JP2012522815A - イチョウ抽出物から農薬を除去する方法および前記方法によって得られる抽出物 - Google Patents

イチョウ抽出物から農薬を除去する方法および前記方法によって得られる抽出物 Download PDF

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Abstract

イチョウ抽出物から農薬を除去する方法であって、従来の方法によって得られる抽出物を、以下のステップ:a.ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペンを含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシドを含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出ステップ;b.50%以上のギンコライド含量を有する中間物を得るための、ステップa)で得られた中間極性画分からの結晶化ステップ;c.50%以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップb)で得られた残留溶液からの結晶化ステップ;d.ステップa)で得られた高極性画分と、ステップb)およびc)で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合ステップにかけることを含む方法。

Description

本発明は、イチョウ(Ginkgo biloba)抽出物から農薬(pesticides)を除去する方法、および前記方法によって得ることのできる抽出物に関する。
先行技術
イチョウ葉抽出物は、前記抽出物の成分に起因する複数の薬理特性(血管拡張、免疫賦活、抗酸化および抗凝集(antiaggregant)特性)のために、中国の伝統医学で、および多数の欧米諸国で長く用いられてきた。
イチョウ葉抽出物の調製のための方法は、US 5700468、EP 360 556、EP 431 535およびJP 09110713に開示されている。
特に過去において、前記抽出物を生成するために用いられる植物の栽培で、その毒性が十分に報告されている有機リン化合物などの農薬が使用されてきた。多くの保健および農業当局がそのような農薬の使用を禁止または規制してきているが、植物原料の原産地を確証することは必ずしも容易ではなく、さらに農薬の使用が規制されている国でさえ、医薬または栄養用のグレードの抽出物中でのその存在が全く望ましくない殺虫作用物質の違法または不適切な使用を排除することは不可能である。特に把握が難しい問題は、近くの作物に由来する農薬によって起こり得る交叉汚染である。
汚染一般の問題は、Journal of AOAC International、第88巻(3号)、2005年、729〜735ページで述べられており、その論文は、ガスクロマトグラフィーによるイチョウ葉の有機リン農薬含量の決定方法も記載している。
US 5,660,832は、特定のpH範囲の極性溶媒による抽出、それに続く樹脂上での吸収および脱吸収を含む、農薬からの植物抽出物の一般精製方法を開示している。イチョウ葉の場合、抽出はエタノールと水との混合物で実施される。
農薬は、イチョウ抽出物中の唯一の望ましくない汚染物ではない。例えば、EP 1 968 625は、低含量のギンコトキシンとしても知られる4’−O−メチルピリドキシンおよび/またはビフラボンを含むイチョウ抽出物の多段階式調製方法を記載している。しかしこの場合、望ましくない成分は植物に天然に存在する。
最後に、EP 1 868 626は、イチョウ作物の近くでの化石燃料の使用に由来する多環芳香族炭化水素を低含量で有するイチョウ抽出物を調製する方法を開示している。記載されている方法は非常に複雑であり、11のステップ、長い調製時間、およびポリアミドなどの高価な試薬、または鉛塩などの有毒試薬の使用を含む。
事実上すべての公知の方法は、イチョウ抽出物の親油性成分(特にビフラボンおよびギンコール(ginkgols))の除去の1つまたは複数のステップを含む。前記抽出は、存在するいかなる親油性農薬含量も減少させるが、より高い極性を有する農薬は、その挙動が親水性成分(例えばフラボングリコシドおよびテルペン)の挙動により類似しているので、抽出物中に残存する。
その結果、医薬用、栄養用または化粧用の植物起源の製品中のいかなる種類の農薬の残留含量も管理しうる、特に米国での法律によって課される限度に適合するためにイチョウ葉抽出物から農薬または他の汚染物質を低減させるまたは取り除く便利な精製方法の必要性がある。
発明の説明
以下のステップを含む方法によって、イチョウ抽出物の農薬含量を低減させることができることが今や見出された:
a)ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペン(ginkgo terpenes)を含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシド(ginkgo flavone glycosides)を含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出;
b)50%以上のギンコライド含量を有する中間物(intermediate)を得るための、ステップa)で得られた中間極性画分からの結晶化;
c)50%以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップb)で得られた残留溶液からの結晶化;
d)ステップa)で得られた高極性画分と、ステップb)およびc)で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合。
残留農薬含量を取り除くまたは実質的に低減することに加えて、本発明の方法は、イチョウテルペン含量およびその相対比率の制御も可能にする。
したがって本発明は、上記の方法から入手できる、所定比率のイチョウテルペンを有する抽出物にも関する。
本発明によれば、ステップa)は、エステル、塩素化炭化水素、炭化水素とアルコールとの混合物、ケトンおよびケトンとアルコールとの混合物、好ましくはC2〜C8エステル、例えば酢酸エチルおよび酢酸t−ブチル、またはトルエン−ブタノール混合物から選択される水非混和性溶媒による抽出によって、イチョウテルペンが富化された画分およびイチョウフラボングリコシドが富化された画分を生成する。
イチョウテルペンは水とC1〜C5アルコールとの混合物中で結晶化されるが、一方、ステップc)で得られたテルペンに富む画分から結晶化するのは、水中または水とC1〜C3アルコールとの混合物中で実施される。本発明による方法は、ギンコールと共に除去されない中間極性農薬を取り除く。
本発明は、下記の例でより詳細に例示される。
例1:US 5700468およびEP 0 360 556(Indena)の例Iによって生成される抽出物の精製
1)100kgの細断葉を、約50℃の温度で、400lの60%(w/w)アセトンで4回抽出する。
2)合わせたパーコレート(the combined percolates)を、500lのヘキサンにより向流で抽出する。
3)その脱脂された溶液を真空下で200lの体積まで濃縮し、2℃で一晩放置し、その後遠心分離にかけてビフラボン画分を分離する。
4)その水溶液を、400lのn−ブタノール/トルエンの8/2 v/v混合物により向流で抽出する。
5)その有機溶液を真空下で小体積まで濃縮し、水で置き換える(substituting with water)。濃縮物を水に溶解させて(taken up with water)、約30%の乾燥残留物を含む溶液を得る。
6)その溶液を、約65lの酢酸エチルにより向流で抽出する。水相をシロップ様稠度(consistency)まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る(1.95kg)。
7)その酢酸エチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を3lの75%エタノール水溶液に溶解させる。
8)溶液を20lのヘキサンにより向流で抽出し、合わせた有機相(the combined organic phases)を取り除く。
9)その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、0.9lの50%エタノール水溶液を加える。
得られた溶液を撹拌下で還流加熱し、次に室温まで冷却させ、4日間放置して結晶化させる。
10)次にその溶液をろ過し、固体を50%EtOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、95gの精製されたギンコライドを得る。
11)その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を1.9lの水に溶解させ、撹拌下で30分間90℃に加熱する。水溶液を分離し、さらに3回残留物を90℃で1.9lの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
12)その水溶液(複数)を合わせ、14lのヘキサンにより向流で抽出する。
13)その水溶液を0.3lの体積まで濃縮し、次に0.1lの95°のEtOHを加え、溶液を撹拌下、50℃で加熱し、次に室温まで冷却させ、3日間放置して結晶化させる。
14)その溶液をろ過し、固体を20%EtOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、103gの精製されたビロバライドを得る。
15)第6、10および14項で得られた生成物を混合して、以下の特性を有するイチョウ抽出物2.15kgを得る:イチョウフラボングリコシド26.0%;ビロバライド3.2%;ギンコライド3.5%;ギンコール酸<5.0ppm;各農薬<10ppb。
例2:US 5700468、EP 0 360 556(Indena)の例IIに記載の通りに生成される抽出物の精製
1)100kgの細断葉を、約35℃の温度で、400lの50%(w/w)メタノールで4回抽出する。
2)合わせたパーコレートを40℃、真空下で100lまで濃縮し、濃縮物を100lのメタノールに溶解させ、得られた懸濁液をろ過する。
3)ろ過した溶液を、100lのトルエン/n−ブタノールの9:2混合物で3回抽出する。
4)合わせた有機相を、50lの50%メタノールにより向流洗浄する(counterwashed)。
5)その水−メタノール溶液を真空下で水溶液へ濃縮し、ろ過の後、n−ブタノール/トルエンの8:2混合物で抽出する。
6)その有機溶液を水で向流洗浄し、真空下で少量の体積まで濃縮し、水で置き換える。その溶液を水に溶解させて、20%の乾燥残留物を含む溶液を得る。
7)生じた溶液を、90lのn−ブタノール/トルエンの1:1混合物により向流で抽出する。水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る(2.05kg)。
8)そのn−ブタノール/トルエン混合物を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を3.5lの60%エタノール水溶液に溶解させる。
9)生じた溶液を20lのヘキサンにより向流で抽出し、合わせた有機相を取り除く。
10)その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、1.2lの40%エタノール水溶液を加える。
生じた溶液を撹拌下で45分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、3〜4日間放置して結晶化させる。
11)次にその溶液をろ過し、固体を40%EtOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、97gの精製されたギンコライドを得る。
12)その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を2lの水に溶解させ、撹拌下、90℃で30分間加熱する。その水溶液を分離し、さらに3回残留物を90℃の2lの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
13)その水溶液を合わせ、17lのヘキサンにより向流で抽出する。
14)その水溶液を0.4lの体積に濃縮し、0.15lの95°のEtOHを加える;生じた溶液を撹拌下、50〜55℃で30分間加熱し、次に室温まで冷却させ、3〜4日間放置して結晶化させる。
15)溶液をろ過し、固体を20%EtOHで洗浄し、60℃の真空下で乾燥させて、110gの精製されたビロバライドを得る。
16)第7、11および15項で得られた生成物を混合して、例1で得られたものに類似したイチョウ抽出物2.26kgを得る。
例3:EP 431 535(Schwabe)の例Iによって生成される抽出物の精製
1)100kgの細断葉を、57〜59℃の温度で30分間、750kgの60%(w/w)アセトンで2回抽出する。
2)合わせた抽出物を30〜40%の乾燥残留物を含む水溶液まで濃縮し、等量の水を加え、混合物を撹拌下、12℃で1時間放置する。
3)アルキルフェノールに富む沈殿物を遠心分離によって分離し、取り除く。
4)30%の硫安を清澄化された溶液に撹拌下で加え、その溶液を、1/2の体積のメチルエチルケトン/アセトンの6:4混合物で2回抽出する。
5)合わせたメチルエチルケトン/アセトン溶液を、真空下で乾燥残留物50〜70%まで濃縮し、次に水および95%エタノールで希釈して、10%の乾燥残留物を含む50%エタノール溶液を得る。
6)色が褐色から淡褐色に変化するまで、撹拌下で酢酸水酸化鉛の水溶液を加える。得られた沈殿物を、遠心分離によって取り除く。
7)遠心分離された溶液を、1/3の体積のヘキサンで3回抽出する。
8)脱脂された溶液を真空下で水溶液へ濃縮し、20%の硫安を加え、1/2の体積のメチルエチルケトン/エタノールの6:4混合物で2回抽出する。合わせた有機相を20%の硫安で洗浄し、水および形成された固体をすべて除去する。
9)次に、その透明な溶液を真空下で少量の体積に濃縮し、水で置き換える。
濃縮物を水に溶解させて、約10%の乾燥残留物を含む溶液を得る。
10)その溶液を、約100lの酢酸t−ブチルにより向流で抽出する。その水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る(1.88kg)。
11)その酢酸ブチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、0.8lの60%エタノール水溶液を加える。
生じた溶液を撹拌下で25分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、2日間放置して結晶化させる。
12)次にその溶液をろ過し、固体を60%EtOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、98gの精製されたギンコライドを得る。
13)その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を1.9lの水に溶解させ、撹拌下、90℃で30分間加熱する。水溶液を分離し、さらに3回残留物を90℃で1.9lの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
14)合わせた水溶液を0.6lの体積まで濃縮し、撹拌下、70℃まで60分間加熱し、次に室温まで冷却させ、1日放置して結晶化させる。
15)生じた溶液をろ過し、固体を水で洗浄し、真空下で乾燥させて、99gの精製されたビロバライドを得る。
16)第10、12および15項で得られた生成物を混合して、例1で得られたものに類似したイチョウ抽出物2.08kgを得る。
例4:JP 09110713(Nippon Green wave)によって生成される抽出物の精製
1)100kgの細断イチョウ葉を、50℃で30時間、500lの70%エタノールで3回抽出する。
2)合わせたパーコレートを真空下で100lまで濃縮し、濃縮物を100lの水に溶解させる。
得られた懸濁液をろ過する。
3)ろ過した溶液を100lのHP20樹脂(Mitsubishi)を含むクロマトグラフィーカラムに導入して、抽出物を吸着させる。次に、カラムを200lの水で洗浄し、200lの70%エタノールで溶出することによって抽出物を回収する。
4)その水−エタノール溶液を真空下で少量の体積に濃縮し、水で置き換える。濃縮物を20%エタノールに溶解させて、20%の乾燥残留物を含む溶液を得る。
5)生じた溶液を、70lの塩化メチレンにより向流で抽出する。水−エタノール相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る(2.4kg)。
6)そのクロロメチレン相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を4lの75%メタノール水溶液に溶解させる。
7)生じた溶液を2lのヘキサンにより10回抽出し、合わせたヘキサン相を取り除く。
8)その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、1lの50%メタノール水溶液を加える。
生じた溶液を撹拌下で30分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、5日間放置して結晶化させる。
9)次にその溶液をろ過し、固体を50%MeOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、105gの精製されたギンコライドを得る。
10)その母液を真空下で濃縮してメタノールを取り除き、次に残留物を2lの水に溶解させ、撹拌下、90℃で30分間加熱する。水溶液を分離し、さらに3回残留物を90℃で2lの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
11)合わせた水溶液を0.4lの体積まで濃縮し、0.1lのMeOHを加える;生じた溶液を撹拌下、50℃で30分間加熱し、次に室温まで冷却させ、3日間放置して結晶化させる。
12)生じた溶液をろ過し、固体を20%MeOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、102gの精製されたビロバライドを得る。
13)第5、9および12項で得られた生成物を混合して、例1で得られたものに類似したイチョウ抽出物2.6kgを得る。
例5:テルペン含量の高い農薬を含む精製された抽出物の精製
1)24%のイチョウフラボングリコシド、12%のイチョウテルペン、2ppmのギンコール酸ならびに315ppbのクロルピリホスおよびトリシクラゾールを含む1kgのイチョウ葉抽出物を、撹拌下で5lの水に懸濁する。
2)懸濁液を、室温で、5lの酢酸エチルで12回抽出する。次に、水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る(810g)。
3)合わせた酢酸エチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を2lの50%エタノール水溶液に溶解させる。
生じた溶液を撹拌下で1時間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、2日間放置して結晶化させる。
4)次にその溶液をろ過し、固体を50%EtOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、82gの精製されたギンコライドを得る。
5)その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を2lの水に溶解させ、撹拌下、90℃で15分間加熱する。水溶液を分離し、残留物を90℃で2lの水で2回目の溶解をさせ、水溶液を回収する。
6)その水溶液を合わせ、真空下でシロップ様稠度まで濃縮する;次に残留物を400mlの10%EtOHに溶解させる。生じた溶液を撹拌下、50℃で60分間加熱し、次に室温まで冷却させ、2日間放置して結晶化させる。
7)その溶液をろ過し、固体を10%EtOHで洗浄し、真空下で乾燥させて、70gの精製されたビロバライドを得る。
8)41gの精製されたギンコライドおよび35gの精製されたビロバライドを第2項で得られた生成物と混合して、以下の特性を有するイチョウ抽出物885gを得る:a.イチョウフラボングリコシド27%;b.イチョウテルペン6.8%;c.ギンコール酸1.0ppm;d.各農薬<10ppb。
記載された方法は農薬を除去し、イチョウ抽出物のテルペン含量の制御を可能にし、精製された中間物が混合されるステップにおいて要求に応じてテルペン含量を調整する。実際上、抽出物で理想的とみなされる24/6の比率(GFG/GT)は、植物において見られる天然の比率としばしば異なる。例えば、中国産の葉は、しばしばより高いテルペン含量を有し、適合する(conforming)抽出物を得るためにイチョウテルペン力価(titre)の低減ステップが必要とされる。
下の表は、上記の手順によって得られる抽出物の農薬含量を示す。各例について2つの試験を実施した:第1試験では特許で開示される手順に正確に従い、第2試験ではテルペン画分の処理が加えられた。
すべての抽出物は、同じ植物から得られた。
Figure 2012522815

Claims (6)

  1. イチョウ抽出物から農薬を除去する方法であって、従来の方法によって得られる抽出物を、以下のステップ:
    a)ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペンを含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシドを含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出ステップ;
    b)50%以上のギンコライド含量を有する中間物を得るための、ステップa)で得られた中間極性画分からの結晶化ステップ;
    c)50%以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップb)で得られた残留溶液からの結晶化ステップ;
    d)ステップa)で得られた高極性画分と、ステップb)およびc)で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合ステップ
    にかけることを含む方法。
  2. ステップa)の抽出が、エステル、塩素化炭化水素、炭化水素とアルコールとの混合物、ケトンおよびケトンとアルコールとの混合物から選択される水非混和性溶媒で実施される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記溶媒が2〜8の炭素原子数を有するエステルである、請求項2に記載の方法。
  4. イチョウテルペンの結晶化が水とC1〜C3アルコールとの混合物中で実施される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
  5. ステップc)のテルペンに富む画分からの結晶化が、水中または水とC1〜C3アルコールとの混合物中で実施される、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
  6. 予め定められたイチョウテルペン比率を有する、請求項1から5のいずれかに記載の方法によって得られる抽出物。
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