CN103336419B - 一种两步相移干涉相位显微一次成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两步相移干涉相位显微一次成像系统及方法，基于典型的马赫-曾德尔干涉光路，采用侧向位移分光镜分别对样品光与参考光进行分光，利用波片作为相移器，通过单次曝光，可同时采集到两幅干涉图，经相应的相位恢复运算可快速实现相位成像，进而解构相位体的空间形态结构。本发明适用于所有的干涉相位显微成像系统，包括传统的同轴干涉、离轴干涉以及轻微离轴干涉。本发明在相位显微方面具有广泛的实用价值与应用前景，特别是在生物细胞形态识别应用领域。

Description

一种两步相移干涉相位显微一次成像系统及方法

技术领域

本发明属于成像技术领域，具体涉及一种基于两步相移下的干涉相位显微一次成像技术。

背景技术

众多的生物样品，如活细胞，大部分是透明的，而且表现为相位物体。为了使得这些相位物体清晰可见，一般需要将相位信息转换为强度分布，为此相位显微成像技术应运而生。尤其是近十几年来，各种定量相位显微成像技术被相继提出，为类似于生物细胞的相位物体的显微观察与动力学行为等研究提供了强有力的工具。而相位显微成像技术大部分都是基于光的干涉原理，所以常也称此类技术为干涉相位显微成像技术。对于同轴干涉而言，一般会结合时域相移技术获取多幅干涉图而实现相位成像，如专利技术CN201010106282.5（基于衍射光栅的物参共路相移数字全息显微装置），它是通过移动其中的光栅来实现相移的，从而采集到多幅图像，然后根据相移运算呈现出所需要的相位信息；又如美国GabrielPopescu教授提出的傅里叶相位显微技术以及他的专利技术US2009290156(A1)（Spatiallightinterferencemicroscopyandfouriertransformlightscatteringforcellandtissuecharacterization：空间光干涉显微镜与细胞组织的傅里叶变换光散射传输方法），他通过采用相位调制器来调节参考光的相位以及运用四步相移运算来实现相位成像。上述这些技术具有很好的先进性和独特性，如物光与参考光共光路使得整个光路表现出很好的稳定性，但是分时获取至少三幅干涉图，一方面耗时，另一方面很难保证许多参量在改变参考光的位相过程中不发生变化，所以仅在静态样品的观察中发挥着很好的作用。对于离轴干涉显微，具有单次拍摄的特性，可以很好地用于相位物体发生快速现象的研究，如专利技术CN20110374950.7（用于希尔伯特相位成像的系统和方法），它是基于典型的马赫-曾德尔干涉光路，并采用希尔伯特积分变换处理干涉图像而实现相位成像。需注意的是，为了避免显微物镜所引起的球面二次相位误差，在样品臂与参考臂上增加了相同的显微物镜，但是光学器件的增加，一定程度上会导致噪声的变大。另外，此系统也需要经过高通滤波分离出干涉项，这就导致了不能够充分利用CCD的空间带宽。对此，美国杜克大学AdamWax教授提出了介于同轴干涉与离轴干涉之间的轻微离轴干涉技术，仅需采集两相移干涉图样就可实现相位成像，不足的是这两干涉图像是分时获得的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种两步相移干涉相位显微一次成像系统及方法，使同时适用于同轴与离轴干涉，也包括轻微离轴干涉，在单次曝光下同时采集到两幅干涉图，节约采集时间，实现相位物体快速相位显微成像。

为了实现上述目的，本发明采用马赫-曾德尔干涉光路，基于后放大干涉的原理并结合两步相移技术，提出了一种两步相移干涉相位显微一次成像技术，构造独立的双通道干涉系统，具体技术方案如下：

一种两步相移干涉相位显微一次成像系统，采用马赫-曾德尔干涉光路，其特征在于包括用于分光的第一侧向位移分光镜9和第二侧向位移分光镜11、用于旋转的第二反射镜10、用于改变参考光位相的波片12以及置于干涉系统后用于放大的显微镜14；沿着激光器1的输出方向依次连接由第一透镜2、针孔空间滤波器3、第二透镜4组成的透镜扩束准直系统以及第一分光镜5，所述的第一分光镜5将激光分为物光与参考光，沿物光方向依次放置有第一反射镜6、载物台7、样品8、第一侧向位移分光镜9；沿参考光方向依次放置有第二反射镜10、第二侧向位移分光镜11；经所述第二侧向位移分光镜11得到的偏离原参考光束通道的参考光经过波片12；经所述第一位移分光镜9得到的两物光与经所述第二侧向位移分光镜11和波片12得到的两参考光通过第二分光镜13，并经置于其后的的显微镜14放大，在CCD15上形成两相移干涉图，并存储在计算机16上。

所述的第一侧向位移分光镜9与第二侧向位移分光镜11结构相同，其内两胶层分别镀半透半反膜和全反射膜，且与底面交角45°，保证一光束被分成两严格平行的光束，并沿原来光束的方向进行传输；两侧向位移分光镜其内两胶层面的距离相等，保证两干涉图样仅发生由波片12产生的相移。

一种利用所述的两步相移干涉相位显微一次成像系统进行成像的方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，激光束经第一分光镜5分成透射光束和反射光束两束光；所述的透射光束透过样品8作为样品光，并通过第一侧向位移分光镜9分成与原样品光束传输方向相同的两平行光束O _Ⅰ与O _Ⅱ；

第二步，所述的反射光束经过第二反射镜10与第二侧向位移分光镜11将参考光分为与原参考光束传输方向相同的两独立平行光束R _Ⅰ与R _Ⅱ，这两光束的间距与样品光束O _Ⅰ与O _Ⅱ的间距相同；

第三步，在R _Ⅱ的参考臂上增加一波片，改变参考光的相位；

第四步，样品光束O _Ⅰ、O _Ⅱ与参考光束R _Ⅰ、R _Ⅱ对应相遇形成双通道干涉系统，仅需单次曝光，可在CCD上采集到仅有波片12引起的两幅相移干涉图样；然后由相应的相位恢复运算可实现定量相位成像。

所述的第二反射镜10通过旋转可改变参考场的传输方向，经第二侧向位移分光镜11分出的两参考光束，并经过第二分光镜13也会发生相应的改变，由此可根据需要，观察采集到的干涉图像来调整第二反射镜10的角度自由切换同轴干涉与离轴干涉。

本发明的工作原理如下:

激光器1光源发出水平方向的光束，向前传输通过由第一透镜2、针孔滤波器3与第二透镜4组成的扩束准直系统后又传输至第一分光镜5被分为水平方向的透射光束和垂直向上的反射光束，透射光束继续水平向前传输遇到第一反射镜6改为垂直向上传输的光束，该光束通过放置在可调节的载物台7上的样品8作为样品光，然后进入到第一侧向位移分光镜9被分为仍垂直向上传输的两样品光：O _Ⅰ、O _Ⅱ，并继续传输通过第二分光镜13，然后进入显微镜14系统；所述的由第一分光镜分成的反射光束垂直向上传输遇到第二反射镜10改为沿水平方向传输的光束，该光束通过第二侧向位移分光镜11被分成两水平方向的参考光束：R _Ⅰ、R _Ⅱ，并继续向前传输，其中偏离原光束的参考光R _Ⅱ会通过一波片12，其相位发生变化，与参考光束R _Ⅰ继续水平传输至第二分光镜13被反射为垂直向上的两光束，并与两样品光相遇而对应产生干涉，即：沿原样品光通道传输的样品光O _Ⅰ与沿原参考光通道传输的参考光R _Ⅰ相干涉，偏离沿原样品光通道传输的样品光O _Ⅱ与偏离原参考光通道传输的参考光R _Ⅱ相干涉，从而形成双通道干涉系统，且两干涉场的相位之差仅为波片12引起的相位差；其实若调整第二反射镜10的转向，可改变两参考光的传播方向，与样品光可发生同轴、离轴或是轻微离轴干涉；干涉后的图样经干涉系统后的显微镜14放大，并记录在后面的CCD15上，经相应的相位恢复运算，就可获得样品的定量相位图样，由相位与光程差的关系可解构出相位体的形态结构。

本发明具有有益效果。1、通过采用侧向位移分光镜分别对样品光与参考光进行分光，尤其是样品光，形成双通道干涉，结构简单，易于操作；2、采用典型的马赫-曾德尔干涉光路保证了本发明系统的可靠性与稳定性；3、本发明相位成像系统采用波片作为相移器发生同步相移，单次曝光可同时采集到两幅干涉图，耗时少，利于样品实时相位信息的提取以及快现象的研究；4、通过旋转第二反射镜，同轴干涉与离轴干涉可自由转换，还包括能够有效利用CCD空间带宽的轻微离轴干涉；5、显微物镜位于干涉系统之后，可减少相位噪声。因此，本发明系统应用面广，具有很好的实用价值。

附图说明

图1是本发明两步相移干涉相位显微一次成像系统及方法对应的光路示意图。

图中：1：激光器；2：第一透镜；3：针孔空间滤波器；4：第二透镜；5：第一分光镜；6：第一反射镜；7：可调载物台；8：样品；9：第一侧向位移分光镜；10：第二反射镜；11：第二侧向位移分光镜；12：波片；13：第二分光镜；14：显微镜；15：CCD;16：计算机；O _Ⅰ：样品光束Ⅰ；O _Ⅱ：样品光束Ⅱ；R _Ⅰ：参考光束Ⅰ；R _Ⅱ：参考光束Ⅱ。

具体实施方式

结合图1，本发明的两步相移干涉相位显微一次成像系统及方法是通过马赫-曾德尔干涉光路实现的。

激光器1发出的激光通过由第一透镜2、针孔空间滤波器3和第二透镜4组成的扩束准直系统，然后传输到第一分光镜5将光束分为相互垂直的透射光束和反射光束两束光；透射光束沿水平方向继续前进，直到遇到第一反射镜6将光束转为垂直向上的光束，然后通过可调载物台7以及样品8成为携带样品信息的样品光，样品光继续传输至第一侧向位移分束镜9内的分光面被分成两束光，其中一样品光仍沿原来方向垂直向上传输：O _Ⅰ，另一样品光垂直原样品光传输方向向内传输，然后通过第一侧向位移分束镜9内的第二个胶层全反射面转为垂直向上：O _Ⅱ，这两样品光束相互平行，继续垂直向上传输通过第二分光镜13；经第一分光镜5分成的反射光束垂直向上传输，遇到可调的第二反射镜10，此时倾斜角为45°，将光束改为水平方向传输，此光束未通过样品而作为参考光，参考光束继续传输到第二侧向位移分束镜11内的分光面被分为沿水平方向传输：R _Ⅰ和垂直水平方向向内传输的两光束，其中向内传输的参考光经第二侧向位移分束镜11内的全反射面也转为沿水平方向传输：R _Ⅱ，然后参考光束R _Ⅱ通过一波片12，其相位发生变化；第一侧向位移分束镜9与第二侧向位移分束镜11具有相同的结构，只是放置的位置不同，因此沿水平方向传输的两参考光束R _Ⅰ和R _Ⅱ与沿垂直方向传输的两样品光束O _Ⅰ和O _Ⅱ之间的间距相同，两参考光束水平传输至第二分光镜13被反射向上传输，此时两样品光束与两参考光束对应产生同轴干涉，需注意的是，位于参考臂上的第二反射镜10可旋转以改变参考场的传播方向，可使得通过第二分光镜13后的参考光束与样品光束的传输方向有一定的倾斜而发生离轴干涉；样品光束与参考光束相干涉后经过显微镜进行放大，在CCD15上形成两相移干涉图样，最后通过对应的两步相移相位恢复运算就可实现定量相位成像，这个过程在计算机16上操作完成。

Claims (2)

1.一种两步相移干涉相位显微一次成像系统，采用马赫-曾德尔干涉光路，其特征在于：

包括用于分光的第一侧向位移分光镜(9)和第二侧向位移分光镜(11)、用于旋转的第二反射镜(10)、用于改变参考光位相的波片(12)以及用于放大的显微镜(14)；沿着激光器(1)的输出方向依次连接扩束准直系统以及第一分光镜(5)，所述的扩束准直系统由第一透镜(2)、针孔空间滤波器(3)、第二透镜(4)组成，所述的第一分光镜(5)将激光分为物光与参考光，沿物光方向依次放置有第一反射镜(6)、载物台(7)、样品(8)、第一侧向位移分光镜(9)；沿参考光方向依次放置有第二反射镜(10)、第二侧向位移分光镜(11)；所述物光透过所述第一侧向位移分光镜(9)被分为沿物光传输方向的第一路物光O _Ⅰ和平行于物光传输方向的第二路物光O _Ⅱ；所述参考光透过所述第二侧向位移分光镜(11)被分为沿参考光传输方向的第一路参考光R _Ⅰ和平行于参考光传输方向的第二路参考光R _Ⅱ；所述第一路物光O _Ⅰ与第二路物光O _Ⅱ之间的间距等于所述第一路参考光R _Ⅰ与第二路参考光R _Ⅱ之间的间距；所述第二路参考光R _Ⅱ通过波片(12)继续传输，并与向前传输的第一路物光O _Ⅰ、第二路物光O _Ⅱ和第一路参考光R _Ⅰ共同通过第二分光镜(13)，然后经置于所述第二分光镜(13)后面的显微镜(14)放大，在CCD(15)上形成两幅相移干涉图，并存储在计算机(16)上；所述两幅相移干涉图，其中一幅是第一路物光O _Ⅰ与第一路参考光R _Ⅰ形成的干涉图样，另一幅是第二路物光O _Ⅱ与第二路参考光R _Ⅱ形成的干涉图样；

所述第一侧向位移分光镜(9)与第二侧向位移分光镜(11)结构完全相同且包括内两胶层，所述内两胶层分别镀半透半反膜和全反射膜，且所述内两胶层均与第一侧向位移分光镜(9)或第二侧向位移分光镜(11)的底面交角45°，保证一光束被分成两严格平行的光束，并沿原来光束的方向进行传输。

2.一种利用如权利要求1所述的两步相移干涉相位显微一次成像系统进行成像的方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，激光束经第一分光镜(5)分成透射光束和反射光束两束光；所述的透射光束透过样品(8)作为物光，并通过第一侧向位移分光镜(9)分成沿所述物光传输方向的第一路物光O _Ⅰ和平行于所述物光传输方向的第二路物光O _Ⅱ；所述第一侧向位移分光镜(9)中的内两胶层分别镀半透半反膜和全反射膜，且所述内两胶层与第一侧向位移分光镜(9)的底面交角45°，保证了所述第一路物光O _Ⅰ与第二路物光O _Ⅱ平行；

第二步，所述的反射光束作为参考光，经过第二反射镜(10)与第二侧向位移分光镜(11)分成沿所述参考光传输方向的第一路参考光R _Ⅰ和平行于所述参考光传输方向的第二路参考光R _Ⅱ；所述第二侧向位移分光镜(11)与所述第一侧向位移分光镜(9)结构完全相同，保证了所述第一路参考光R _Ⅰ与第二路参考光R _Ⅱ平行，且所述第一路参考光R _Ⅰ与第二路参考光R _Ⅱ之间的距离与第一路物光O _Ⅰ与第二路物光O _Ⅱ之间的距离相等；

第三步，在所述第二路参考光R _Ⅱ的光路上增加一波片(12)，改变所述第二路参考光R _Ⅱ的相位；

第四步，所述第一路物光O _Ⅰ、第二路物光O _Ⅱ与所述第一路参考光R _Ⅰ、第二路参考光R _Ⅱ对应相遇形成双通道干涉系统，仅需单次曝光，可在CCD上采集到仅相差由波片(12)引起相移的两幅相移干涉图样；然后由相应的相位恢复运算可实现定量相位成像。