JP2013039425A5

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Filing date: 2012-11-02
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Description

実施例Ｉ−ＮｉＣｏｌｌ／ＭＰＣＩＰＮヒドロゲル［ＮｉＣｏｌｌ／ＭＰＣ，バイオポリマー／合成ポリマーの完全ＩＰＮ］
材料
ニッポンコラーゲン（ブタ皮膚）；
０．６２５Ｍモルホリノエタンスルホン酸［バッファー］（ＡａｌｉｚａｒｉｎＲｅｄＳｐＨ指示薬（６．５ｍｇ／１００ｍｌ水）を含有するＭＥＳ）；
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）と、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）と、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）［生体適合性合成モノマー］は、ＢｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（英国）から購入した。
ＮａＯＨ溶液（２Ｎ）と、ＰＥＧ−ジアクリレート［架橋剤］（Ｍｗ＝５７５ダルトン）と、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）と、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）は、シグマ・アルドリッチ社から購入した。

ＮｉＣｏｌｌ／ＭＰＣＩＰＮヒドロゲルの調製
まず、氷水浴中の、プラスチック製Ｔ字管で連結された２つのシリンジにおいて、１３．７重量％ニッポンコラーゲン溶液０．３ｍｌおよび０．６２５ＭＭＥＳ０．１ｍｌを混合した。続いて、ＭＰＣ１２．９ｍｇ（コラーゲンとＭＰＣの比は４：１（ｗ／ｗ））をＭＥＳ０．２５ｍｌに溶解し、得られた溶液の０．２ｍｌを、１００μｌマイクロシリンジで上記の混合物中に注入した。次いで、ＰＥＧ−ジアクリレート４．６μｌを、５００μｌマイクロシリンジを使用して注入し、ＰＥＧ−ジアクリレートとＭＰＣとの重量比を１：２にした。別段の指定がない限り、ＰＥＧ−ジアクリレート［生体適合性合成モノマー］とＭＰＣの比は、１：２で一定である。次いで、その溶液を完全に混合した。次に、２％ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤ溶液（ＭＥＳ中）２５μｌを、１００μｌマイクロシリンジで注入し［ＭＰＣが重合し、ＰＥＧ−ジアクリレートの架橋により合成ネットワークが形成される］、続いてＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（ＭＥＳ中）５７μｌを注入し［連続的なＩＰＮ］、ＥＤＣ：ＮＨＳ：コラーゲンＮＨ_２のモル比を３：３：１にした［バイオポリマーが形成される］。この研究では、ＥＤＣとコラーゲンの比も一定に維持した。ＮａＯＨ（２Ｎ）を使用して、ｐＨを約５に調整した。均一な混合物をガラス製の型に流し込み、室温にて湿度１００％で１６時間インキュベートした。後硬化するために、その型を３７℃で５時間インキュベータに移した。
同様の方法で、コラーゲンとＭＰＣの比１：１、２：１、３：１を有する「ＮｉＣｏｌｌ／ＭＰＣＩＰＮヒドロゲル」と示されるＩＰＮを調製した。
［連続的なＩＰＮ：コラーゲン→合成モノマーの重合→合成ポリマーの架橋→コラーゲンの架橋］

実施例ＩＩ［ＮｉＣｏｌｌ／ＭＰＣ，バイオポリマー及び合成ポリマーの双方がネットワークを形成しているＩＰＮ］
−ＮｉＣｏｌｌ／ＭＰＣＩＰＮヒドロゲル
本実施例では、コラーゲン溶液濃度を１３．７％から２０％に上げることによって、ＥＤＣ／コラーゲンＮＨ_２比を１．５：１にし、実施例Ｉと同様に製造されたＩＰＮの特性を変化させる能力を実証することを目的に実験を行った。さらに、ｐＨ指示薬を含有しないＭＥＳを使用した。

ＮｉＣｏｌｌ／ＭＰＣＩＰＮヒドロゲルの調製
まず、氷水浴中の、プラスチック製Ｔ字管で連結された２つのシリンジにおいて、２０．０重量％ニッポンコラーゲン溶液０．３ｍｌおよびＭＥＳ（０．６２５Ｍ）０．１ｍｌを混合した。次に、ＭＰＣ１２．９ｍｇ（コラーゲンとＭＰＣの比４：１（ｗ／ｗ））をＭＥＳ０．２５ｍｌに溶解した。得られた溶液の０．２ｍｌを、１００μｌマイクロシリンジで上記の混合物中に注入した。次いで、ＰＥＧ−ジアクリレート４．６μｌを５００μｌマイクロシリンジで注入し、ＰＥＧ−ジアクリレートとＭＰＣとの重量比を１：２にした。その溶液を完全に混合した。次に、２％ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤ溶液（ＭＥＳ中）２５μｌを１００μｌマイクロシリンジで注入し、続いてＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（ＭＥＳ中）８６μｌを注入し、ＥＤＣ：ＮＨＳ：コラーゲンＮＨ_２のモル比を１．５：１．５：１にした。均一な混合物をガラス製の型またはプラスチック製の型（厚さ５００μｍ）に流し込み、室温にて湿度１００％で１６時間インキュベートした。後硬化するために、その型を３７℃で５時間インキュベータに移した。
［連続的なＩＰＮ：コラーゲン→合成モノマーの重合→合成ポリマーの架橋→コラーゲンの架橋］

実施例ＩＩＩ［コラーゲン／キトサン］
−視力向上眼用デバイスのための新規な生合成素材
この実施例における組織工学素材は、従来から知られている素材と比較して、向上した靱性および弾性を有する、本質的に頑丈な移植素材である。この素材はコラーゲンをベースとするが、キトサンなどのバイオミメティック分子（biomimetic molecule）も組み込まれる。バイオミメティック分子は、ヒト角膜中で発見された天然細胞外マトリックス分子（ＥＣＭ）に匹敵し、それと同時に引張り強さを著しく向上させる。さらに、コラーゲン／キトサン足場を安定化するため、ハイブリッド架橋システムが開発されて使用され、素材の弾性および靱性がさらに向上した。これらの向上した素材の機械的性質、光学的性質、および生物学的性質を試験した。その結果から、足場は、強靭、弾性であり、かつ光学的透明性においてアイバンクのヒト角膜よりも優れており、ｉｎｖｉｔｒｏでの角膜細胞および神経の再生を可能にすることが示唆されている。

材料および方法［２種のバイオポリマー；キトサンは多糖（ポリマー）である］
ベース材料は、Ｉ型アテロコラーゲン１０％（ｗ／ｖ）とキトサン３％（ｗ／ｖ）の混合物を含む。日本ハム株式会社（日本）から入手した凍結乾燥されたブタコラーゲン粉末を冷水（滅菌ｄｄＨ_２Ｏ）に溶解し、４℃で攪拌して、濃度１０％（ｗ／ｖ）を得た。０．２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）にキトサン粉末（フルカ社から入手、ＭＷ４００００）を溶解し、４℃で攪拌することによって、３％（ｗ／ｖ）キトサン溶液も調製した。次いで、架橋前に均一なブレンドを調製するために、２つの溶液を所定の比で、シリンジシステム中で混合した。様々な架橋剤（つまり、ＰＥＧジアルデヒドおよびＥＤＣ／ＮＨＳ）を使用して、架橋剤およびバイオミメティック成分（biomimetic component）の種類および濃度に基づく特有の性質を有する相互侵入ネットワーク（ＩＰＮ）を形成した（表７参照）。
［２種のバイオポリマーの同時架橋］

コラーゲンベースの角膜移植片（ＩＰＮ−ＩＩ）の作製［コラーゲン／キトサン］
ルアーガラス製シリンジにおいて、３％キトサン溶液０．０２ｍｌを１０％コラーゲン溶液０．６ｍｌに添加した［モル比０．１：１のキトサン：コラーゲン］。次いで、テフゼル（Ｔｅｆｚｅｌ）Ｔ字管を使用して、この組成物をＭＥＳバッファー０．４ｍｌと混合した。次いで、ＭＥＳバッファー０．３５ｍｌ中にて約０〜４℃で気泡捕捉せず、その混合物をハイブリッド架橋剤［ＰＥＧ：ＮＨ_２のモル当量比が０．２５：１であり、ＥＤＣ：ＮＨ_２のモル当量比が４．５：１であり、ＥＤＣ：ＮＨＳのモル当量比が１：１である］と混合した。Ｔ字管を通して第１シリンジと第２シリンジの間で繰り返しポンピング（pumping）することによって、その組成物を完全に混合した。

ＩＰＮ−ＩＩ（ＥＰ１０−１１）：
ＰＥＧ−ジブチルアルデヒド（ＭＷ４１３２ダルトン、ネクター社から入手）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で構成されるハイブリッド架橋システムを使用して、コラーゲン／キトサンブレンドを架橋した。コラーゲン／キトサンブレンド、およびＰＥＧ−ＥＤＣ／ＮＨＳハイブリッド架橋剤を酸性ｐＨ約５にて共に混合し、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーを使用してｐＨの急上昇（surge）を防いだ。十分に混合した後、混合組成物の一部を型に注ぎ、型内で硬化させて、ＩＰＮ−ＩＩを形成した。
［実施例ＩＩＩにおいて、ＩＰＮ−ＩＩ，ＰＥＧ−ジアクリレート，ＥＤＣ／ＮＨＳを添加］

実施例ＩＶ−コラーゲン／ＰＡＡＩＰＮヒドロゲル［バイオポリマー及び合成ポリマーの双方がネットワークを形成しているＩＰＮ］
材料
ニッポンコラーゲン（ブタ皮膚）
０．６２５Ｍモルホリノエタンスルホン酸［ＡａｌｉｚａｒｉｎＲｅｄＳｐＨ指示薬（６．５ｍｇ／１００ｍｌ水）を含有するＭＥＳ］
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）
アクリル酸（ＡＡ）をアルドリッチ社から購入した。
ＰＥＧ−ジアクリレート（Ｍｗ５７５）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）は、アルドリッチ社によって提供された。

コラーゲン／ＰＡＡＩＰＮヒドロゲルの調製
第１に、氷水浴中の、プラスチック製Ｔ字管で連結された２つのシリンジにおいて、１０．０重量％ニッポンコラーゲン溶液０．３ｍｌおよびＭＥＳ（０．６２５Ｍ）０．１ｍｌを混合した。第２に、ＡＡ３０μｌ（コラーゲンとＡＡの比１／１（ｗ／ｗ））を上記混合物中に１００μｌマイクロシリンジで注入した。第３に、ＰＥＧ−ジアクリレート５．０μｌを５０μｌマイクロシリンジで注入し、ＰＥＧ−ジアクリレートとＡＡとの重量比を１：５にした。別段の指定がない限り、ＰＥＧ−ジアクリレートとＡＡの比は、１：５で一定である。次いで、その溶液を完全に混合した。第４に、２％ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤ溶液（ＭＥＳ中）２５μｌを１００μｌマイクロシリンジで注入し、続いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（ＭＥＳ中）５７μｌを注入し、ＥＤＣ：ＮＨＳ：コラーゲンＮＨ_２のモル比を６：６：１にした。本実施例では、ＥＤＣとコラーゲンの比も一定に維持した。均一な混合物をガラス製の型に流し込み、室温にて湿度１００％で１６時間インキュベートした。次いで、後硬化するために、得られた型を３７℃で５時間インキュベータに移した。得られたヒドロゲルは、頑丈かつ透明であった。
［連続的なＩＰＮ：コラーゲン→合成モノマーの重合→合成ポリマーの架橋→コラーゲンの架橋］

実施例Ｖ［素材の潜在的な用途のみ記載］
−角膜に対する、眼への、薬物、生理活性因子送達システムにおける素材の適用
生理活性ペプチドまたは成長因子が組み込まれた生合成素材が開発されている。これらの素材は、主に角膜代替物として有用であり、特に、生理活性ＹＩＧＳＲ（ラミニン）ペプチドを組み込んだ後に、角膜細胞の再生および切断された角膜神経の再成長を促進することが示されている（Li et al. 2003, 2005）。素材は、成長因子の送達に適応させることもできる（Klenker et al. 2005）。

実施例ＶＩ［開示ハイドロゲルの用途のみ記載］
−眼の前区画（anterior compartment）および後区画（posterior compartment）のための接着剤
角膜断裂などの角膜穿通性創傷を修復するために、縫合は、有効な方法であった。しかしながら、縫合には、手術時間が長くなったり、外科技術が必要とされるなど、いくつかの不利点がある。縫合は、著しい局所的な歪みおよび高レベルの乱視も生じさせる恐れがある。緩い縫合は、細菌の温床となり、炎症および組織の壊死を起こす恐れがある。さらに、縫合によって、著しい不快感が起こり得る。さらに、非生分解性縫合糸は、除去する必要があり、そのため患者の経過観察が長くなる。

実施例ＶＩＩ［ＲＨＣ−ＩＩＩ／ＭＰＣの双方がネットワークを形成しているＩＰＮ］
−コラーゲン１２．１％（ｗ／ｗ）を有する組換えヒトＩＩＩ型コラーゲン−ＭＰＣＩＰＮ
第１に、氷水浴中の、プラスチック製Ｔ字管で連結された２つのシリンジにおいて、１２．１重量％ＩＩＩ型コラーゲン溶液０．３ｍｌおよびＭＥＳ（０．６２５Ｍ）０．１ｍｌを混合した。第２に、ＭＰＣ（コラーゲンとＭＰＣの比１／１（ｗ／ｗ））５０ｍｇをＭＥＳ０．１３８ｍｌに溶解し、その０．１ｍｌを１００μｌマイクロシリンジで上記混合物中に注入した。第３に、ＰＥＧ−ジアクリレート（Ｍｎ＝５７５）１６μｌを１００μｌマイクロシリンジで注入し、ＰＥＧ−ジアクリレートとＭＰＣとの重量比を１：２にした。次いで、その溶液を完全に混合した。第４に、２％ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤ溶液（ＭＥＳ中）２５μｌを１００μｌマイクロシリンジで注入し、続いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（ＭＥＳ中）５７μｌを注入し、ＥＤＣ：ＮＨＳ：コラーゲンＮＨ_２のモル比を３：３：１にした。均一な混合物をガラス製またはプラスチック製の型（厚さ５００μｍ）に流し込み、室温に湿度１００％で１６時間放置した。次いで、後硬化するために、その型を３７℃で５時間インキュベータに移した。
［連続的なＩＰＮ：コラーゲン→合成モノマーの重合→合成ポリマーの架橋→コラーゲンの架橋］

実施例ＶＩＩＩ［コラーゲン／キトサン、バイオポリマー／バイオポリマー］
−コラーゲンまたはコラーゲンヒドロゲル
実施例ＩＩＩと同様に、このセクションに記載の眼科素材は、従来から知られている素材と比較して、向上した靱性および弾性を有する、本質的に頑丈な移植可能な素材である。この素材はコラーゲンをベースとするが、ヒト角膜中で発見された天然細胞外マトリックス分子（ＥＣＭ）に匹敵し、それと同時に引張り強さを著しく向上させる、キトサンなどのバイオミメティック分子（biomimetic molecule）も組み込まれる。さらに、架橋システムが開発され、コラーゲンおよびコラーゲン／キトサン足場を安定化するために使用され、素材の弾性および靱性がさらに向上した。これらの向上した素材の機械的性質、光学的性質、および生物学的性質に関して試験した。その結果から、足場は、強靭、弾性であり、かつ光学的透明性においてアイバンクのヒト角膜よりも優れており、ｉｎｖｉｔｒｏでの角膜細胞および神経の再生を可能にすることが示唆されている。

材料および一般法
ベース材料は、Ｉ型アテロコラーゲン１０％（ｗ／ｖ）とキトサン３％（ｗ／ｖ）の混合物を含む。日本ハム株式会社（日本）から入手した凍結乾燥されたブタコラーゲン粉末を冷水（滅菌ｄｄＨ_２Ｏ）に溶解し、４℃で攪拌して、濃度１０％（ｗ／ｖ）とした。０．２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）にキトサン粉末（フルカ社から入手、ＭＷ４００００）を溶解し、４℃で攪拌することによって、３％（ｗ／ｖ）キトサン溶液も調製した。次いで、架橋前に均一なブレンドを調製するために、２つの溶液を所定の比でシリンジシステムにおいて混合した。ＰＥＧ−ジブチルアルデヒド（ＭＷ３４００ダルトン、ネクター社）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などの様々な架橋剤を使用して、架橋剤およびバイオミメティック成分（biomimetic component）の種類および濃度に基づいた特有の性質を有する相互侵入ネットワークを形成した（表８参照）。
［ＰＥＧ−ジブチルアルデヒド及びＥＤＣ／ＮＨＳを添加］

実施例ＩＸ［コラーゲン／キトサン、バイオポリマー／バイオポリマー］
−ＥＤＣ／ＮＨＳおよびＰＥＧ−ジブチルアルデヒドによって架橋されるコラーゲンヒドロゲル（ＨＰＮ−３）の製造
ルアーガラス製シリンジにおいて、テフゼル（Ｔｅｆｚｅｌ）Ｔ字管を使用して、１０％コラーゲン溶液０．６ｍＬをＭＥＳバッファー０．４ｍｌと混合した。ＰＥＧ−ジブチルアルデヒドおよびＥＤＣ／ＮＨＳ［ＰＥＧ：ＮＨ_２のモル当量比が０．３６：１であり、ＥＤＣ：ＮＨ_２のモル当量比が５．４：１であり、ＥＤＣ：ＮＨＳのモル当量比が１：１である］で構成される架橋システムを使用して、ＭＥＳバッファー０．３５ｍｌ中にて約０〜４℃で気泡捕捉せず、コラーゲンブレンドを架橋した。ＭＥＳバッファーを使用して、架橋反応中、ｐＨ５を維持した。Ｔ字管を通して第１シリンジと第２シリンジの間で繰り返しポンピング（pumping）することによって、その組成物を完全に混合した。
［ＰＥＧ−ジブチルアルデヒド及びＥＤＣ／ＮＨＳを添加］

実施例Ｘ［コラーゲン／キトサン；２種の架橋剤；バイオポリマー／バイオポリマー］
−ＥＤＣ／ＮＨＳおよびＰＥＧ−ジブチルアルデヒドで架橋されるコラーゲン−キトサンヒドロゲルの製造（ＨＰＮ−４）
ルアーガラス製シリンジにおいて、１５％コラーゲン溶液０．６ｍＬに３％キトサン０．０３６ｍＬを添加した［キトサン：コラーゲンのモル比を０．０１：１とした］。次いで、テフゼルＴ字管を使用して、この組成物をＭＥＳバッファー０．４ｍｌと混合した。ＭＥＳバッファー０．３５ｍｌ中にて約０〜４℃で気泡捕捉せず、ＰＥＧ−ジブチルアルデヒドおよびＥＤＣ／ＮＨＳ［ＰＥＧ：ＮＨ_２のモル当量比は０．３：１であり、ＥＤＣ：ＮＨ_２のモル当量比は４．５：１であり、ＥＤＣ：ＮＨＳのモル当量比は１：１である］で構成されるハイブリッド架橋システムを使用して、コラーゲン／キトサンブレンドを架橋した。ＭＥＳバッファーを使用して、架橋反応中、ｐＨ５を維持した。Ｔ字管を通して第１シリンジと第２シリンジの間で繰り返しポンピング（pumping）することによって、その組成物を完全に混合した。

実施例ＸＩ［１５％コラーゲンのみ；２種の架橋剤］：
ＥＤＣ／ＮＨＳおよびＰＥＧ−ジブチルアルデヒドによって架橋されるコラーゲンヒドロゲルの製造（ＨＰＮ−５）
テフゼルＴ字管を使用して、ルアーガラス製シリンジ中の１５％コラーゲン溶液０．６ｍＬをＭＥＳバッファー０．４ｍｌと混合した。ＭＥＳバッファー０．３５ｍｌ中にて約０〜４℃で気泡捕捉せず、ＰＥＧ−ジブチルアルデヒドおよびＥＤＣ／ＮＨＳ［ＰＥＧ：ＮＨ_２のモル当量比が０．３６：１であり、ＥＤＣ：ＮＨ_２のモル当量比が５．４：１であり、ＥＤＣ：ＮＨＳのモル当量比が１：１である］で構成されるハイブリッド架橋システムを使用して、コラーゲンブレンドを架橋した。ＭＥＳバッファーを使用して、架橋反応中、ｐＨ５を維持した。Ｔ字管を通して第１シリンジと第２シリンジの間で繰り返しポンピング（pumping）することによって、その組成物を完全に混合した。

実施例ＸＩＩ［２０％コラーゲンのみ］：
ＰＥＧ−ジブチルアルデヒドによって架橋されるコラーゲンヒドロゲルの製造（ＨＰＮ−６）
テフゼルＴ字管を使用して、ルアーガラス製シリンジ中の２０％コラーゲン溶液０．６ｍＬをＭＥＳバッファー０．４ｍｌと混合した。ＭＥＳバッファー０．３５ｍｌ中にて約０〜４℃で気泡捕捉せず、ＰＥＧ−ジブチルアルデヒド［ＰＥＧ：ＮＨ_２のモル当量比が１：１である］を使用して、コラーゲンブレンドを架橋した。ＭＥＳバッファーを使用して、架橋反応中、ｐＨ５を維持した。Ｔ字管を通して第１シリンジと第２シリンジの間で繰り返しポンピング（pumping）することによって、その組成物を完全に混合した。

実施例ＸＩＩＩ［２０％コラーゲンのみ；１種の架橋剤；実施例ＸＩＩの架橋剤：ポリマー比の半分；非ＩＰＮ］：
ＰＥＧ−ジブチルアルデヒドによって架橋されるコラーゲンヒドロゲルの製造（ＨＰＮ−７）
一般に、テフゼルＴ字管を使用して、ルアーガラス製シリンジ中の２０％コラーゲン溶液０．６ｍＬをＭＥＳバッファー０．４ｍｌと混合した。ＭＥＳバッファー０．３５ｍｌ中にて約０〜４℃で気泡捕捉せず、ＰＥＧ−ジブチルアルデヒド［ＰＥＧ：ＮＨ_２のモル当量比が２：１である］を使用して、コラーゲンブレンドを架橋した。ＭＥＳバッファーを使用して、架橋反応中、ｐＨ５を維持した。Ｔ字管を通して第１シリンジと第２シリンジの間で繰り返しポンピング（pumping）することによって、その組成物を完全に混合した。

実施例ＸＩＶ［１２．７％ＲＨＣ−Ｉのみ；１種の架橋剤］：
組換えヒトＩ型コラーゲンおよびＥＤＣ／ＮＨＳから製造されるコラーゲンマトリックス
気泡を含有しないシリンジ混合システム中に、組換えヒトＩ型コラーゲン溶液（１２．７％（ｗ／ｗ））のアリコートを添加した。第２のシリンジからセプタム（septum）を通して、計算量のＥＤＣおよびＮＨＳ（どちらも１０％（ｗ／ｖ）、ＥＤＣ：コラーゲン−ＮＨ_２比＝０．４：１；ＥＤＣ：ＮＨＳ比＝１：１）を添加し、再び０℃で完全に混合した。最終溶液を直ちに、ガラスプレート上に分配し、平坦なフィルムを形成した。その平坦なフィルムを湿度１００％で硬化させた（２１℃で２４時間、次いで３７℃で２４時間）。フィルムを新たなＰＢＳで３回洗浄し、クロロホルム１％を含有するＰＢＳ中に保存し、無菌に維持した。他の比のＥＤＣ／コラーゲンＮＨ_２を有するゲルを同じ方法で製造した。

実施例ＸＶ［１２．７％ＲＨＣ−ＩＩＩのみ；１種の架橋剤］：
組換えヒトＩＩＩ型コラーゲンおよびＥＤＣ／ＮＨＳから製造されるコラーゲンマトリックス
気泡を含有しないシリンジ混合システム中に、組換えヒトＩＩＩ型コラーゲン溶液（１２．７％（ｗ／ｗ））のアリコートを添加した。第２のシリンジからセプタム（septum）を通して、計算量のＥＤＣおよびＮＨＳ（どちらも１０％（ｗ／ｖ）、ＥＤＣ：コラーゲン−ＮＨ_２比＝０．４：１；ＥＤＣ：ＮＨＳ比＝１：１）を添加し、再び０℃で完全に混合した。最終溶液を直ちに、ガラスプレート上に分配し、平らなフィルムを形成した。その平らなフィルムを湿度１００％で硬化させた（２１℃で２４時間、次いで３７℃で２４時間）。フィルムを新たなＰＢＳで３回洗浄し、クロロホルム１％を含有するＰＢＳ中に保存し、無菌に維持した。他の比のＥＤＣ／コラーゲンＮＨ_２を有するゲルを同じ方法で製造した。

実施例ＸＶＩ［１２．７％ＲＨＣ−ＩＩＩおよび１２．７％ＲＨＣ−ＩＩＩ；１種の架橋剤］：
組換えヒトＩ型およびＩＩＩ型デュアルコラーゲンおよびＥＤＣ／ＮＨＳから製造される角膜マトリックス
気泡を含有しないシリンジ混合システム中に、組換えヒトＩ型コラーゲン溶液（１２．７％（ｗ／ｗ））のアリコートを添加し、計量した。等量の組換えヒトコラーゲンＩＩＩ型溶液（１２．７％（ｗ／ｗ））のアリコートを同じシリンジ混合システム中に添加し、シリンジ混合システムにおいてコラーゲンＩ型およびＩＩＩ型溶液の５０／５０（ｗｔ／ｗｔ）％溶液を得た。第２のシリンジからセプタム（septum）を通して、計算量のＥＤＣおよびＮＨＳ（どちらも１０％（ｗ／ｖ）、ＥＤＣ：ＮＨ_２比＝０．４：１；ＥＤＣ：ＮＨＳ比＝１：１）を添加し、再び０℃で完全に混合した。最終溶液を直ちに、ガラスプレート上に分配し、平らなフィルムを形成した。その平らなフィルムを湿度１００％で硬化させた（２１℃で２４時間、次いで３７℃で２４時間）。フィルムを新たなＰＢＳで３回洗浄し、クロロホルム１％を含有するＰＢＳ中に保存し、無菌に維持した。他の比のＥＤＣ／コラーゲンＮＨ_２を有するゲルを同じ方法で製造した。最終ゲルの含水率は、９３．３％であった。

実施例ＸＶＩＩ［Ｃｏｌｌ−ＤＭＡ，バイオポリマー及び合成ポリマーの双方がネットワークを形成しているＩＰＮ］：
コラーゲン−合成相互侵入高分子ネットワーク
材料
ニッポンコラーゲン（ブタ皮膚）；
０．６２５Ｍモルホリノエタンスルホン酸［ＡａｌｉｚａｒｉｎＲｅｄＳｐＨ指示薬（６．５ｍｇ／１００ｍｌ水）を含有するＭＥＳ］；
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）、ＮａＯＨ溶液（２Ｎ）、ＰＥＧ−ジアクリレート（Ｍｗ５７５）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）をシグマ・アルドリッチ社から購入した。

コラーゲン−ＤＭＡＩＰＮヒドロゲルの製造
第１に、氷水浴中の、プラスチック製Ｔ字管で連結された２つのシリンジにおいて、１３．７重量％ニッポンコラーゲン溶液０．３ｍｌおよびＭＥＳ（０．６２５Ｍ）０．３ｍｌを混合した。第２に、ＤＭＡ（コラーゲンとＤＭＡとの比３／１（ｗ／ｗ））１４．２ｍｌを５０μｌマイクロシリンジで上記混合物中に注入した。第３に、ＰＥＧ−ジアクリレート（Ｍｎ＝５７５）６．１４μｌを１００μｌマイクロシリンジで注入し、ＰＥＧ−ジアクリレートとＤＭＡとの重量比を１：２にした。別段の指定がない限り、ＰＥＧ−ジアクリレートとＤＭＡの比は１：２で一定である。次いで、その溶液を完全に混合した。第４に、ＤＭＡに対して１％ＡＰＳおよび１％ＴＥＭＥＤ溶液（ＭＥＳ２５μｌ中）を１００μｌマイクロシリンジで注入し、続いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（ＭＥＳ中）５７μｌを注入し［連続的なＩＰＮ］、ＥＤＣ：ＮＨＳ：コラーゲンＮＨ_２のモル比を３：３：１にした。本実施例では、ＥＤＣとコラーゲンの比も一定に維持した。均一な混合物をガラス製の型に流し込み、室温にて湿度１００％で１６時間放置した。次いで、後硬化するために、その型を３７℃で５時間インキュベータに移した。コラーゲンとＤＭＡの比１：１、２：１および４：１を有するコラーゲン−ＤＭＡＩＰＮヒドロゲルを製造した。
［連続的なＩＰＮ：コラーゲン→合成モノマーの重合→合成ポリマーの架橋→コラーゲンの架橋］

実施例ＸＶＩＩＩ［開示ハイドロゲルの用途のみ］：
生理活性剤を含有する眼科デバイス
抗菌剤、抗ウイルス剤などの生理活性剤または神経栄養因子などの成長因子を組み込んだヒドロゲル素材は、例えば、角膜移植に有用な、または薬物送達または創傷治癒のための治療用レンズとして有用である、改良型デバイスを構成する。ＩＰＮヒドロゲル中に組み込まれる抗菌性ペプチドの例としては、限定されないが：
ペプチド番号１：
酸−ＣＧＳＧＳＧＧＧＺＺＱＯＺＧＯＯＺＯＯＺＧＯＯＺＧＹ−ＮＨ_２
ペプチド番号２：
酸−ＧＺＺＱＯＺＧＯＯＺＯＯＺＧＯＯＺＧＹＧＧＳＧＳＧＣ−ＮＨ_２

実施例ＸＩＸ［コラーゲン／ＭＰＣハイドロゲルの分解のみ記載］：
コラーゲン−ＭＰＣＩＰＮヒドロゲルのｉｎｖｉｔｒｏでの生分解
手順：
水和ヒドロゲル５０〜８０ｍｇを０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）５ｍｌを含有するバイアルに入れ、続いてコラゲナーゼ（ヒストリチクス菌、ＥＣ３．４．２４．３、シグマケミカル社）（１ｍｇ／ｍＬ）６０μｌを添加した。次いで、バイアルを３７℃で異なる時間間隔にてオーブン内でインキュベートし、表面の水を拭き取って計量するためにゲルを取り出した。初期膨潤重量に基づいて、ヒドロゲルの残存量の時間経過を追跡した。各ヒドロゲル試料において、３つの試験片を試験した。ヒドロゲルの残存量％を以下の等式で計算した：
残存量％＝Ｗ_ｔ／Ｗ_ｏ
（上記式中、Ｗ_ｏは、ヒドロゲルの初期重量であり、Ｗ_ｔは、各時点でのヒドロゲルの重量である。）

実施例ＸＸ［ＲＨＣ−ＩＩＩ／ＭＰＣバイオポリマー／合成ポリマーのＩＰＮの製造及び分解］：
ＩＩＩ型コラーゲン−ＭＰＣＩＰＮヒドロゲルの特性およびｉｎｖｉｔｒｏでの生分解
ＩＩＩ型組換えヒトコラーゲン（ｒｈｃ）−ＭＰＣＩＰＮヒドロゲルの製造
第１に、氷水浴中の、プラスチック製Ｔ字管で連結された２つのシリンジにおいて、１３．７重量％ｒｈｃＩＩＩ溶液０．３ｍｌおよびＭＥＳ（０．６２５Ｍ）０．１ｍｌを混合した。第２に、ＭＰＣ溶液（ＭＥＳ中、ＭＰＣ／コラーゲン＝２／１（ｗ／ｗ））２５０μｌを５００ｍｌマイクロシリンジで上記混合物中に注入した。第３に、ＰＥＧ−ジアクリレート９．３ｍｌを１００ｍｌマイクロシリンジで注入し、ＰＥＧ−ジアクリレートとＭＰＣとの重量比を１：２にした。次いで、その溶液を完全に混合した。第４に、２％ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤ溶液（ＭＥＳ中）２５ｍｌを１００ｍｌマイクロシリンジで注入し、続いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（ＭＥＳ中）１９ｍｌを注入し［連続的なＩＰＮ］、ＥＤＣ：ＮＨＳ：コラーゲンＮＨ_２のモル比を１：１：１にした。均一な混合物をガラス製の型に流し込み、室温、湿度１００％でＮ_２下にて２４時間放置した。次いで、後硬化するために、型を３７℃で２４時間インキュベータに移した。生成物は、Ｃｏｌｌ−ＩＩＩ−ＭＰＣＩＰＮ２−１−１とコード化した。
［連続的なＩＰＮ：コラーゲン→合成モノマーの重合→合成ポリマーの架橋→コラーゲンの架橋］

実施例ＸＸＩ［以前のコラーゲン／キトサンハイドロゲルの製造方法であり、人工角膜後面の修飾を行う］：
アルジネートグラフト化巨大分子
この実施例において、本発明者らは、コラーゲンベースの人工角膜マトリックスの後面にアルジネート巨大分子を共有結合でグラフトし、内皮細胞付着および増殖を防ぐ、二段階プラズマ補助表面改質技術（two-stage plasma-assisted surface modification technique）を開発した。