JP2013032365A - イオン交換クロマトグラフィによるタンパク質精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】連続的に実施される以下の工程:(a)当該ポリペプチドを、第1の伝導率及びpHの負荷バッファーを用いてイオン交換材料に結合させ;(b)当該イオン交換材料を第2の伝導率及び/又はpHの中間バッファーで洗浄して汚染物質をイオン交換材料から溶離し;(c)当該イオン交換材料を第3の伝導率及び/又はpHの洗浄バッファーで洗浄し、ここで、中間バッファーから洗浄バッファーへの伝導率及び/又はpHの変化が、負荷バッファーから中間バッファーへの伝導率及び/又はpHの変化と反対方向であり;(d)当該イオン交換材料を第4の伝導率及び/又はpHの溶離バッファーで洗浄してポリペプチドをイオン交換材料から溶離する。
【選択図】図3
Description
細胞細片からのタンパク質の精製方法は、まず最初にタンパク質の発現部位に依存する。幾つかのタンパク質は細胞から周囲の培地中に直接分泌され;他は細胞内で作られる。後者のタンパク質については、精製プロセスの第1の工程は細胞の溶解を含み、それは、機械的せん断、浸透圧ショック、又は酵素的処理を含む種々の方法で実施できる。このような破壊は細胞内容物全てをホモジネート中に放出させ、さらに細胞下断片を生成し、それらはサイズが小さいために除去が困難である。これらは一般に、差動的遠心分離又は濾過により除去される。同じ問題は、スケールは小さいものの、タンパク質製造の実行中での細胞の自然死及び細胞内宿主細胞タンパク質の放出により直接分泌タンパク質でも生じる。
イオン効果クロマトグラフィーはタンパク質精製に通常使用されるクロマトグラフィー技術である。イオン交換クロマトグラフィーでは、溶質の表面上の荷電パッチがクロマトグラフィーマトリクスに反対電荷によって結合するが、周囲のバッファーのイオン強度は低い。溶離は、バッファーのイオン強度(即ち、伝導率)を上昇させ、イオン交換マトリクスの荷電部位に対して溶質と競合させることにより達成される。pHを変化させ、それにより溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶離を達成する他の方法である。伝導率又はpHの変化は、徐々に(勾配溶離)又は段階的に(段階溶離)してよい。以前は、これらの変化は進行性;即ち、pH又は伝導率が一方向に増加又は減少するものであった。
(a)当該ポリペプチドを、第1の伝導率及びpHの負荷バッファーを用いてイオン交換材料に結合させ;
(b)当該イオン交換材料を第2の伝導率及び/又はpHの中間バッファーで洗浄して汚染物質をイオン交換材料から溶離し;
(c)当該イオン交換材料を第3の伝導率及び/又はpHの洗浄バッファーで洗浄し、ここで、中間バッファーから洗浄バッファーへの伝導率及び/又はpHの変化が、負荷バッファーから中間バッファーへの伝導率及び/又はpHの変化と反対方向であり;そして
(d)当該イオン交換材料を第4の伝導率及び/又はpHの溶離バッファーで洗浄してポリペプチドをイオン交換材料から溶離する。第1の伝導率及び/又はpHは第3の伝導率及び/又はpHと同じであってもよい。
好ましくは、汚染物質及びポリペプチドの溶離は、各々中間バッファー及び溶離バッファーの伝導率の変更によって達成されるが、これらのバッファーのpHはほぼ同じに維持される。
(a)当該ポリペプチドを、第1の伝導率及びpHの負荷バッファーを用いてカチオン交換材料に結合させ;
(b)当該カチオン交換材料を、負荷バッファーのものより大きな第2の伝導率及び/又はpHの中間バッファーで洗浄して汚染物質をイオン交換材料から溶離し;
(c)当該カチオン交換材料を、中間バッファーのものより小さな第3の伝導率及び/又はpHの洗浄バッファーで洗浄し;そして
(d)当該イオン交換材料を、中間バッファーのものより大きな第4の伝導率及び/又はpHの溶離バッファーで洗浄してポリペプチドをイオン交換材料から溶離する。
さらに本発明は、抗-HER2抗体及び一又は複数のその酸性変異体を含む組成物を提供し、当該組成物中の酸性変異体の量は約25%未満、好ましくは約20%未満、例えば約1%から約18%の範囲である。場合によっては、この組成物は製薬的に許容される担体をさらに含んでいる。
定義:
ここで精製されるべき「組成物」は、対象とするポリペプチド及び一または複数の汚染物質を含む。この組成物は「部分的に精製」(即ち、下記の実施例1におけるようにプロテインAクロマトグラフィー等の一または複数の精製工程を施され)ていてもよく、あるいは、ポリペプチドを産生する宿主細胞または生物から直接に得てもよい(例えば、組成物は回収した細胞培養液を含んでいてもよい)。
ここで用いられる「ポリペプチド」は、一般的には約10より多いアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。好ましくは、ポリペプチドは哺乳動物タンパク質であり、その例は、例えば、レニン;ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク;アルファ−1−アンチトリプシン;インシュリンA−鎖;インシュリンB−鎖;プロインシュリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;因子VIIIC、因子IX、組織因子、及びvonWillebrands因子等の凝固因子;プロテインC等の抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺界面活性剤;ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤(t−PA)等のプラスミノーゲン活性化剤;ボンベシン;トロンビン;造血性成長因子;腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ;エンケファリナーゼ;RANTES(正常なT細胞発現及び分泌での調節);ヒトマクロファージ感染タンパク質(MIP-1-アルファ);ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン;ミューラー阻害物質;リラキシンA−鎖;リラキシンB−鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質;DNA分解酵素;IgE;CTLA−4等の細胞毒性Tリンパ球関連抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモン又は成長因子のレセプター;プロテインA又はD;リウマチ因子;骨誘導神経向性因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、−4、−5又は−6(NT−3、NT−4、NT−5、又はNT−6)、又はNGF−β等の神経成長因子などの神経向性因子;血小板誘導成長因子(PDGF);aFGF及びbFGF等の繊維芽成長因子;表皮成長因子(EGF);TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、又はTGF−β5を含むTGF−アルファ及びTGF−ベータ等のトランスホーミング増殖因子(TGF);インシュリン様成長因子−I及び−II(IGF−I及びIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBPs);CD3、CD4、CD8、CD19及びCD20等のCDタンパク質;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSFs)、例えば、M−CSF、GM−CSF、及びG−CSF;インターロイキン(ILs)、例えば、IL−1〜IL−10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプター;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス性抗原、例えば、AIDSエンベロープの一部など;輸送タンパク質;ホーミングレセプター;アドレシン(addressins);調節タンパク質;CD11a、CD11b、CD11c、CD18,ICAM、VLA−4及びVCAM等のインテグリン;HER2、HER3またはHER4レセプター等の腫瘍関連抗原;及び上に列挙した任意のポリペプチドの断片及び/又は変異体を含む。最も好ましいのは、ヒトHER2に結合する全長抗体である。
出発ポリペプチドの「変異体」または「アミノ酸変異体」は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一般的に、変異体は天然ポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する。パーセント配列同一性は、例えば、Fitch等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1382-1386 (1983)、Needleman等, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)に記載されたバージョンのアルゴリズムにより、最大の相同性を与えるように配列を整列させた後に決定される。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ポリペプチドをコードするDNAに適当な核酸変化を導入することにより、あるいはペプチド合成により調製される。このような変異体は、例えば、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列内残基からの欠失、及び/又はそれへの挿入及び/又はその置換を含む。最終的な作成物に到達する欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終作成物が所望の特徴を持つ限りなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変更といったポリペプチドの翻訳後プロセスを変えてもよい。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体の生成方法は、例えば米国特許第5,534,615号に記載され、ここに出典明示して参考として取り入れる。
ポリペプチド分子の「脱アミド化変異体」は、最初のポリペプチドの一又は複数のアスパラギン残基がアスパラギン酸に変換された、即ち、中性アミド側鎖が全体として酸性特性を持つ残基に変換されたポリペプチドである。下記の実施例からの脱アミド化humMAb4D5抗体は、そのVL領域の一方又は両方のCDR1におけるAsn30がアスパラギン酸に変換されている。ここで用いられる「脱アミド化ヒトDNase」は、天然成熟ヒトDNaseのアミノ酸配列の位置74で生ずるアスパラギン残基で脱アミドされたヒトDNaseを意味する(米国特許第5,279,823号;出典明示してここに参考として取り入れる)。
抗-HER2抗体を含む組成物を参照してここで用いられる「混合物」とは、所望の抗-HER2抗体及びその一又は複数の酸性変異体の存在を意味する。酸性変異体は、主に脱アミド化抗-HER2抗体を含み、少量の他の酸性変異体を含んでもよい。例えば、組換え発現から得た抗-HER2抗体の調製では、抗-HER2抗体の約25%までが脱アミド化されていることが見いだされた。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特にモノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を、それらが所望の生物学的特性を有する限り包含する。
ここで使用される場合の「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基(即ち、軽鎖可変ドメインの残基24−34(L1)、50−56(L2)及び89−97(L3)及び重鎖可変ドメインの31−35(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3);Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び/又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基26−32(L1)、50−52(L2)及び91−96(L3)及び重鎖可変ドメインの残基26−32(H1)、53−55(H2)及び96−101(H3);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「FR」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。下記実施例のrhuMAb HER2抗体のCDR及びFR残基(humAb4D5-8)は、Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992)で同定されている。
抗原性を軽減するには、ヒト化抗体を生成するために使用するヒトの軽及び重可変ドメインの両方の選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列ライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151: 2296 (1993);Chothia等, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987))。
さらに、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのFR残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、CDR残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81[1985]を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上記で検討した抗体ファージライブラリから分離することができる。あるいは、Fab’-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab’)2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167[1992])。他の実施態様では、F(ab’)2はロイシンジッパーGCN4を用いて形成されてF(ab’)2分子の組立が促進される。他の方法に従うと、F(ab’)2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。
「直鎖状抗体」という表現は、この出願を通してZapata等, Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。簡単に言えば、これらの抗体は抗原結合領域の対を形成する直列のFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。直鎖状抗体は二重特異性でも単特異性でもよい。
国際公開WO 96/27011号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab’)2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab’断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab’-チオールに再転換し、他のFab’-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J. Immunol. 147:60(1991)。
「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。固相は、精製カラム、別々の粒子の不連続相、膜又はフィルター等であってよい。固相を形成する材料の例は、ポリサッカリド(例えばアガロース及びセルロース);及び他の機械的に安定な材料、例えばシリカ(例えば孔制御されたガラス)、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子及び上記の誘導体を含む。
「カチオン交換樹脂」は負に荷電した固相を意味し、よってそれは、固相の上又は中を通過する水溶液中のカチオンと交換される遊離のカチオンを有する。固相に結合してカチオン交換樹脂を形成する負に荷電したリガンドは、例えば、カルボキシレート又はスルホネートであってよい。市販のカチオン交換樹脂は、カルボキシ-メチル-セルロース、BAKERBOND ABX(商品名)、アガロース上に固定化されたスルホプロピル(SP)(例えば、SP-SEPHAROSE FAST FLOW(商品名)又はSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE(商品名)、Pharmaciaより)及びアガロース上に固定化されたスルホニル(例えば、S-SEPHAROSE FAST FLOW(商品名)、Pharmaciaより)を含む。
ここで用いられる「アニオン交換樹脂」は、正に荷電した固相を意味し、例えばそれに結合した第4級アミノ基等の一又は複数の正荷電リガンドを有する。市販のアニオン交換樹脂は、DEAEセルロース、QAE SEPHADEX(商品名)及びFAST Q SEPHAROSE(商品名(Pharmacia)を含む。
「負荷バッファー」は、対象とするポリペプチド及び一又は複数の汚染物質を含む組成物をイオン交換樹脂に負荷するのに使用するものである。負荷バッファーは、対象とするポリペプチド分子(及び一般に一又は複数の汚染物質)がイオン交換樹脂に結合するような伝導率及び/又はpHを有する。
「中間バッファー」は、対象とするポリペプチド分子の溶離に先立って、一又は複数の汚染物質をイオン交換樹脂から溶離するのに使用される。中間バッファーの伝導率及び/又はpHは、汚染物質はイオン交換樹脂から溶離されるが、対象とするポリペプチドの有意な量は溶離されないものである。
「洗浄バッファー」は、ここで用いられる場合、対象とするポリペプチド分子の溶離に先立って、イオン交換樹脂を洗浄又は再平衡化するのに使用されるバッファーを意味する。便利には、洗浄バッファー及び負荷バッファーは同じであってもよいが、そうである必要はない。
「溶離バッファー」は、対象とするポリペプチドを固相から溶離するのに使用される。溶離バッファーの伝導率及び/又はpHは、対象とするポリペプチドがイオン交換樹脂から溶離されるものである。「再生バッファー」は、イオン交換樹脂を再生して再利用できるようにするのに使用される。再生バッファーは、実質的に全ての汚染物質と対象とするポリペプチドをイオン交換樹脂から除去するのに必要な伝導率及び/又はpHを有する。
ポリペプチド及び一又は複数の汚染物質を含む組成物からポリペプチドを「精製する」とは、組成物から少なくとも1つの汚染物質を(完全又は部分的に)除去することにより組成物中のポリペプチドの純度を向上させることを意味する。「精製工程」は、ここで組成物全重量に対して少なくとも70重量%、好ましくは少なくとも80重量%の対象ポリペプチドを含む組成物を意味する「均一な」組成物をもたらす全精製プロセスの一部であってよい。
ここで用いられる「humMAb4D5-8」はヒト化抗-HER2抗体を意味し、それは配列番号:1の軽鎖アミノ酸配列及び配列番号:2の重鎖アミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列変異体を含み、HER2に結合してHER2を過剰発現する腫瘍細胞の成長を阻害する能力を保持しているものである(米国特許第5,677,171号を参照して、ここに参考として取り入れる)。
ポリペプチドの「pI」又は「等電点」は、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と均衡するpHを意味する。pIはポリペプチドのアミノ酸残基の電荷から計算でき、等電点電気泳動により決定できる(例えば、下記実施例のようにCSxクロマトグラフィーを用いて)。
イオン交換材料を「洗浄する」とは、適当なバッファーをイオン交換材料中又は上に通すことを意味する。
イオン交換材料から分子(例えばポリペプチド又は汚染物質)を「溶離する」とは、イオン交換材料周囲のバッファーのイオン強度を変えることによりそこから分子を除去し、イオン交換材料上の荷電部位に対してバッファーを分子と競合させることを意味する。
ここで使用される「標識」なる語句は、ポリペプチドに直接的に又は間接的に抱合する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(商品名), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号参照)、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
本発明はここに、ポリペプチドを、当該ポリペプチド及び一又は複数の汚染物質を含有する組成物(例えば、水溶液)から精製する方法を提供する。組成物は一般に、ポリペプチドの組換え生産から得られたものであるが、ペプチド合成(又は他の合成手段)によるポリペプチドの製造から得られたものでもよく、あるいはポリペプチドはポリペプチドの天然源から精製されてもよい。好ましくは、ポリペプチドは抗体、例えばHER2抗原に結合するものである。
ポリペプチドの組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。ポリペプチドをコードするDNAは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、ポリペプチドが抗体である場合、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば、米国特許第5,534,615号に記載されており、ここで特に参考として取り入れる)。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア又は普通のベーカーの酵母菌は、最も普通に用いられる下等真核生物宿主微生物である。しかし、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe);クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)、例えばケーラクチス(K. lactis)、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226);ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070);カンジダ;トリコデルマレーシア(reesia)(EP 244,234);アカパンカビ;シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium);及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビなどの他の多くの属、種及び株が通常利用可能であり、ここで有用である。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CVI ATCC CCL 70);;アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2);イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75);ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065);マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51);TRI細胞(Mother等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
本発明のポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。例えばハム(Ham)のF10(Sigma)、最小必須培地((MEM) Sigma)、RPMI−1640(Sigma)及びダルベッコの改変イーグル培地((DMEM), Sigma)のような市販培地が当該宿主細胞の培養に適している。さらに、Ham等, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem., 102:255 (1980), 米国特許 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 又は5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 米国再発行特許 30,985に記載された任意の培地を宿主細胞の培養培地として用いることができる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー類(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCIN(商品名)薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質も又当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
次いでポリペプチドに、ここで特許請求するイオン交換クロマトグラフィー法を含む一又は複数の精製工程を施す。イオン交換クロマトグラフィー法に先立って、その最中に、又はその後のさらなる精製方法の例は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(例えばフェニルセファロース)での分画、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相HPLC、シリカ上でのクロマトグラフィー、HEPARIN SEPHAROSE(商品名)でのクロマトグラフィー、さらなるアニオン交換クロマトグラフィー及び/又はさらなるカチオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィー(例えば、プロテインA、プロテインG、抗体、特異的基質、リガンド、又は抗原、例えば捕捉剤を用いる)を含む。
アニオン又はカチオン交換樹脂は、公知の方法によって調製される。通常は、ポリペプチド及び一又は複数の汚染物質を含有する組成物を樹脂に負荷する前に、平衡化バッファーをイオン交換樹脂に通す。便利には、平衡化バッファーは負荷バッファーと同じであるが、そうである必要はない。
クロマトグラフィーに使用される種々のバッファーは、例えば、カチオン又はアニオン交換樹脂のいずれが用いられるかによる。このことは、Fig1及び2の流れ図においてより明確に示される。
カチオン交換樹脂は、次いで、実質的に汚染物質を溶離するが実質的に対象とするポリペプチドは溶離しないような第2の伝導率及び/又はpHにある中間バッファーで洗浄される。これは、中間バッファーの伝導率又はpH、あるいは両方を増大させることにより達成される。負荷バッファーから中間バッファーへの変化は、必要に応じて段階的でも徐々にでもよい。ここでの実施例では、中間バッファーは負荷バッファーより大きな伝導率を有していた(即ち、中間バッファーの伝導率は約7.3から約8.8mmhosの範囲であった)。あるいは、Fig1に示すように、カチオン交換樹脂が用いられる本発明のこの実施態様では、中間バッファーのpHが負荷バッファーのpHを越えるようにしてもよい。例えば、中間バッファーは約5.4のpHを持ち得る。
本発明の任意の実施態様では、イオン交換樹脂はポリペプチドの溶離の後に再生バッファーで再生され、カラムを再利用できるようにする。一般に、再生バッファーの伝導率及び/又はpHは、実質的に全ての汚染物質及び対象とするポリペプチドがイオン交換樹脂から溶離されるものである。一般に、再生バッファーは、汚染物質及びポリペプチドをイオン交換樹脂から溶離させるために非常に高い伝導率を有する。
ここでのイオン交換クロマトグラフィー法に従って得られたポリペプチド調製物は、必要ならばさらなる精製工程を施してもよい。さらなる精製工程の例は上述した。
場合によっては、ポリペプチドは必要に応じて一又は複数の異種分子に抱合させる。異種分子は、例えば、ポリペプチドの血清半減期を向上させるもの(例えばポリエチレングリコール、PEG)であってよく、標識(例えば酵素、蛍光標識及び/又は放射性核種)又は細胞毒性分子(例えば毒素、化学治療薬、または放射性同位元素など)であってもよい。
また活性成分は、各々例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリペプチド-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical sciences 16th edition, Osol, A. 編, (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
ここに開示したように精製されたポリペプチド又は当該ポリペプチド及び製薬的に許容される担体を含有する組成物は、次いで、そのようなポリペプチド及び組成物について知られた種々の診断、治療又は他の用途に使用される。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物における疾患の治療に使用できる。
以下の実施例は例示を目的とし、何ら限定するものではない。明細書における全ての引用の開示は、ここに出典明示して参考として取り入れるものとする。
全長ヒトIgG rhuMAb HER2(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4285-4289 (1992)の配列番号:1の軽鎖アミノ酸配列及び配列番号:2の重鎖アミノ酸配列を含むhumAb4D5-8)をCHO細胞で組換え的に製造した。タンパク質生成及び細胞培養培地への分泌に続いて、CHO細胞を細胞培養培地から接線方向流動濾過(PROSTACK(商品名))により分離した。次いで、平衡化PROSEPA(商品名)カラム(Bioprocessing, Ltd.)にCHO細胞からの回収細胞培養流体(HCCF)を直接適用することにより、プロテインAクロマトグラフィーを実施した。
プロテインAクロマトグラフィーに続いて、スルホプロピル(SP)-SEPHAROSE FAST FLOW(商品名)(SPSFF)カラム(Pharmacia)を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを実施して所望の抗-HER2抗体分子をさらに分離した。クロマトグラフィー操作は、結合及び溶離モードで実施した。
カラム及び負荷調製:縮小スケールのSPSFFカラムを充填した。寸法は、27.0mL容量、1.0cm直径及び34.5cmベッド高さであった。プロテインAプールのアリコートのpHは、1.5Mトリス塩基で5.6に滴定した。プールの伝導率は、等量の注射用滅菌水(SWFI)の添加で低下させた。
クロマトグラフィー:この実験のために実行したクロマトグラフィーは、PharmaciaのUNICORN(商品名)FPLCシステムで実施した。平衡化、負荷、及び最初の洗浄工程は、200cm/hの線形流速で実施した。全てのクロマトグラフィー工程は、100cm/hの線形流速で実施した。クロマトグラフィー工程の順序は表1に定義した。実行した6つのクロマトグラフィーは、SPSFF樹脂1mL当たり、15, 20, 25, 30, 35, 及び40mgのrhuMAb HER2という負荷密度で実施した。
カラムは55℃において1mL/分で実行した。
クロマトグラムの比較:各クロマトグラフィーファイルからの吸収データ(AU280nm)をASCIIフォーマットのUnicornから移した。0.025M MES / 0.07M NaCl, pH5.6洗浄からのデータをExcelフォーマットに翻訳し、KALEIDAGRAPH(商品名)にコピーした。KALEIDAGRAPH(商品名)を用いて、洗浄プロフィールを上書きし(Fig6)、互いに比較した。
抗体を組み換えDNA技術で作成した場合、rhuMAb HER2の脱アミド化及び他の酸性変異体が生成された(例えば、Fig5のCSxピークa、bおよび1参照)。脱アミド化及び他の酸性変異体は、最初のプロテインAクロマトグラフィー工程で得られた組成物の(積分曲線下の面積又はCSxクロマトグラフィーで得られたプロフィールとして計算すると)約25%を構成していた。ここに記載したイオン交換クロマトグラフィー法は、抗-HER2組成物中の脱アミド化及び他の酸性変異体の量を有意に、即ち約13%又はそれ以下に減少させるのに使用できた(即ち、ここに記載したカチオン交換クロマトグラフィーを施した調製物中の酸性変異体の量は、約50%又はそれ以上減少した)。
15mg/mLから35mg/mLまでの負荷密度において、溶離プールにおける生成物収率は約75%であった。40mg/mLの負荷密度については、プールの生成物収率は65%に低下した(Fig4)。プールにおけるこの回収の低下は、(各々70mM NaCl及び50mM NaClでの)二つの洗浄工程における抗体の増加に大きく依存する。
全ての溶離プールにおけるrhuMAb HER2の量は、CSx HPIEX分析によって測定した場合に等価であった(Fig5)。負荷材料に比較して;非脱アミド化抗体の富化があり(ピーク3)、Iso-Asp102又はLys450抗体量の変化が無く(ピーク4)、Asp30脱アミド化抗体量の減少があった(ピークa、b、1、その他)。
この実験は、どれくらいのrhuMAb HER2がSPSFFに負荷できるかを決定した。樹脂1mL当たりに15から40mgの範囲の抗体では、溶離プールに回収されたrhuMAb HER2の質に相違は無かった。しかし、回収されたrhuMAb HER2の量は、樹脂に35mg/mLより大きな負荷をした場合に約10%減少した。一貫した収率のために、rhuMAb HER2製造については35mg/mLを負荷上限とすることが推奨される。さらに、20から15mg/mLの間では、必要とされる70mM NaCl洗浄容量が有意に増加するので、rhuMAb HER2の製造には20mg/mLを負荷下限とすることが推奨される。
1. ポリペプチドを、当該ポリペプチド及び汚染物質を含有する組成物から単離する方法において、連続的に実施される以下の工程:
(a)当該ポリペプチドを、第1の伝導率及びpHの負荷バッファーを用いてイオン交換材料に結合させ;
(b)当該イオン交換材料を第2の伝導率及び/又はpHの中間バッファーで洗浄して汚染物質をイオン交換材料から溶離し;
(c)当該イオン交換材料を第3の伝導率及び/又はpHの洗浄バッファーで洗浄し、ここで、中間バッファーから洗浄バッファーへの伝導率及び/又はpHの変化が、負荷バッファーから中間バッファーへの伝導率及び/又はpHの変化と反対方向であり;そして
(d)当該イオン交換材料を第4の伝導率及び/又はpHの溶離バッファーで洗浄してポリペプチドをイオン交換材料から溶離することを含んでなる方法。
2. 前記イオン交換材料がカチオン交換樹脂である、実施態様1に記載の方法。
3. 前記イオン交換材料がアニオン交換樹脂である、実施態様1に記載の方法。
4. 中間バッファーの伝導率及び/又はpHが負荷バッファーの伝導率及び/又はpHよりも大きく、洗浄バッファーの伝導率及び/又はpHが中間バッファーの伝導率及び/又はpHよりも小さい、実施態様2に記載の方法。
5. 洗浄バッファーの伝導率及び/又はpHが負荷バッファーの伝導率及び/又はpHとほぼ同じである、実施態様1に記載の方法。
6. 溶離バッファーの伝導率及び/又はpHが中間バッファーの伝導率及び/又はpHより大きい、実施態様2に記載の方法。
7. 汚染物質及びポリペプチドの溶離が、各々中間バッファー及び溶離バッファーの伝導率の変更によって達成される、実施態様1に記載の方法。
8. 各工程(a)−(d)でほぼ一定のpHが維持される、実施態様1に記載の方法。
9. ポリペプチド及び汚染物質が僅かに異なるpIを有する、実施態様1に記載の方法。
10. 汚染物質がポリペプチドの脱アミド化変異体である、実施態様1に記載の方法。
11. 中間及び溶離バッファーの伝導率が、それらの塩濃度の変化によって改変される、実施態様7に記載の方法。
12. 中間及び溶離バッファーの伝導率が、それらのNaCl濃度の変化によって改変される、実施態様11に記載の方法。
13. 工程(d)の後に、イオン交換体を再生バッファーで洗浄することをさらに含む、実施態様1に記載の方法。
14. カチオン交換樹脂がアガロース上に固定化されたスルホプロピルを含む、実施態様2に記載の方法。
15. ポリペプチドが抗体である、実施態様1に記載の方法。
16. 抗体がHER2に結合する、実施態様15に記載の方法。
17. 汚染物質がポリペプチドの脱アミド変異体である、実施態様1に記載の方法。
18. イオン交換クロマトグラフィーの前、最中又は後に、ポリペプチドを含む組成物に一又は複数の精製工程を施し、ポリペプチドの均一な調製物を得ることをさらに含む、実施態様1に記載の方法。
19. 精製したポリペプチドを異種分子と複合させることをさらに含む、実施態様18に記載の方法。
20. 異種分子が、ポリエチレングリコール、標識、又は細胞毒性薬である、実施態様19に記載の方法。
21. ポリペプチドの調製物と製薬的に許容される担体とを混合することにより製薬組成物を調製することをさらに含む、実施態様18に記載の方法。
22. 実施態様1に記載の方法に従って精製されたポリペプチド。
23. ポリペプチドを、当該ポリペプチド及び汚染物質を含有する組成物から単離する方法において、連続的に実施される以下の工程:
(a)当該ポリペプチドを、第1の伝導率及びpHの負荷バッファーを用いてカチオン交換材料に結合させ;
(b)当該カチオン交換材料を、負荷バッファーのものより大きな第2の伝導率及び/又はpHの中間バッファーで洗浄して汚染物質をイオン交換材料から溶離し;
(c)当該カチオン交換材料を、中間バッファーのものより小さな第3の伝導率及び/又はpHの洗浄バッファーで洗浄し;そして
(d)当該イオン交換材料を、中間バッファーのものより大きな第4の伝導率及び/又はpHの溶離バッファーで洗浄してポリペプチドをイオン交換材料から溶離することを含んでなる方法。
24. 抗体を、当該抗体及び汚染物質を含有する組成物から精製する方法において、当該組成物をカチオン交換樹脂上に負荷することを含んでなり、カチオン交換樹脂上に負荷される抗体の量が、カチオン交換樹脂1mL当たりに約20mgから約35mgの抗体である方法。
25. カチオン交換樹脂がアガロース上に固定化されたスルホプロピルを含む、実施態様24に記載の方法。
26. 抗体をカチオン交換樹脂から溶離することをさらに含む、実施態様24に記載の方法。
27. 抗体をカチオン交換樹脂から溶離する前の中間洗浄工程において汚染物質をカチオン交換樹脂から溶離することをさらに含む、実施態様26に記載の方法
28. 抗-HER2抗体及び一又は複数のその酸性変異体を含み、当該酸性変異体の量が約25%未満である組成物。
29. 製薬的に許容される担体をさらに含む、実施態様28に記載の組成物。
30. 抗-HER2抗体がhumMAb4D5-8である、実施態様28に記載の組成物。
31. 抗HER2抗体とその一又は複数の酸性変異体との混合物を含んでなる組成物であって、
当該酸性変異体の量がおよそ25%より少なく、
当該酸性変異体が主に、抗HER2抗体の一又は複数のアスパラギン残基が脱アミドされている脱アミド化変異体であり、
当該抗HER2抗体がhumMAb4D5−8であり、
当該脱アミド化変異体が、アスパラギン酸に転換されたhumMAb4D5−8のVL領域の何れか又は両方のCDR1にAsn30を有するものである、組成物。
32. 酸性変異体の量がおよそ20%より少ない、実施態様31に記載の組成物。
33. 酸性変異体の量がおよそ13%より少ない、実施態様32に記載の組成物。
34. 酸性変異体の量がおよそ1から18%の範囲である、実施態様32に記載の組成物。
35. 抗HER2抗体が配列番号1の軽鎖アミノ酸配列と配列番号2の重鎖アミノ酸配列とを含む、実施態様31に記載の組成物。
36. さらに、薬学的に許容される担体を含有してなる、実施態様31から35の何れか一に記載の組成物。
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