BRPI1016023B1 - Processo para remoção de pesticidas de extratos de ginkgo biloba - Google Patents

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BRPI1016023B1
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Andrea Giori
Giacomo Mombelli
Sabrina Arpini
Mario Acerbi
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Abstract

processo para remoção de pesticidas de extratos de ginkgo biloba a presente invenção refere-se a um processo para remover pesticidas de extratos de ginkgo biloba e aos extratos obteníveis através do mesmo. o processo da presente invenção compreende submeter um extrato de ginkgo biloba às seguintes etapas: a) extração líquido–líquido do extrato com um solvente imiscível em água selecionado de ésteres, hidrocarbonetos clorados, misturas de hidrocarbonetos e alcoóis, cetonas e misturas de cetonas e álcoois, para obter uma fração contendo terpenos de ginkgo e pesticidas não removíveis com hexano, e uma fração contendo flavona glicosídeos de ginkgo; b) cristalização de terpenos de ginkgo em misturas de água e alcoóis c1-c3 a partir da fração contendo terpenos de ginkgo e pesticidas nãoremovíveis com hexano obtida na etapa a) para render um intermediário com um teor de ginkgolídeo de não menos que 50% p/p; c) cristalização em água ou em uma mistura de água e alcoóis c1-c3 a partir da solução residual obtida na etapa b) para render um intermediário com um teor de bilobalídeo de não menos que 50% p/p; d) mistura da fração contendo flavona glicosídeos de ginkgo obtida na etapa a) com o intermediário terpeno de ginkgo e o intermediário bilobalídeo obtidos nas etapas b) e c).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO
PARA REMOÇÃO DE PESTICIDAS DE EXTRATOS DE GINKGO BILOBA.
A presente invenção refere-se a um processo para remoção de pesticidas de extratos de Ginkgo biloba, e os extratos obteníveis através do dito processo.
Técnica Anterior
Extratos de folhas de Ginkgo biloba têm sido usados por muito tempo na medicina tradicional Chinesa e em numerosos países Ocidentais devido às múltiplas propriedades farmacológicas atribuídas aos componentes dos ditos extratos (propriedades vasodilatadoras, imunoestimulantes, antioxidantes e antiagregadoras).
Processos para a preparação de extratos de folhas de Ginkgo biloba são mostrados em US 5700468, EP 360 556, EP 431 535 e JP 09110713.
Pesticidas tais como organofosfatos, a toxidez dos quais é bem documentada, têm sido empregados no cultivo das plantas usadas para a produção dos ditos extratos, especialmente no passado. Embora muitas autoridades de saúde e agricultura tenham banido ou restringido o uso de tais pesticidas, não é sempre fácil estabelecer a origem de material de planta, e mesmo em países onde o uso de pesticidas é regulado, é impossível excluir uso ilegal ou impróprio de substâncias com ação pesticida, cuja presença no extrato de grau farmacêutico ou nutricional é inteiramente indesejável. Um problema particularmente insidioso é possível contaminação - cruzada a partir de pesticidas originando-se de colheitas próximas.
O problema de contaminação em geral é discutido no Journal of AOAC International, Vol. 88(3), 2005, 729-735, que também descreve um processo para determinação do teor de pesticida organofosfato de folhas de Ginkgo através de cromatografia gasosa.
A patente US 5,660,832 descreve um processo genérico para purificação de extratos de plantas de pesticidas, compreendendo extração com um solvente polar em uma específica faixa de pH, seguido por absorção e desabsorção sobre resinas. No caso de folhas de Ginkgo biloba, a extraPetição 870180150669, de 12/11/2018, pág. 4/10
2/12 ção é realizada com uma mistura de etanol e água.
Pesticidas não são os únicos contaminantes indesejáveis em extratos de Ginkgo biloba: por exemplo, EP 1 968 625 descreve um processo de preparação multi - etapas de um extrato de Ginkgo biloba com um baixo teor de 4’-O-metil piridoxina, também conhecida como toxina ginkgo, e/ou biflavonas. Neste caso, entretanto, os componentes indesejáveis estão presentes naturalmente na planta.
Finalmente, EP 1 868 626 descreve um processo de preparação de extratos de Ginkgo biloba tendo um baixo teor de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos derivando do uso de combustíveis fósseis próximo de colheitas de Ginkgo. O processo descrito é altamente complexo, compreendendo onze etapas, longos tempos de preparação e o uso de reagentes onerosos tais como poliamidas, ou reagentes tóxicos como sais de chumbo.
Praticamente todos os processos conhecidos envolvem uma ou mais etapas de remoção dos componentes lipofílicos do extrato de Ginkgo (em particular biflavonas e ginkgóis). A dita extração também reduz qualquer teor de pesticida lipofílico presente, enquanto pesticidas com maior polaridade permanecem no extrato, quando seu comportamento é mais similar àquele dos componentes hidrofílicos (tais como flavona glicosídeos e terpenos).
Consequentemente existe uma necessidade de um processo conveniente de purificação que reduza ou elimine pesticidas ou outros poluentes de extratos de folhas de Ginkgo biloba de modo a aquiescer com os limites impostos pela legislação, especialmente nos USA, controlando o teor residual de qualquer tipo de pesticida em produtos de origem de plantas para uso farmacêutico, nutricional ou cosmético.
Descrição da Invenção
Foi agora verificado que o teor de pesticida de extratos de Ginkgo biloba pode ser reduzido através de um processo compreendendo:
a) extração líquido - líquido do extrato para obter uma fração de polaridade média contendo terpenos de ginkgo e pesticidas não removíveis com hexano, e uma fração de alta polaridade contendo flavona glicosídeos de ginkgo;
3/12
b) cristalização a partir da fração de polaridade média obtida na etapa a) para render um intermediário com um teor de ginkgolídeo de não menos que 50%;
c) cristalização a partir da solução residual obtida na etapa b) para render um intermediário com um teor de bilobalídeo de não menos que 50%;
d) mistura da fração de alta polaridade obtida na etapa a) com o intermediário terpeno ginkgo e o intermediário bilobalídeo obtido em etapas b) e c).
O processo da invenção, em adição a eliminar ou reduzir substancialmente o teor de pesticida residual, também permite que o teor de terpenos de ginkgo e sua razão relativa sejam controlados.
A invenção por isso também refere-se a extratos obteníveis do processo descrito acima, com uma razão predeterminada de terpenos de ginkgo.
De acordo com a invenção, a etapa a) produz uma fração enriquecida com terpenos de ginkgo e uma enriquecida com flavona glicosídeos de ginkgo através de extração com um solvente imiscível em água selecionado de ésteres, hidrocarbonetos clorados, misturas de hidrocarbonetos e alcoóis, cetonas e misturas de cetonas e alcoóis, preferivelmente um C2-C8 éster, tal como acetato de etila e acetato de t-butila ou uma mistura de tolueno - butanol.
Os terpenos de ginkgo são cristalizados em água e misturas de alcoóis C1-C5, enquanto a cristalização da fração rica em terpeno obtida na etapa c) é realizada em água ou uma mistura de água e alcoóis C1-C3. O processo de acordo com a invenção elimina pesticidas de polaridade média que não são removidos com os ginkgóis.
A invenção é ilustrada em maiores detalhes nos exemplos abaixo. Exemplo 1: Purificação do extrato produzido de acordo com exemplo I em US 5700468 e EP 0 360 556 (Indena)
1) 100 kg de folhas cortadas são extraídos 4 vezes com 400 L de acetona 60% (peso / peso) em uma temperatura de aproximadamente 50°C.
4/12
2) Os percolados são extraídos em contracorrente com 500 L de hexano.
3) A solução desengordurada é concentrada sob vácuo para um volume de 200 L, deixada por toda noite a 2°C, e então centrifugada para separar a fração biflavona.
4) A solução aquosa é extraída em contracorrente com 400 L de uma mistura 8/2 v/v de n-butanol / tolueno.
5) A solução orgânica é concentrada sob vácuo para um pequeno volume, substituindo com água. O concentrado é tomado com água para obter uma solução com aproximadamente 30% de resíduo seco.
6) A solução é extraída em contracorrente com aproximadamente 65 L de acetato de etila. A fase aquosa é concentrada para uma consistência semelhante a xarope e secada sob vácuo, para obter um intermediário enriquecido com flavona glicosídeos de ginkgo e destituído de terpenos (1,95 kg).
7) A fase etil acético é concentrada sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e o resíduo é tomado com 3 L de etanol aquoso 75%.
8) A solução é extraída em contracorrente com 20 L de hexano, eliminando as fases orgânicas combinadas.
9) A solução de água - álcool é concentrada sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e 0,9 L de etanol aquoso 50% é adicionado.
A resultante solução é aquecida a refluxo sob agitação, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 4 dias.
10) A solução é então filtrada e o sólido lavado com EtOH 50% e seco sob vácuo, para obter 95 g de ginkgolídeos purificados.
11) 0 licor mãe é concentrado sob vácuo para eliminar o etanol, e o resíduo é então tomado com 1,9 L de água e aquecido a 90°C sob agitação por 30 minutos. A solução aquosa é separada, e o resíduo é tomado em 3 vezes mais com 1,9 L de água a 90°C, a solução aquosa sendo recuperada cada vez.
5/12
12) As soluções aquosas são combinadas e extraídas em contracorrente com 14 L de hexano.
13) A solução aquosa é concentrada para um volume de 0,3 L; 0,1 L de EtOH 95° é então adicionado, e a solução é aquecida a 50°C sob agitação, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 3 dias.
14) A solução é filtrada e o sólido é lavado com EtOH 20% e seco sob vácuo para obter 103 g de bilobalídeo purificado.
15) Os produtos obtidos em pontos 6, 10 e 14 são misturados para renderem 2,15 kg de extrato de Ginkgo biloba com as seguintes características: flavona glicosídeos de ginkgo 26,0%; bilobalídeo 3,2%; ginkgolídeos 3,5%; ácidos ginkgólicos < 5,0 ppm; cada pesticida <10 ppb.
Exemplo 2: Purificação do extrato produzido como descrito no exemplo II de US 5700468, EP 0 360 556 (Indena)
1) 100 kg de folhas cortadas são extraídos 4 vezes com 400 L de metanol 50% (peso / peso) na temperatura de aproximadamente 35°C.
2) Os percolados combinados são concentrados para 100 L sob vácuo a 40°C, o concentrado é tomado com 100 L de metanol, e a suspensão obtida é filtrada.
3) A solução filtrada é extraída 3 vezes com 100 L de uma mistura 9:2 de tolueno / n-butanol.
4) As fases orgânicas combinadas são lavadas em contracorrente com 50 L de metanol 50%.
5) As soluções de água - metanol são concentradas sob vácuo para uma solução aquosa e, após filtração, são extraídas com uma mistura 8:2 de n-butanol / tolueno.
6) A solução orgânica é lavada em contracorrente com água e concentrada sob vácuo para um pequeno volume, substituindo com água. A solução é tomada com água para obter uma solução com um resíduo seco de 20%.
7) A resultante solução é extraída em contracorrente com 90 L de uma mistura 1:1 de n-butanol / tolueno. A fase aquosa é concentrada pa6/12 ra uma consistência semelhante a xarope e seca sob vácuo para obter um intermediário enriquecido em flavona glicosídeos de ginkgo e destituído de terpenos (2,05 kg).
8) A mistura de n-butanol / tolueno é concentrada sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e o resíduo é tomado com 3,5 L de etanol aquoso 60%.
9) A solução resultante é extraída em contracorrente com 20 L de hexano, eliminando as fases orgânicas combinadas.
10) A solução de água - álcool é concentrada sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e 1,2 L de etanol aquoso 40% é adicionado.
A resultante solução é aquecida a refluxo sob agitação por 45 minutos, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 3-4 dias.
11) A solução é então filtrada e o sólido lavado com EtOH 40% e seco sob vácuo, para obter 97 g de ginkgolídeos purificados.
12) O licor mãe é concentrado sob vácuo para eliminar o etanol, e o resíduo é então tomado com 2 L de água e aquecido a 90°C sob agitação por 30 minutos. A solução aquosa é separada, e o resíduo é tomado 3 vezes mais com 2 L de água a 90°C, a solução aquosa sendo recuperada cada vez.
13) As soluções aquosas são combinadas e extraídas em contracorrente com 17 L de hexano.
14) As soluções aquosas são concentradas para um volume de 0,4 L, e 0,15 L de EtOH 95° é adicionado; a resultante solução é aquecida a 50-55°C sob agitação por 30 minutos, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 3-4 dias.
15) A solução é filtrada e o sólido é lavado com EtOH 20% e seco sob vácuo a 60°C para obter 110 g de bilobalídeo purificado.
16) Os produtos obtidos em pontos 7, 11 e 15 são misturados para renderem 2,26 kg de extrato de Ginkgo biloba similar àquele obtido no exemplo 1.
7/12
Exemplo 3: Purificação do extrato produzido de acordo com o exemplo I de EP 431 535 (Schwabe)
1) 100 kg de folhas cortadas são extraídos duas vezes com 750 kg de acetona 60% (peso / peso) por 30 minutos na temperatura de 57-59°C.
2) Os extratos combinados são concentrados para uma solução aquosa com um resíduo seco de 30-40%, um igual volume de água é adicionado, e a mistura é deixada sob agitação por uma hora a 12°C.
3) O precipitado rico em alquilfenol é separado por centrifugação e eliminado.
4) 30% de sulfato de amônio são adicionados à solução clarificada sob agitação, e a solução é extraída duas vezes com meio volume de uma mistura 6:4 de metil etil cetona/ acetona.
5) As soluções de metil etil cetona / acetona combinadas são concentradas sob vácuo para um resíduo seco de 50-70%, e então diluídas com água e etanol 95% para obter uma solução de etanol 50% com um resíduo seco de 10%.
6) Uma solução aquosa de hidróxido acetato de chumbo é adicionada sob agitação até a cor mudar de marrom para marrom claro. O precipitado obtido é eliminado por centrifugação.
7) A solução centrifugada é extraída 3 vezes com 1/3 de volume de hexano.
8) A solução desengordurada é concentrada para uma solução aquosa sob vácuo, e sulfato de amônio 20% é adicionado e extraído duas vezes com metade de volume de uma mistura 6:4 de metil etil cetona / etanol. As fases orgânicas combinadas são lavadas com sulfato de amônio 20%, removendo qualquer água e sólido formado.
9) A solução clara é então concentrada sob vácuo para um pequeno volume, substituindo com água.
O concentrado é tomado com água para obter uma solução com aproximadamente 10% de resíduo seco.
10) A solução é extraída em contracorrente com aproximadamente 100 L de acetato de t-butila. A fase aquosa é concentrada para uma
8/12 consistência semelhante a xarope e secada sob vácuo para obter um intermediário enriquecido com flavona glicosídeos de ginkgo e destituído de terpenos (1,88 kg).
11) A fase butil acética é concentrada sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e 0,8 L de etanol aquoso 60% é adicionado.
A resultante solução é aquecida a refluxo sob agitação por 25 minutos, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 2 dias.
12) A solução é então filtrada e o sólido lavado com EtOH 60% e seco sob vácuo, para obter 98 g de ginkgolídeos purificados.
13) O licor mãe é concentrado sob vácuo para eliminar o etanol, e o resíduo é tomado com 1,9 L de água e aquecido para 90°C sob agitação por 30 minutos. A solução aquosa é separada, e o resíduo é tomado mais 3 vezes com 1,9 L de água a 90°C, a solução aquosa sendo recuperada cada vez.
14) As soluções aquosas combinadas são concentradas para um volume de 0,6 L e aquecidas a 70°C, sob agitação, por 60 minutos, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 1 dia.
15) A resultante solução é filtrada e o sólido é lavado com água e seco sob vácuo para obter 99 g de bilobalídeo purificado.
16) Os produtos obtidos em pontos 10, 12 e 15 são misturados para renderem 2,08 kg de extrato de Ginkgo biloba similar àquele obtido no exemplo 1.
Exemplo 4: Purificação de extrato produzido de acordo com JP 09110713 (Nippon Green wave)
1) 100 kg de folhas de ginkgo cortadas são extraídos 3 vezes com 500 L de etanol 70% a 50°C por 30 horas.
2) Os percolados combinados são concentrados para 100 L sob vácuo e o concentrado é tomado com 100 L de água.
A suspensão obtida é filtrada.
3) A solução filtrada é introduzida em uma coluna de cromatografia contendo 100 L de resina HP20 (Mitsubishi) para adsorver o extrato. A
9/12 coluna é então lavada com 200 L de água, e o extrato é recuperado através de eluição com 200 L de etanol 70%.
4) A solução de água - etanol é concentrada sob vácuo para um pequeno volume, substituindo com água. O concentrado é tomado com etanol 20% para obter uma solução com um resíduo seco de 20%.
5) A solução resultante é extraída em contracorrente com 70 L de cloreto de metileno. A fase de água - etanol é concentrada para uma consistência semelhante a xarope e seca sob vácuo para obter um intermediário enriquecido com flavona glicosídeos de ginkgo e destituído de terpenos (2,4 kg).
6) A fase de clorometileno é concentrada sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e o resíduo é tomado com 4 L de metanol aquoso 75%.
7) A solução resultante é extraída 10 vezes com 2 L de hexano, eliminando as fases de hexano combinadas.
8) A solução água - álcool é concentrada sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e 1 L de metanol aquoso 50% é adicionado.
A resultante solução é aquecida a refluxo sob agitação por 30 minutos, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 5 dias.
9) A solução é então filtrada e o sólido lavado com MeOH 50% e seco sob vácuo, para obter 105 g de ginkgolídeos purificados.
10) O licor mãe é concentrado sob vácuo para eliminar o metanol, e o resíduo é tomado com 2 L de água e aquecido a 90°C sob agitação por 30 minutos. A solução aquosa é separada, e o resíduo é tomado mais 3 vezes com 2 L de água a 90°C, a solução aquosa sendo recuperada cada vez.
11) As soluções aquosas combinadas são concentradas para um volume de 0,4 L, e 0,1 L de MeOH é adicionado; a resultante solução é aquecida a 50°C sob agitação por 30 minutos, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 3 dias.
12) A resultante solução é filtrada e o sólido é lavado com MeOH
10/12
20% e secado sob vácuo para obter 102 g de bilobalídeo purificado.
13) Os produtos obtidos nos pontos 5, 9 e 12 são misturados para renderem 2,6 kg de extrato de Ginkgo biloba similar àquele obtido no exemplo 1.
Exemplo 5: Purificação de um extrato purificado contendo pesticidas com um alto teor de terpeno
1) 1 kg de extrato de folha de Ginkgo biloba contendo 24% de flavona glicosídeos de ginkgo, 12% de terpenos de ginkgo, 2 ppm de ácidos ginkgólicos e 315 ppb de clorpirifos e triciclazol é suspenso sob agitação em 5 L de água.
2) A suspensão é extraída 12 vezes com 5 L de acetato de etila em temperatura ambiente. A fase aquosa é então concentrada para uma consistência semelhante a xarope e seca sob vácuo para obter um intermediário enriquecido com flavona glicosídeos de ginkgo e destituído de terpenos (810 g).
3) As fases etil acéticas combinadas são concentradas sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope, e o resíduo é tomado com 2 L de etanol aquoso 50%.
A solução resultante é aquecida a refluxo sob agitação por 1 hora, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 2 dias.
4) A solução é então filtrada e o sólido lavado com EtOH 50% e seca sob vácuo, para obter 82 g de ginkgolídeos purificados.
5) O licor mãe é concentrado sob vácuo para eliminar o etanol, e o resíduo é então tomado com 2 L de água e aquecido a 90°C sob agitação por 15 minutos. A solução aquosa é separada, e o resíduo é tomado uma segunda vez com 2 L de água a 90°C, a solução aquosa sendo recuperada.
6) As soluções aquosas são combinadas e concentradas sob vácuo para uma consistência semelhante a xarope; o resíduo é tomado com 400 mL de EtOH 10%. A resultante solução é aquecida a 50°C sob agitação por 60 minutos, então resfriada para temperatura ambiente e deixada cristalizar por 2 dias.
7) A solução é filtrada e o sólido é lavado com EtOH 10% e seco
11/12 sob vácuo para obter 70 g de bilobalídeo purificado.
8) 41 g de ginkgolídeos purificados e 35 g de bilobalídeo purificado são misturados com o produto obtido no ponto 2 para render 885 g de extrato de Ginkgo biloba com as seguintes características: a. flavona glicosí5 deos ginkgo 27%; b. terpenos ginkgo 6,8%; c. ácidos ginkgólicos 1,0 ppm; d. cada pesticida < 10 ppb.
O processo descrito remove os pesticidas e permite que o teor de terpeno dos extratos de Ginkgo biloba seja controlado, ajustando o mesmo como requerido na etapa quando os intermediários purificados são mis10 turados. Na prática, a razão de 24/6 (GFG/GT) considerada ideal nos extratos frequentemente difere da razão natural encontrada nas plantas. Por exemplo, folhas Chinesas frequentemente têm um maior teor de terpeno, e uma etapa de redução de título de terpeno de ginkgo é requerida para obtenção de extratos em conformação.
A tabela abaixo mostra os teores de pesticidas de extratos obtidos de acordo com os procedimentos descritos acima. Dois testes foram conduzidos para cada exemplo: o procedimento mostrado na patente foi exatamente seguido em primeiro lugar, e tratamento da fração terpeno foi adicionado no segundo.
12/12
Todos os extratos foram obtidos da mesma planta.
Exemplo 4 - Ref. Nippon Green Wave Patente J09110713 Depois de remoção de pes- ticida <10 o V <10 <10
Antes de remoção de pes- ticida 212 CXI σ> 175 84
Exemplo 3 - Ref. Schwabe Patente EP 0 431 535 B1; e- xemplo I Depois de remoção de pes- ticida <10 o V <10 <10
Antes de remoção de pes- ticida 63 rCM 45 26
Exemplo 2 - Ref. Indena Patentes US 5700468, EP 0 3600 556 B1; exemplo II Depois de remoção de pes- ticida <10 o V o V <10
Antes de remoção de pes- ticida 55 CD 37 28
Exemplo 1 - Ref. Indena Patentes US 5700468, EP 0 3600 556 B1; exemplo I Depois de remoção de pesticida <10 o V <10 <10
Antes de remoção de pesticida 85 sr CM 48 33
Triciclazol (PPM_______ ro Ό CL E ro ro â £ S ro p vCL O O CB — 1 £ E α o ro .o £ a
1/1

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para remoção de pesticidas de extratos de Ginkgo biloba, caracterizado pelo fato de que compreende submeter um extrato obtido através de processos convencionais às seguintes etapas:
    a) extração líquido-líquido do extrato com um solvente imiscível em água selecionado de ésteres, hidrocarbonetos clorados, misturas de hidrocarbonetos e alcoóis, cetonas e misturas de cetonas e álcoois, para obter uma fração contendo terpenos de ginkgo e pesticidas não removíveis com hexano, e uma fração contendo flavona glicosídeos de ginkgo;
    b) cristalização de terpenos de ginkgo em misturas de água e alcoóis C1-C3 a partir da fração contendo terpenos de ginkgo e pesticidas não removíveis com hexano obtida na etapa a) para render um intermediário com um teor de ginkgolídeo de não menos que 50% p/p;
    c) cristalização em água ou em uma mistura de água e alcoóis C1 C3 a partir da solução residual obtida na etapa b) para render um intermediário com um teor de bilobalídeo de não menos que 50% p/p;
    d) mistura da fração contendo flavona glicosídeos de ginkgo obtida na etapa a) com o intermediário terpeno de ginkgo e o intermediário bilobalídeo obtidos nas etapas b) e c).
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente é um éster tendo 2 a 8 átomos de carbono.
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