BR112012007766A2

BR112012007766A2 - interferometro para microscopia holografica fora do eixo microscopio holografico digital, processo para a produção de margens dos feixes de luz parcialmente coerente e processo para registrar hologramas digitais fora do eixo.

Info

Publication number: BR112012007766A2
Application number: BR112012007766-0A
Authority: BR
Inventors: Frank Dubois; Catherine Yourassowsky
Original assignee: Universite Libre De Bruxelles
Priority date: 2009-10-08
Filing date: 2010-10-05
Publication date: 2020-08-25
Also published as: CA2772735C; CN102576209B; US20120200901A1; BR112012007766B1; KR20120093270A; US9207638B2; WO2011042442A1; JP5914340B2; JP2013507647A; CN102576209A; IN2012DN01700A; CA2772735A1; KR101817110B1

Abstract

INTERFERÓMETRO PARA MICROSCOPIA HOLOGRÁFICA DIGITAL FORA DO EIXO, MICROSCÓPIO HOLOGRÁFICO DIGITAL, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM CONTRASTE DE MARGENS ENTRE DOIS FEIXES DE LUZ PARCIALMENTE COERENTE E PROCESSO PARA REGISTAR HOLOGRAMAS DIGITAIS FORA DO EIXO A presente invenção tem por objecto um interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo (15) compreendendo: um plano de registo (10); - um retículo (G) localizado num plano conjugado oticamente com o referido plano de registo (10), definindo o referido retículo (G) um primeiro e um segundo trajeto ótico, correspondendo o referido trajeto ótico a diferentes ordens de difração.

Description

| & “INTERFERÓMETRO PARA MICROSCOPIA HOLOGRÁFICA DIGITAL FORA DO EIXO, MICROSCÓPIO HOLOGRÁFICO DIGITAL, PROCESSO PARA A

PRODUÇÃO DE UM CONTRASTE DE MARGENS ENTRE DOIS FEIXES DE i LUZ PARCIALMENTE COERENTE E PROCESSO PARA REGISTAR HOLOGRAMAS DIGITAIS FORA DO EIXO” o Âmbito da invenção A presente invenção tem por objecto um interferómetro " fora do eixo e à sua utilização num aparelho assim como | um processo para microscopia holográfica digital fora do eixo. Estado da técnica Nos interferómetros da técnica anterior, um feixe de luz incidente é geralmente dividido num feixe objecto e num feixe referência e, em seguida, recombinam-se num plano de registo em que o feixe objecto e o feixe referência interferem, produzindo margens de interferência. O objectivo desses dispositivos é a medição da amplitude complexa da luz (isto é, a informação sobre a fase e a amplitude). Geralmente, a luz utilizada em tal medição tem uma coerência elevada, tal como à luz produzida por lasers. Isto tem várias desvantagens, tais como o aparecimento de , ruído coerente (campo de “speckle”) e o elevado custo | associado com fontes de luz altamente coerentes. Em muitos casos, introduz-se um pequeno ângulo entre o . feixe objeto e o feixe referência a fim de se obter . margens espacialmente heteródinas de baixa frequência, 4 tais como as descritas na US7002691. Estes tipos de configurações são geralmente designados por configurações fora do eixo devido ao ângulo diferente de zero entre o eixo do interferómetro e um dos feixes interferentes. Nessa configuração fora do eixo, é obrigatória uma luz incidente altamente coerente para se observar a interferência: se as diferenças de comprimento do trajeto entre o feixe referência e o feixe objecto forem maiores do que o comprimento de coerência do feixe incidente, não se observa nenhuma interferência e perde-se a informação

| 2 Í

Í de fase. | Isto significa que, temporariamente, para a luz 1 parcialmente coerente, a diferença no comprimento do 9 trajeto, em diferentes posições no plano de registo = 5 introduzido pelo pequeno ângulo, pode ser suficiente para . perturbar a coerência, por isso as interferências só serão observadas na parte do plano de registo, onde se z mantém a coerência. O registo da informação de fase e de amplitude (ou amplitude complexa) é a base da holografia em geral e, mais especificamente, da microscopia holográfica digital (MHD). Na MHD, regista-se um holograma com uma câmara CCD e a reconstrução de um modelo tridimensional da amostra observada é realizada por um computador. Obtém-se o holograma utilizando um interferómetro. Este procedimento fornece uma ferramenta eficiente para uma nova focalização, lâmina a lâmina, dando imagens em profundidade de amostras espessas. A MHD permite a obtenção de imagens quantitativas de contraste da fase com numerosas aplicações, tal como a observação de amostras biológicas. A capacidade de reconstrução em profundidade torna a MHD uma poderosa ferramenta para a implementação de velocimetria em 3D. Como a holografia digital providencia a amplitude complexa, implantaram-se processos de processamento poderosos, tais como : reorientação automática de foco, compensação de =, aberrações, reconhecimento de padrões em 3D, segmentação j T e processamento de fronteira. O princípio da holografia digital, com o feixe objecto e o feixe referência separados, consiste em extrair a informação da amplitude complexa de um feixe objecto a partir dos padrões de interferência registados entre o feixe objecto e um feixe referência. A amplitude complexa pode então ser processada por computador para uma reorientação de foco digital e para a realização de imagiologia quantitativa de contraste de fase. Existem

& " linha e configurações fora de eixo. Í A amplitude complexa é geralmente obtida usando um interferómetro, tal como um interferómetro de Mach- Zehnder ou um de Michelson. Nas configurações em linha, tal como divulgado por z 1. YAMAGUCHI ET AL. em "Phase-shifting digital holography", Opt. Lett. 22, 1268-1270 (1997), o ângulo - entre os feixes referência e objeto, incidentes no sensor da câmara é tão pequeno quanto possível. O tratamento em computador da amplitude complexa precisa de um processo em fases em que várias imagens de interferometria são registadas, com pequenas alterações de trajeto ótico, introduzidas entre o feixe objeto e o feixe referência. A informação da fase ótica é calculada em computador através da implementação das várias imagens interferométricas numa fórmula. A principal desvantagem da configuração em linha é a necessidade do registo sequencial de várias imagens interferométricas, o que limita a velocidade de | aquisição, devido à taxa de fotogramas da câmara. Na Í verdade, o objeto tem que permanecer estático durante a aquisição completa, que leva o tempo de registo de vários fotogramas. Na configuração fora do eixo, tal como descrito na US

6.525.821 e por TAKEDA ET AL. em "Fourier-transform . method of fringe-pattern analysis for computer-based ” topography and interferometry", J. Opt. Soc. Am. 72, 156- 7 160 (1982), há um ângulo médio diferente de zero entre os feixes objeto e referência que permite o tratamento em 1 computador da amplitude complexa, apenas a partir de uma única imagem interferométrica gravada. No que diz respeito à configuração em linha, isto é uma vantagem decisiva para a análise dos fenómenos de variação rápida. No entanto, a utilização de um interferómetro de Mach- Zehnder ou de um de Michelson, nessas configurações, exige uma fonte ótica de coerência temporal elevada. Caso

+ + a atrasos óticos variáveis no campo de visão entre os " feixes objeto e referência.

Tal como descrito por DUBOIS ET AL. em "Improved three- dimensional imaging with digital holography microscope using a partial spatial coherent source" Appl.

Opt. 38, : 7085-7094 (1999), o uso de iluminação parcialmente coerente melhora a qualidade do registo holográfico por e meio da diminuição do ruído coerente do objeto.

Na transmissão, a redução mais eficaz de ruído obtêm-se usando iluminação espacial parcialmente coerente.

Este tipo de iluminação obtém-se através da diminuição das propriedades de coerência de um feixe laser ou por aumento da coerência espacial de uma fonte incoerente como um díodo emissor de luz por meio de um sistema ótico de filtragem.

Com o conjunto usual utilizado para reduzir a coerência espacial de um laser, o feixe de laser é focado perto de um vidro esmerilado em movimento.

Para uma dada posição do vidro esmerilado, a luz transmitida através da amostra é um campo de “speckle”. Quando o vidro esmerilado está i em movimento e supondo que o tempo de exposição é suficientemente longo para se obter um efeito médio, pode-se ver que este tipo de fonte é equivalente a uma fonte de luz espacial parcialmente coerente na qual a distância de coerência espacial é igual à média do campo BR de “speckle”. Este método para a preparação da fonte i mantém um elevado grau de coerência temporal que permite : o uso do método de fora do eixo.

No entanto, as flutuações da iluminação surgem quando são necessários tempos de exposição curtos.

Na prática, é difícil conseguir um movimento do vidro esmerilado suficientemente rápido de modo a registar objetos dinâmicos que requerem um tempo de exposição curto.

Com a configuração que aumenta a coerência espacial de uma fonte incoerente ou uma fonte não laser, mantêm-se as propriedades de incoerência temporal.

Neste caso, não é

” possível registar a informação total da amplitude . complexa num único fotograma. No que respeita ao posicionamento das amostras, podem definir-se dois tipos principais de configurações: 5 configuração diferencial, tal como descrita na EP - 1631788, em que a amostra está localizada à frente do interferómetro e configuração clássica, tal como definida + na EP 1399730, em que a amostra está localizada num braço do interferómetro.

No artigo "Resolution-enhanced approaches in digital holography" (Optical Measurement systems for Industrial inspection VI, Proc. Of SPIE, vol. 7389, 738905- 1) Paturzo et al. descrevem um dispositivo em que se utiliza um retículo para melhorar a resolução. Na configuração descrita, utilizam-se vários trajetos óticos difratados para aumentar a abertura numérica do sistema ótico. Esses diferentes trajetos óticos difratados atingem o plano de registo fora do eixo, mas mantém-se a coerência espacial e temporal. Isto significa que, tal como será explicado na descrição detalhada da presente invenção, um impulso de intensidade de luz, sob a forma de um delta de Dirac, no plano do objeto, não irá alcançar todo o plano de registo simultaneamente para todos os trajetos óticos. Assim, no caso da fonte de luz incoerente, a informação de fase será perdido nalguma parte do plano de registo.

. Objetivos da invenção i A presente invenção tem por objeto proporcionar um - interferómetro que ultrapasse as desvantagens dos interferómetros da técnica anterior.

Mais especificamente, a presente invenção tem por objetivo proporcionar um interferómetro fora do eixo capaz de trabalhar com fontes de luz parcialmente coerentes. A presente invenção também tem por objeto proporcionar | configurações de microscópios holográficos digitais (MHD) | que permitem a utilização de configurações fora do eixo, | E " o a 6 tá 2 " espacial coerente.

Isto resulta na capacidade para ' implementar um registo holográfico digital a cores rápido com níveis de ruído muito baixos.

A presente invenção ainda tem por objeto proporcionar microscópios holográficos digitais que permitem o uso de z fontes parcialmente coerentes criadas a partir de uma fonte incoerente com a configuração fora do eixo.

É uma . melhoria significativa, uma vez que permite operar O microscópio num modo rápido, sem a desvantagem de flutuações resultantes da configuração com um laser (ruído coerente). Além disso, esta aplicação permite o uso de fontes de baixo custo como LED e dá a possibilidade de gravar simultaneamente — hologramas vermelho-verde-azul para providenciar uma microscopia holográfica digital completa, sem o ruído coerente.

Sumário da Invenção Um primeiro aspeto da presente invenção está relacionado com um interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo, em que o referido interferómetro compreende: - um plano de registo perpendicular a um eixo ótico do interferómetro; - meios óticos que definem um primeiro trajeto ótico e um segundo trajeto ótico incidente no referido plano de registo, sendo os referidos primeiro e segundo trajetos z óticos não paralelos, sendo os referidos meios óticos caracterizado pelo fato z de os feixes de luz temporalmente parcialmente coerentes, que se propagam ao longo dos referidos primeiro e segundo trajetos óticos, serem capazes de interferir e produzir um contraste de margens que é independente da posição no | plano de registo.

Por fora do eixo, entende-se que pelo menos um dos feixes de luz interferente tem um ângulo diferente de zero no que diz respeito ao eixo do interferómetro ou, de forma equivalente, que os feixes de luz interferente não são

De acordo com determinadas modalidades preferidas, o ' interferómetro da presente invenção ainda tem por objeto pelo menos uma ou uma combinação adequada das seguintes características: - os referidos meios óticos compreendem um retículo - oticamente conjugado com o referido plano de registo para a produção de feixes de luz difratada; . - o retículo seleciona-se no grupo que consiste em retículos de Ronchi, retículo de difração de luz ' brilhante e retículo holográfico de fase espessa; - os meios óticos compreendem ainda uma primeira lente, estando o referido retículo localizado no plano focal posterior da referida primeira lente; - os meios óticos compreendem um segunda lente, estando o referido retículo localizado no plano focal frontal da referida segunda lente; - o interferómetro compreende ainda uma terceira lente opticamente acoplada à referida segunda lente, estando o plano de registo localizado no plano focal anterior da referida terceira lente; - o interferómetro compreende ainda um cone localizado em pelo menos um dos primeiro e segundo trajetos óticos para induzir um deslocamento do padrão produzido pela propagação de um feixe de luz em pelo menos um dos primeiro e segundo trajetos óticos no plano de registo .: para produzir um padrão diferencial de margens de interferência; . - o interferómetro inclui ainda uma barragem ótica para parar o excesso de feixes de luz difratada.

Por dois planos opticamente conjugados, num sistema ótico, entende-se que um dos planos é a imagem ótica do outro.

Alternativamente, um interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo da presente invenção compreende: - um plano de registo; - um retículo localizado num plano conjugado oticamente com o referido plano de registo, definindo o referido ' retículo um primeiro e um segundo trajetos óticos, correspondendo os referidos trajetos óticos a diferentes ordens de difração.

S Um retículo com uma periodicidade de d deflete um feixe = incidente em vários feixes que preenchem a condição: b dísen 6, + sen 69;) =mA . em que On representa o ângulo entre o feixe de luz | difratada e o retículo normal, o; é o ângulo entre o feixe de luz incidente e o retículo normal, A é oO | comprimento de onda do feixe de luz e m representa um | número inteiro chamado "ordem de difração". A luz que corresponde à transmissão direta (ou à reflexão especular, no caso de um retículo de reflexão) é E 15 designada de ordem zero e é indicada por m = 0. Os outros | feixes de luz ocorrem em ângulos que são representados por números inteiros de m diferente de zero.

Note-se que | m pode ser positivo ou negativo, resultando em ordens difratadas em ambos os lados do feixe de ordem zero.

De preferência, o referido interferómetro compreende ainda uma primeira lente, estando o referido retículo ' localizado no plano focal posterior da referida primeira lente. | Com vantagem, de preferência, o referido interferómetro compreende ainda uma segunda lente, estando o referido . retículo localizado no plano focal frontal da referida segunda lente.

À . De preferência, o referido interferómetro compreende | ainda uma terceira lente oticamente acoplada à referida É: 30 segunda lente, em que o referido plano de registo está k localizado no plano focal posterior da referida terceira | lente.

De preferência, o interferómetro compreende ainda um cone localizado em pelo menos um dos primeiro e segundo | 35 trajetos óticos para induzir uma mudança do padrão | produzido pela propagação de um feixe de luz em pelo menos um dos primeiro e segundo trajetos óticos no plano

+ + de registo para produzir um padrão diferencial de margens ' de interferência.

Vantajosamente, o referido interferómetro compreende uma barreira ótica capaz de parar, em utilização, os feixes de luz em excesso produzidos pelo retículo. s Um segundo aspeto da presente invenção está relacionado com um microscópio holográfico digital compreendendo: : - um interferómetro, tal como descrito aqui antes; - uma objetiva de microscópio;

- uma célula objeto capaz de manter um modelo a ser estudado localizado num plano focal frontal da referida objetiva do microscópio estando a referida célula objeto opticamente conjugada com o referido plano de registo;

- uma fonte de luz parcialmente coerente capaz de produzir um primeiro feixe de luz parcialmente coerente.

De acordo com determinadas modalidades preferidas, oO microscópio holográfico digital da presente invenção ainda tem por objeto pelo menos uma ou uma combinação adequada das seguintes características:

- a célula objeto é iluminada pelo primeiro feixe de luz, estando o referido microscópio objetivo situado na frente do interferómetro - o microscópio digital holográfico compreende ainda:

o um interferómetro de Mach-Zehnder compreendendo um primeiro defletor de feixes e um segundo deflector de

. feixes, sendo o referido primeiro defletor de feixes Ú capaz de dividir o referido primeiro feixe de luz num : segundo feixe de luz e num terceiro feixe de luz;

o uma primeira lente, localizada no trajeto ótico do referido terceiro feixe de luz, para focar o referido terceiro feixe de no referido retículo;

o uma segunda lente tendo o mesmo eixo ótico que a primeira lente e localizada a uma distância focal do retículo para a produção de pelo menos um feixe de luz difratada de uma ordem diferente de zero e estando o referido segundo defletor de feixes arranjado para

ND 10 t : feixe de luz difratada num feixe recombinado; : o uma barreira ótica para parar a luz difratada de ordem zero do referido terceiro de feixe de luz; o os meios de registo capazes de registar os sinais interferométricos produzidas pela interação entre o > segundo feixe de luz e o feixe de luz difratada, estando os referidos meios de registo situados no plano de º registo do referido interferómetro; o os meios de focagem para a focagem do referido feixe recombinado nos referidos meios de registo, formando a primeira lente, a segunda lente e o retículo um interferómetro, tal como descrito aqui antes e sendo os trajetos óticos do segundo e terceiro feixes de luz praticamente equivalentes (exceto no retículo e na barreira ótica); - o suporte da amostra e a objetiva do microscópio estão localizados em frente do primeiro defletor de feixe, definindo uma configuração holográfica diferencial; - o suporte da amostra e a objetiva do microscópio estão localizados no trajeto ótico do segundo feixe de luz. - uma segunda objetiva de microscópio está localizada no trajeto ótico do terceiro feixe de luz; | - o microscópio holográfica digital compreende ainda meios de compensação para equalizar o trajeto ótico do | 25 segundo e terceiro feixes de luz; | : - os referidos meios de compensação compreendem meios para compensar o suporte da amostra e/ou duas lentes para + compensar a primeira lente e a segunda lente; i - o microscópio holográfico digital compreende ainda um terceiro defletor de feixes localizado no segundo trajeto | do feixe de luz para iluminar um objeto refletor e um | quarto defletor de feixes localizado no trajeto do | | terceiro feixe de luz para iluminar um espelho de | | referência, definindo uma geometria de Mach-Zehnder; - a fonte de luz parcialmente coerente compreende meios | de iluminação selecionados no grupo que consiste num LED

Fr SS ô=D 2 22221)/a""ASNÇA nn PP iasr"ÉÊÊE A 11 Ss um laser pulsado;

: - a fonte de luz parcialmente coerente compreende uma fonte de luz térmica, de preferência filtrada para reduzir a sua largura espectral;

| 5 - a fonte de luz parcialmente coerente compreende ainda . uma primeira lente de iluminação, um orifício numa tela e uma segunda lente de iluminação para a produção de um z feixe de luz parcialmente coerente;

' - os referidos meios de registo são meios de registo sensíveis à cor e a fonte de luz produz, simultaneamente, pelo menos, três comprimentos de onda separados para O registo do interferograma holográfico a cores, de preferência, os comprimentos de onda separados correspondem a ciano magenta e amarelo (CMA) ou vermelho verde azul (RVA) para a reconstrução da cor; | - a referida fonte de luz inclui pelo menos três LED de diferentes comprimentos de onda; | - o microscópio holográfico digital compreende ainda uma fonte de excitação por fluorescência oticamente acoplada | 20 ao referido suporte da amostra; - o microscópio holográfico digital compreende ainda um filtro de barreira para evitar que a transmissão da luz proveniente da fonte de excitação alcance o plano de registo.

Por «essencialmente equivalente" entende-se que o trajeto : ótico dos segundo e terceiro feixes de luz induz uma | mudança de fase menor do que o comprimento de coerência : da fonte de luz.

Isto pode ser obtido por equalização dos comprimentos dos trajetos óticos e através da introdução dos mesmos elementos, oticamente ativos, à mesma distância, a partir da fonte de luz em ambos os trajetos, exceto para o retículo, a barreira ótica e, eventualmente, o objeto a ser observado.

Um terceiro aspeto da presente invenção está relacionado com um processo para produzir um contraste de margens entre dois feixes de luz parcialmente coerentes,

| ! 12 zo método as etapas de: : - proporcionar um feixe de luz incidente, sendo oO referido feixe de luz incidente temporariamente parcialmente coerente, - focar o referido feixe de luz incidente num retículo oa para a produção de pelo menos dois feixes de luz difratada, z —- focar os referidos feixes de luz difratada no infinito para a obtenção de feixes de luz difratada paralelos e paralelos ao feixe de luz incidente, - focar os referidos feixes paralelos de luz difratada no referido plano de registo, produzindo um contraste de i margens independente da posição no plano de registo.

Os feixes de luz difratada podem ser feixes de luz difratada de ordem zero ou de ordem diferente de zero, produzindo o feixe de luz de ordem diferente de zero o feixe de luz fora do eixo.

Um quarto aspeto da presente invenção está relacionado com um processo para registar hologramas digitais fora do eixo compreendendo as etapas de: - providenciar uma fonte de luz parcialmente coerente produzindo um primeiro feixe de luz parcialmente coerente, - dividir o primeiro feixe de luz parcialmente coerente num segundo feixe de luz e num terceiro feixe de luz, . —- focar o terceiro feixe de luz num retículo para dividir o referido terceiro feixe de luz num feixe de luz : difratada de ordem diferente de zero e num feixe de luz | difratada de ordem zero, - focar o feixe de luz difratada de ordem diferente de zero e o feixe de luz difratada de ordem zero no infinito, a fim de obter um feixe de luz difratada de ordem diferente de zero e um feixe de luz difratada de ordem zero paralelos e espacialmente separados, - barrar o feixe de luz difratada de ordem zero, | - combinar o feixe de luz difratada de ordem diferente de

- focar o feixe recombinado nos meios de registo para ' obter um interferograma fora do eixo. Breve descrição dos desenhos A fig. 1 ilustra a limitação da coerência entre dois feixes de interferência secantes no plano; . A fig. 2 representa um interferómetro de acordo com a presente invenção; . A fig. 3 representa um microscópio holográfico digital de transmissão a trabalhar no modo diferencial, que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção; A fig. 4 representa um microscópio holográfico digital de transmissão que compreende um interferómetro de acordo | com a presente invenção; ! 15 A fig. 5 representa um microscópio holográfico digital de ! reflexão que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção; A fig. 6 representa um microscópio holográfico digital de transmissão a trabalhar no modo diferencial, que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção; e A fig. 7 representa um microscópio holográfico digital de transmissão com capacidades de fluorescência que compreende um interferómetro de acordo com a presente invenção. . Legendas das figuras

1. Primeiro feixe de luz . 2. Segundo feixe de luz

3. Terceiro feixe de luz 4, Meios de registo

5. Feixe de luz difratada (difração de ordem diferente de zero)

6. Feixe de luz difratada paralela de ordem diferente de zero 6'. Feixe &de luz difratada paralela de ordem de zero

7. Feixe de luz não difratada (ou difração de ordem zero)

8. Barreira ótica

15. Interferómetro da presente invenção | . 16. Espelho de referência

17. Fonte de luz de excitação por fluorescência Bsl, Bs2, Bs3 e Bs4: defletores de feixes FE: filtro de excitação R: Retículo Ll1, L2, L3, L4, L5, L6 e L7: lentes M11 e Ml12: objetivas do microscópi M1, M2 e M3: espelhos P: Orifício num écran Am: amostra de transmissão ou suporte da amostra FE: filtro espectral Ft: Fonte de iluminação GR: Grupo de rotação Rf : amostra de reflexão ou suporte da amostra C: Cunha Descrição detalhada da invenção Em interferometria, quando se usa luz parcialmente coerente, é de fundamental importância, para manter a | . coerência da luz incidente em um plano de registo, observar margens de interferência. Em muitos casos, as . margens de interferência são obtidas por divisão de um primeiro feixe de luz (incidente) num segundo e num | 30 terceiro feixe de luz e recombinando o terceiro e o segundo feixe de luz com um pequeno ângulo introduzido | entre eles. Nesse caso, o pequeno comprimento de coerência da luz incidente parcialmente coerente (a luz a ser analisada) introduz uma forte limitação: não sendo paralelos os planos de coerência de ambos os feixes, só podem interferir numa pequena área na interseção entre os dois o MO DM a ! 15 planos, não se observando nenhuma interferência quando a : distância entre os planos de coerência é maior do que o comprimento de coerência.

Isto está ilustrado na fig. 1, em que um feixe de luz perpendicular a um plano está a interferir com outro raio . de luz, não paralelo tendo um fora do eixo a em relação ao plano.

Como representado, a luz não paralela é apenas . coerente (capaz de interferir) na vizinhança do plano de coerência 14, a uma distância menor do que o comprimento de coerência 12, definindo uma área limitada 13 em que se observa a interferência.

A presente invenção tem por objeto um interferómetro, em que o plano de coerência de um feixe de luz interferente não é perpendicular à direção de propagação do feixe de luz na proximidade de um plano de registo.

Isto resulta na capacidade do feixe de luz não perpendicular interferir com um feixe de luz perpendicular e produzir um contraste de franja que é independente da posição no plano de registo.

Isto permite o registo das margens de interferência fora do eixo (margens espacialmente heteródinas), mesmo no caso de luz tendo um comprimento de coerência limitado, tal como a luz produzida por um LED, uma lâmpada de descarga gasosa,... Utilizando como primeiro feixe de luz (incidente) um feixe de luz temporariamente parcialmente coerente, os . segundo e terceiro feixes de luz nos interferómetros da técnica anterior só podem interferir nas zonas . correspondentes definidas pelo comprimento de coerência.

Isto significa que a diferença no comprimento do trajeto ótico e a mudança de fase devida aos dispositivos óticos no trajeto ótico entre o segundo e o terceiro feixes de luz devem permanecer menores do que o comprimento de coerência da fonte de luz.

A coerência temporal é a medida da correlação média entre os valores de uma onda em qualquer par de vezes, separada por intervalo de tempo 1. Caracteriza se uma onda pode interferir com ela própria num momento diferente.

O intervalo de tempo durante o qual a fase ou a amplitude º variam de um valor significativo (daí a correlação diminui num valor significativo) é definido como o tempo de coerência T.. Para t = O, o grau de coerência é perfeito, embora baixe significativamente no intervalo de . tempo t.. O comprimento de coerência L, é definido como a distância que a onda percorre no tempo 1t.. O comprimento . de coerência pode ser estimado pela fórmula: Lc = 21n(2) Nº In AA em que A representa o comprimento de onda da luz, AA representa a largura espectral da fonte e n representa o índice de refração da propagação.

Para uma fonte LED típica, isto representa alguns comprimentos de onda até várias dezenas de comprimentos de onda.

Por exemplo, para um LED tendo um comprimento de onda de 650 nm e uma largura de banda espectral de 15 nm (valores típicos para os LED disponíveis comercialmente), o comprimento de coerência é de cerca de 20 A.

Isto significa que o feixe de referência fora do eixo não pode ter uma mudança de fase superior ao tempo de coerência, em qualquer lugar no plano de registo.

Isto também significa que o número de margens induzido pela diferença de ângulo entre o feixe de referência e o feixe objeto não pode ser mais do que cerca de 20, o que é uma limitação forte. . O tempo de coerência limitado também pode resultar da duração do impulso de um laser de impulso ultra-curto. . Normalmente, esse laser pulsado tem uma duração de impulso de vários femtossegundos e assim o comprimento do impulso limita-se a alguns comprimentos de onda.

Neste caso, o tempo de coerência é igual à duração do impulso.

Novamente, isto também significa que o número de margens induzido pela diferença de ângulo entre o feixe referência e o feixe objeto não pode ser maior do que o número do comprimento de onda que representa o comprimento do impulso.

De preferência, para evitar esta limitação em ambos os casos, a presente invenção tira partido das propriedades ' particulares dos retículos de difração para a produção de um feixe de referência fora do eixo, sem perturbar a coerência temporal dos feixes interferentes no plano de registo. + No interferómetro 15, da presente invenção, coloca-se um retículo de difração G no plano focal posterior de uma . lente L5 colocada nos eixos óticos de um feixe de luz incidente 9. O retículo G grade induz a divisão do feixe de luz incidente 9 num feixe difratado 5 (referência) e ' num feixe de luz não difratada 7 (sendo eventualmente o | feixe objeto). Em seguida, uma segunda lente L6, colocada a uma distância focal do retículo G, dá uma nova forma tanto ao feixe difratado como ao feixe não difratado em feixes paralelos ao eixo ótico.

Seleciona-se L5, L6 e O retículo G para se obter, atrás de L6, dois feixes de luz espacialmente separados, um feixe difratada e um feixe de luz não difratada.

O feixe de luz não difratada pode tornar-se ou o feixe objeto ou pode ser eliminado por uma barreira ótica.

Neste último caso, um outro feixe objeto pode ser providenciado por uma estrutura ótica maior, como será descrito aqui a seguir.

O feixe difratado é então recombinado com o feixe objeto e focado, por meio de uma lente de objetiva L7 num plano de registo, estando o plano de registo localizado no plano focal posterior de . L7. | Como o feixe difratado é paralelo ao eixo ótico da L7, .: mas não está centrado neste eixo ótico, L7 irá originar, no referido feixe difratado, um ângulo fora do eixo. | Alternativamente, os feixes de luz interferentes podem ser quaisquer pares de feixes de luz difratada com diferentes ordens de difração.

Por exemplo, o feixe de luz difratada de ordem +1 pode ser selecionado como o feixe de luz de referência e o feixe de luz difratada de ordem -1 pode ser selecionado como o feixe objeto.

De preferência, utiliza-se uma barreira ótica para parar todos os feixes exceto os dois feixes de luz difratada selecionados para interferir no plano de gravação. ] Pode-se demonstrar que, em tal configuração, o retículo não perturba a coerência temporal de nenhum dos feixes de luz difratada de ordem diferente de zero.

A coerência temporal está relacionado com o trajeto do caminho ótico. ” Por isso, é equivalente demonstrar que um impulso ótico temporário, que ilumina os planos focais posteriores de . L5 e L4, num determinado momento, simultaneamente ilumina todo o plano focal posterior L7. Considerando que um retículo G, do qual a transparência é definida por g(x,y) = (1 + sen Kx)/2, é iluminado por uma onda plana monocromática de amplitude A.

Assumindo que o par de lentes L6-1L7 é um sistema afocal (formando L6-L7 um sistema do tipo 4f), a amplitude no plano de registo é dada por: Uy(x,y) = B exp $ 4nví(fç + enbofz00-20] (1) ec f7 f, em que B é uma constante que não desempenha um papel significativo, j = V-l1, v representa a frequência ótica, c representa a velocidade da luz em vácuo e f;5, f; são as distâncias focais de L6 e L7. Calculando a contribuição de apenas um feixe difratado no plano de registo, a eq. (1) torna-se:

. u'”, (x,y) = B' exp Ganviss + f7) tes E x | (2) ce f7 . em que K= 2n/A, sendo A o período espacial do retículo.

B' é uma constante que não desempenha um papel importante.

A iluminação por um impulso de Dirac temporal com a forma de delta obtém-se através da resolução da transformada de Fourier da eq. (2): u'v(x,y) = profees, + so so [3% À (3) c f7 na qual t representa o tempo, a eq. (3) expressa o fato de um impulso de luz espacialmente uniforme no plano ' focal frontal de L6 ir simultaneamente chegar a toda a parte no plano focal posterior de L7, sem intervalo de tempo, dependendo da posição de (X,y). A parte exponencial expressa o fato de o feixe ser incidente em | . relação ao plano do sensor com um ângulo de inclinação em | relação ao eixo ótico.

Quando os trajetos óticos do . interferómetro da presente invenção são equalizadas, é | então possível registar o padrão de interferência em todo o plano do sensor de entre o objeto e o feixe de referência.

O ângulo de inclinação do feixe de referência providencia a configuração fora do eixo.

Tal como demonstrado, as propriedades do referido retículo são independentes do feixe de luz não difratada, compreendendo a referida configuração descrita um retículo G situado num plano conjugado com o plano de registo 10 que pode ser usado em qualquer configuração fora do eixo.

Esta conjugação pode ser obtida, por exemplo, através da utilização de um sistema do tipo 4f com um retículo entre as duas lentes L5, L6 e uma lente de focagem L7. Nesta fase, pode notar-se que o feixe difratado, que tem agora o seu plano de coerência paralelo ao plano de registo, pode interferir com qualquer feixe de luz com um trajeto ótico equivalente e tendo o seu plano de . coerência paralelo ao plano de registo.

Mais particularmente pode interferir com o feixe de luz não . difratada, mas também com outros feixes de luz difratada de outra ordem maior ou um feixe de luz que passa através de um outro braço de um interferómetro de Mach-Zehnder ou Michelson, desde que o percurso ótico não difira de mais do que o comprimento de coerência da luz incidente.

No microscópio holográfico digital fora do eixo (MHD) da presente invenção, os hologramas digitais são registados utilizando fontes de luz parcialmente coerentes.

Para se obter essas fontes de luz parcialmente coerentes, podem utilizar-se fontes de luz incoerente, tais como LED.

A

| O 20 fim de obter a coerência parcial necessária para observar ' as margens de interferência necessárias para permitir a determinação da informação de fase da luz de entrada, pode-se usar um filtro espacial.

Um primeiro exemplo de um microscópio usando um . interferómetro 15, de acordo com a presente invenção, está representado na fig. 3. Nesta figura, uma fonte de ” luz parcialmente coerente, tal como um LED está localizada no plano focal posterior de uma lente Ll.

O feixe de luz produzido é então filtrado espacialmente através de um orifício numa tela P, a fim de aumentar a sua coerência espacial.

O orifício P está localizado no plano focal posterior de uma lente L2, para iluminar uma amostra Am.

A amostra Am está localizada no plano focal posterior da objectiva do microscópio ML1 e, em seguida, segue o interferómetro 15 como previamente descrito.

O holograma, nesta figura, é registado por meio de uma câmara CCD.

Neste último caso, de preferência, insere-se uma cunha W no trajeto ótico de um dos segundo ou terceiro feixes, a fim de induzir uma ligeira mudança das imagens produzidas pelos feixes de luz difratada e não difratada, a fim de obter o interferograma diferencial tal como descrito na EP 1631788, que se incorpora aqui como referência.

Neste caso, de preferência, os meios de compensação 11 são : introduzidos no trajeto ótico do feixe de luz não difratada para compensar o deslocamento de fase . introduzido pela cunha no feixe difratado.

Alternativamente, o interferómetro 15 pode ser introduzido numa estrutura ótica maior, tal como um interferómetro de Mach-Zehnder como representado nos MHD representados nas fig. 4 a 7. Nesse caso, o feixe de luz não difratada 15 é interrompido por uma barreira ótica 8 e providencia-se o feixe objeto por um outro trajeto ótico, por exemplo, um outro braço de um interferómetro de Mach-Zehnder.

Tal como é oO caso com os microscópios holográficos habituais, um primeiro feixe de luz 1 divide-se num : segundo feixe de luz 2 e num terceiro feixe de luz 3 por meio de um primeiro defletor dos feixes Bsl e recombinado por um segundo defletor de feixes bs2 num feixe recombinado, em que os referidos segundo e terceiro . feixes de luz, interferindo no feixe recombinado, formam um padrão de interferência num meio de registo, tal como . um sensor CCD, a fim de se obter padrões de interferência.

Neste caso, o interferómetro 15 da presente invenção é inserido no braço de referência do interferómetro de Mach-Zehnder, a fim de se obter a configuração fora do eixo, sendo o feixe não difratado 6' interrompido por uma barreira ótica 8. De preferência, a presença das lentes L5 e L6 é compensada pelas lentes L3 e L4 no trajeto do feixe objeto para compensar a alteração de fase induzida pelas referidas lentes L5 e L6. De preferência, a lente L7 é colocada depois do defletor de feixe BS2 do interferómetro de Mach-Zehnder, usado para a recombinação do feixe objeto e do feixe de referência.

Isto permite partilhar as referidas lentes L7 entre o feixe objeto e o feixe de referência.

Alternativamente, a lente L7 pode ser substituída por duas lentes localizadas respetivamente no trajeto ótico do feixe de referência e no trajeto ótico do feixe . objeto, focando-se ambas as lentes de nos meios de registo, mas estando localizadas antes dos meios de . recombinação.

As configurações, incluindo fontes de excitação por fluorescência também podem ser implementadas como representado na fig.7. Como nenhum deslocamento de fase precisa de ser utilizados, o MHD descrito pode ser utilizado para registar eventos dinâmicos rápidos, gravando várias estruturas sucessivas, de modo a registar as sequências ao longo do tempo, da representação em 3D da amostra a ser observada.

Esta implementação permite a utilização de fontes de baixo custo, tais como os LED e, ' com sensores de cor, que permite o registo simultâneo de hologramas vermelhos-verdes-azuis usando a iluminação de três LED de modo a proporcionar microscopia holográfica digital a cores, sem ruído coerente. Até agora, a . implementação do microscópio holográfico digital a cores requeria o uso de processos de registo complexos. Na . presente invenção aqui descrita, as três cores podem ser gravadas simultaneamente.

Vários tipos de sensores de cor estão disponíveis comercialmente, incluindo sensores de cor única, tal como os projetos dos sensores de cor CCD e os sensores triplos. Em modelos de sensores triplos, um bloco de prisma (ou seja, um conjunto tricróico composto por dois prismas dicróicos) pode filtrar o interferograma obtido nas três cores primárias, vermelho, verde e azul, direcionando cada cor para um dispositivo de carga acoplada separado (CCD) ou um sensor de pixel ativo (sensor de imagem CMOS) montado em cada face do prisma.

Existem vários tipos de retículos de transmissão que podem ser implementados. O tipo mais simples de retículo é o retículo de Ronchi, que é constituído por uma placa ótica transparente onde se imprimem linhas opacas paralelas com uma largura de 1. Existe um espaçamento L constante e claro entre as linhas opacas consecutivas. Os . retículos de Ronchi muitas vezes têm uma largura de abertura clara igual à opaca. A quantidade significativa . que caracteriza um retículo de Ronchi e o ângulo de difração para um dado comprimento de onda é o período do retículo P=L+1. A análise da difração de um retículo de Ronchi é realizada por primeira da decomposição da função de transmitância, de acordo com uma série de Fourier. Para um dado comprimento de onda, cada componente de Fourier dá origem à uma ordem de difração caracterizada por um ângulo de difração Om, em que m representa um número inteiro e 60 representa o primeiro ângulo de difração.

A amplitude difratada em cada ordem de difração é ' proporcional à componente de Fourier correspondente. No interferómetro da presente invenção, 15, o período do retículo é selecionado de modo a garantir uma separação espacial dos feixes difratados no plano, onde se coloca a . barreira ótica 8. Geralmente, é uma das primeiras ordens de difração (m = " + 1 ou -1), que é mantida durante a incidência do feixe de referência no detetor. Uma limitação do retículo de Ronchi é a disseminação da intensidade de luz entre várias ordens de difração reduzindo assim a luz disponível para as medições por interferometria.

A fim de otimizar a eficiência da difração na ordem de difração mantida durante o processo holográfico, pode-se implementar um retículo de difração de brilho. Os retículos de difração do brilho também têm uma estrutura periódica, numa das superfícies de uma placa ótica. Neste caso, é um relevo em forma de dente de uma superfície que otimiza a eficiência da difração nas ordens de difração de m=10u m=-1l.

A fim de otimizar a eficiência da difração, é também possível implementar retículos holográficos de fase espessa. Este tipo de retículo obtém-se por registo num material fotossensível, por exemplo gelatina dicromada, do padrão de interferência entre duas ondas planas.

. Depois, a placa é tratada e é capaz de difratar a maior parte da luz numa ordem de difração de acordo com um modo . de difração de Bragg. O ângulo entre a onda e plano de registo determina o período do retículo.

As saídas analógicas podem então ser digitalizadas e tratadas por um computador de modo a obter-se uma representação tridimensional a cores das amostras.

Uma fonte parcial temporal e espacial pode ser constituída por uma fonte (Ft), uma lente de colimação (L1), um orifício (P) e uma lente (L2). A coerência temporal resulta da largura espectral da fonte (Ft). Normalmente, pode ser um LED com um espectro tendo um pico (por exemplo, o comprimento de onda A = 650 nm, 4A = Ú 15 nm) ou um conjunto de LED que origina um conjunto de picos, para alcançar o registo holográfico da cor.

O feixe é colimado pela lente (L1) e é filtrado pelo orifício (P), de modo a aumentar a coerência espacial. . Pode-se demonstrar que a dependência da coerência espacial emergente, que emerge da lente (L2), é uniforme . e pode ser modelada por uma função de coerência y(x1- X2,Y17Y2), em que (x1,Vy1) E (X2,y2) são as coordenadas espaciais perpendiculares ao eixo ótica z.

Esta implementação da fonte parcialmente coerente não é limitativa e poderia ser realizado de outras maneiras, tais como, com um feixe de laser não correlacionado, por meio de vidro moído em movimento.

Descrição das modalidades preferidas da presente invenção Configuração de Mach-Zehnder O esquema do microscópio holográfico digital, com base numa configuração de Mach-Zehnder, que permite o registo fora do eixo com fontes óticas, de coerência espacial e temporal parciais, está representado na fig.4. No caso da fig. 4, a fonte de luz é constituída por uma fonte (Ft), uma lente de colimação (Ll), um orifício (P) e uma lente (L2). Após uma reflexão do espelho Ml, o feixe é defletido por BSl no feixe objecto que ilumina a amostra na transmissão . e no feixe de referência, que é dirigido novamente para a lente do microscópio ML2. A imagem do plano focal frontal . de Ml1 é formada pelo conjunto das lentes Mll1, L3, Id e l L7. Para formar a imagem, o plano focal posterior de L3 é correspondente ao plano focal frontal de L4 e o sensor está localizado no plano focal posterior de L7. Nesta configuração, o interferómetro da presente invenção 15 é representado pelas lentes L5, L6 e L7 e o retículo : G.

As lentes Ml1, L3 e L4 têm os seus homólogos no braço de referência, respetivamente, as lentes NMl2, L5, L6, de tal forma que os feixes de referência e objeto, exceto para a amostra, o retículo G e a barreira ótica 8 são quase idênticos.

Isto garante um alinhamento adequado ' dos dois feixes no sensor, onde interferem.

Isto é requerido pela natureza espacial coerente e parcial da iluminação.

O plano focal frontal da lente Ml2, onde o componente : opcional C, que pode ser um percurso ótico compensador e/ou atenuador, é visualizado numa imagem no plano focal . posterior de L5, que também é o plano focal frontal L6 em que G é o retículo.

O papel do retículo é redirecionar a luz por difração de tal modo que o objeto incidente e os feixes de referência em L7 estão espacialmente separados e propagam-se em paralelo.

Tal como já foi demonstrado, esta configuração com L5, G, L6 e L7 permite a manutenção da coerência temporal no plano do sensor, no caso de coerência temporal parcial e produz interferência fora do eixo.

A lente L7 sobrepõe os feixes objeto e referência no sensor com um ângulo médio entre eles que tem origem na difração do retículo.

Nesta configuração, o espelho M2 é paralelo a BS2 e M3 é paralelo a BSl.

Esta orientação relativa dos defletores do feixe e os espelhos permitem ajustar, sem alterar as posições dos feixes no sensor, o trajeto ótico pela rotação do conjunto de rotação CR, em que o espelho e M2 e o defletor do feixe BS2 estão rigidamente ligados.

Por conseguinte, a configuração permite igualar os trajetos óticos dos feixes referência e objeto. ' Esta configuração pode ser adaptada a amostras refletoras, como representado na fig. 5. Nesse caso, o suporte da amostra Am é removido e o espelho M2 é substituído por um terceiro defletor do terceiro de feixes BS3 que ilumina uma amostra refletora Rs através da objetiva da lente ML1. A luz refletida pela amostra e focada pela objetiva da lenta é redirecionada pelo terceiro defletor de feixes BS3 em direção ao segundo defletor de feixes, como na configuração anterior.

A mesma modificação aplica-se ao percurso ótico do feixe de referência, sendo a amostra substituída por um espelho de ' referência 16.

Configuração diferencial A configuração de Mach-Zehnder é adequada para aplicações em que as variações do trajeto ótico introduzidas pelo . objeto estão limitadas: no caso de uma espessura do objeto muito flutuante, a densidade da franja pode - tornar-se demasiado elevada para ser registada pelo sensor.

Além disso, com uma iluminação temporal parcial reduzida, na configuração de Mach-Zehnder, o ajuste fino do trajeto ótico, quando o objeto é mudado, pode ser difícil. Por essa razão, propôs-se o microscópio holográfico digital diferencial. Neste último caso, é a fase ótica diferencial que é medida, apresentando as vantagens de uma gama dinâmica maior para a medição da fase e o ajustamento permanente do interferómetro, independentemente da espessura da amostra. Vantajosamente, a configuração fora do eixo com fontes parcialmente coerentes, espacialmente e temporalmente, pode ser usada no modo diferencial. O esquema ótico está representado na fig.6.

Uma fonte espacial e temporalmente parcialmente coerente é constituída por uma fonte (Ft), uma lente de colimação

25. (L1), um orifício (P) e uma lente (L2). O feixe é . colimado pela lente (11) e é filtrado pelo orifício (P), * de modo à aumentar a coerência espacial.

. Após uma reflexão pelo espelho Ml, o feixe de luz ilumina a amostra e é transmitido pela lente do microscópio M1l1.

O feixe de luz proveniente da Ml11 é em seguida defletido por BSl1 em dois feixes correspondentes a um segundo e a um terceiro feixe de luz. A imagem do plano focal frontal de Mll, localizada dentro da amostra, é formada pelo conjunto das lentes Ml1, L3, I4 e L7. Para este efeito, o plano focal posterior de L3 é coincidente com o plano focal frontal de L4 e o sensor está localizado no plano focal posterior de L7. Da mesma maneira, a imagem do plano focal da frente de Ml1 é formada pelo conjunto de ' lentes Ml1, L5, L6 e L7, com o plano focal posterior de L3 correspondendo ao plano da focal frontal de L4. A distância entre L4 e L7 é idêntica à distância entre L6 e LI. - Por conseguinte, o mesmo plano do plano da amostra, que corresponde ao plano focal frontal de Ml11, é visualizado . no sensor CCD.

Introduz-se um desvio entre as imagens formadas pelo segundo e terceiro feixes luz por rotação ligeira do espelho M2 ou do espelho M3. É um desvio de apenas alguns pixels ou até menos do que um pixel no sensor CCD.

As contrapartes das lentes L3 e IL4 do primeiro canal ótico 1, respetivamente, as lentes L5, L6, estão situadas no trajeto ótico do terceiro feixe de luz de tal maneira que o trajeto ótico tanto do segundo como do terceiro feixes de luz, exceto para a amostra, o retículo G e a barreira ótica 8, são idênticos.

Isto permite um alinhamento apropriado com o pequeno desvio dos dois canais no sensor, onde são interferentes.

O plano focal frontal da lente Ml11 é visualizado no plano focal posterior de L5, que também é o plano focal frontal de L6, onde está o retículo G.

O papel do retículo é redirecionar a luz por difração de tal modo que os feixes incidentes dos dois canais em L1L7 estão espacialmente separados.

A lente L7 sobrepõe os dois feixes no sensor . com um ângulo médio entre eles que tem origem na difração do retículo.

Na configuração, o espelho M2 é quase . paralelo a BS2 e M3 a BSl.

Estas orientações relativas dos defletores de feixes e os espelhos permitem ajustar, sem alterar as posições dos feixes no sensor, o trajeto ótico por rotação do conjunto de rotação CR, a que oO espelho M2 e o defletor do feixe BS2 estão rigidamente ligados.

Por conseguinte, a configuração permite igualar os feixes dos trajetos óticos objeto e de referência.

O ângulo médio entre o feixe objeto e o feixe de referência no sensor proporciona a configuração fora do eixo.

Como já foi demonstrado, existe um alinhamento apropriado, mesmo no caso de uma fonte de coerência S temporal parcial, a fim de proporcionar homogeneamente um padrão de margens contrastado sobre todo o sensor CCD. Deve notar-se que se pode colocar um atenuador no trajeto ótico do segundo feixe de luz para compensar a perda de . luz proveniente do retículo. Pode-se inserir uma placa ótica transparente no trajeto ótico do terceiro feixe de . luz de modo a compensar a diferença do percurso ótico introduzido entre os dois canais pelo atenuador.

Pode-se utilizar uma fonte de fluorescência 17 quando a amostra de interesse é fluorescente tal como representado na fig. 7. O seu feixe reflete-se pelo defletor do feixe fluorescente através da lente MlIl para iluminar a amostra. O sinal fluorescente que se propaga para trás é transmitido pela Ml1 e espectralmente filtrado por SF a fim de remover a parte de excitação por fluorescência antes de incidir em BSl. Como a lente Ml1 está limitada por uma abertura, o sinal fluorescente incoerente tem uma coerência espacial parcial quando emerge da Mlli, donde resulta que os dois feixes são capazes de interferir, desde que o desvio seja menor do que o comprimento de coerência espacial.

A presente invenção também está descrita em detalhe na prioridade do pedido de patente EP com o número

09.172.561.A4, cuja descrição é aqui integralmente . incorporada como referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES ] 1. Interferómetro para microscopia holográfica digital fora do eixo, caracterizado pelo fato de compreender: - um plano de registo (10); - um retículo (G) localizado num plano conjugado - oticamente com o referido plano de registo (10) definindo o referido retículo (G) um primeiro e um . segundo trajeto ótico, correspondendo os referidos trajetos óticos a ordens de difração diferentes.
2. Interferómetro, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma primeira lente (L5), estando o referido retículo (G) localizado no plano focal posterior da referida primeira lente.
3. Interferómetro, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma segunda lente (L6), estando o retículo (G) localizado no plano focal frontal da referida segunda lente (L6) e uma terceira lente (L7) oticamente acoplada à referida segunda lente (L6), estando o referido plano de registo (10) localizado no plano focal anterior da referida terceira lente (17).
4, Interferómetro, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma barreira ótica (8) capaz de parar, em utilização, os feixes de luz em excesso produzidos c pela retículo (G).
5. Microscópio holográfico digital, caracterizado pelo . fato de compreender: - um interferómetro (15), confore definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4; - uma objetiva de microscópio (ML1); ' - uma célula objeto (Am) capaz de suportar uma amostra a ser estudada localizada num plano focal frontal da ! referida objetiva do microscópio, estando a referida : 35 célula objeto (Am) oticamente conjugada com o referido | plano de registo (10); - uma fonte de luz parcialmente coerente capaz de o 2 produzir um primeiro feixe de luz parcialmente coerente ] (1).
6. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a célula objeto (Am) ser iluminada pelo primeiro feixe de luz (1), . estando a referida objetiva (ML1) do microscópio localizada na frente do interferómetro (15) e em que uma - cunha (W) está localizada no segundo trajeto ótico do referido interferómetro para a produção de um holograma diferencial.
7. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender ainda: - um interferómetro de Mach-Zehnder compreendendo um primeiro defletor de feixe (Bsl) e um segundo defletor de feixe (Bs2), sendo o referido primeiro defletor de feixe (Bsl1) capaz de dividir o referido primeiro feixe de luz num segundo feixe de luz (2) e num terceiro luz feixe (3); - uma primeira lente (L5), localizada no trajeto ótico do referido terceiro feixe de luz (3), para a focagem do referido terceiro feixe de luz no referido retículo (G); - uma segunda lente (L6) com o mesmo eixo ótico que a primeira lente (L5) e localizada à distância focal do retículo (G) para a produção de pelo menos um feixe de luz difratada de ordem diferente de zero e estando o : referido segundo defletor de feixe (Bs2) arranjado de . forma a recombinar o referido segundo feixe de luz e o referido feixe de luz difratada num feixe recombinado; - uma barreira ótica para parar a luz difratada de ordem zero do referido terceiro feixe de luz; - meios de registo capazes de registarem sinais de interferometria produzidos pela interação entre o segundo feixe de luz e o feixe de luz difratada, estando os referidos meios de registo localizados no plano de registo (10) do referido interferómetro (15); - meios de focagem (L1L7) para focar o referido feixe

. recombinado nos referido meios de registo, formando, a primeira lente, a segunda lente e o retículo, o interferómetro de acordo com as reivindicações 1 a 5 e sendo o trajeto ótico dos segundo e do terceiro feixes de luz praticamente equivalentes.

”
8. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o suporte da | . amostra (Am) e a objetiva do microscópio estarem | localizados em frente do primeiro defletor (Bsl) do feixe, definindo uma configuração holográfica diferencial.
9. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o suporte da amostra e a objetiva (Mll) do microscópio estarem localizados no trajeto ótico do segundo feixe de luz (2).
10. Microscópio holográfico digital, de acordo com a | reivindicação 9, caracterizado pelo fato de uma segunda objetiva (Ml12) do microscópio estar localizada no trajeto | ótico do terceiro feixe de luz (3).
11. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender ainda um terceiro defletor de feixe (BS3), localizado no trajeto do segundo feixe de luz para iluminar um objeto refletor (Ra) e um quarto defletor de feixe (BS4) localizado no trajeto do terceiro feixe de luz para . iluminar um espelho de referência (16), definindo uma geometria de Mach-Zehnder. .
12. Microscópio holográfico digital, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 12, caracterizado pelo fato de a fonte de luz parcialmente coerente compreender meios de iluminação (Ft) selecionados no grupo consistindo em um LED, uma lâmpada de descarga de gás, fontes de energia térmica e laser pulsado.
13. Microscópio holográfico digital, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 12, caracterizado pelo fato de os referidos meios de registo serem meios de registo sensíveis à cor e a fonte de luz produzir,

é R simultaneamente, pelo menos três comprimentos de onda separados, para registar o interferograma holográfico de cor.
14. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de a referida - fonte de luz compreender pelo menos três LED de comprimentos de onda diferentes. .
15. Microscópio holográfico digital, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de os comprimentos de onda distintos corresponderem a Ciano, Magenta e Amarelo (CMA) ou a Vermelho Verde Azul (VVA) para a reconstrução da cor. |
16. Microscópio holográfico digital, de acordo com | qualquer uma das reivindicações de 5 a 15, caracterizado pelo fato de compreender uma fonte de excitação por fluorescência (17) oticamente acoplada ao referido suporte da amostra.
17. Processo para a produção de um contraste de margens entre dois feixes de luz parcialmente coerente, temporariamente não paralelos, caracterizado pelo fato de o referido processo compreender as etapas de: - proporcionar um feixe de luz incidente (9), sendo o referido feixe de luz incidente temporariamente parcialmente coerente, - focar o referido feixe de luz incidente num retículo . (G) para a produção de pelo menos dois feixes (5, 7) de luz difratada; & —- focar os referidos feixes de luz difratada no infinito para a obtenção de feixes de luz difratada (6,6') paralelos ao feixe de luz incidente (9), - focar os referidos feixes paralelos de luz difratada no referido plano de registo, produzindo um contraste de margens independente da posição no plano de registo.
18. Processo para registar hologramas digitais fora do eixo, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - providenciar uma fonte de luz parcialmente coerente

, . produzindo um primeiro feixe de luz parcialmente coerente (1); - dividir o primeiro feixe de luz parcialmente coerente num segundo feixe de luz (2) e num terceiro feixe de luz 5 (3); - - focar o terceiro feixe de luz (3) num retículo (G) para dividir o referido terceiro feixe de luz (3) num feixe de " luz difratada (5) de ordem diferente de zero e num feixe de luz difratada (7) de ordem zero; - focar o feixe de luz difratada de ordem diferente de zero e o feixe de luz difratada de ordem zero no infinito, a fim de se obter um feixe de luz difratada (6) de ordem diferente de zero e um feixe de luz difratada (6') de ordem zero, paralelos e espacialmente separados; - barrar o feixe de luz difratada de ordem zero; - combinar o feixe de luz difratada (6) de ordem diferente de zero com o segundo feixe de luz (2) num feixe recombinado; - focar o feixe recombinado nos meios de registo para obter um interferograma fora do eixo.

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