JP2013507647A - 軸外し干渉計 - Google Patents

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Abstract

本発明は、軸外しデジタルホログラフィック顕微鏡観察用の干渉計(15)であって、前記干渉計(15)が記録面(10)と、前記記録面(10)と光学的に共役な面内に位置する格子(G)とを備え、前記格子は第1および第2光路を画定し、前記光路は異なる回折次数に対応する。
【選択図】図4

Description

本発明は、軸外し干渉計、および軸外しデジタルホログラフィック顕微鏡観察のための装置および方法におけるその使用に関する。
先行技術の干渉計では、入射光線は通常、物体光および参照光に分割され、次いで記録面上で再結合され、そこで物体光および参照光は干渉して干渉縞を生成する。そのような装置の目的は光の複素振幅(すなわち位相および振幅情報)の測定である。
一般的に、そのような測定に用いられる光は、レーザによって生成される光のような高いコヒーレンシを有する。これは、コヒーレントノイズ(スペックル場)の出現および高コヒーレント光源に関連する高コストのような、幾つかの欠点を有する。
多くの場合、米国特許第7002691号明細書に開示されているような低周波の空間的ヘテロダイン干渉縞を得るために、物体光と参照光との間に小さい角度が導入される。この種の構成は、干渉計の軸線と干渉光の1つとの間の非零角度のため、一般的に軸外し構成と呼ばれる。
そのような軸外し構成では、高コヒーレント入射光が干渉を観察することは必須である。参照光と物体光との間の光路長差が入射光線のコヒーレンス長より大きければ、干渉は観察することができず、位相情報は失われる。
これの意味することは、部分的時間的コヒーレント光の場合、小さい角度によって導入される記録面の異なる位置における光路長の差異が、コヒーレンシを破壊するのに充分であり得るので、干渉は記録面の一部分、コヒーレンシが維持された部分でしか観察されないということである。
位相および振幅(または複素振幅)情報の記録はホログラフィ一般の、さらに詳しくはデジタルホログラフィック顕微鏡法(DHM)の基礎である。DHMでは、ホログラムはCCDカメラにより記録され、観察試料の三次元モデルの再構成はコンピュータによって実行される。ホログラムは干渉計の使用によって得られる。この手順は、厚い試料の奥行画像を切片毎に再合焦させるために効率的なツールを提供する。DHMは、生物学的試料の観察のような多くの用途を持つ定量的位相差結像を達成することを可能にする。奥行再構成能力はDHMを3D速度計測の実現のための強力なツールにする。デジタルホログラフィは複素振幅を提供するので、自動再合焦、収差補償、3Dパターン認識、セグメンテーション、および境界処理のような強力な処理方法が実現されるようになった。
分離された物体光および参照光によるデジタルホログラフィの原理は、物体光と参照光との間の記録された干渉パターンから物体光の複素振幅情報を抽出することにある。複素振幅は次いで、デジタル再合焦を計算するため、かつ定量的位相差結像を実行するために処理することができる。オンライン構成および軸外し構成の2種類の主たる構成が存在する。
複素振幅は一般的に、マッハツェンダまたはマイケルソン干渉計のような干渉計を用いることによって得られる。
I.YAMAGUCHIらによって「Phase‐shifting digital holography」、Opt.Lett.22、1268〜1270(1997)に開示された通り、オンライン構成では、カメラセンサに入射する参照光および物体光間の角度はできるだけ小さい。複素振幅の計算には位相ステッピング法が必要であり、そこで物体光および参照光の間に小さい光路の変化を導入して幾つかの干渉画像が記録される。光位相情報は幾つかの干渉画像を公式に取り込むことによって算出される。
オンライン構成の主な不利点は、幾つかの干渉画像を順次記録する必要があり、カメラのフレームレートのため取得速度が制限されることである。実際、数フレームの記録時間を要する完全な取得中、物体は静止していなければならない。
米国特許第6525821号明細書およびTAKEDAらによって「Fourier‐transform method of fringe‐pattern analysis for computer‐based topography and interferometry」、J.Opt.Soc.Am.72、156〜160(1982)に開示されたような軸外し構成では、物体光および参照光の間に非零の平均角度が存在し、それは1つだけの記録された干渉画像から複素振幅を算出することを可能にする。オンライン構成に対して、これは、急速に変化する現象の解析には決定的に有利である。しかし、これらの構成でマッハツェンダまたはマイケルソン干渉計を使用するには、時間的コヒーレンスの高い光源が要求される。さもなければ、物体光および参照光の間の視野全体にわたる可変光学遅延のため、干渉縞変調は一定でなくなる。
DUBOISらによって「Improved three‐dimensional imaging with digital holography microscope using a partial spatial coherent source」、Appl.Opt.38、7085〜7094(1999)に開示された通り、部分的コヒーレント照明の使用は、コヒーレントなアーチファクトノイズを低減することによってホログラフィック記録の品質を改善する。透過におけるもっとも効果的なノイズ低減は、部分的空間的コヒーレント照明を用いることによって得られる。このタイプの照明は、レーザビームのコヒーレンス特性を低下させることによって、または光学フィルタリングシステムによって発光ダイオードのようなインコヒーレント光源の空間的コヒーレンスを増大することによって、得られる。
レーザの空間的コヒーレントを低減するために使用される通常のセットアップにより、レーザビームは可動すりガラスの近くに集束される。すりガラスが所与の位置にある場合、試料の透過光はスペックル場である。すりガラスが移動する場合、露光時間が平均効果を得るのに充分長いと仮定すると、このタイプの光源は部分的空間的コヒーレント光源に匹敵し、その空間的コヒーレンス距離が平均スペックル場に等しいことを示すことができる。光源を準備するこの方法は、軸外し方法を可能にする高度の時間的コヒーレンスを維持する。しかし、短い露光時間が要求される場合、照明のゆらぎが生じる。実際には、短い露光時間を要求する動的物体を記録するために、充分に高速のすりガラスの動きを達成することは困難である。
インコヒーレント光源または非レーザ光源の空間的コヒーレンスを増大させるセットアップにより、時間的インコヒーレンス特性が維持される。そのような場合、軸外し構成を実現することは不可能であり、単一フレームで全複素振幅情報を記録することも不可能である。
試料の位置決めに関して、主に2種類の構成を定義することができる。すなわち、欧州特許第1631788号明細書に開示された、試料が干渉計の前に位置する差動構成、および欧州特許第1399730号明細書に記載された、試料が干渉計の1つのアームに位置する古典的構成である。
論文「resolution‐enhanced approaches in digital holography」、(Optical Measurement ystems for Industrial inspection VI、Proc. Of SPIE、Vol.7389、738905〜1)で、Paturzoらは、解像度を高めるために格子を使用する装置を開示している。開示されたセットアップでは、光学系の開口数を高めるために幾つかの回折光路が使用される。これらの異なる回折光路は記録面に軸をずらして衝突するが、空間的および時間的コヒーレンスは維持されない。これは、本発明の詳細な説明で説明するように、物体面におけるディラックのデルタの形の光強度パルスが全ての光路で記録面全体に同時には到達しないことを意味する。したがって、インコヒーレント光源の場合、記録面の幾つかの部分で位相情報が失われる。
本発明の目的は、先行技術の干渉計の欠点を克服する干渉計を提供することである。
さらに詳しくは、本発明の目的は、部分的コヒーレント光源で機能することのできる軸外し干渉計を提供することである。
本発明の目的は、デジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)構成を提供することでもある。部分的時間および/または空間コヒーレント光源のいずれかを持つ軸外し構成の使用を可能にする。この結果、非常に低いノイズレベルの高速カラー・デジタル・ホログラフィック記録を実現することが可能になる。
本発明のさらなる目的は、軸外し構成のインコヒーレント光源から形成される部分的コヒーレント光源の使用を可能にする、デジタルホログラフィック顕微鏡を提供することである。それは、レーザを持つ構成の結果生じるゆらぎの不利点(コヒーレントノイズ)無く、顕微鏡を高速モードで操作することを可能にするので、著しい改善である。さらに、この実現は、LEDのような低コストの光源の使用を可能にし、赤‐緑‐青のホログラムを同時に記録して、コヒーレントノイズの無いフル・カラー・デジタル・ホログラフィック顕微鏡観察を達成する可能性をもたらす。
本発明の第1態様は、軸外しデジタルホログラフィック顕微鏡観察のための干渉計に関し、前記干渉計は、
‐干渉計の光軸に垂直な記録面と、
‐前記記録面に入射する第1光路および第2光路を画定する光学手段と、
を備え、前記第1および第2光路は非平行であり、
前記光学手段は、前記第1および第2光路に沿って伝搬する部分的時間的コヒーレント光線が干渉して、記録面の位置とは無関係の干渉縞コントラストを生成することができることを特徴とする。
軸外しとは、干渉光線の少なくとも1つが干渉計の軸線に対して非零の角度を有すること、または等価的に、干渉光線が非平行であることを意味する。
特に好適な実施形態では、本発明の干渉計はさらに、以下の特徴の少なくとも1つまたは適切な組合せを開示する。
‐前記光学手段は、回折光線を生成するために、前記記録面と光学的に共役な格子を含む。
‐格子は、ロンキ格子、ブレーズ回折格子、および厚い位相型ホログラフィック格子から成る群から選択される。
‐光学手段はさらに第1レンズを含み、前記格子は前記第1レンズの後焦点面に位置する。
‐光学手段は第2レンズを含み、格子は前記第2レンズの前焦点面に位置する。
‐干渉計はさらに、前記第2レンズに光学的に結合された第3レンズを備え、記録面は前記第3レンズの後焦点面に位置する。
‐干渉計は、微分干渉縞パターンを生成するために、第1および第2光路の少なくとも1つを伝搬する光線によって記録面上に生じるパターンのシフトを誘発するように、第1および第2光路の少なくとも1つに位置するウェッジをさらに備える。
‐干渉計は、過剰な回折光線を阻止するために光学絞りをさらに備える。
光学系で共役する2つの面とは、面の一方が他方の面の光学画像であることを意味する。
代替的に、本発明の軸外しデジタルホログラフィック顕微鏡観察用の干渉計は、
‐記録面と、
‐前記記録面と光学的に共役な面内に位置する格子と、
を備え、前記格子は第1および第2光路を画定し、前記光路は異なる回折次数に対応する。
dの周期性を有する格子は入射光線を、次の条件を満たす幾つかのビームに分割する。
Figure 2013507647
ここでθmは回折光線と格子法線との間の角度であり、θiは入射光線と格子法線との間の角度であり、λは光波長であり、mは「回折次数」と呼ばれる整数である。直接透過(または反射格子の場合、正反射)に対応する光は零次と呼ばれ、m=0と表わされる。他の光線は、非零の整数mで表わされる角度に発生する。mは正数または負数とすることができ、結果として零次光線の両側に回折次数になることに留意されたい。
前記干渉計はさらに第1レンズを備え、前記格子は前記第1レンズの後焦点面に位置することが好ましい。
前記干渉計はさらに第2レンズを備え、格子は前記第2レンズの前焦点面に位置することが有利である。
前記干渉計は前記第2レンズに光学的に結合された第3レンズをさらに備え、前記記録面は前記第3レンズの後焦点面に位置することが好ましい。
干渉計は、微分干渉縞パターンを生成するために、第1および第2光路の少なくとも1つを伝搬する光線によって記録面上に生じるパターンのシフトを誘発するように、第1および第2光路の少なくとも1つに位置するウェッジをさらに備えることが好ましい。
前記干渉計は、使用中に、格子によって生じる過剰な光線を阻止する光学絞りを備えることが有利である。
本発明の第2態様は、
‐上述した干渉計と、
‐顕微鏡対物と、
‐前記顕微鏡対物の前焦点面に位置する、検査対象の試料を保持することのできる対物セルであって、前記記録面と光学的に共役する前記対物セルと、
‐第1の部分的コヒーレント光線を生成することのできる部分的コヒーレント光源と、
を備えたデジタルホログラフィック顕微鏡に関する。
特に好適な実施形態では、本発明のデジタルホログラフィック顕微鏡はさらに、以下の特徴の少なくとも1つまたは適切な組合せを開示する。
‐対物セルは第1光線によって照明され、前記顕微鏡対物は干渉計の前に位置する。
‐デジタルホログラフィック顕微鏡はさらに以下を含む。
○第1ビームスプリッタおよび第2ビームスプリッタを含むマッハツェンダ干渉計。前記第1ビームスプリッタは前記第1光線を第2光線および第3光線に分割することができる。
○前記第3光線を前記格子に集束させるために前記第3光線の光路に位置する第1レンズ。
○第1レンズと同一光軸を有し、少なくとも1つの非零次の回折光線を生成するために格子の焦点距離に位置する第2レンズ、および前記第2光線および前記回折光線を再結合して再結合ビームにするように構成された前記第2ビームスプリッタ。
○前記第3光線の零次回折光を阻止するための光学絞り。
○第2光線と回折光線との間の相互作用によって生じる干渉信号を記録することのできる記録手段であって、前記干渉計の記録面に位置する前記記録手段。
○上述の通り干渉計を形成する、前記再結合ビームを前記記録手段上に集束されるための集束手段、第1レンズ、第2レンズ、および格子、ならびに本質的に同等(格子および光学絞りを除く)の第2および第3光線の光路。
‐試料ホルダおよび顕微鏡対物は第1ビームスプリッタの前に位置し、差動ホログラフィック構成を画定する。
‐試料ホルダおよび顕微鏡対物は第2光線の光路内に位置する。
‐第2顕微鏡対物は第3光線の光路内に位置する。
‐デジタルホログラフィック顕微鏡は、第2光線および第3光線の光路を等しくするための補償手段をさらに備える。
‐前記補償手段は、試料ホルダを補償するための手段、ならびに/または第1レンズおよび第2レンズを補償するための2つのレンズを含む。
‐デジタルホログラフィック顕微鏡は、反射物体を照明するために第2光線光路に位置する第3ビームスプリッタ、および参照ミラーを照明するために第3光線光路に位置する第4ビームスプリッタをさらに備え、マッハツェンダのジオメトリを画定する。
‐部分的コヒーレント光源は、LED、ガス放電ランプ、およびパルスレーザから成る群から選択された照明手段を含む。
‐部分的コヒーレント光源は、好ましくはそのスペクトル幅を低減させるためにフィルタリングされた、熱光源を含む。
‐部分的コヒーレント光源は、第1照明レンズ、スクリーンにおける針穴、部分的コヒーレント光線を生成するための第2照明レンズをさらに含む。
‐前記記録手段は感色性記録手段であり、光源はカラー・ホログラフィック・インターフェログラムを記録するために少なくとも3つの別個の波長を同時に生成し、好ましくは、別個の波長は色再現のためのシアン、マゼンタ、およびイエロ(CMY)、または赤・緑・青(RGB)に対応する。
‐前記光源は異なる波長の少なくとも3つのLEDを含む。
‐デジタルホログラフィック顕微鏡は、前記試料ホルダに光学的に結合された蛍光励起源をさらに備える。
‐デジタルホログラフィック顕微鏡は、励起源に由来する光が透過して記録面に達するのを防止するバリアフィルタをさらに備える。
「本質的に同等」とは、第2および第3光線の光路が、光源のコヒーレンス長未満の位相シフトを誘発することを意味する。これは、光路長を均等化することによって、かつ格子、光学絞り、および最終的に観察対象物体を除いて両方の経路上で光源から同一距離に同一光学能動素子を導入することによって、得ることができる。
本発明の第3態様は、2つの非平行の部分的時間的コヒーレント光線の間で干渉縞コントラストを生成するための方法に関し、前記方法は、
‐部分的時間的コヒーレントである入射光線を提供するステップと、
‐少なくとも2つの回折光線を生成するために、前記入射光線を格子上に集束させるステップと、
‐入射光線に平行な平行回折光線を得るために、前記回折光線を無限遠に集束させるステップと、
‐前記平行回折光線を前記記録面上に集束させ、記録面内の位置に関係なく干渉縞コントラストを生成するステップと、
を含む。
回折光線は零次または非零次の回折光線とすることができ、非零次の光線は軸外し光線を生じる。
本発明の第4態様は、
‐第1の部分的コヒーレント光線を生成する部分的コヒーレント光源を提供するステップと、
‐第1の部分的コヒーレント光線を第2光線および第3光線に分割するステップと、
‐前記第3光線を非零次回折光線および零次回折光線に分割するために第3光線を格子に集束させるステップと、
‐平行かつ空間的に分離された非零回折光線および零次回折光線を得るために、非零次回折光線および零次回折光線を無限遠に集束させるステップと、
‐零次回折光線を阻止するステップと、
‐非零回折光線を第2光線と結合して再結合ビームを生成するステップと、
‐再結合ビームを記録手段上に集束させて、軸外しインターフェログラムを得るステップと、
を含む、軸外しデジタルホログラムを記録するための方法に関する。
図1は、面内の2つの割線干渉ビーム間のコヒーレンシの限界を示す模式図である。
図2は、本発明に係る干渉計を表わす模式図である。
図3は、本発明に係る干渉計を備え、差動モードで動作する透過デジタルホログラフィック顕微鏡を表わす模式図である。
図4は、本発明に係る干渉計を備えた透過デジタルホログラフィック顕微鏡を表わす模式図である。
図5は、本発明に係る干渉計を備えた反射デジタルホログラフィック顕微鏡を表わす模式図である。
図6は、本発明に係る干渉計を備え、差動モードで動作する透過デジタルホログラフィック顕微鏡を表わす模式図である。
図7は、本発明に係る干渉計を備え、蛍光能力を持つ透過デジタルホログラフィック顕微鏡を表わす模式図である。
干渉法で、部分的コヒーレント光を使用する場合、決定的に重要なことは、干渉縞が観察されるように記録面の入射光のコヒーレンスを維持することである。多くの場合、干渉縞は、第1(入射)光線を第2および第3光線に分割し、かつ第3および第2光線をそれらの間に小さい角度を導入して再結合することによって得られる。
その場合、部分的コヒーレント入射光(解析対象の光)の小さいコヒーレンス長は強い制限を導入する。すなわち、両ビームのコヒーレンス面は非平行であるので、それらは両方の面間の交差部の小さい領域でしか干渉することができず、コヒーレンス面間の距離がコヒーレンス長より大きいときには干渉が観察されない。
これを図1に図解する。図中、面に垂直な光線は、面からの軸外れαの別の非平行な光線と干渉する。描かれる通り、非平行光はコヒーレンシ面14の近傍の、干渉が観察される制限領域13を画定するコヒーレンス長12より小さい距離のみで、コヒーレント(干渉可能)である。
本発明は、干渉光線のコヒーレンス面が記録面の近傍で光線の伝搬方向に垂直でない干渉計を開示する。この結果、非垂直光線は垂直光線と干渉して、記録面の位置とは無関係に干渉縞コントラストを生成することが可能になる。これは、LED、ガス放電ランプ等によって生成される光のような、制限されたコヒーレンス長を有する光の場合でさえも、軸外し干渉縞(空間的ヘテロダイン縞)を記録することを可能にする。
第1(入射)光線として部分的時間的コヒーレント光線を使用して、先行技術の干渉計における第2および第3光線は、コヒーレンス長によって画定される対応するゾーンのみで干渉することができる。これは、第2および第3光線間の光路上の光学素子による光路長の差および位相シフトを、光源のコヒーレンス長より小さく維持しなければならないことを意味する。
時間的コヒーレンスは、時間間隔τだけ離れた任意の対の時間における光波の値間の平均相関の尺度である。それは、光波が異なる時間にそれ自体と干渉することができるか否かを特徴付ける。その間に位相または振幅が有意の量変化する(したがって相関が有意の量低下する)時間間隔をコヒーレンス時間τと定義する。τ=0でコヒーレンス度は完全であるが、時間間隔τでコヒーレンス度はかなり低下する。コヒーレンス長Lは光波が時間τで移動する距離と定義される。コヒーレンス長は次式によって推算することができる。
Figure 2013507647
ここでλは光波長であり、Δλは光源のスペクトル幅であり、nは伝搬屈折率である。典型的なLED光源の場合、これは数波長ないし数十波長を表わす。例えば、650nmの波長および15nmのスペクトルバンド幅(市販のLEDの典型値)を有するLEDの場合、コヒーレンス長は約20λである。これは、軸外し参照光が記録面内のどの場所でもコヒーレンス時間より大きい位相シフトを持つことができないことを意味する。これはまた、参照光と物体光との間の角度差によって誘発される縞の数が約20を超えることができないことをも意味し、それは強い制限である。
制限されたコヒーレンス時間はまた、超短パルスレーザのパルス幅からも生じることがある。典型的に、そのようなパルスレーザは数フェムト秒のパルス幅を有し、したがってパルス幅は数波長に制限される。その場合、コヒーレンス時間はパルス幅に等しい。再び、これは、参照光と物体光との間の角度差によって誘発される縞の数が、パルス長を表わす波長数を超えることができないことを意味する。
好ましくは、どちらの場合もこの制限を回避するために、本発明は、記録面における干渉ビームの時間的コヒーレンスを破壊することなく、軸外し参照光を生成するために、回折格子の特定の特性を利用する。
本発明の干渉計15では、回折格子Gが、入射光線9の光軸上に配置されたレンズL5の後焦点面に配置される。格子Gは、入射光線9の回折光線5(参照)および非回折光線7(結局は物体光)への分割を誘発する。次いで、格子Gの焦点距離に配置された第2レンズL6は、回折光線および非回折光線の両方を光軸に平行な光線に整形する。L5、L6、および格子Gは、L6の背後に、空間的に分離された2つの光線、回折光線および非回折光線が得られるように選択される。非回折光線は物体光になるか、または光学絞りによって排除される。後者の場合、後述するように、より大きい光学的構造によって別の物体光を提供することができる。回折光線は次いで物体光と再結合され、対物レンズL7によって記録面上に集束され、記録面はL7の後焦点面に位置する。
回折光線はL7の光軸と平行であるが、この光軸上に心合せされておらず、L7は前記回折光線に軸外し角度をもたらす。
代替的に、干渉光線は、異なる回折次数を有する任意の対の回折光線とすることができる。例えば、+1次の回折光線は参照光として選択することができ、かつ−1次の対称回折光線は物体光として選択することができる。
光学絞りを使用して、記録面上で干渉するように選択された2つの回折光線以外は全部阻止することが好ましい。
そのような構成では、格子は非零次回折光線の時間的コヒーレンスを乱さないことを示すことができる。時間的コヒーレンスは光路伝搬に関係する。したがって、それは、L5およびL4の後焦点面を任意の時間に照射する光学的時間的パルスは同時に、L7の後焦点面全体を照射することを実証することと同等である。
その透明度がg(x,y)=(1+sin Kx)/2によって定められる格子Gは、振幅Aの単色平面波によって照射されると考えよう。レンズL6‐L7の対が無限焦点系である(L6‐L7が4f型のシステムを形成する)と仮定すると、記録面の振幅は、次式によって得られる。
Figure 2013507647
式中、Bは重要な役割を果たさない定数であり、j=√−1であり、νは光周波数であり、cは真空中の光の速度であり、f、fはL6およびL7の焦点距離である。記録面における1回折光線のみの寄与を計算すると、方程式(1)は次のようになる。
Figure 2013507647
式中、Κ=2π/Λであり、Λは格子の空間的周期である。B′は重要な役割を果たさない定数である。
デルタダィラック形時間的パルスによる照度は、方程式(2)のフーリエ変換を実行することによって得られる。
Figure 2013507647
式中、tは時間であり、方程式(3)は、L6の前焦点面の空間的に均一な光パルスが、
位置(x,y)によって異なる時間間隔無しに、L7の後焦点面のあらゆる位置に同時に到達することを表わす。指数部は、光線が光軸に対して傾斜角度でセンサ面に入射することを表わす。本発明の干渉計の光路が均等化されたとき、したがってセンサの面全体で物体光と参照光との間の干渉パターンを記録することが可能になる。参照光の傾斜角度は軸外し構成をもたらす。
前記格子の実証された特性は非回折光線には関係しないので、記録面10と共役な面内に位置する格子Gを含む開示されたセットアップは、任意の軸外しセットアップに使用することができる。この共役は、例えば2つのレンズL5、L6の間の格子および焦点レンズL7を持つ4f型システムを使用することによって得ることができる。
この段階で、今やそのコヒーレンシ面が記録面と平行な回折光線は、同等の光路を有しかつそのコヒーレンシ面が記録面と平行な任意の光線と干渉することができることに気付くことができる。さらに詳しくは、それは非回折光線と干渉することができるだけでなく、光路の差が入射光のコヒーレンス長を超えないことを前提として、他の次数の回折光線、またはより大型のマッハツェンダもしくはマイケルソン干渉計の別のアームを通過する光線とも干渉することができる。
本発明の軸外しデジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)では、デジタルホログラムは部分的コヒーレント光源を用いて記録される。そのような部分的コヒーレント光源を得るために、LEDのようなインコヒーレント光源を使用することができる。入射する光の位相情報の決定を可能にするために必要な干渉縞を観察するのに必要な部分コヒーレンスを得るため、空間フィルタを使用することができる。
本発明に係る干渉計15を使用した顕微鏡の第1実施例を図3に表わす。この図では、LEDのような部分的コヒーレント光源Soが、レンズL1の後焦点面に位置する。生成された光線は次いで、その空間的コヒーレンシを高めるために、スクリーンの針穴Pを介して空間的にフィルタリングされる。試料Saに照射するために、針穴PはレンズL2の後焦点面に位置する。試料Saは顕微鏡対物ML1の後焦点面に位置し、次いで、前述の通り干渉計15がその後に続く。この図のホログラムはCCDカメラによって記録される。
後者の場合、参照によって本書に援用する欧州特許第1631788号明細書に記載された通り、差動インターフェログラムを得るため、回折および非回折光線によって生成された画像のわずかなシフトを誘発するために、第2または第3光線のうちの1つの光路内にウェッジWを挿置することが好ましい。この場合、回折光線内のウェッジによって導入される位相シフトを補償するために、非回折光線の光路内に補償手段11を導入することが好ましい。
代替的に、干渉計15は、図4ないし7に表わされたDHMに表わされるように、マッハツェンダ干渉計のようなより大型の光学的構造に導入することができる。そのような場合、非回折光線15は光学絞り8によって阻止され、物体光は別の光路、例えばマッハツェンダ干渉計の別のアームによって提供される。
通常のホログラフィック顕微鏡の場合と同様に、非回折光線6′を光学絞り8によって阻止して干渉パターンを得るために、第1光線1は、第1ビームスプリッタBS1によって第2光線2および第3光線3に分割され、かつ第2ビームスプリッタBS2によって再結合されて再結合ビームになり、前記第2および第3光線は再結合ビームで干渉し、CCDセンサのような記録媒体上に干渉パターンを形成する。そのような場合、軸外し構成を得るために、本発明の干渉計15はマッハツェンダ干渉計の参照アーム内に挿置される。
レンズL5およびL6の存在は、前記レンズL5およびL6によって誘発される位相変化を補償するために、物体光経路上のレンズL3およびL4によって補償することが好ましい。
物体光および参照光を再結合するために使用されるレンズL7は、マッハツェンダ干渉計のビームスプリッタBS2の後に配置することが好ましい。これは、前記レンズL7を物体光および参照光の間で共用することを可能にする。
代替的に、レンズL7は、参照光の光路および物体光の光路にそれぞれ位置する2つのレンズに置き換えることができ、両レンズは記録手段に合焦するが、再結合手段の前に位置する。
蛍光励起光源を含む構成は、図7に表わすように実現することもできる。
位相シフトを使用する必要がないので、開示されたDHMは、高速動的事象を記録し、観察対象試料の3D表現の時間系列を記録するように幾つかの連続フレームを記録するために、使用することができる。
この実現はLEDのような低コスト光源の使用を可能にし、かつカラーセンサにより、コヒーレントノイズの無いフル・カラー・デジタル・ホログラフィック顕微鏡観察を達成するように、LED3個の照明を使用することによって、赤‐緑‐青ホログラムの同時記録を可能にする。今まで、カラー・デジタル・ホログラフィック顕微鏡観察の実現には複雑な記録プロセスを使用する必要があった。開示する発明では、三色を同時に記録することができる。
カラーCCDおよびトリプルセンサ設計のような単一カラーセンサを含め、数種類のカラーセンサが市販されている。トリプルセンサ設計では、プリズムブロック(すなわち2つのダイクロイックプリズムを含むトリクロイックアセンブリ)が、得られたインターフェログラムを三原色の赤、緑、および青にフィルタリングし、各色をプリズムの各面に取り付けられた別々の電荷結合素子(CCD)または能動画素センサ(CMOS画像センサ)に方向付けることができる。
実現することのできる数種類の透過型格子がある。最も単純な格子のタイプはロンキ格子であり、それは幅1の不透明な平行線が印刷された透明な光学板によって構成される。連続した不透明な線の間に一定の透明な空間Lが存在する。ロンキ格子はしばしば不透明な開口幅に等しい透明な開口幅を有する。ロンキ格子および所与の波長に対する回折角を特徴付ける有意の量は格子周期P=L+1である。ロンキ格子の回折解析は、最初に透過関数をフーリエ級数に従って分解することによって実行される。所与の波長に対し、各フーリエ成分は回折角θmによって特徴付けられる回折次数をもたらす。ここでmは整数であり、θは第1回折角である。
各回折次数における回折振幅は対応するフーリエ成分に比例する。本発明の干渉計15では、格子周期は、光学絞り8が配置された面内の回折光線の空間的分離を保証するために選択される。
通常、検出器に入射する参照光に対して維持されるのは1次の回折次数の1つ(m=+1または−1)である。ロンキ格子の限界は、幾つかの回折次数の間で光強度が拡散し、したがって干渉計測に利用可能な光が低減されることである。
ホログラフィックプロセスに維持される回折次数における回折効率を最適化するために、ブレーズ回折格子を実現することができる。ブレーズ回折格子もまた、光学板の表面の1つに周期的構造を有する。この場合、m=1またはm=−1の回折次数における回折効率を最適化するのは、表面の歯形レリーフである。
回折効率を最適化するために、厚い位相ホログラフィック格子を実現することも可能である。このタイプの格子は、感光性材料、例えば重クロム酸ゼラチンに、2つの平面波間の干渉パターンを記録することによって得られる。その後、板を処理し、ブラッグ回折モードに従って回折次数の光をほとんど回折させることができる。記録平面波間の角度は格子周期を決定する。
次いでアナログ出力をデジタル化し、試料の三次元カラー表現を得るためにコンピュータで処理することができる。
部分的時間および空間光源は、光源(So)、視準レンズ(L1)、針穴(P)、およびレンズ(L2)によって構成することができる。時間的コヒーレンスは、光源(So)のスペクトル幅から生じる。典型的には、それはピーク(例えば波長λ=650nm、Δλ=15nm)を有するスペクトルを持つLED、またはカラーホログラフィック記録を達成するために1組のピークをもたらす1組のLEDとすることができる。光線は、空間的コヒーレンスを高めるために、レンズ(L1)によって視準され、針穴(P)によってフィルタリングされる。レンズ(L2)から現われる出現空間コヒーレンス依存性は、均一であり、コヒーレンス関数γ(x−x,y−y)によってモデル化することができることを示すことができる。ここで(x,y)および(x,y)は、光軸zに垂直な空間座標である。
部分的コヒーレント光源のこの実現は制限ではなく、可動すりガラスによる無相関レーザビームを用いるなど、他の方法で実現することができる。
本発明の好適な実施形態
マッハツェンダ構成
部分的空間および時間コヒーレンスの光源による軸外し記録を可能にする、マッハツェンダ構成に基づくデジタルホログラフィック顕微鏡のスキームを図4に示す。
図4の事例では、光源は光源(So)、視準レンズ(L1)、針穴(P)、およびレンズ(L2)によって構成される。
ミラーM1による反射の後、光線はBS1によって、透過中の試料を照射する物体光、および顕微鏡レンズML2に向かって再方向付けされる参照光に分割される。M11の前焦点面の結像は、レンズM11、L3、L4、およびL7の組によって実行される。像を形成するために、L3の後焦点面はL4の前焦点面と一致し、L7の後焦点面にセンサが位置する。
この構成では、本発明の干渉計15はレンズL5、L6、およびL7、ならびに格子Gによって表わされる。
レンズM11、L3、およびL4は、試料、格子G、および光学絞り8を除いて、参照光および物体光がほぼ同一となるように、参照アームにそれらと対を成す相手であるレンズM12、L5、L6をそれぞれ有する。これは、2つのビームが干渉するセンサ上における2つのビームの適切な位置合せを保証する。これは、照射の部分空間コヒーレント性によって要求される。
光路補償器および/または減衰器とすることのできる任意選択的構成部品Cが位置するM12レンズの前焦点面は、L5の後焦点面に結像され、それはL6の前焦点面でもあり、そこに格子Gが位置する。格子の役割は、L7の入射物体光および参照光が空間的に分離されて平行に伝搬するように、回折によって光を再方向付けることである。すでに実証した通り、L5、G、L6、およびL7によるこのセットアップは、部分的な時間的コヒーレンスの場合にセンサ面で時間的コヒーレンスを維持し、軸外し干渉を生成することを可能にする。
レンズL7は、センサ上で物体光および参照光を、格子回折から生じるそれらの間の平均角度で重ね合わせる。この構成では、ミラーM2はBS2と平行であり、M3はBS1と平行である。ビームスプリッタおよびミラーのこの相対的方向性は、ミラーM2およびビームスプリッタBS2が不動に取り付けられた回転アセンブリRAを回転させることによって、センサ上の光線の位置を変化させることなく光路を調整することを可能にする。したがって該構成は、参照光路および物体光路の光線を均等化することを可能にする。
この構成は、図5に表わすように、反射性試料に適応させることができる。その場合、試料ホルダSaは取り外され、ミラーM2は、対物レンズML1を介して反射性試料Rsを照射する第3ビームスプリッタBS3に置き換えられる。試料によって反射し、対物レンズによって集束された光は次いで、前の構成と同様に、第3ビームスプリッタBS3によって第2ビームスプリッタに向かって再方向付けされる。同じ変更は、試料を参照ミラー16によって置き換えて、参照光の光路にも適用される。
差動構成
マッハツェンダ構成は、物体によって導入される光路の変動が制限される用途に適している。物体の厚さが非常に変動する場合、干渉縞の密度が高くなりすぎて、センサによって記録することができない。
加えて、時間的部分的照射の低減により、マッハツェンダ構成では、物体が変化したときの光路の微調整が難しくなることがあり得る。そうした理由から、差動デジタルホログラフィック顕微鏡が提案された。後者の場合、計測されるのは差動光位相であり、試料の厚さに関係なく、位相計測のダイナミックレンジの増大および干渉計の永久調整という利点がもたらされる。
空間的および部分的時間的コヒーレント光源を持つ軸外し構成は、差動モードで使用することができ、有利である。光学的スキームを図6によって表わす。
部分的時間的および空間的コヒーレント光源は、光源(So)、視準レンズ(L1)、針穴(P)、およびレンズ(L2)によって構成される。光線は、空間的コヒーレンスを高めるために、レンズ(L1)によって視準され、針穴(P)によってフィルタリングされる。
ミラーM1による反射の後、光線は試料を照射し、顕微鏡レンズM11によって透過される。M11から出てきた光線は次いでBS1によって、第2および第3光線に対応する2つの光線に分割される。試料の内部に位置するM11の前焦点面の結像は、レンズM11、L3、L4、およびL7の組によって実行される。その目的のために、L3の後焦点面はL4の前焦点面と一致し、センサはL7の後焦点面に位置する。同様に、M11の前焦点面の結像は、レンズM11、L5、L6、およびL7の組によって実行され、L3の後焦点面はL4の前焦点面と一致する。L4およびL7の間の距離は、L6およびL7の間の距離と同一である。
したがって、M11の前焦点面と一致する試料面の1つと同一の平面は、CCDセンサ上に結像される。わずかに回転するミラーM2またはミラーM3によって、第2および第3光線により形成される像の間にシフトが導入される。それはCCDセンサの数画素のみのシフト、または1画素未満のシフトでさえある。第1光路1のレンズL3およびL4と対を成す相手、すなわちそれぞれレンズL5、L6は、試料、格子G、および光学絞り8を除いて第2および第3光線両方の光路が同一となるように、第3光線の光路に位置する。これにより、2つの光路が干渉するセンサ上で2つの光路が小さいシフトを持つ適切な位置合せが可能になる。
M11レンズの前焦点面は、L5の後焦点面に結像され、それは格子Gが位置するL6の前焦点面でもある。格子の役割は、L7における2つの光路の入射光線が空間的に分離されるように、回折によって光を再方向付けすることである。レンズL7は、センサ上で2つの光線を、格子回折から生じたそれらの間の平均角度で重ね合わせる。この構成では、ミラーM2はBS2とほぼ平行であり、M3はBS1とほぼ平行である。ビームスプリッタおよびミラーのこれらの相対的方向性は、ミラーM2およびビームスプリッタBS2が不動に取り付けられた回転アセンブリRAを回転させることによって、センサ上の光線の位置を変化させることなく光路を調整することを可能にする。したがって該構成は、参照光路および物体光路の光線を均等化することを可能にする。
センサ上の物体光および参照光の間の平均角度は、軸外し構成をもたらす。すでに実証した通り、時間的部分的コヒーレンス光源の場合でさえも、CCDセンサ全体に強調された干渉縞パターンを均質的に提供するために、適切な位置合せが存在する。格子に起因する光の損失を補償するために、減衰器を第2光線の光路に配置することができることに留意する必要がある。減衰器によって2つの光路の間に導入される光路差を補償するように、透明な光学板を第3光線の光路に挿置することができる。
関心のある試料が図7に表わすように蛍光を発する場合、蛍光源17を使用することができる。その光線はレンズM1lを介して蛍光ビームスプリッタによって反射され、試料を照射する。逆伝搬する蛍光信号はM11によって透過され、BS1に入射する前に蛍光励起部を除去するために、SFによって分光的にフィルタリングされる。レンズM11は口径によって制限されるので、インコヒーレント蛍光信号はM11から出射するときには空間的部分的コヒーレントであり、その結果、2つの光線は、シフトが空間的コヒーレンス長のそれより小さい限り、干渉することができる。
本発明は、第09172561.4号の出願番号を有する優先権欧州出願にも詳細に記載されており、その開示内容全体を参照によって本書に援用する。
1.第1光線
2.第2光線
3.第3光線
4.記録手段
5.回折光線(非零次回折)
6.非零次回折平行光線
6′.零次回折平行光線
7.非回折光線(または零次回折)
8.光学絞り
9.入射光線
10.記録面
11.ウェッジを補償するための補償手段
12.2*コヒーレンス長
13.干渉領域
14.コヒーレンシ面
15.本発明の干渉計
16.参照ミラー
17.蛍光励起光源
BSl,BS2,BS3およびBS4:ビームスプリッタ
EF:励起フィルタ
G:格子
LI,L2,L3,L4,L5,L6およびL7:レンズ
Ml1およびMl2:顕微鏡対物
Ml,M2およびM3:ミラー
P:スクリーンの針穴
Sa:透過型試料または試料ホルダ
SF:スペクトルフィルタ
So:照明光源
RA:回転アセンブリ
Rs:反射試料または試料ホルダ
W:ウェッジ

Claims (18)

  1. 軸外しデジタルホログラフィック顕微鏡観察用の干渉計(15)であって、前記干渉計(15)が
    ‐記録面(10)と、
    ‐前記記録面(10)と光学的に共役な面内に位置される格子(G)と、
    を備え、前記格子(G)は第1および第2光路を画定し、前記光路は異なる回折次数に対応する、干渉計。
  2. 前記干渉計は第1レンズ(L5)をさらに備え、前記格子(G)は前記第1レンズの後焦点面に位置される、請求項1に記載の干渉計。
  3. 前記干渉計は第2レンズ(L6)をさらに備え、前記格子(G)は前記第2レンズ(L6)の前焦点面に位置され、前記干渉計は前記第2レンズ(L6)に光学的に結合された第3レンズ(L7)をさらに備え、前記記録面(10)は前記第3レンズ(L7)の後焦点面に位置される、請求項2に記載の干渉計。
  4. 前記干渉計は、使用中に、格子(G)によって生じる過剰な光線を阻止することができる光学絞り(8)をさらに備える、請求項1〜3のいずれかに記載の干渉計。
  5. ‐請求項1〜4のいずれかに記載の干渉計(15)と、
    ‐顕微鏡対物(ML1)と、
    ‐前記顕微鏡対物(ML1)の前焦点面に位置される、検査対象の試料を保持することのできる対物セル(Sa)であって、前記記録面(10)と光学的に共役される前記対物セル(Sa)と、
    ‐第1の部分的コヒーレント光線(1)を生成することのできる部分的コヒーレント光源と、
    を備えたデジタルホログラフィック顕微鏡。
  6. 対物セル(Sa)は第1光線(1)によって照明され、前記顕微鏡対物(ML1)は干渉計(15)の前に位置され、ウェッジ(W)は差動ホログラムを生成するために前記干渉計の第2光路に位置される、請求項5に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  7. ‐第1ビームスプリッタ(BS1)および第2ビームスプリッタ(BS2)を含むマッハツェンダ干渉計であって、前記第1ビームスプリッタ(BS1)は前記第1光線を第2光線(2)および第3光線(3)に分割することができる;
    ‐前記第3光線(3)を前記格子(G)に集束させるために前記第3光線(3)の光路に位置される第1レンズ(L5);
    ‐第1レンズ(L5)と同一光軸を有し、かつ少なくとも1つの非零次の回折光線を生成するために格子(G)の焦点距離に位置される第2レンズ(L6)であって、前記第2ビームスプリッタ(BS2)が前記第2光線および前記回折光線を再結合して再結合ビームにするように構成される;
    ‐前記第3光線の零次回折光を阻止するための光学絞り;
    ‐第2光線と回折光線との間の相互作用によって生じる干渉信号を記録することのできる記録手段であって、前記記録手段は前記干渉計(15)の記録面に位置される;
    ‐前記再結合ビームを前記記録手段上に集束するための集束(L7)手段、
    をさらに備え、第1レンズ(L5)、第2レンズ(L6)、および格子(G)が請求項1〜4のいずれかに記載の干渉計を形成し、第2光線(2)および第3光線(3)の光路が本質的に同等である、請求項5に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  8. 試料ホルダ(Sa)および顕微鏡対物は第1ビームスプリッタ(BS1)の前に位置され、差動ホログラフィック構成を画定する、請求項7に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  9. 試料ホルダおよび顕微鏡対物(Ml1)は第2光線(2)の光路内に位置される、請求項7に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  10. 第2顕微鏡対物(Ml2)は第3光線(3)の光路内に位置される、請求項9に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  11. 反射物体(Ra)を照明するために第2光線の光路に位置される第3ビームスプリッタ(BS3)、および参照ミラー(16)を照明するために第3光線の光路に位置される第4ビームスプリッタ(BS4)をさらに備え、マッハツェンダのジオメトリを画定する、請求項7に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  12. 部分的コヒーレント光源は、LED、ガス放電ランプ、熱光源およびパルスレーザから成る群から選択された照明手段(So)を含む、請求項6〜12のいずれかに記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  13. 前記記録手段は感色性記録手段であり、光源はカラー・ホログラフィック・インターフェログラムを記録するために少なくとも3つの別個の波長を同時に生成する、請求項5〜12のいずれかに記載のデジタルホログラフィック顕微鏡
  14. 前記光源は異なる波長の少なくとも3つのLEDを含む、請求項13に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  15. 別個の波長は色再現のためのシアン、マゼンタ、およびイエロ(CMY)、または赤・緑・青(RGB)に対応する、請求項13または14に記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  16. 前記試料ホルダに光学的に結合された蛍光励起源(17)をさらに備える、請求項5〜15のいずれかに記載のデジタルホログラフィック顕微鏡。
  17. 2つの非平行の部分的時間的コヒーレント光線の間で干渉縞コントラストを生成するための方法であって、前記方法は、
    ‐部分的時間的コヒーレントである入射光線(9)を提供するステップと、
    ‐少なくとも2つの回折光線(5,7)を生成するために、前記入射光線を格子(G)上に集束させるステップと、
    ‐入射光線(9)に平行な平行回折光線(6,6′)を得るために、前記回折光線を無限遠に集束させるステップと、
    ‐前記平行回折光線を前記記録面上に集束させ、記録面内の位置に関係なく干渉縞コントラストを生成するステップと、
    を含む、方法。
  18. 軸外しデジタルホログラムを記録するための方法であって、前記方法は、
    ‐第1の部分的コヒーレント光線(1)を生成する部分的コヒーレント光源を提供するステップと、
    ‐第1の部分的コヒーレント光線を第2光線(2)および第3光線(3)に分割するステップと、
    ‐前記第3光線(3)を非零次回折光線(5)および零次回折光線(7)に分割するために第3光線(3)を格子(G)に集束させるステップと、
    ‐平行かつ空間的に分離された非零回折光線(6)および零次回折光線(6′)を得るために、非零次回折光線および零次回折光線を無限遠に集束させるステップと、
    ‐零次回折光線を阻止するステップと、
    ‐非零回折光線(6)を第2光線(2)と結合して再結合ビームを生成するステップと、
    ‐再結合ビームを記録手段上に集束させて、軸外しインターフェログラムを得るステップと、
    を含む、方法。
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