行细菌定量分析时，忽略细菌个体活性的差异，会造成对样品中细菌危害性的错误评估。据此足以说明细菌活性的区分对于准确定量至关重要。本发明最终得到的细菌定量标准曲线为：y=0.4088x-0.3137，R2=0.9798。借助此标准曲线可以免除培养的情况下，可预测每毫升溶液经培养后可形成的单菌落数量，最终得到更加准确的定量检测结果。
S3.药物敏感性分析方法的建立；
步骤①，首先以微量肉汤法测试大肠杆菌（ATCC 25922）对多粘菌素E和氨苄青霉素两种抗生素的药物敏感程度；
a.取所需抗生素的贮备液进行倍比稀释，以此得到浓度为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml的抗生素工作液。
b.取无菌96孔板，按照浓度梯度向每孔中加入50μL抗生素工作液，每行留出1孔不加药物，用作阳性对照。
c.取培养至对数期的菌液，先用无菌水稀释菌液，调整至菌液浑浊度为0.5MCF，再经液体培养基按1∶100进行稀释，稀释完成后，将菌液加入到预先准备的96孔板中，每孔加入50μL,菌液接种完毕盖好盖子，将96孔板送入37℃培养箱中孵育16小时。
d.结果判读：在读取和报告所测试菌株的最小抑菌浓度（MIC）前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，之后以肉眼观察，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为受试菌的MIC如表1所示。
表1 微量肉汤稀释法对大肠杆菌药物敏感性的分析
。
步骤②，以本发明方法检测大肠杆菌（ATCC 25922）对两种抗生素的药物敏感程度；
a.取培养至对数生长期的大肠杆菌（ATCC 25922）的纯培养物，用无菌液体培养基将原菌液稀释至1×105CFU/mL。
b.取所需抗生素的贮备液进行倍比稀释，64、32、8、2μg/mL的抗生素工作液。
c.取检测芯片，向不同的检测腔室中加入50μL大肠杆菌菌液，孵育15分钟，记录细菌的时序图像，确定原始菌液中细菌的活性高低及活细菌的数量，之后再分别向不同的腔室中加入50μL浓度不同的抗生素工作液，此时检测腔内的抗生素浓度分别为32、16、4、1μg/mL，在抗生素加入后开始计时，之后每隔20min对腔室内细菌的活力状态进行记录，通常此过程要循环2~3次，根据所选作用药物的不同，存在差异。
d.结果判读：统计同一腔室内在每个时间节点所对应的活细菌数量，将药物作用后腔室内活细菌数量与初始时刻活细菌数作比，根据比值来分析不同浓度的抗生素对细菌的抑制效果；一段时间后抗生素的抑制效果会趋于稳定，将稳定时间，作为该药物分析所需的最短时间；根据活细菌数量百分比与抗生素剂量的关系曲线与细菌半数致死率横线的交点，作为该抗生素对实验细菌的最小抑制浓度。
对比两种方法的实验结果：微量肉汤稀释法的检测结果表明，多粘菌素E对大肠杆菌（ATCC 25922）的最小抑制浓度为2μg/mL，氨苄青霉素对大肠杆菌（ATCC 25922）的最小抑制浓度为16μg/mL，根据分类标准，判定实验菌株对两种抗生素的敏感性均表型为中介。本发明方法测得多粘菌素对实验菌株的最小抑制浓度为2.0μg/mL，氨苄青霉素对实验菌株的最小抑制浓度为16.6μg/mL，两种测试方法所得到的检测结果十分接近，并且本发明的检测方法所用时间更短，分析精度更高。
S4对临床尿液样品进行尿路感染检测；
步骤①，首先需要对样品进行尿路感染的阳性筛查，医院普遍认可的标准是对尿液进行培养，根据培养出的单菌落来判断是否存在细菌尿路感染，一般认为每毫升尿液经培养所形成的单菌落数超过5×104CFU时，可认为是细菌尿路感染阳性，而临床结果表明75%以上的尿路感染元凶为大肠杆菌。
步骤②，借助本发明的检测方法对26例临床尿液样本进行分析，每次采集获得一例新的尿液样本时应尽快完成检测，将一份尿液分成三份，并用简单计数法和“金标准”培养法进行同步实验，以“金标准”培养法的结果作为标准对照，以检验本发明方法的可靠性。
检测结果如表2所示，普通计数法的检测结果与“金标准”测试结果相比准确率为88.5%，检测假阳性率为11.5%，假阴性率为0%，本发明对26例尿液样本的检测准确率为96.2%，假阳性率为3.8%，假阴性率为0%，定量分析效果要好于简单计数法，临床真实尿样中可能会存在，蛋白质结晶或细胞碎片等，增大了背景干扰，凭借单张图像的计数分析，可能出现对细菌的误识别，更容易造成假阳性的检测结果。培养法使用传统平板培养法进行菌落计数。
表2 26例患者尿液标本的尿路感染检测
。
S5对阳性尿液样本进行药物敏感性分析；
按照本发明【S3步骤②】所建立的方法，对6例细菌感染阳性尿液做了进一步分析，测试了多粘菌素E和氨苄青霉素对每个样本的作用效果，并与微量肉汤稀释法的检测结果作对照如表3，本发明的检测准确率为83.3%，假阳性率为8.4%，假阴性率为8.4%。这证实了本发明提供了一种在临床环境中诊疗细菌尿路感染的简单的方法。
表3 6例阳性尿样的抗生素敏感性分析
。
实施例二，本发明对两株耐药性不同的金黄色葡萄球菌进行药物敏感性分析，不同种类的细菌由于其个体构造不同，而存在运动能力的差异，对于金黄色葡萄球菌等非运动型的细菌也可以适用本发明来进行分析。
T1确定区分金黄色葡萄球菌活、死细胞运动强度的分离阈值；
步骤①，将正常培养至对数期的金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）培养物分成两份，一份为正常组，不做处理，另一份为热灭活组，在80℃下水浴加热30min进行灭活。样品使用前需用无菌液体培养基稀释至适宜浓度，借助细胞计数板，将两组细菌样品的浓度调整为5×104cell/mL。
步骤②，准备好检测芯片，对于非运动性的细菌可不借助于抗体的捕获作用，即免除了抗体修饰的步骤，可以直接向检测腔室内加入细菌样品并进行观察，从两组细菌样品中各取100μL样品分别加入到不同的培养腔中，静置孵育15min，之后借助显微镜观察，记录视野内细菌运动的时序图像，并对图中单个细菌的运动强度进行定量统计，此步骤需要平行重复三次，最后将所有统计的数据进行可视化分析对比，根据细菌运动强度的差异，确定区分活、死金黄色葡萄球菌的最佳分离阈值。
即使是非运动性的细菌，由于自身代谢作用，与外界存在物质交换，因此仍可以观察到纳米级的微弱波动，所以同样可以通过光斑的波动强度来区分生理代谢活性不同群体，最后得出当分离阈值δS=0.28时，可以实现对每个数据点的最佳分类。根据ROC曲线可得出此时方法的分析灵敏度是72.8%，特异性是83.8%，分析效能为0.83，证明本发明可以区分活性不同的金黄色葡萄球菌。
T2对比分析两株金黄色葡萄球菌的药物敏感性；
同【实例一S3步骤①】中方法一致，制备好氨苄青霉素和万古霉素的标准工作液，并按照标准微量肉汤稀释法的步骤确定出，分别确定出两种金黄色葡萄球菌（ATCC 25923和MRSA）对两种药物的敏感程度，并确定两种药物对该细菌的最小抑菌浓度。
以本发明方法检测两种金黄色葡萄球菌（ATCC 25923和MRSA）对两种抗生素的药物敏感程度；
a.取培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌（ATCC 25923和MRSA）的纯培养物，用无菌液体培养基将原菌液稀释至1×105CFU/mL。
b.取所需抗生素的贮备液进行倍比稀释，获得浓度为2、1、0.5、0.25μg/mL的氨苄青霉素工作液和浓度为16、8、4、2μg/mL的万古霉素工作液。
c.取未进行抗体修饰的检测芯片，向不同的检测腔室中加入50μL金黄色葡萄球菌菌液，孵育15分钟，记录细菌的时序图像，确定原始菌液中细菌的活性高低及活细菌的数量，之后再分别向不同的腔室中加入50μL浓度不同的抗生素工作液，此时不同检测腔内的抗生素浓度会比加入的抗生素工作液浓度减半，在抗生素加入后开始计时，之后每隔20min对腔室内细菌的活力状态进行记录，重复此过程2~3次，根据所选作用药物的不同，存在差异。
d.结果判读：分析方法同【实例一S3步骤②d】，按照A、B、C、D的顺序分别代表加入药物后间隔20min、40min、60min、80min时刻所对应的不同抗生素浓度对细菌活力抑制曲线，当加入药物作用60min后药物对金黄色葡萄球菌的抑制曲线趋于稳定，此时氨苄青霉素对于金黄色葡萄球菌（MRSA）的最小抑制浓度为0.57μg/mL，对于金黄色葡萄球菌（ATCC25923）的最小抑制浓度为0.14μg/mL；此时万古霉素对于金黄色葡萄球菌（MRSA）的最小抑制浓度为2.58μg/mL,对于金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）的最小抑制浓度为2.35μg/mL。根据表4的标准文件的敏感性分类标准，金黄色葡萄球菌（MRSA）对氨苄青霉素表现为耐药，金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）对氨苄青霉素的耐受等级属于中介。而两种金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感程度都处于敏感的临界状态，适当延长检测时间，将获得更为准确的检测结果。
表4 临床和实验室标准研究所标准文件中对葡萄球菌属药物敏感性的解读
。
在本发明的实际应用过程中，应当根据需要自行平衡检测时间和检测结果的准确度，可适当延长检测时间以获得更准确的测定结果。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，包括进行检测芯片预处理，将检测芯片置于显微镜载物台上，将待测样品加入检测芯片静置孵育15分钟，细菌游到载玻片表面后，抗体特异性捕获细菌，使用相机成像形成细菌图像，使用高斯检测器的拉普拉斯算子进行细菌图像的光斑检测，对时间序列内单个细菌的光学波动幅度进行归一化，量化后的光学波动幅度为：
；
式中，是量化后的单个光斑的光学波动幅度，/>是光斑强度变化的标准偏差，/>是光斑的平均强度，/>是标准差，/>是平均值，/>是随时间/>变化的描述光斑波动的强度变化曲线；
根据单个细菌的光学波动幅度，判断细菌有无分裂繁殖能力。
2.根据权利要求1所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，检测芯片预处理包括烷基化修饰载玻片、形成检测芯片、对检测芯片进行羧基化处理。
3.根据权利要求2所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，载玻片先进行烷基化修饰，包括用乙醇和去离子水分别清洁载玻片，将清洁后的载玻片浸没在1毫摩尔AA-PEG-AA乙醇溶液中，将载玻片在黑暗中放置8小时，以包被AA-PEG-AA自组装单层，然后用乙醇和去离子水再次清洗载玻片，随后用氮气干燥载玻片，完成载玻片的烷基化修饰。
4.根据权利要求3所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，烷基化修饰载玻片后，用无毒橡胶将聚二甲基硅氧烷分析腔粘贴在干燥后的载玻片表面，形成检测芯片，将检测芯片密封并储存在-4℃下。
5.根据权利要求4所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，对检测芯片进行羧基化处理，以连接检测抗体；
使用新鲜制备的1:1摩尔比的磺基-NHS和EDC的混合溶液浸泡烷基化后的载玻片40分钟，使载玻片表面形成羧基，用去离子水清洗载玻片上残留的羧基活化试剂，用氮气吹干载玻片备用；
将pH为载玻片6.0，30μg/mL且溶于10毫摩尔MES的多克隆抗大肠杆菌抗体立即应用于载玻片表面并孵育45分钟，将检测芯片与1.0mg/mL载玻片的牛血清白蛋白一起孵育10分钟，封闭检测芯片表面的非特异性结合位点，再次用氮气干燥检测芯片。
6.根据权利要求5所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，使用相机成像形成细菌图像包括，将检测芯片放置在具有40×相位对比度物镜的倒置显微镜上，并用CMOS相机成像。
7.根据权利要求6所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，细菌图像序列记录为图像堆栈，光斑检测时，计算大于光斑强度阈值的光斑数量。
8.根据权利要求7所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，光斑强度阈值为10，光斑数量和单个光斑强度由TrackMate程序计算。
9.根据权利要求8所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，单细菌运强度分析中，对于大肠杆菌，光学波动幅度达到0.72认为细菌有分裂繁殖能力。
10.根据权利要求9所述的一种基于单细胞光学波动法的尿路感染快速检测方法，其特征在于，单细菌运强度分析中，对于金黄色葡萄球菌，光学波动幅度达到0.28认为细菌有分裂繁殖能力。
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