BR112012007766B1

BR112012007766B1 - Microscópio holográfico digital fora do eixo e método para registrar hologramas digitais fora do eixo

Info

Publication number: BR112012007766B1
Application number: BR112012007766-0A
Authority: BR
Inventors: Frank Dubois; Catherine Yourassowsky
Original assignee: Universite Libre De Bruxelles
Priority date: 2009-10-08
Filing date: 2010-10-05
Publication date: 2021-11-09
Also published as: IN2012DN01700A; US9207638B2; CN102576209A; CA2772735A1; BR112012007766A2; WO2011042442A1; KR101817110B1; JP2013507647A; US20120200901A1; CN102576209B; JP5914340B2; CA2772735C; KR20120093270A

Abstract

interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo, microscópio holográfico digital, processo para a produção de um contraste de margens entre dois feixes de luz parcialmente coerente e processo para registar hologramas digitais fora do eixo a presente invenção tem por objecto um interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo (15) compreendendo: um plano de registo (10); - um retículo (g) localizado num plano conjugado oticamente com o referido plano de registo (10), definindo o referido retículo (g) um primeiro e um segundo trajeto ótico, correspondendo o referido trajeto ótico a diferentes ordens de difração.

Description

Âmbito da invenção

[0001] A presente invenção tem por objeto um interferómetro fora do eixo e a sua utilização num aparelho assim como um processo para microscopia holográfica digital fora do eixo.

Estado da técnica

[0002] Nos interferómetros da técnica anterior, um feixe de luz incidente é geralmente dividido num feixe objeto e num feixe referência e, em seguida, recombinam-se num plano de registro em que o feixe objeto e o feixe referência interferem, produzindo margens de interferência. O objetivo desses dispositivos é a medição da amplitude complexa da luz (isto é, a informação sobre a fase e a amplitude). Geralmente, a luz utilizada em tal medição tem uma coerência elevada, tal como a luz produzida por lasers. Isto tem várias desvantagens, tais como o aparecimento de ruído coerente (campo de “speckle”) e o elevado custo associado com fontes de luz altamente coerentes.

[0003] Em muitos casos, introduz-se um pequeno ângulo entre o feixe objeto e o feixe referência a fim de se obter margens espacialmente heteródinas de baixa frequência, tais como as descritas na US7002691. Estes tipos de configurações são geralmente designados por configurações fora do eixo devido ao ângulo diferente de zero entre o eixo do interferómetro e um dos feixes interferentes.

[0004] Nessa configuração fora do eixo, é obrigatória uma luz incidente altamente coerente para se observar a interferência: se as diferenças de comprimento do trajeto entre o feixe referência e o feixe objeto forem maiores do que o comprimento de coerência do feixe incidente, não se observa nenhuma interferência e perde-se a informação de fase.

[0005] Isto significa que, temporariamente, para a luz parcialmente coerente, a diferença no comprimento do trajeto, em diferentes posições no plano de registro introduzido pelo pequeno ângulo, pode ser suficiente para perturbar a coerência, por isso as interferências só serão observadas na parte do plano de registro, onde se mantém a coerência.

[0006] O registro da informação de fase e de amplitude (ou amplitude complexa) é a base da holografia em geral e, mais especificamente, da microscopia holográfica digital (MHD). Na MHD, registra-se um holograma com uma câmara CCD e a reconstrução de um modelo tridimensional da amostra observada é realizada por um computador. Obtém-se o holograma utilizando um interferómetro. Este procedimento fornece uma ferramenta eficiente para uma nova focalização, lâmina a lâmina, dando imagens em profundidade de amostras espessas. A MHD permite a obtenção de imagens quantitativas de contraste da fase com numerosas aplicações, tal como a observação de amostras biológicas. A capacidade de reconstrução em profundidade torna a MHD uma poderosa ferramenta para a implementação de velocimetria em 3D. Como a holografia digital providencia a amplitude complexa, implantaram-se processos de processamento poderosos, tais como reorientação automática de foco, compensação de aberrações, reconhecimento de padrões em 3D, segmentação e processamento de fronteira.

[0007] O princípio da holografia digital, com o feixe objeto e o feixe referência separados, consiste em extrair a informação da amplitude complexa de um feixe objeto a partir dos padrões de interferência registrados entre o feixe objeto e um feixe referência. A amplitude complexa pode então ser processada por computador para uma reorientação de foco digital e para a realização de imagiologia quantitativa de contraste de fase. Existem dois tipos principais de configuração: configuração em linha e configurações fora de eixo.

[0008] A amplitude complexa é geralmente obtida usando um interferómetro, tal como um interferómetro de Mach-Zehnder ou um de Michelson.

[0009] Nas configurações em linha, tal como divulgado por I.YAMAGUCHI ET AL. em "Phase-shifting digital holography", Opt. Lett. 22, 1268-1270 (1997), o ângulo entre os feixes referência e objeto, incidentes no sensor da câmara é tão pequeno quanto possível. O tratamento em computador da amplitude complexa precisa de um processo em fases em que várias imagens de interferometria são registradas, com pequenas alterações de trajeto óptico, introduzidas entre o feixe objeto e o feixe referência. A informação da fase óptica é calculada em computador através da implementação das várias imagens interferométricas numa fórmula.

[0010] A principal desvantagem da configuração em linha é a necessidade do registro sequencial de várias imagens interferométricas, o que limita a velocidade de aquisição, devido à taxa de fotogramas da câmara. Na verdade, o objeto tem que permanecer estático durante a aquisição completa, que leva o tempo de registro de vários fotogramas.

[0011] Na configuração fora do eixo, tal como descrito na US 6.525.821 e por TAKEDA ET AL. em "Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry", J. Opt. Soc. Am. 72, 156-160 (1982), há um ângulo médio diferente de zero entre os feixes objeto e referência que permite o tratamento em computador da amplitude complexa, apenas a partir de uma única imagem interferométrica gravada. No que diz respeito à configuração em linha, isto é uma vantagem decisiva para a análise dos fenómenos de variação rápida. No entanto, a utilização de um interferómetro de Mach- Zehnder ou de um de Michelson, nessas configurações, exige uma fonte óptica de coerência temporal elevada. Caso contrário, a modulação da franja não é constante, devido a atrasos ópticos variáveis no campo de visão entre os feixes objeto e referência.

[0012] Tal como descrito por DUBOIS ET AL. em "Improved three-dimensional imaging with digital holography microscope using a partial spatial coherent source" Appl. Opt. 38, 70857094 (1999), o uso de iluminação parcialmente coerente melhora a qualidade do registro holográfico por meio da diminuição do ruído coerente do objeto. Na transmissão, a redução mais eficaz de ruído obtêm-se usando iluminação espacial parcialmente coerente. Este tipo de iluminação obtém-se através da diminuição das propriedades de coerência de um feixe laser ou por aumento da coerência espacial de uma fonte incoerente como um díodo emissor de luz por meio de um sistema óptico de filtragem.

[0013] Com o conjunto usual utilizado para reduzir a coerência espacial de um laser, o feixe de laser é focado perto de um vidro esmerilado em movimento. Para uma dada posição do vidro esmerilado, a luz transmitida através da amostra é um campo de “speckle”. Quando o vidro esmerilado está em movimento e supondo que o tempo de exposição é suficientemente longo para se obter um efeito médio, pode-se ver que este tipo de fonte é equivalente a uma fonte de luz espacial parcialmente coerente na qual a distância de coerência espacial é igual à média do campo de “speckle”. Este método para a preparação da fonte mantém um elevado grau de coerência temporal que permite o uso do método de fora do eixo. No entanto, as flutuações da iluminação surgem quando são necessários tempos de exposição curtos. Na prática, é difícil conseguir um movimento do vidro esmerilado suficientemente rápido de modo a registrar objetos dinâmicos que requerem um tempo de exposição curto.

[0014] Com a configuração que aumenta a coerência espacial de uma fonte incoerente ou uma fonte não laser, mantêm-se as propriedades de incoerência temporal. Neste caso, não é possível implementar a configuração fora de eixo nem é possível registrar a informação total da amplitude complexa num único fotograma.

[0015] No que respeita ao posicionamento das amostras, podem definir-se dois tipos principais de configurações: configuração diferencial, tal como descrita na EP 1631788, em que a amostra está localizada à frente do interferómetro e configuração clássica, tal como definida na EP 1399730, em que a amostra está localizada num braço do interferómetro.

[0016] No artigo "Resolution-enhanced approaches in digital holography" (Optical Measurement systems for Industrial inspection VI, Proc. Of SPIE, vol. 7389, 738905- 1) Paturzo et al. descrevem um dispositivo em que se utiliza um retículo para melhorar a resolução. Na configuração descrita, utilizam- se vários trajetos ópticos difratados para aumentar a abertura numérica do sistema óptico. Esses diferentes trajetos ópticos difratados atingem o plano de registro fora do eixo, mas mantém-se a coerência espacial e temporal. Isto significa que, tal como será explicado na descrição detalhada da presente invenção, um impulso de intensidade de luz, sob a forma de um delta de Dirac, no plano do objeto, não irá alcançar todo o plano de registro simultaneamente para todos os trajetos ópticos. Assim, no caso da fonte de luz incoerente, a informação de fase será perdido nalguma parte do plano de registro.

Objetivos da invenção

[0017] A presente invenção tem por objeto proporcionar um interferómetro que ultrapasse as desvantagens dos interferómetros da técnica anterior.

[0018] Mais especificamente, a presente invenção tem por objetivo proporcionar um interferómetro fora do eixo capaz de trabalhar com fontes de luz parcialmente coerentes.

[0019] A presente invenção também tem por objeto proporcionar configurações de microscópios holográficos digitais (MHD) que permitem a utilização de configurações fora do eixo, quer com uma fonte parcial temporal e/ou com uma fonte espacial coerente. Isto resulta na capacidade para implementar um registro holográfico digital a cores rápido com níveis de ruído muito baixos.

[0020] A presente invenção ainda tem por objeto proporcionar microscópios holográficos digitais que permitem o uso de fontes parcialmente coerentes criadas a partir de uma fonte incoerente com a configuração fora do eixo. É uma melhoria significativa, uma vez que permite operar o microscópio num modo rápido, sem a desvantagem de flutuações resultantes da configuração com um laser (ruído coerente). Além disso, esta aplicação permite o uso de fontes de baixo custo como LED e dá a possibilidade de gravar simultaneamente hologramas vermelho-verde-azul para providenciar uma microscopia holográfica digital completa, sem o ruído coerente.

Sumário da Invenção

[0021] Um primeiro aspeto da presente invenção está relacionado com um interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo, em que o referido interferómetro compreende: - um plano de registro perpendicular a um eixo óptico do interferómetro; - meios ópticos que definem um primeiro trajeto óptico e um segundo trajeto óptico incidente no referido plano de registro, sendo os referidos primeiro e segundo trajetos ópticos não paralelos, sendo os referidos meios ópticos caracterizado pelo fato de os feixes de luz temporalmente parcialmente coerentes, que se propagam ao longo dos referidos primeiro e segundo trajetos ópticos, serem capazes de interferir e produzir um contraste de margens que é independente da posição no plano de registro.

[0022] Por fora do eixo, entende-se que pelo menos um dos feixes de luz interferente tem um ângulo diferente de zero no que diz respeito ao eixo do interferómetro ou, de forma equivalente, que os feixes de luz interferente não são paralelos.

[0023] De acordo com determinadas modalidades preferidas, o interferómetro da presente invenção ainda tem por objeto pelo menos uma ou uma combinação adequada das seguintes características: - os referidos meios ópticos compreendem um retículo ópticamente conjugado com o referido plano de registro para a produção de feixes de luz difratada; - o retículo seleciona-se no grupo que consiste em retículos de Ronchi, retículo de difração de luz brilhante e retículo holográfico de fase espessa; - os meios ópticos compreendem ainda uma primeira lente, estando o referido retículo localizado no plano focal posterior da referida primeira lente; - os meios ópticos compreendem um segunda lente, estando o referido retículo localizado no plano focal frontal da referida segunda lente; - o interferómetro compreende ainda uma terceira lente opticamente acoplada à referida segunda lente, estando o plano de registro localizado no plano focal anterior da referida terceira lente; - o interferómetro compreende ainda um cone localizado em pelo menos um dos primeiro e segundo trajetos ópticos para induzir um deslocamento do padrão produzido pela propagação de um feixe de luz em pelo menos um dos primeiro e segundo trajetos ópticos no plano de registro para produzir um padrão diferencial de margens de interferência; - o interferómetro inclui ainda uma barragem óptica para parar o excesso de feixes de luz difratada.

[0024] Por dois planos opticamente conjugados, num sistema óptico, entende-se que um dos planos é a imagem óptica do outro. Alternativamente, um interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo da presente invenção compreende: - um plano de registro; - um retículo localizado num plano conjugado ópticamente com o referido plano de registro, definindo o referido retículo um primeiro e um segundo trajetos ópticos, correspondendo os referidos trajetos ópticos a diferentes ordens de difração.

[0025] Um retículo com uma periodicidade de d deflete um feixe incidente em vários feixes que preenchem a condição: d(sen θm + sen θi)= mA em que θm representa o ângulo entre o feixe de luz difratada e o retículo normal, θi é o ângulo entre o feixe de luz incidente e oretículo normal, À é o comprimento de onda do feixe de luz e m representa um número inteiro chamado "ordem de difração". A luz que corresponde à transmissão direta (ou à reflexão especular, no caso de um retículo de reflexão) é designada de ordem zero e é indicada por m = 0. Os outros feixes de luz ocorrem em ângulos que são representados por números inteiros de m diferente de zero. Note-se que m pode ser positivo ou negativo, resultando em ordens difratadas em ambos os lados do feixe de ordem zero.

[0026] De preferência, o referido interferómetro compreende ainda uma primeira lente, estando o referido retículo localizado no plano focal posterior da referida primeira lente. Com vantagem, de preferência, o referido interferómetro compreende ainda uma segunda lente, estando o referido retículo localizado no plano focal frontal da referida segunda lente.

[0027] De preferência, o referido interferómetro compreende ainda uma terceira lente ópticamente acoplada à referida segunda lente, em que o referido plano de registro está localizado no plano focal posterior da referida terceira lente. De preferência, o interferómetro compreende ainda um cone localizado em pelo menos um dos primeiro e segundo trajetos ópticos para induzir uma mudança do padrão produzido pela propagação de um feixe de luz em pelo menos um dos primeiro e segundo trajetos ópticos no plano de registro para produzir um padrão diferencial de margens de interferência.

[0028] Vantajosamente, o referido interferómetro compreende uma barreira óptica capaz de parar, em utilização, os feixes de luz em excesso produzidos pelo retículo.

[0029] Um segundo aspeto da presente invenção está relacionado com um microscópio holográfico digital compreendendo: - um interferómetro, tal como descrito aqui antes; - uma objetiva de microscópio; - uma célula objeto capaz de manter um modelo a ser estudado localizado num plano focal frontal da referida objetiva do microscópio estando a referida célula objeto opticamente conjugada com o referido plano de registro; - uma fonte de luz parcialmente coerente capaz de produzir um primeiro feixe de luz parcialmente coerente.

[0030] De acordo com determinadas modalidades preferidas, o microscópio holográfico digital da presente invenção ainda tem por objeto pelo menos uma ou uma combinação adequada das seguintes características: - a célula objeto é iluminada pelo primeiro feixe de luz, estando o referido microscópio objetivo situado na frente do interferómetro; - microscópio digital holográfico compreende ainda: - um interferómetro de Mach-Zehnder compreendendo um primeiro defletor de feixes e um segundo deflector de feixes, sendo o referido primeiro defletor de feixes capaz de dividir o referido primeiro feixe de luz num segundo feixe de luz e num terceiro feixe de luz; - uma primeira lente, localizada no trajeto óptico do referido terceiro feixe de luz, para focar o referido terceiro feixe de no referido retículo; - uma segunda lente tendo o mesmo eixo óptico que a primeira lente e localizada a uma distância focal do retículo para a produção de pelo menos um feixe de luz difratada de uma ordem diferente de zero e estando o referido segundo defletor de feixes arranjado para recombinar o referido segundo feixe de luz e o referido feixe de luz difratada num feixe recombinado; - uma barreira óptica para parar a luz difratada de ordem zero do referido terceiro de feixe de luz; - os meios de registro capazes de registrar os sinais interferométricos produzidas pela interação entre o segundo feixe de luz e o feixe de luz difratada, estando os referidos meios de registro situados no plano de registro do referido interferómetro; - os meios de focagem para a focagem do referido feixe recombinado nos referidos meios de registro, formando a primeira lente, a segunda lente e o retículo um interferómetro, tal como descrito aqui antes e sendo os trajetos ópticos do segundo e terceiro feixes de luz praticamente equivalentes (exceto no retículo e na barreira óptica); - o suporte da amostra e a objetiva do microscópio estão localizados em frente do primeiro defletor de feixe, definindo uma configuração holográfica diferencial; - o suporte da amostra e a objetiva do microscópio estão localizados no trajeto óptico do segundo feixe de luz. - uma segunda objetiva de microscópio está localizada no trajeto óptico do terceiro feixe de luz; - o microscópio holográfica digital compreende ainda meios de compensação para equalizar o trajeto óptico do segundo e terceiro feixes de luz; - os referidos meios de compensação compreendem meios para compensar o suporte da amostra e/ou duas lentes para compensar a primeira lente e a segunda lente; - o microscópio holográfico digital compreende ainda um terceiro defletor de feixes localizado no segundo trajeto do feixe de luz para iluminar um objeto refletor e um quarto defletor de feixes localizado no trajeto do terceiro feixe de luz para iluminar um espelho de referência, definindo uma geometria de Mach-Zehnder; - a fonte de luz parcialmente coerente compreende meios de iluminação selecionados no grupo que consiste num LED (díodo emissor de luz), uma lâmpada de descarga de gás e um laser pulsado; - a fonte de luz parcialmente coerente compreende uma fonte de luz térmica, de preferência filtrada para reduzir a sua largura espectral; - a fonte de luz parcialmente coerente compreende ainda uma primeira lente de iluminação, um orifício numa tela e uma segunda lente de iluminação para a produção de um feixe de luz parcialmente coerente; - os referidos meios de registro são meios de registro sensíveis à cor e a fonte de luz produz, simultaneamente, pelo menos, três comprimentos de onda separados para o registro do interferograma holográfico a cores, de preferência, os comprimentos de onda separados correspondem a ciano, magenta e amarelo (CMY) ou vermelho, verde e azul (RGB) para a reconstrução da cor; - a referida fonte de luz inclui pelo menos três LED de diferentes comprimentos de onda; - o microscópio holográfico digital compreende ainda uma fonte de excitação por fluorescência ópticamente acoplada ao referido suporte da amostra; - o microscópio holográfico digital compreende ainda um filtro de barreira para evitar que a transmissão da luz proveniente da fonte de excitação alcance o plano de registro.

[0031] Por «essencialmente equivalente" entende-se que o trajeto óptico dos segundo e terceiro feixes de luz induz uma mudança de fase menor do que o comprimento de coerência da fonte de luz. Isto pode ser obtido por equalização dos comprimentos dos trajetos ópticos e através da introdução dos mesmos elementos, ópticamente ativos, à mesma distância, a partir da fonte de luz em ambos os trajetos, exceto para o retículo, a barreira óptica e, eventualmente, o objeto a ser observado.

[0032] Um terceiro aspeto da presente invenção está relacionado com um processo para produzir um contraste de margens entre dois feixes de luz parcialmente coerentes, temporariamente não paralelos, compreendendo o referido método as etapas de: - proporcionar um feixe de luz incidente, sendo o referido feixe de luz incidente temporariamente parcialmente coerente, - focar o referido feixe de luz incidente num retículo para a produção de pelo menos dois feixes de luz difratada, - focar os referidos feixes de luz difratada no infinito para a obtenção de feixes de luz difratada paralelos e paralelos ao feixe de luz incidente, - focar os referidos feixes paralelos de luz difratada no referido plano de registro, produzindo um contraste de margens independente da posição no plano de registro.

[0033] Os feixes de luz difratada podem ser feixes de luz difratada de ordem zero ou de ordem diferente de zero, produzindo o feixe de luz de ordem diferente de zero o feixe de luz fora do eixo.

[0034] Um quarto aspeto da presente invenção está relacionado com um processo para registrar hologramas digitais fora do eixo compreendendo as etapas de: - providenciar uma fonte de luz parcialmente coerente produzindo um primeiro feixe de luz parcialmente coerente, - dividir o primeiro feixe de luz parcialmente coerente num segundo feixe de luz e num terceiro feixe de luz, - focar o terceiro feixe de luz num retículo para dividir o referido terceiro feixe de luz num feixe de luz difratada de ordem diferente de zero e num feixe de luz difratada de ordem zero, - focar o feixe de luz difratada de ordem diferente de zero e o feixe de luz difratada de ordem zero no infinito, a fim de obter um feixe de luz difratada de ordem diferente de zero e um feixe de luz difratada de ordem zero paralelos e espacialmente separados, - barrar o feixe de luz difratada de ordem zero, - combinar o feixe de luz difratada de ordem diferente de zero com o segundo feixe de luz, num feixe recombinado, - focar o feixe recombinado nos meios de registro para obter um interferograma fora do eixo.

Breve descrição dos desenhos

[0035] A fig. 1 ilustra a limitação da coerência entre dois feixes de interferência secantes no plano;

[0036] A fig. 2 representa um interferómetro de acordo com a presente invenção;

[0037] A fig. 3 representa um microscópio holográfico digital de transmissão a trabalhar no modo diferencial, que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção; A fig. 4 representa um microscópio holográfico digital de transmissão que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção;

[0038] A fig. 5 representa um microscópio holográfico digital de reflexão que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção;

[0039] A fig. 6 representa um microscópio holográfico digital de transmissão a trabalhar no modo diferencial, que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção; e

[0040] A fig. 7 representa um microscópio holográfico digital de transmissão com capacidades de fluorescência que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção. Legendas das figuras 1. Primeiro feixe de luz 2. Segundo feixe de luz 3. Terceiro feixe de luz 4. Meios de registro 5. Feixe de luz difratada (difração de ordem diferente de zero) 6. Feixe de luz difratada paralela de ordem diferente de zero 6'. Feixe de luz difratada paralela de ordem de zero 7. Feixe de luz não difratada (ou difração de ordem zero) 8. Barreira óptica 9. Feixe de luz incidente 10. Plano de registro 11. Meios de compensação para o cone de compensação 12. 2*Comprimento de coerência 13. Área de interferência 14. Plano de coerência 15. Interferómetro da presente invenção 16. Espelho de referência 17. Fonte de luz de excitação por fluorescência Bsl, BS2, Bs3 e Bs4: defletores de feixes FE: filtro de excitação R: Retículo L1, L2, L3, L4, L5, L6 e L7: lentes Ml1 e Ml2: objetivas do microscópi M1, M2 e M3: espelhos P: Orifício num écran Am: amostra de transmissão ou suporte da amostra FE: filtro espectral Ft: Fonte de iluminação GR: Grupo de rotação Rf : amostra de reflexão ou suporte da amostra C: Cunha

Descrição detalhada da invenção

[0041] Em interferometria, quando se usa luz parcialmente coerente, é de fundamental importância, para manter a coerência da luz incidente em um plano de registro, observar margens de interferência. Em muitos casos, as margens de interferência são obtidas por divisão de um primeiro feixe de luz (incidente) num segundo e num terceiro feixe de luz e recombinando o terceiro e o segundo feixe de luz com um pequeno ângulo introduzido entre eles.

[0042] Nesse caso, o pequeno comprimento de coerência da luz incidente parcialmente coerente (a luz a ser analisada) introduz uma forte limitação: não sendo paralelos os planos de coerência de ambos os feixes, só podem interferir numa pequena área na interseção entre os dois planos, não se observando nenhuma interferência quando a distância entre os planos de coerência é maior do que o comprimento de coerência.

[0043] Isto está ilustrado na fig. 1, em que um feixe de luz perpendicular a um plano está a interferir com outro raio de luz, não paralelo tendo um fora do eixo α em relação ao plano. Como representado, a luz não paralela é apenas coerente (capaz de interferir) na vizinhança do plano de coerência 14, a uma distância menor do que o comprimento de coerência 12, definindo uma área limitada 13 em que se observa a interferência.

[0044] A presente invenção tem por objeto um interferómetro, em que o plano de coerência de um feixe de luz interferente não é perpendicular à direção de propagação do feixe de luz na proximidade de um plano de registro. Isto resulta na capacidade do feixe de luz não perpendicular interferir com um feixe de luz perpendicular e produzir um contraste de franja que é independente da posição no plano de registro. Isto permite o registro das margens de interferência fora do eixo (margens espacialmente heteródinas), mesmo no caso de luz tendo um comprimento de coerência limitado, tal como a luz produzida por um LED, uma lâmpada de descarga gasosa,... Utilizando como primeiro feixe de luz (incidente) um feixe de luz temporariamente parcialmente coerente, os segundo e terceiro feixes de luz nos interferómetros da técnica anterior só podem interferir nas zonas correspondentes definidas pelo comprimento de coerência. Isto significa que a diferença no comprimento do trajeto óptico e a mudança de fase devida aos dispositivos ópticos no trajeto óptico entre o segundo e o terceiro feixes de luz devem permanecer menores do que o comprimento de coerência da fonte de luz.

[0045] A coerência temporal é a medida da correlação média entre os valores de uma onda em qualquer par de vezes, separada por intervalo de tempo T. Caracteriza se uma onda pode interferir com ela própria num momento diferente. O intervalo de tempo durante o qual a fase ou a amplitude variam de um valor significativo (daí a correlação diminui num valor significativo) é definido como o tempo de coerência Tc. Para T = 0, o grau de coerência é perfeito, embora baixe significativamente no intervalo de tempo Tc. O comprimento de coerência Lc é definido como a distância que a onda percorre no tempo Tc. O comprimento de coerência pode ser estimado pela fórmula:

em que A representa o comprimento de onda da luz, AÀ representa a largura espectral da fonte e n representa o índice de refração da propagação. Para uma fonte LED típica, isto representa alguns comprimentos de onda até várias dezenas de comprimentos de onda. Por exemplo, para um LED tendo um comprimento de onda de 650 nm e uma largura de banda espectral de 15 nm (valores típicos para os LED disponíveis comercialmente), o comprimento de coerência é de cerca de 20 A. Isto significa que o feixe de referência fora do eixo não pode ter uma mudança de fase superior ao tempo de coerência, em qualquer lugar no plano de registro. Isto também significa que o número de margens induzido pela diferença de ângulo entre o feixe de referência e o feixe objeto não pode ser mais do que cerca de 20, o que é uma limitação forte.

[0046] O tempo de coerência limitado também pode resultar da duração do impulso de um laser de impulso ultra-curto. Normalmente, esse laser pulsado tem uma duração de impulso de vários femtossegundos e assim o comprimento do impulso limita- se a alguns comprimentos de onda. Neste caso, o tempo de coerência é igual à duração do impulso. Novamente, isto também significa que o número de margens induzido pela diferença de ângulo entre o feixe referência e o feixe objeto não pode ser maior do que o número do comprimento de onda que representa o comprimento do impulso.

[0047] De preferência, para evitar esta limitação em ambos os casos, a presente invenção tira partido das propriedades particulares dos retículos de difração para a produção de um feixe de referência fora do eixo, sem perturbar a coerência temporal dos feixes interferentes no plano de registro. No interferómetro 15, da presente invenção, coloca-se um retículo de difração G no plano focal posterior de uma lente L5 colocada nos eixos ópticos de um feixe de luz incidente 9. O retículo G grade induz a divisão do feixe de luz incidente 9 num feixe difratado 5 (referência) e num feixe de luz não difratada 7 (sendo eventualmente o feixe objeto). Em seguida, uma segunda lente L6, colocada a uma distância focal do retículo G, dá uma nova forma tanto ao feixe difratado como ao feixe não difratado em feixes paralelos ao eixo óptico. Seleciona-se L5, L6 e o retículo G para se obter, atrás de L6, dois feixes de luz espacialmente separados, um feixe difratada e um feixe de luz não difratada. O feixe de luz não difratada pode tornar-se ou o feixe objeto ou pode ser eliminado por uma barreira óptica. Neste último caso, um outro feixe objeto pode ser providenciado por uma estrutura óptica maior, como será descrito aqui a seguir. O feixe difratado é então recombinado com o feixe objeto e focado, por meio de uma lente de objetiva L7 num plano de registro, estando o plano de registro localizado no plano focal posterior de L7.

[0048] Como o feixe difratado é paralelo ao eixo óptico da L7, mas não está centrado neste eixo óptico, L7 irá originar, no referido feixe difratado, um ângulo fora do eixo.

[0049] Alternativamente, os feixes de luz interferentes podem ser quaisquer pares de feixes de luz difratada com diferentes ordens de difração. Por exemplo, o feixe de luz difratada de ordem +1 pode ser selecionado como o feixe de luz de referência e o feixe de luz difratada de ordem -1 pode ser selecionado como o feixe objeto.

[0050] De preferência, utiliza-se uma barreira óptica para parar todos os feixes exceto os dois feixes de luz difratada selecionados para interferir no plano de gravação. Pode-se demonstrar que, em tal configuração, o retículo não perturba a coerência temporal de nenhum dos feixes de luz difratada de ordem diferente de zero. A coerência temporal está relacionado com o trajeto do caminho óptico. Por isso, é equivalente demonstrar que um impulso óptico temporário, que ilumina os planos focais posteriores de L5 e L4, num determinado momento, simultaneamente ilumina todo o plano focal posterior L7.

[0051] Considerando que um retículo G, do qual a transparência é definida por g(x,y) = (1 + sen Kx)/2, é iluminado por uma onda plana monocromática de amplitude A. Assumindo que o par de lentes L6-L7 é um sistema afocal (formando L6-L7 um sistema do tipo 4f), a amplitude no plano de registro é dada por:

em que B é uma constante que não desempenha um papel significativo, j=√-1, ν representa a frequência óptica, c representa a velocidad e da luz em vácuo e f6, f7 são as distâncias focais de L6 e L7. Calculando a contribuição de apenas um feixe difratado no plano de registro, a eq. (1) torna-se:

em que K= 2π/Λ, sendo Λ o período espacial do retículo. B' é uma constante que não desempenha um papel importante.

[0052] A iluminação por um impulso de Dirac temporal com a forma de delta obtém-se através da resolução da transformada de Fourier da eq. (2):

na qual t representa o tempo, a eq. (3) expressa o fato de um impulso de luz espacialmente uniforme no plano focal frontal de L6 ir simultaneamente chegar a toda a parte no plano focal posterior de L7, sem intervalo de tempo, dependendo da posição de (x,y). A parte exponencial expressa o fato de o feixe ser incidente em relação ao plano do sensor com um ângulo de inclinação em relação ao eixo óptico. Quando os trajetos ópticos do interferómetro da presente invenção são equalizadas, é então possível registrar o padrão de interferência em todo o plano do sensor de entre o objeto e o feixe de referência. O ângulo de inclinação do feixe de referência providencia a configuração fora do eixo.

[0053] Tal como demonstrado, as propriedades do referido retículo são independentes do feixe de luz não difratada, compreendendo a referida configuração descrita um retículo G situado num plano conjugado com o plano de registro 10 que pode ser usado em qualquer configuração fora do eixo. Esta conjugação pode ser obtida, por exemplo, através da utilização de um sistema do tipo 4f com um retículo entre as duas lentes L5, L6 e uma lente de focagem L7.

[0054] Nesta fase, pode notar-se que o feixe difratado, que tem agora o seu plano de coerência paralelo ao plano de registro, pode interferir com qualquer feixe de luz com um trajeto óptico equivalente e tendo o seu plano de coerência paralelo ao plano de registro. Mais particularmente pode interferir com o feixe de luz não difratada, mas também com outros feixes de luz difratada de outra ordem maior ou um feixe de luz que passa através de um outro braço de um interferómetro de Mach-Zehnder ou Michelson, desde que o percurso óptico não difira de mais do que o comprimento de coerência da luz incidente.

[0055] No microscópio holográfico digital fora do eixo (MHD) da presente invenção, os hologramas digitais são registrados utilizando fontes de luz parcialmente coerentes. Para se obter essas fontes de luz parcialmente coerentes, podem utilizar-se fontes de luz incoerente, tais como LED. A fim de obter a coerência parcial necessária para observar as margens de interferência necessárias para permitir a determinação da informação de fase da luz de entrada, pode-se usar um filtro espacial.

[0056] Um primeiro exemplo de um microscópio usando um interferómetro 15, de acordo com a presente invenção, está representado na fig. 3. Nesta figura, uma fonte de luz parcialmente coerente, tal como um LED está localizada no plano focal posterior de uma lente L1. O feixe de luz produzido é então filtrado espacialmente através de um orifício numa tela P, a fim de aumentar a sua coerência espacial. O orifício P está localizado no plano focal posterior de uma lente L2, para iluminar uma amostra Am. A amostra Am está localizada no plano focal posterior da objetiva do microscópio Ml1 e, em seguida, segue o interferómetro 15 como previamente descrito. O holograma, nesta figura, é registrado por meio de uma câmara CCD.

[0057] Neste último caso, de preferência, insere-se uma cunha W no trajeto óptico de um dos segundo ou terceiro feixes, a fim de induzir uma ligeira mudança das imagens produzidas pelos feixes de luz difratada e não difratada, a fim de obter o interferograma diferencial tal como descrito na EP 1631788, que se incorpora aqui como referência. Neste caso, de preferência, os meios de compensação 11 são introduzidos no trajeto óptico do feixe de luz não difratada para compensar o deslocamento de fase introduzido pela cunha no feixe difratado.

[0058] Alternativamente, o interferómetro 15 pode ser introduzido numa estrutura óptica maior, tal como um interferómetro de Mach-Zehnder como representado nos MHD representados nas fig. 4 a 7. Nesse caso, o feixe de luz não difratada 15 é interrompido por uma barreira óptica 8 e providencia-se o feixe objeto por um outro trajeto óptico, por exemplo, um outro braço de um interferómetro de Mach-Zehnder.

[0059] Tal como é o caso com os microscópios holográficos habituais, um primeiro feixe de luz 1 divide-se num segundo feixe de luz 2 e num terceiro feixe de luz 3 por meio de um primeiro defletor dos feixes BS1 e recombinado por um segundo defletor de feixes bs2 num feixe recombinado, em que os referidos segundo e terceiro feixes de luz, interferindo no feixe recombinado, formam um padrão de interferência num meio de registro, tal como um sensor CCD, a fim de se obter padrões de interferência. Neste caso, o interferómetro 15 da presente invenção é inserido no braço de referência do interferómetro de Mach-Zehnder, a fim de se obter a configuração fora do eixo, sendo o feixe não difratado 6' interrompido por uma barreira óptica 8.

[0060] De preferência, a presença das lentes L5 e L6 é compensada pelas lentes L3 e L4 no trajeto do feixe objeto para compensar a alteração de fase induzida pelas referidas lentes L5 e L6.

[0061] De preferência, a lente L7 é colocada depois do defletor de feixe BS2 do interferómetro de Mach-Zehnder, usado para a recombinação do feixe objeto e do feixe de referência. Isto permite partilhar as referidas lentes L7 entre o feixe objeto e o feixe de referência.

[0062] Alternativamente, a lente L7 pode ser substituída por duas lentes localizadas respetivamente no trajeto óptico do feixe de referência e no trajeto óptico do feixe objeto, focando-se ambas as lentes de nos meios de registro, mas estando localizadas antes dos meios de recombinação.

[0063] As configurações, incluindo fontes de excitação por fluorescência também podem ser implementadas como representado na fig.7.

[0064] Como nenhum deslocamento de fase precisa de ser utilizados, o MHD descrito pode ser utilizado para registrar eventos dinâmicos rápidos, gravando várias estruturas sucessivas, de modo a registrar as sequências ao longo do tempo, da representação em 3D da amostra a ser observada. Esta implementação permite a utilização de fontes de baixo custo, tais como os LED e, com sensores de cor, que permite o registro simultâneo de hologramas vermelhos-verdes-azuis usando a iluminação de três LED de modo a proporcionar microscopia holográfica digital a cores, sem ruído coerente. Até agora, a implementação do microscópio holográfico digital a cores requeria o uso de processos de registro complexos. Na presente invenção aqui descrita, as três cores podem ser gravadas simultaneamente.

[0065] Vários tipos de sensores de cor estão disponíveis comercialmente, incluindo sensores de cor única, tal como os projetos dos sensores de cor CCD e os sensores triplos. Em modelos de sensores triplos, um bloco de prisma (ou seja, um conjunto tricróico composto por dois prismas dicróicos) pode filtrar o interferograma obtido nas três cores primárias, vermelho, verde e azul, direcionando cada cor para um dispositivo de carga acoplada separado (CCD) ou um sensor de pixel ativo (sensor de imagem CMOS) montado em cada face do prisma.

[0066] Existem vários tipos de retículos de transmissão que podem ser implementados. O tipo mais simples de retículo é o retículo de Ronchi, que é constituído por uma placa óptica transparente onde se imprimem linhas opacas paralelas com uma largura de 1. Existe um espaçamento L constante e claro entre as linhas opacas consecutivas. Os retículos de Ronchi muitas vezes têm uma largura de abertura clara igual à opaca. A quantidade significativa que caracteriza um retículo de Ronchi e o ângulo de difração para um dado comprimento de onda é o período do retículo P=L+1. A análise da difração de um retículo de Ronchi é realizada por primeira da decomposição da função de transmitância, de acordo com uma série de Fourier. Para um dado comprimento de onda, cada componente de Fourier dá origem a uma ordem de difração caracterizada por um ângulo de difração θm, em que m representa um número inteiro e θ representa o primeiro ângulo de difração.

[0067] A amplitude difratada em cada ordem de difração é proporcional à componente de Fourier correspondente. No interferómetro da presente invenção, 15, o período do retículo é selecionado de modo a garantir uma separação espacial dos feixes difratados no plano, onde se coloca a barreira óptica 8.

[0068] Geralmente, é uma das primeiras ordens de difração (m = + 1 ou -1), que é mantida durante a incidência do feixe de referência no detetor. Uma limitação do retículo de Ronchi é a disseminação da intensidade de luz entre várias ordens de difração reduzindo assim a luz disponível para as medições por interferometria.

[0069] A fim de otimizar a eficiência da difração na ordem de difração mantida durante o processo holográfico, pode-se implementar um retículo de difração de brilho. Os retículos de difração do brilho também têm uma estrutura periódica, numa das superfícies de uma placa óptica. Neste caso, é um relevo em forma de dente de uma superfície que otimiza a eficiência da difração nas ordens de difração de m = 1 ou m = -1.

[0070] A fim de otimizar a eficiência da difração, é também possível implementar retículos holográficos de fase espessa. Este tipo de retículo obtém-se por registro num material fotossensível, por exemplo gelatina dicromada, do padrão de interferência entre duas ondas planas. Depois, a placa é tratada e é capaz de difratar a maior parte da luz numa ordem de difração de acordo com um modo de difração de Bragg. O ângulo entre a onda e plano de registro determina o período do retículo.

[0071] As saídas analógicas podem então ser digitalizadas e tratadas por um computador de modo a obter-se uma representação tridimensional a cores das amostras.

[0072] Uma fonte parcial temporal e espacial pode ser constituída por uma fonte (Ft), uma lente de colimação (L1), um orifício (P) e uma lente (L2). A coerência temporal resulta da largura espectral da fonte (Ft). Normalmente, pode ser um LED com um espectro tendo um pico (por exemplo, o comprimento de onda A = 650 nm, ΔA = 15 nm)ou um conjunto de LED que origina um conjunto de picos, para alcançar o registro holográfico da cor. O feixe é colimado pela lente (L1) e é filtrado pelo orifício (P), de modo a aumentar a coerência espacial. Pode-se demonstrar que a dependência da coerência espacial emergente, que emerge da lente (L2), é uniforme e pode ser modelada por uma função de coerência Y (X--X2, yi-y2), em que (x1,y1) e (x2,y2) são as coordenadas espaciais perpendiculares ao eixo óptica z.

[0073] Esta implementação da fonte parcialmente coerente não é limitativa e poderia ser realizado de outras maneiras, tais como, com um feixe de laser não correlacionado, por meio de vidro moído em movimento.

Descrição das modalidades preferidas da presente invenção Configuração de Mach-Zehnder

[0074] O esquema do microscópio holográfico digital, com base numa configuração de Mach-Zehnder, que permite o registro fora do eixo com fontes ópticas, de coerência espacial e temporal parciais, está representado na fig.4.

[0075] No caso da fig. 4, a fonte de luz é constituída por uma fonte (Ft), uma lente de colimação (L1), um orifício (P) e uma lente (L2).

[0076] Após uma reflexão do espelho M1, o feixe é defletido por BS1 no feixe objeto que ilumina a amostra na transmissão e no feixe de referência, que é dirigido novamente para a lente do microscópio ML2. A imagem do plano focal frontal de Ml1 é formada pelo conjunto das lentes Ml1, L3, L4 e L7. Para formar a imagem, o plano focal posterior de L3 é correspondente ao plano focal frontal de L4 e o sensor está localizado no plano focal posterior de L7.

[0077] Nesta configuração, o interferómetro da presente invenção 15 é representado pelas lentes L5, L6 e L7 e o retículo G.

[0078] As lentes Ml1, L3 e L4 têm os seus homólogos no braço de referência, respetivamente, as lentes Ml2, L5, L6, de tal forma que os feixes de referência e objeto, exceto para a amostra, o retículo G e a barreira óptica 8 são quase idênticos. Isto garante um alinhamento adequado dos dois feixes no sensor, onde interferem. Isto é requerido pela natureza espacial coerente e parcial da iluminação.

[0079] O plano focal frontal da lente Ml2, onde o componente opcional C, que pode ser um percurso óptico compensador e/ou atenuador, é visualizado numa imagem no plano focal posterior de L5, que também é o plano focal frontal L6, em que G é o retículo. O papel do retículo é redirecionar a luz por difração de tal modo que o objeto incidente e os feixes de referência em L7 estão espacialmente separados e propagam-se em paralelo. Tal como já foi demonstrado, esta configuração com L5, G, L6 e L7 permite a manutenção da coerência temporal no plano do sensor, no caso de coerência temporal parcial e produz interferência fora do eixo.

[0080] A lente L7 sobrepõe os feixes objeto e referência no sensor com um ângulo médio entre eles que tem origem na difração do retículo. Nesta configuração, o espelho M2 é paralelo a BS2 e M3 é paralelo a BS1. Esta orientação relativa dos defletores do feixe e os espelhos permitem ajustar, sem alterar as posições dos feixes no sensor, o trajeto óptico pela rotação do conjunto de rotação CR, em que o espelho e M2 e o defletor do feixe BS2 estão rigidamente ligados. Por conseguinte, a configuração permite igualar os trajetos ópticos dos feixes referência e objeto.

[0081] Esta configuração pode ser adaptada a amostras refletoras, como representado na fig. 5. Nesse caso, o suporte da amostra Am é removido e o espelho M2 é substituído por um terceiro defletor do terceiro de feixes BS3 que ilumina uma amostra refletora Rs através da objetiva da lente Ml1. A luz refletida pela amostra e focada pela objetiva da lenta é redirecionada pelo terceiro defletor de feixes BS3 em direção ao segundo defletor de feixes, como na configuração anterior. A mesma modificação aplica-se ao percurso óptico do feixe de referência, sendo a amostra substituída por um espelho de referência 16.

Configuração diferencial

[0082] A configuração de Mach-Zehnder é adequada para aplicações em que as variações do trajeto óptico introduzidas pelo objeto estão limitadas: no caso de uma espessura do objeto muito flutuante, a densidade da franja pode tornar-se demasiado elevada para ser registrada pelo sensor. Além disso, com uma iluminação temporal parcial reduzida, na configuração de Mach-Zehnder, o ajuste fino do trajeto óptico, quando o objeto é mudado, pode ser difícil. Por essa razão, propôs-se o microscópio holográfico digital diferencial. Neste último caso, é a fase óptica diferencial que é medida, apresentando as vantagens de uma gama dinâmica maior para a medição da fase e o ajustamento permanente do interferómetro, independentemente da espessura da amostra.

[0083] Vantajosamente, a configuração fora do eixo com fontes parcialmente coerentes, espacialmente e temporalmente, pode ser usada no modo diferencial. O esquema óptico está representado na fig.6.

[0084] Uma fonte espacial e temporalmente parcialmente coerente é constituída por uma fonte (Ft), uma lente de colimação (L1), um orifício (P) e uma lente (L2). O feixe é colimado pela lente (L1) e é filtrado pelo orifício (P), de modo a aumentar a coerência espacial.

[0085] Após uma reflexão pelo espelho M1, o feixe de luz ilumina a amostra e é transmitido pela lente do microscópio Ml1. O feixe de luz proveniente da Ml1 é em seguida defletido por BS1 em dois feixes correspondentes a um segundo e a um terceiro feixe de luz. A imagem do plano focal frontal de Ml1, localizada dentro da amostra, é formada pelo conjunto das lentes Ml1, L3, L4 e L7. Para este efeito, o plano focal posterior de L3 é coincidente com o plano focal frontal de L4 e o sensor está localizado no plano focal posterior de L7. Da mesma maneira, a imagem do plano focal da frente de Ml1 é formada pelo conjunto de lentes Ml1, L5, L6 e L7, com o plano focal posterior de L3 correspondendo ao plano da focal frontal de L4. A distância entre L4 e L7 é idêntica à distância entre L6 e L7.

[0086] Por conseguinte, o mesmo plano do plano da amostra, que corresponde ao plano focal frontal de Ml1, é visualizado no sensor CCD. Introduz-se um desvio entre as imagens formadas pelo segundo e terceiro feixes luz por rotação ligeira do espelho M2 ou do espelho M3. É um desvio de apenas alguns pixels ou até menos do que um pixel no sensor CCD. As contrapartes das lentes L3 e L4 do primeiro canal óptico 1, respetivamente, as lentes L5, L6, estão situadas no trajeto óptico do terceiro feixe de luz de tal maneira que o trajeto óptico tanto do segundo como do terceiro feixes de luz, exceto para a amostra, o retículo G e a barreira óptica 8, são idênticos. Isto permite um alinhamento apropriado com o pequeno desvio dos dois canais no sensor, onde são interferentes.

[0087] O plano focal frontal da lente Ml1 é visualizado no plano focal posterior de L5, que também é o plano focal frontal de L6, onde está o retículo G. O papel do retículo é redirecionar a luz por difração de tal modo que os feixes incidentes dos dois canais em L7 estão espacialmente separados. A lente L7 sobrepõe os dois feixes no sensor com um ângulo médio entre eles que tem origem na difração do retículo. Na configuração, o espelho M2 é quase paralelo a BS2 e M3 a BS1. Estas orientações relativas dos defletores de feixes e os espelhos permitem ajustar, sem alterar as posições dos feixes no sensor, o trajeto óptico por rotação do conjunto de rotação CR, a que o espelho M2 e o defletor do feixe BS2 estão rigidamente ligados. Por conseguinte, a configuração permite igualar os feixes dos trajetos ópticos objeto e de referência.

[0088] O ângulo médio entre o feixe objeto e o feixe de referência no sensor proporciona a configuração fora do eixo. Como já foi demonstrado, existe um alinhamento apropriado, mesmo no caso de uma fonte de coerência temporal parcial, a fim de proporcionar homogeneamente um padrão de margens contrastado sobre todo o sensor CCD. Deve notar-se que se pode colocar um atenuador no trajeto óptico do segundo feixe de luz para compensar a perda de luz proveniente do retículo. Pode- se inserir uma placa óptica transparente no trajeto óptico do terceiro feixe de luz de modo a compensar a diferença do percurso óptico introduzido entre os dois canais pelo atenuador.

[0089] Pode-se utilizar uma fonte de fluorescência 17 quando a amostra de interesse é fluorescente tal como representado na fig. 7. O seu feixe reflete-se pelo defletor do feixe fluorescente através da lente Ml1 para iluminar a amostra. O sinal fluorescente que se propaga para trás é transmitido pela Ml1 e espectralmente filtrado por SF a fim de remover a parte de excitação por fluorescência antes de incidir em BS1. Como a lente Ml1 está limitada por uma abertura, o sinal fluorescente incoerente tem uma coerência espacial parcial quando emerge da Ml1, donde resulta que os dois feixes são capazes de interferir, desde que o desvio seja menor do que o comprimento de coerência espacial.

[0090] A presente invenção também está descrita em detalhe na prioridade do pedido de patente EP com o número 09.172.561.4, cuja descrição é aqui integralmente incorporada como referência.

Claims

1. Microscópio holográfico digital fora do eixo, caracterizado pelo fato de compreender: - uma fonte de luz parcialmente coerente disposta para produzir um primeiro feixe de luz parcialmente coerente (1); - um plano de registro (10); - uma objetiva de microscópio (Ml1) tendo um plano focal frontal; - uma célula objeto (Am) capaz de suportar uma amostra a ser estudada localizada no plano focal frontal da referida objetiva do microscópio (Ml1), estando a referida célula objeto (Am) ópticamente conjugada com o referido plano de registro (10); - interferómetro (15) compreendendo: - um retículo (G) localizado num plano conjugado ópticamente com o referido plano de registro (10), o referido retículo (G) definindo um primeiro trajeto óptico e um segundo trajeto óptico, os referidos trajetos ópticos correspondendo a ordens de difração diferentes; - uma primeira lente (L5), o referido retículo (G) estando localizado no plano focal posterior da referida primeira lente (L5); - uma segunda lente (L6) tendo um plano focal frontal, o retículo (G) estando localizado no plano focal frontal da referida segunda lente (L6); - uma terceira lente (L7) tendo um plano focal frontal e estando ópticamente acoplada à referida segunda lente (L6), o referido plano de registro (10) estando localizado no plano focal anterior da referida terceira lente (L7); sendo que a coerência temporal e a coerência espacial entre os feixes de luz seguindo os citados primeiro e segundo trajetos ópticos são mantidas sobre uma totalidade do plano de registro (10).

2. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a célula objeto (Am) ser iluminada pelo primeiro feixe de luz (1), a referida objetiva (Ml1) do microscópio estando localizada na frente do interferómetro (15) e sendo que uma cunha (W) está localizada no segundo trajeto óptico do referido interferómetro para a produção de um holograma diferencial.

3. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de a fonte de luz parcialmente coerente compreender meios de iluminação (Ft) selecionados no grupo consistindo de um diodo emissor de luz (LED), uma lâmpada de descarga de gás, fontes de energia térmica e laser pulsado.

4. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de os referidos meios de registro serem meios de registro sensíveis à cor, e a fonte de luz produzir, simultaneamente, pelo menos três comprimentos de onda separados, para registrar o interferograma holográfico de cor.

5. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de a referida fonte de luz compreender pelo menos três LED de comprimentos de onda diferentes.

6. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de os comprimentos de onda distintos corresponderem a Ciano, Magenta e Amarelo (CMY) ou a Vermelho, Verde e Azul (RGB) para a reconstrução da cor.

7. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender uma fonte de excitação por fluorescência (17) ópticamente acoplada ao referido suporte da amostra.

8. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender: - um interferómetro de Mach-Zehnder compreendendo um primeiro defletor de feixe (BS1) e um segundo defletor de feixe (BS2), o referido primeiro defletor de feixe (BS1) sendo capaz de dividir o referido primeiro feixe de luz (1) num segundo feixe de luz (2) e num terceiro luz feixe (3); - a primeira lente (L5) sendo localizada no trajeto óptico do referido terceiro feixe de luz (3), para a focagem do referido terceiro feixe de luz (3) no referido retículo (G); - a segunda lente (L6) tendo o mesmo eixo óptico que a primeira lente (L5) e localizada na distância focal do retículo (G) para a produção de pelo menos um feixe de luz difratada de ordem diferente de zero, e o referido segundo defletor de feixe (BS2) estando arranjado de forma a recombinar o referido segundo feixe de luz (2) e o referido feixe de luz difratada num feixe recombinado; - uma barreira óptica (8) para parar a luz difratada de ordem zero do referido terceiro feixe de luz (3); - meios de registro (4, CCD) sendo dispostos para registrarem sinais de interferometria produzidos pela interação entre o segundo feixe de luz (2) e o feixe de luz difratada, os referidos meios de registro (4, CCD) estando localizados no plano de registro (10) do referido interferómetro (15); - a terceira lente (L7) para focar o referido feixe recombinado nos referido meios de registro (4, CCD); e sendo o trajeto óptico dos segundo feixe de luz (2) e do terceiro feixe de luz (3) equivalentes.

9. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de o suporte da amostra (Am) e a objetiva do microscópio (Ml1) estarem localizados em frente do primeiro defletor do feixe (Bs1), definindo uma configuração holográfica diferencial.

10. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de o suporte da amostra (Am) e a objetiva do microscópio (Ml1) estarem localizados no trajeto óptico do segundo feixe de luz (2).

11. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de uma segunda objetiva do microscópio (Ml2) estar localizada no trajeto óptico do terceiro feixe de luz (3).

12. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de compreender ainda um terceiro defletor de feixe (BS3), localizado no trajeto do segundo feixe de luz (2) para iluminar um objeto refletor (Rs) e um quarto defletor de feixe (BS4) localizado no trajeto do terceiro feixe de luz (3) para iluminar um espelho de referência (16), definindo uma geometria de Mach-Zehnder.

13. Método para registrar hologramas digitais fora do eixo, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de: - prover uma fonte de luz parcialmente coerente produzindo um primeiro feixe de luz parcialmente coerente (1); - dividir o primeiro feixe de luz parcialmente coerente (1) num segundo feixe de luz (2) e num terceiro feixe de luz (3); - focar o terceiro feixe de luz (3) num retículo (G) para dividir o referido terceiro feixe de luz (3) num feixe de luz difratada de ordem diferente de zero (5) e num feixe de luz difratada de ordem zero (7); - focar o feixe de luz difratada de ordem diferente de zero (5) e o feixe de luz difratada de ordem zero (7) no infinito, a fim de se obter um feixe de luz difratada de ordem diferente de zero (6) e um feixe de luz difratada de ordem zero (6’), paralelos e espacialmente separados; - barrar o feixe de luz difratada de ordem zero; - combinar o feixe de luz difratada de ordem diferente de zero (6) com o segundo feixe de luz (2) num feixe recombinado; - focar o feixe recombinado nos meios de registro (4,CCD) para obter um interferograma fora do eixo; - manter a coerência temporal e a coerência espacial do feixe de luz de ordem diferente de zero e do segundo feixe de luz (2) nos meios de registro (4,CCD).