JP2012503612A - 二重特異性抗ｅｇｆｒ／抗ｉｇｆ−１ｒ抗体 - Google Patents

Abstract

ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体、該二重特異性抗体の製造方法、該二重特異性抗体を含む医薬組成物及びその使用に関する。

Description

本発明は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体、該二重特異性抗体の製造方法、該二重特異性抗体を含有する医薬組成物及びその使用に関する。

ＥＧＦＲ及び抗ＥＧＦＲ抗体
ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても知られているが、本明細書では「ＥＧＦＲ」と呼ぶ）は、ｃ−ｅｒｂＢプロトオンコジーンによってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型受容体であり、内因性チロシンキナーゼ活性を示す（Modjtahedi, H. 等, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース登録番号Ｐ００５３３によって、ＥＧＦＲの配列が提供される。また、ＥＧＦＲのアイソフォーム及び変異体も存在し（例えば、選択的ＲＮＡ転写産物，欠失変異体（truncated version)，多型体等）、例えば、特に限定されるわけではないが、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース登録番号Ｐ００５３３−１，Ｐ００５３３−２，Ｐ００５３３−３及びＰ００５３３−４で特定されるものが挙げられる。ＥＧＦＲは、上皮成長因子（ＥＧＦ），トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧｆ−α），アンフィレグリン（amphiregulin），ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ），ベータセルリン（betacellulin），エピレグリン（epiregulin）等のリガンドに結合することが知られている（Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J., 及び Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565）。ＥＧＦＲは、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路、例えば、特に限定されるわけではないが、細胞増殖，分化，細胞生存，アポトーシス，血管形成，有糸分裂誘発及び転移をコントロールするシグナル伝達経路の活性化を介して、多数の細胞過程を調節する（Atalay, G. 等, Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S., 及び Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H. 等, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235）。

ＥＧＦＲの過剰発現が、数多くのヒト悪性疾患、例えば、膀胱癌，脳腫瘍，頭頸部癌，膵臓癌，肺癌，乳癌，卵巣癌，結腸癌，前立腺癌及び腎臓癌で報告されている（Atalay, G. 等, Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H. 等, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235）。これらのうち多くの疾患において、ＥＧＦＲの過剰発現は、患者の予後不良と相関するか又は関連している（Herbst R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H. 等, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235）。また、ＥＧＦＲは、正常な組織の細胞、特に皮膚，肝臓及び胃腸管の上皮組織の細胞でも発現しているが、発現レベルは、一般的に、悪性細胞よりも低い（Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611）。

非複合型（unconjugated）モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、癌の治療のための医薬として有用であり、例えば、米国食品医薬品局の承認を受けたものとして、進行性乳癌の治療に関するトラスツズマブ（Herceptin^TM; Genentech Inc,）（Grillo-Lopez, A.J. 等, Semin. Oncol. 26 (1999) 66-73; Goldenberg, M.M., Clin. Ther. 21 (1999) 309-18）、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞性の低悪性度又は濾胞性非ホジキンリンパ腫の治療に関するリツキシマブ（Rituxan^TM; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, and Genentech Inc., San Francisco, CA）、再発性急性骨髄性白血病の治療に関するゲムツズマブ（Mylotarg^TM, Celltech/Wyeth-Ayerst）、及びＢ細胞慢性リンパ性白血病の治療に関するアレムツズマブ（CAMPATH^TM, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG）がある。これらの医薬品の成功の要因は、それらの効能だけでなく、それらの優れた安全性プロファイルにもある（Grillo-Lopez, A.J. 等, Semin. Oncol. 26 (1999) 66-73; Goldenberg, M.M., Clin. Ther. 21 (1999) 309-18）。これらの薬物の成果にもかかわらず、現在、非複合型ｍＡｂ治療によって典型的に達成されるものよりも高い特異性を有する抗体活性を得ることに大きな興味が持たれている。

多数の研究の結果によって、Ｆｃ受容体依存的なメカニズムが、腫瘍に対する抗体の細胞毒性作用に大きく貢献することが示唆されているとともに、腫瘍に対する最適な抗体が、活性化Ｆｃ受容体には選択的に結合するが、その抑制型であるＦｃγＲＩＩＢにはほとんど結合しないことが示されている（Clynes, R.A. 等, Nature Medicine 6(4) (2000) 443-446; Kalergis, A.M., 及びRavetch, J.V., J. Exp. Med. 195(12) (2002) 1653-1659）。例えば、少なくとも１つの研究結果では、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体における多型性が、特に、抗体治療の効能と強く関連することが示唆されている（Cartron, G. 等, Blood 99 (3) (2002) 754-758）。この研究では、ＦｃγＲＩＩＩａがホモ接合体の患者は、ヘテロ接合体の患者よりも、リツキシマブに対して良好な応答を示すことが示されている。その著者は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ結合性が向上したことによって応答が向上し、リンパ腫細胞に対する良好なＡＤＣＣ活性が生じたと結論づけている（Cartron, G. 等, Blood 99(3) (2002) 754-758）。

ＥＧＦＲの標的化及びＥＧＦＲシグナル伝達経路のブロックのための様々なストラテジーが報告されている。ゲフィチニブ，エルロチニブ，ＣＩ−１０３３等の小分子チロシンキナーゼ阻害剤は、細胞内チロシンキナーゼ領域におけるＥＧＦＲの自己リン酸化をブロックし、下流のシグナル伝達事象を阻害する（Tsao, A.S., 及び Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9）。一方、モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲの細胞外部分を標的とし、その結果、リガンド結合をブロックして下流の事象、例えば、細胞増殖を阻害する（Tsao, A.S., 及び Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9）。

そのようなブロックをｉｎ ｖｉｔｒｏで達成する幾つかのマウスモノクローナル抗体が作製され、マウス異種移植モデルにおいて腫瘍増殖に対する効能が評価されている（Masui, H. 等, Cancer Res. 46 (1986) 5592-5598; Masui, H. 等, Cancer Res. 44 (1984) 1002-1007; Goldstein, N. 等, Clin. Cancer Res. 1 (1995) 1311-1318）。例えば、ＥＭＤ５５９００（EMD Pharmaceuticals）は、ヒト表皮癌細胞株Ａ４３１に対するマウス抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であり、喉頭又は下咽頭の進行性扁平上皮細胞癌に罹患した患者の臨床試験で試験されている（Bier, H. 等, Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252 (1995) 433-9）。さらに、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合するラットモノクローナル抗体ＩＣＲ１６，ＩＣＲ６２及びＩＣＲ８０は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αのその受容体に対する結合を阻害するのに有効であることが示されている（Modjtahedi, H. 等, Int. J. Cancer 75 (1998) 310-316）。マウスモノクローナル抗体４２５は、ヒトＡ４３１癌細胞株に対する別のＭＡｂであり、ヒト上皮成長因子受容体の外部ドメインのポリペプチドエピトープに結合することが示されている（Murthy, U. 等, Arch. Biochem. Biophys. 252(2) (1987) 549-560）。治療的処置でのマウス抗体の使用に関する潜在的な問題点は、非ヒトモノクローナル抗体がヒト宿主によって異種タンパク質として認識され得るという点にある。したがって、そのような異種抗体を繰り返し投与すると、有害な過敏反応を生じる免疫反応が誘起される可能性がある。マウスモノクローナル抗体に関し、これは、しばしば、ヒト抗マウス抗体反応、すなわち「ＨＡＭＡ」反応、又はヒト抗ラット抗体反応、すなわち「ＨＡＲＡ」反応と呼ばれる。さらに、これらの「異種」抗体は、宿主の免疫系によって攻撃され、標的部位に到達する前に中和される可能性がある。さらに、非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）は、典型的には、ヒトエフェクター機能を欠くため、とりわけ、補体依存性溶解を媒介できず、また、抗体依存性細胞傷害又はＦｃ受容体媒介食作用を通じてヒト標的細胞を溶解することができない。

２以上の異なる種（例えば、マウス及びヒト）に由来する抗体の部分を含むキメラ抗体が、代替物である「複合型（conjugated）」抗体として開発されている。例えば、US 5,891,996（Mateo de Acosta del Rio, C.M. 等）には、ＥＧＦＲに対するマウス／ヒトキメラ抗体Ｒ３について言及されており、US 5,558,864には、マウス抗ＥＧＦＲ ＭＡｂ４２５のキメラ型及びヒト型形態の作製について言及されている。また、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Erbitux（登録商標）; ImClone）は、キメラ型マウス／ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（マウスＭ２２５モノクローナル抗体に基づき、ヒト臨床試験において、ＨＡＭＡ反応を生じる）であり、様々なヒト異種移植モデルにおいて抗腫瘍効果を示すことが報告されている（Herbst, R.S., 及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＩＭＣ−Ｃ２２５の効能には、幾つかのメカニズム、例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達経路によって調節される細胞事象の阻害、可能である場合には、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の増加等が寄与する（Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611）。また、ＩＭＣ−Ｃ２２５は、放射線療法及び化学療法との併用を含む臨床試験で使用される（Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611）。最近、Abgenix, Inc.（Fremont, CA）は、癌治療に関するＡＢＸ−ＥＧＦを開発した。ＡＢＸ−ＥＧＦは、完全なヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である（Yang, X.D. 等, Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38 (2001) 17-23）。

WO 2006/082515は、ラットモノクローナル抗体ＩＣＲ６２に由来するヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体に言及するとともに、それらの糖鎖改変型形態（glycoengineered form）を用いた癌の治療に言及する。

ＩＧＦ−１Ｒ及び抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体
インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ，ＩＧＦ−ＩＲ，ＣＤ２２１抗原）は、膜貫通型タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する（LeRoith, D. 等, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; 及び Adams, T.E. 等, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093）。ＩＧＦ−ＩＲは、高アフィニティーでＩＧＦ−Ｉに結合し、このリガンドによるｉｎ ｖｉｖｏ生理反応を開始させる。また、ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦ−ＩＩにも結合するが、そのアフィニティーは若干低い。ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現は、細胞の悪性形質転換を促進し、ＩＧＦ−ＩＲが細胞の悪性形質転換に関与する証拠も存在しており、したがって、癌処置の治療薬剤を開発するための有用なターゲットである（Adams, T.E. 等, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093）。

ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は、当業界で周知であり、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍作用が調べられている（Benini, S. 等, Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K. 等, Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K. 等, Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A. 等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218; Prigent, S.A. 等, J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L. 等, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252; Pessino, A. 等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K.H. 等, J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos, M. A. 等, J. Biol. Chem. 267 (1992) 12955-12963; Soos, M.A. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221; O'Brien, R., M. 等, EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R. 等, Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A. 等, Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S.L. 等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P. 等, J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673; Kull, F.C., Jr. 等, J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D.O., 及び Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J.R. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E.M. 等, J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., 及び Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A. 等, FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A. 等, J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q.T. 等, Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281; 並びに Kalebic, T. 等, Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T.E. 等, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093; Dricu, A. 等, Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn, L. 等, Melanoma Res. 8 (1998) 389-397; Li, S.L. 等, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252）。また、ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は、数多くの刊行物に記載されている（例えば、Arteaga, C.L. 等, Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106; 及び Hailey, J. 等, Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353）。

特に、αＩＲ３と呼ばれる、ＩＧＦ−ＩＲに対するモノクローナル抗体は、ＩＧＦ−ＩＲ媒介プロセス及びＩＧＦ−Ｉ媒介疾患（例えば癌）を研究する上で広く使用されている。αＩＲ３は、Kull, F.C., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566 に記載されている。これまでに、αＩＲ３の研究に関する約１００以上の刊行物が刊行され、αＩＲ３の単独又は細胞増殖抑制剤（例えばドキソルビシン及びビンクリスチン）と組み合わせた治療的使用が、その抗腫瘍作用との関連において記述されている。αＩＲ３は、マウスモノクローナル抗体であり、ＩＧＦ−ＩのＩＧＦ受容体に対する結合は阻害するが、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−ＩＲに対する結合は阻害しないことが知られている。αＩＲ３は、高濃度において、腫瘍細胞増殖及びＩＧＦ−ＩＲリン酸化を刺激する（Bergmann, U. 等, Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H. 等, J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661）。ＩＧＦ−Ｉの結合よりもＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−ＩＲに対する結合を強く阻害するその他の抗体も存在する（例えば、１Ｈ７，Li, S., L. 等, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000） 243-252）。抗体並びにその特性及び特徴の現状については、Adams, T.E. 等, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000） 1050-1093 に概説されている。

刊行物に記載されている抗体の大部分が、マウス起源である。そのような抗体は、当業界で周知のように、キメラ化、ヒト化等の改変なしでは、ヒト患者の治療に有用ではない。これらの欠点のため、ヒト患者を処置する治療薬剤としては、明らかにヒト抗体が好ましい。ヒト抗体は、当業界で周知である（van Dijk, M.A., 及び van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374）。周知技術に基づき、様々な標的に対するヒト抗体の作製が可能である。ＩＧＦ−ＩＲに対するヒト抗体の具体例が、WO 02/053596 に記載されている。

WO 2005/005635 は、ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン２２（DSM ACC 2594）及びそれらの癌治療における使用に言及する。

二重特異性抗体
近年、様々な組換え型抗体、例えば、ＩｇＧ型抗体及び単鎖ドメインの融合による四価の二重特異性抗体が開発されている（例えば、Coloma, M.J. 等, Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; 及び Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234）。

また、幾つかの新しい形態、例えば、抗体コア構造（ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ又はＩｇＭ）がもはや保持されておらず、二価（dia-），三価（tria-）又は四価抗体（tetrabody），ミニボディー（minibody），幾つかの単鎖形態（ｓｃＦｖ，Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）といった２以上の抗原に結合できる形態が開発されている（Holliger, P. 等, et al, Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J. 等, Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C. 等, Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297）。

そのような全ての形態において、抗体コア（ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ又はＩｇＭ）を別の結合性タンパク質（例えばｓｃＦｖ）に融合するために、あるいは、例えば２つのＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖを融合するために、リンカーが使用されている（Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14）。そこでは、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体結合を通じて媒介される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を保持したいがために、天然に存在する抗体との高度の類似性を保持することが念頭に置かれている。

WO 2007/024715 には、多価及び多重特異性結合性タンパク質となるように操作された二重可変領域イムノグロブリンが報告されている。生物学的に活性な抗体ダイマーの製造方法が、US 6,897,044 に報告されている。ペプチドリンカーを介して互いに連結された少なくとも４つの可変領域を有する多価Ｆｖ抗体構築物が、US 7,129,330 に報告されている。二量体及び多量体の抗原結合性構造が、US 2005/0079170 に報告されている。互いに連結構造によって共有結合した３又は４つのＦａｂフラグメントを含む三価又は四価の単一特異性抗原結合性タンパク質が、US 6,511,663 に報告されているが、そこでのタンパク質は天然のイムノグロブリンではない。WO 2006/020258 には、原核細胞及び真核細胞で効率的に発現可能であり、治療的及び診断的方法で有用である四価の二重特異性抗体が報告されている。２種のポリペプチド二量体の混合物に含まれる、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結された二量体を、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されていない二量体から分離する方法又は選択的に合成する方法が、US 2005/0163782 に報告されている。四価の二重特異性受容体が、US 5,959,083 に報告されている。３以上の機能性抗原結合部位を有するように操作された抗体が、WO 2001/077342 に報告されている。

多重特異性かつ多価の抗原結合性ポリペプチドが WO 1997/001580 に報告されている。WO 1992/004053 には、同一の抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体同士を合成架橋結合で共有結合させることによって典型的に調製されるホモ複合体（homoconjugate）が報告されている。抗原に対する高アビディティーを有するオリゴマーモノクローナル抗体が、WO 1991/06305 に報告されているが、分泌されるオリゴマーは、典型的にはＩｇＧクラスであり、２以上のイムノグロブリンモノマーが互いに結合して四価又は六価のＩｇＧ分子を形成している。インターフェロン・ガンマ活性が病因である疾患の処置に使用できるヒツジ由来抗体及び人工的に操作された抗体構築物が、US 6,350,860 に報告されいる。US 2005/0100543 には、二重特異性抗体の多価担体である標的化可能な（targetable）構築物（すなわち、標的化可能な構築物の各分子が、２以上の二重特異性抗体の担体としての役割を果たし得る）が報告されている。遺伝子操作された四価の二重特異性抗体が、WO 1995/009917 に報告されている。WO 2007/109254 には、安定化ｓｃＦｖからなる又はそれを含む安定化結合性分子が報告されている。

ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体は公知である（Lu, D. 等, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 及び J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72）。しかしながら、これらの二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、それらの親抗体である単一特異性抗体の組み合わせと比較して、明らかに（特に、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒの両方の発現レベルが等しい（等しく高い）腫瘍細胞において）減少した腫瘍増殖阻害を示す。

本発明者等は、驚くべきことに、新規な二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、その親抗体である単一特異性抗体の組み合わせと比較して、少なくとも類似の腫瘍増殖阻害を示すことを見出した（より少ない二重特異性抗体の使用量で）（特に、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒの両方を同等レベル（同等に高レベル）で発現する腫瘍細胞に対して）。

本発明の第１の態様は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１記載のＣＤＲ３領域、配列番号２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号４記載のＣＤＲ３領域、配列番号５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号６記載のＣＤＲ１領域を含み；並びに
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１１記載のＣＤＲ３領域、配列番号１２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号１４記載のＣＤＲ３領域、配列番号１５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１６記載のＣＤＲ１領域を含むか；又は、
前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１７記載のＣＤＲ３領域、配列番号１８記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１９記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号２０記載のＣＤＲ３領域、配列番号２１記載のＣＤＲ２領域及び配列番号２２記載のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、
i） 前記第１の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号７又は配列番号８記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号９又は配列番号１０記載の配列を含み、
ii） 前記第２の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号２３又は配列番号２４記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２５又は配列番号２６記載の配列を含むことを特徴とする。

本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、
i） 前記第１の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号８記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号１０記載の配列を含み、
ii） 前記第２の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号２３記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２５記載の配列を含むことを特徴とする。

本発明の二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価、四価又は多価であり得る。好ましくは、本発明の二重特異性抗体は二価、三価又は四価である。

本発明の別の態様は、前記二重特異性抗体の鎖をコードする核酸分子である。

本発明のさらに別の態様は、前記二重特異性抗体を含む医薬組成物、癌の処置のための該医薬組成物、癌の処置のための医薬の製造における前記二重特異性抗体の使用、並びに、癌の患者を処置する方法であって、前記二重特異性抗体を該処置の必要な患者に投与することを含む方法である。

本発明の二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒ標的療法の必要な患者に対して効能を示す。本発明の二重特異性抗体は、そのような患者、特に癌患者に対して有効な、新規かつ優れた特性を有する。

図１は、本発明の一実施形態に係る四価の二重特異性抗体の構造を示す模式図であり、該実施形態に係る二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する四価の二重特異性抗体であり、抗原Ａ及びＢの一方がＥＧＦＲ、他方がＩＧＦ−１Ｒである。抗原Ａに結合する完全長抗体を構造の基礎とし、これにペプチドリンカーを通じて、抗原Ｂに結合する２つの（ジスルフィド安定化されていてもよい）単鎖Ｆｖが連結されている。 図２は、本発明の４つの実施形態Ａ〜Ｄに係る四価の二重特異性抗体の構造を示す模式図であり、該実施形態に係る二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する四価の二重特異性抗体であり、抗原Ａ及びＢの一方がＥＧＦＲ、他方がＩＧＦ−１Ｒである。抗原Ａに結合する完全長抗体を構造の基礎とし、実施形態Ａでは完全長抗体重鎖のＣ末端に、実施形態Ｂでは完全長抗体重鎖のＮ末端に、実施形態Ｃでは完全長抗体軽鎖のＣ末端に、実施形態Ｄでは完全長抗体軽鎖のＣ末端に、ペプチドリンカーを通じて、抗原Ｂに結合する２つの（ジスルフィド安定化されていてもよい）単鎖Ｆｖが連結されている。 図３ａは、精製二重特異性抗体ＸＧＦＲ１−２４２１のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。 図３ｂは、精製二重特異性抗体ＸＧＦＲ１−２４２１（３ｍｇ／ｍｌ）のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す図である。 図３ｃは、精製二重特異性抗体ＸＧＦＲ１−２４２１（１ｍｇ／ｍｌ）のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す図である。 図４ａは、二重特異性抗体ＸＧＦＲ１−２３２０（ジスルフィド安定化されていない）（８．７％凝集）のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を示す図である。 図４ｂは、二重特異性抗体ＸＧＦＲ１−２３２１（ジスルフィド安定化されている）（０％凝集）のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を示す図である。 図５は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒに対する二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＸＧＦＲ１−２３２０）の同時結合に関する、固定化ＸＧＦＲ１−２３２０を用いたＢｉａｃｏｒｅアッセイを示す。 図６は、二重特異性抗体によるＡ５４９ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株のＩＧＦＲ（図６ａ）及びＥＧＦＲ（図６ｂ）のダウンレギュレーションを示す。 図７は、二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体分子（ＸＧＦＲ）によるＨ３２２Ｍ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株のＩＧＦ−１Ｒリン酸化（図７ａ）及びＥＧＦＲリン酸化（図７ｂ）の阻害を示す図である。図７ａは、ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＬＩＳＡで測定した、様々な二重特異性抗体ＸＧＦＲ分子及びそれらの親抗体によるＨ３２２Ｍ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞の阻害であり、所定の抗体濃度でインキュベーションし、ＩＧＦ１／ＥＧＦ抗体を使用する場合には最初の濃度の半分に希釈した。図７ｂは、ホスホ−ＥＧＦＲ−ＥＬＩＳＡで測定した、様々な二重特異性抗体ＸＧＦＲ分子及びそれらの親抗体によるＨ３２２Ｍ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞の阻害であり、所定の抗体濃度でインキュベーションし、ＩＧＦ１／ＥＧＦ抗体を使用する場合には最初の濃度の半分に希釈した。 図８は、二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体分子（ＸＧＦＲ）及びそれらの親抗体による、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒを発現するＨ３２２Ｍ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞の抗腫瘍増殖阻害を示す図である。 図９は、二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体分子（ＸＧＦＲ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性を示す図である。 図１０は、ＣＨ４ドメインを有しない完全長抗体の模式図であり、該抗体は、可変領域及び定常領域を典型的な順序で含む重鎖と軽鎖との組を２組有し、ＥＧＦＲ又はＩＧＦ１−Ｒに特異的に結合する。 図１１は、例えばＥＧＦＲ又はＩＧＦ１−Ｒに特異的に結合する単鎖Ｆａｂフラグメントの４つの具体例を示す模式図である。 図１２は、２つの抗原ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの一方に特異的に結合する完全長抗体と、２つの抗原ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの他方に特異的に結合する２つの単鎖Ｆａｂとを含む、本発明の四価の二重特異性抗体（ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ分子）の模式図である。 図１３は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する完全長抗体と、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂとを含む、本発明の二重特異性抗体であるＳｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子の形態Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤの構造及び精製後の発現レベルを示す図であり、Ａでは、ｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が重鎖のＣ末端に融合しており、Ｂでは、ｓｃＦａｂ（追加のＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド架橋を有する、ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が重鎖のＣ末端に融合しており、Ｃでは、ｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が軽鎖のＣ末端に融合しており、Ｄでは、ｓｃＦａｂ（追加のＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド架橋を有する、ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が軽鎖のＣ末端に融合している。 図１４は、ＥＧＦＲに特異的に結合する完全長抗体と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂとを含む、本発明の二重特異性抗体であるＳｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２分子の形態Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤの構造及び精製後の発現レベルを示す図であり、Ａでは、ｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が重鎖のＣ末端に融合しており、Ｂでは、ｓｃＦａｂ（追加のＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド架橋を有する、ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が重鎖のＣ末端に融合しており、Ｃでは、ｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が軽鎖のＣ末端に融合しており、Ｄでは、ｓｃＦａｂ（追加のＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド架橋を有する、ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）が軽鎖のＣ末端に融合している。 図１５は、単鎖Ｆａｂを含む二重特異性抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、図中、１は、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２０（非還元条件下）、２は、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２１（非還元条件下）、３は、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２０（還元条件下）、４は、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２１（還元条件下）を表す。 図１６ａは、ｓｃＦａｂを含む二重特異性抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１のＨＰ−ＳＥＣ分析を示す図であり、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−４７２０；７．７％の凝集物（四角で囲まれた部分）に関する。 図１６ｂは、ｓｃＦａｂを含む二重特異性抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１のＨＰ−ＳＥＣ分析を示す図であり、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−４７２１；３．５％の凝集物（四角で囲まれた部分）に関する。 図１７ａは、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合性のうち、ＥＧＦＲに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合性（ＫＤ＝２ｎＭ）のＢｉａｃｏｒｅダイアグラムを示す図である。 図１７ｂは、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合性のうち、ＩＧＦ−１Ｒに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合性（ＫＤ＝２ｎＭ）ののＢｉａｃｏｒｅダイアグラムを示す図である。 図１７ｃは、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合性のうち、ＥＧＦＲに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合性（ＫＤ＝０．５ｎＭ）のＢｉａｃｏｒｅダイアグラムを示す図である。 図１７ｄは、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合性のうち、ＩＧＦ−１Ｒに対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合性（ＫＤ＝１１ｎＭ）のＢｉａｃｏｒｅダイアグラムを示す図である。 図１８は、細胞に対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲの結合の模式図であり、該結合は、Ａｌｅｘａ６４７で標識した＜ＩＧＦ１Ｒ＞Ｍａｂ（１μｇ／ｍＬ）及び非標識ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ（１００μｇ／ｍＬ〜０.００１μｇ／ｍＬ）を同時に加え、氷上で４５分間インキュベーションし、洗浄して未結合の抗体を除去し、１％ＨＣＨＯで固定化した後、ＦＡＣＳで分析するという一般的な工程のＦＡＣＳ競合アッセイによって分析される。 図１９ａは、細胞に対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１及び親抗体＜ＩＧＦ１Ｒ＞クローン１８の結合性をＦＡＣＳ競合アッセイで分析した結果のうち、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８のＩＣ５０値（０．１８μｇ／ｍｌ）及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１のＩＣ５０値（０．１５μｇ／ｍｌ）の比較を示す図である。 図１９ｂは、細胞に対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１及び親抗体＜ＩＧＦ１Ｒ＞クローン１８の結合性をＦＡＣＳ競合アッセイで分析した結果のうち、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８の結合曲線（転換点（turning point）０．１１μｇ／ｍｌ）を示す図である（Ｙ軸はＲＬＵを表し、Ｘ軸は抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す）。 図１９ｃは、細胞に対するｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１及び親抗体＜ＩＧＦ１Ｒ＞クローン１８の結合性をＦＡＣＳ競合アッセイで分析した結果のうち、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１の結合曲線（転換点（turning point）０．１０μｇ／ｍｌ）を示す図である（Ｙ軸はＲＬＵを表し、Ｘ軸は抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す）。 図２０は、様々な二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体分子（ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ；１００ｎＭ）と２４時間インキュベーションした後のＨ３２２Ｍ細胞のＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションを示す図である。 図２１は、様々な二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体分子（ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ；１００ｎＭ）と２４時間インキュベーションした後のＨ３２２Ｍ細胞のＥＧＦＲのダウンレギュレーションを示す図である。 図２２は、様々な二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体分子（ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ；１００ｎＭ）による、Ｈ３２２Ｍ細胞の増殖阻害を示す図である。

本発明の一実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１記載のＣＤＲ３領域、配列番号２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号４記載のＣＤＲ３領域、配列番号５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号６記載のＣＤＲ１領域を含み；並びに
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１１記載のＣＤＲ３領域、配列番号１２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号１４記載のＣＤＲ３領域、配列番号１５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１６記載のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１記載のＣＤＲ３領域、配列番号２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号４記載のＣＤＲ３領域、配列番号５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号６記載のＣＤＲ１領域を含み；並びに
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１７記載のＣＤＲ３領域、配列番号１８記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１９記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号２０記載のＣＤＲ３領域、配列番号２１記載のＣＤＲ２領域及び配列番号２２記載のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号７又は配列番号８記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号９又は配列番号１０記載の配列を含み、
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号２３又は配列番号２４記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２５又は配列番号２６記載の配列を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号７記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号１０記載の配列を含み、
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号２３記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２５記載の配列を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号８記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号１０記載の配列を含み、
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号２３記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２５記載の配列を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号７記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号１０記載の配列を含み、
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号２４記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２６記載の配列を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号８記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号１０記載の配列を含み、
iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域として配列番号２４記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２６記載の配列を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体である。

本発明において「抗体」という用語は、抗原結合部位を含む結合性タンパク質を意味する。本発明において「結合部位」又は「抗原結合部位」という用語は、抗体分子の１又は複数の領域であって、リガンドが実質的に結合する領域を意味する。本発明の抗体の結合部位は、それぞれ、一組である２つの可変領域、すなわち、一組である１つの重鎖可変領域及び１つの軽鎖可変領域によって形成され得る。抗体における最小の結合部位決定基は、重鎖ＣＤＲ３領域である。本発明の一実施形態において、各結合部位は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは一組の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）によって形成される。

抗体特異性とは、特定の抗原エピトープに対する抗体の選択的な認識を意味する。例えば、自然抗体は単一特異性（monospecific）である。本発明の「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が２以上の特異性を有する場合、その認識エピトープは、１つの抗原に関連するものであってもよいし、２つ以上の抗原に関連するものであってもよい。本発明の抗体は、２つの異なる抗原、すなわち、第１の抗原であるＥＧＦＲ及び第２の抗原であるＩＧＦ−１Ｒに対して特異的である。

本発明において「単一特異性（monospecific）」抗体という用語は、１又は２以上の結合部位を有する抗体であって、各結合部位が同一の抗原の同一のエピトープに結合するものを意味する。

本発明において「価」という用語は、抗体分子において特定数の結合部位が存在することを意味する。例えば、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、それぞれ、抗体分子において２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明の二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であるが、「三価」又は「多価」（例えば、「四価」又は「六価」）であってもよい。好ましくは、本発明の二重特異性抗体は二価、三価又は四価である。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は二価である。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は三価である。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は四価である。

本発明の抗体は、２又は３以上の結合部位を有し、二重特異性を有する。すなわち、本発明の抗体は、３以上の結合部位が存在する（すなわち抗体が三価又は多価である）場合であっても、二重特異性であり得る。例えば、本発明の二重特異性抗体は、多価の単鎖抗体、二価抗体（diabody）及び三価抗体（triabody）、並びに、さらなる抗原結合部位（例えば、単鎖Ｆｖ、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域、Ｆａｂ、あるいは（Ｆａｂ）₂）が１又は２以上のペプチドリンカーを介して連結された、完全長抗体の定常領域構造を有する抗体である。抗体は、単一種の完全長抗体であってもよいし、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。。３以上の抗原結合部位を有する抗体の場合、２つの異なる抗原に対する結合部位を有する限り、幾つかの結合部位は同一であってもよい。すなわち、第１の結合部位はＥＧＦＲに対して特異的である一方、第２の結合部位はＩＧＦ−１Ｒに対して特異的である。

自然抗体と同様、本発明の抗体の抗原結合部位は、典型的には、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、それらによって抗原に対する結合部位の多様なアフィニティーが生じる。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）と、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）とが存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、データベースに蓄積されたアミノ酸配列との比較によって決定され、その際、それらの領域がアミノ酸配列の多様性に従って規定されているデータベースが用いられる。また、本発明の範囲には、もっと数が少ないＣＤＲから構成される機能性抗原結合部位（すなわち、結合特異性が３、４又は５つのＣＤＲによって決定される場合）が含まれる。例えば、６つのＣＤＲの完全なセットよりも少なくても結合に十分である場合がある。幾つかの場合には、ＶＨ又はＶＬ領域で十分であろう。

本発明の一実施形態において、本発明の抗体は、１又は２以上の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域をさらに含む。免疫グロブリンクラスには、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥアイソタイプが含まれ、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合にはそれらのサブタイプが含まれる。好ましい実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ型抗体の定常領域構造を有するとともに、４つの抗原結合部位を有する。これは、ＥＧＦＲに対して特異的に結合する２つの完全な抗原結合部位（例えば単鎖Ｆｖ）を、ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的に結合する完全抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に連結することによって達成される。４つの抗原結合部位は、好ましくは、２種類の結合部位を含み、各種結合部位は２つの異なる結合特異性のそれぞれに対応する。

本発明において「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成からなる抗体分子の調製物を意味する。

本発明において「キメラ抗体」という用語は、ある起源又は種に由来する可変領域（すなわち結合領域）と、別の起源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部分とを含む抗体を意味し、キメラ抗体は、通常、組換えＤＮＡ技術によって調製される。キメラ抗体は、マウス可変領域とヒト定常領域とを含むことが好ましい。キメラ抗体のその他の好ましい形態としては、その定常領域において、本発明の特性（特にＣ１ｑ結合性及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合性に関する特性）が生じるように、元の抗体の定常領域に修飾又は変異が加えられた抗体である。そのようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体の作製方法としては、当業者に周知の慣用の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術が挙げられる（例えば、Morrison, S.L.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81（1984）6851-6855; 米国特許第5,202,238号及び米国特許第5,204,244号）。

本発明において「ヒト化抗体」という用語は、親の免疫グロブリンとは異なる特性をもつＣＤＲが含まれるように、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が修飾された抗体を意味する。好ましい実施形態において、「ヒト化抗体」を作製するために、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植（graft）される（例えば、Riechmann, L.等, Nature 332（1988）323-327; 及びNeuberger, M.S.等, Nature 314（1985）268-270）。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して上記した抗原を認識する配列で表されるものである。「ヒト化抗体」のその他の形態には、その定常領域において、本発明の特性（特にＣ１ｑ結合性及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合性に関する特性）が生じるように、元の抗体の定常領域に追加的に修飾又は変異が加えられた抗体が挙げられる。

本発明において「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む意味で用いられる。ヒト抗体は当業者に周知である（van Dijk, M.A., 及び van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5（2001）368-374）。また、ヒト抗体は、免疫によって、内因性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体の完全なレパートリー又は選別が可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を用いて作製することができる。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを生殖細胞系変異マウスへ移入すると、抗原チャレンジ（antigen challenge）によって、ヒト抗体の産生が生じる（例えば、Jakobovits, A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）2551-2555; Jakobovits, A.等, Nature 362（1993）255-258; Bruggemann, M.等, Year Immunol. 7（1993）33-40）。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーによって作製することができる（Hoogenboom, H.R., 及びWinter, G.J. Mol. Biol. 227（1992）381-388; Marks, J.D.等, J. Mol. Biol. 222（1991）581-597）。Cole等及びBoerner等の方法は、ヒトモノクローナル抗体の作製に利用可能である（Cole, S.P.C.等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss（1985）77-96; 及びBoerner, P.等, J. Immunol. 147（1991）86-95）。キメラ抗体及びヒト化抗体に関して既に述べたように、「ヒト抗体」という用語は、その定常領域において、本発明の特性（特にＣ１ｑ結合性及び／又はＦｃＲ結合性に関する特性）が生じるように修飾、例えば「クラススイッチング」、すなわちＦｃ部分の変化又は変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４への変異及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）による修飾、が加えられた抗体を含む。

本発明において「組換えヒト抗体」という用語は、組換え技術によって作製、発現、創製又は単離が可能な全てのヒト抗体を含む意味で用いられ、例えば、ＮＳ０、ＣＨＯ細胞等の宿主細胞から単離される抗体、又は、ヒト免疫グロブリン遺伝子又は抗体に関する組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして発現させたトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離される抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、再構成された形態（rearranged form）の可変領域及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体にはin vivoにおける体細胞超変異が施されている。すなわち、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それに関連するが、in vivoにおいてヒト抗体生殖細胞系レパートリーとして天然に存在するものでなくてもよい。本発明において「可変領域」（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ））という用語は、抗体の抗原への直接的な結合に関与する、それぞれ組をなす軽鎖及び重鎖を意味する。ヒト軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は同一の基本構造を有し、各領域は４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、フレームワーク領域の配列は広く保存され、３つの「超可変領域」（すなわち相補性決定領域，ＣＤＲ）によって連結されている。フレームワーク領域はβシート構造を採り、ＣＤＲはβシート構造に連結したループを形成し得る。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域による三次元構造内に保持され、その他の鎖のＣＤＲとともに抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明の抗体の結合特異性／アフィニティーの点で重要な役割を果し、本発明のさらなる目的を提供する。

本発明において「超可変領域」又は「抗体の抗原結合部位」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、明細書中で定義した超可変領域以外の可変領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの間に、ドメインとしてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各鎖のＣＤＲは、上記フレームワークのアミノ酸によって分断されている。特に、重鎖のＣＤＲ３は、最も抗原結合に寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat等の標準的な決定法に従って決定される（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。

本発明の二重特異性抗体には、さらに、「保存配列変異（conservative sequence modification）」を有する抗体（二重特異性抗体の「変異体」を意味する）も含まれる。これは、本発明の抗体の上記特性に対して影響又は変更を与えないヌクレオチド及びアミノ酸配列の変異を意味する。変異は、当業界で公知の標準的な方法、例えば、部位特異的変異誘発法及びＰＣＲを利用した変異誘発法によって導入することができる。保存アミノ酸置換には、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換された形態が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当業界で周知である。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体において必須ではないと予測されるアミノ酸残基は、好ましくは同一ファミリーの側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換され得る。二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の「変異体」は、「親」の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子を意味し、親抗体の１又は２以上の可変領域又は定常領域において、通常１０個以下、好ましくは約２個〜約５個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換が導入され得る。アミノ酸置換は、Riechmann, L.等（Nature 332（1988）323-327）及びQueen, C.等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）10029-10033）の分子モデリングに基づく変異誘発法によって実施することができる。

配列の同一性又は相同性（ホモロジー）は、親の配列と一致する候補配列におけるアミノ酸残基の比率（パーセンテージ）として定義され、必要であれば、ギャップを導入して配列をアライメントした後、配列の同一性の最大比率が求められる。抗体配列のＮ末端、Ｃ末端又は内部への付加、欠失又は挿入は、配列の同一性又は相同性に影響を与えないように導入される。変異体は、ヒトＥＧＦＲ及びヒトＩＧＦ−１Ｒへの結合能を保持する。

本発明において「結合」又は「特異的結合」という用語は、抗体の抗原エピトープへの結合を意味し、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、好ましくは野生型抗原を発現するＣＨＯ細胞を用いた細胞−ＥＬＩＳＡにおいて検出される。結合は、１０^-8Ｍ以下、好ましくは１０^-13Ｍ〜１０^-9Ｍの結合アフィニティー（Ｋ_D）を意味する。抗体の抗原又はＦｃγＲＩＩＩへの結合は、BIAcoreアッセイ（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）によって試験することができる。結合アフィニティーは、ｋ_a（抗体／抗原複合体における抗体の結合定数）、ｋ_D（抗体の解離定数）及びＫ_D（ｋ_D／ｋ_a）として定義される。

本発明において「エピトープ」という用語には、抗体に特異的に結合可能ないかなるポリペプチド決定基も含まれる。本発明の一実施形態において、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、スルホニル等の分子の化学的に活性な表面官能基が含まれ、また、一実施形態において、特定の三次元構造特性又は特定の荷電特性を有する場合がある。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。本発明の一実施形態において、抗体は、タンパク質及び／又は高分子の複合体混合物中の標的抗原を選択的に認識し、抗原に特異的に結合する。

ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても知られているが、本明細書では「ＥＧＦＲ」という。）は、ｃ−ｅｒｂＢプロトオンコジーンによってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通受容体であり、内因性チロシンキナーゼ活性を示す（Modjtahedi, H.等, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース登録Ｐ００５３３によってＥＧＦＲの配列が提供される。ＥＧＦＲのアイソフォーム及び変異体も存在し（例えば、選択的ＲＮＡ転写産物，欠失変異体（truncated version)，多型体等）、それらには、例えば、特に限定されるわけではないが、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース登録番号Ｐ００５３３−１，Ｐ００５３３−２，Ｐ００５３３−３及びＰ００５３３−４として特定されるものが含まれる。ＥＧＦＲは、例えば、次のリガンドに結合することが知られている。上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧｆ−α），アンフィレグリン（amphiregulin），ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ），ベータセルリン（betacellulin）及びエピレグリン（epiregulin）（Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J., 及び Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565）。ＥＧＦＲは、例えば、チロシンキナーゼ媒介シグナル変換経路を通じて、多数の細胞過程を制御する。チロシンキナーゼ媒介シグナル変換経路としては、例えば、これらに限定されるわけではないが、細胞増殖，分化，細胞生存，アポトーシス，血管形成，有糸分裂誘発及び転移をコントロールするシグナル変換経路の活性化が挙げられる（Atalay, G.等, Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S., 及び Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H.等, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235）。

インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ，ＣＤ２２１抗原）は、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する（LeRoith, D.等, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; 及び Adams, T.E.等, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース登録Ｐ０８０６９によってＩＧＦ−１Ｒの配列が提供される。ＩＧＦ−ＩＲは、高アフィニティーでＩＧＦ−Ｉに結合し、このリガンドに対する生理反応がｉｎ ｖｉｖｏで開始される。ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦ−ＩＩにも結合するが、そのアフィニティーは若干低い。ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現が細胞の悪性形質転換を促進することは、ＩＧＦ−ＩＲが細胞の悪性形質転換に関与することの証拠であり、したがって、癌の処置のための治療剤を開発する上で有用なターゲットである（Adams, T.E.等, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063）。

本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、完全長の親抗体を骨格（scaffold）として含む。

本発明において「完全長の抗体」とは、２つの「完全長抗体重鎖」と２つの「完全長抗体軽鎖」とからなる抗体を意味する（ＣＨ４ドメインを有しない「完全長抗体」の模式的構造については図１０参照。また、単鎖Ｆｖが付加された四価の二重特異性抗体の形態（ＸＧＦＲ）及び単鎖Ｆａｂが付加された四価の二重特異性抗体の形態（ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ）の完全長部分については図１及び１２参照。）。「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変領域（ＶＨ），抗体重鎖定常領域１（ＣＨ１），抗体ヒンジ領域（ＨＲ），抗体重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び抗体重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含んでなるポリペプチドであり、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略され；サブクラスＩｇＥの抗体の場合には、抗体重鎖定常領域４（ＣＨ４）が含まれる場合がある。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ，ＣＨ１，ＨＲ，ＣＨ２及びＣＨ３を含んでなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含んでなるポリペプチドであり、ＶＬ−ＣＬと略される。抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ（kappa）又はλ（lambda）であってよい。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン間並びに完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を通じて互いに連結される。典型的な完全長抗体の具体例としては、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１，ＩｇＧ２等），ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等の自然抗体が挙げられる。本発明の完全長抗体は、単一種（例えばヒト）に由来してもよいし、キメラ化又はヒト化抗体であってもよい。本発明の完全長抗体は、２つの抗原結合部位を含み、各抗原結合部位は、同一の抗原に特異的に結合する一組のＶＨ及びＶＬによって形成される。したがって、第１の抗原結合部位を含み、２つの抗体軽鎖及び２つの抗体重鎖からなる単一特異性二価（＝完全長）抗体は、完全長抗体である。完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、重鎖又は軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸である。完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端は、重鎖又は軽鎖のＮ末端の最後のアミノ酸である。

本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は二価であり、例えば、ａ）WO 2009/080251，WO 2009/080252又はWO 2009/080253に記載されるような形態（ドメインが交換された抗体，実施例１４参照）、ｂ）一方の単鎖ＦａｂフラグメントはＥＧＦＲに対して特異的であり、他方はＩＧＦ−１Ｒに対して特異的であるｓｃＦａｂ−Ｆｃ融合抗体に基づく形態（実施例１７参照）、又はｃ）欧州特許出願第07024867.9（WO 2009/080251），Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; WO 96/027011; Merchant A.M等, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S.等, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35 及びEP 1870459 A1 に記載されるような形態が用いられる。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号３０，配列番号３１，配列番号３２若しくは配列番号３３記載のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号３４，配列番号３５，配列番号３６若しくは配列番号３７記載のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号３８若しくは配列番号３９記載のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号４０若しくは配列番号４１記載のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号４２若しくは配列番号４３記載のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含むことを特徴とする。これらのアミノ酸配列において、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８記載の重鎖可変領域及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２に由来する）に基づき、ＩＧＦ-１Ｒに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３記載の重鎖可変領域及び配列番号２５記載の軽鎖可変領域（ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）に由来する）に基づく。

本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は三価であり、例えば、２つの受容体ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの一方に特異的に結合する完全長抗体に基づく形態であって、２つの受容体ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの他方に特異的に結合するｓｃＦａｂフラグメントが、１つの重鎖の１つのＣ末端のみに融合されている形態（例えば欧州特許出願第 09004909.9 号に記載されるような knobs-into-holesテクノロジー）、又は、２つの受容体ＥＧＦＲ及びＩＧＦ-１Ｒのうちの一方に特異的に結合する完全長抗体に基づく形態であって、２つの受容体ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの他方に特異的に結合するＶＨ又はＶＨ−ＣＨ１フラグメントが１つの重鎖の１つのＣ末端に融合され、２つの受容体ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの他方に特異的に結合するＶＬ又はＶＬ−ＣＬフラグメントが別の重鎖のＣ末端に融合している形態（例えば欧州特許出願第 09005108.7 号に記載されるような knobs-into-holesテクノロジー）が用いられる。knobs-into-holesテクノロジー及びその変法については、Ridgway, J. B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; WO 96/027011, Merchant A. M, 等, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., 等, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35; 及び EP 1870459A1を参照のこと。本発明の一実施形態において、本発明の三価の二重特異性抗体は、配列番号４４、配列番号４５若しくは配列番号４６記載のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態において、本発明の三価の二重特異性抗体は、配列番号４７、配列番号４８若しくは配列番号４９記載のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含むことを特徴とする。これらのアミノ酸配列において、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８記載の重鎖可変領域及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２に由来する）に基づき、ＩＧＦ-１Ｒに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３記載の重鎖可変領域及び配列番号２５記載の軽鎖可変領域（ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）に由来する）に基づく。

本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は四価であり、例えば、WO 2007/024715，WO 2007/109254 又は欧州特許出願第 09004909.9 号に記載されるような形態（第１の抗原に結合する完全長抗体に、第２の抗原に結合する２つのｓｃＦａｂフラグメントが融合された形態）（例えば実施例１又は９参照）が用いられる。

本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、四価であって、
ａ）第１の抗原結合部位を含む単一特異性二価抗体であって、２つの抗体軽鎖及び２つの抗体重鎖からなり、各鎖が１つだけの可変領域を含む抗体、
ｂ）２つのペプチドリンカー、並びに
ｃ）第２の抗原結合部位を含む２つの単一特異性一価単鎖抗体（単一特異性一価単鎖Ｆｖ）であって、それぞれが軽鎖可変領域，重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間の単鎖リンカーからなる抗体
からなり、２つの単鎖抗体（２つの単鎖Ｆｖ）が、単一特異性二価抗体軽鎖又は重鎖の同一末端に連結している。

本発明の他の実施形態において、二重特異性抗体は、四価であって、
ａ）第２の抗原結合部位を含む単一特異性二価抗体であって、２つの抗体軽鎖及び２つの抗体重鎖からなり、各鎖は１つだけの可変領域を含む抗体、
ｂ）２つのペプチドリンカー、並びに
ｃ）第１の抗原結合部位を含む２つの単一特異性一価単鎖抗体（単一特異性一価単鎖Ｆｖ）であって、それぞれが軽鎖可変領域，重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間の単鎖リンカーからなる抗体
からなり、２つの単鎖抗体（２つの単鎖Ｆｖ）が、単一特異性二価抗体軽鎖又は重鎖の同一末端に連結している。

本発明の別の実施形態において、二重特異性抗体は、四価であって、
ａ）抗原結合部位を含む完全長抗体であって、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる抗体、並びに
ｂ）第２の抗原結合部位を含む２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメント
からなり、ｂ）記載の２つの単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、ａ）記載の完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において融合している。

本発明の別の実施形態において、二重特異性抗体は、四価であって、
ａ）第２の抗原結合部位を含む完全長抗体であって、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる抗体、並びに
ｂ）第１の抗原結合部位を含む２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメント
からなり、ｂ）記載の２つの単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、ａ）記載の完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において融合している。

好ましくは、ｂ）記載の２つの単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、ａ）記載の完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端において融合している。

本発明の一実施形態において、第２の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、完全長抗体に、該完全長抗体の各重鎖又は軽鎖のＣ末端において融合している。

本発明の一実施形態において、第２の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、完全長抗体に、該完全長抗体の各重鎖のＣ末端において融合している。

本発明の一実施形態において、第２の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、完全長抗体に、該完全長抗体の各軽鎖のＣ末端において融合している。

本発明のさらなる実施形態において、四価の二重特異性抗体は、以下の特徴を有する。
四価の二重特異性抗体は、
ａ）親抗体である単一特異性二価（完全長）抗体であって、２つの完全長抗体重鎖及び２つの完全長抗体軽鎖からなり、各鎖が１つだけの可変領域を含む抗体、
ｂ）２つのペプチドリンカー、
ｃ）それぞれが抗体重鎖可変領域，抗体軽鎖可変領域及び抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域との間の単鎖リンカーからなる２つの単一特異性一価単鎖抗体（単一特異性一価単鎖Ｆｖ）
からなる。

好ましくは、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ）は、単一特異性二価抗体重鎖の同一末端（Ｃ末端又はＮ末端）、又は単一特異性二価抗体軽鎖の同一末端（好ましくはＣ末端）に連結しており、さらに好ましくは、単一特異性二価抗体重鎖の同一末端（Ｃ末端又はＮ末端）に連結している。

本発明において「ペプチドリンカー」という用語は、アミノ酸配列（好ましくは合成起源のアミノ酸配列）を有するペプチドを意味する。本発明のペプチドリンカーは、様々な抗原結合部位及び／又は抗体フラグメントを連結するために用いられ、抗体フラグメントは最終的には様々な抗原結合部位（例えば、単鎖Ｆｖ，完全長抗体，ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン，Ｆａｂ，(Ｆａｂ)₂，Ｆｃ部分）と一緒になって、本発明の二重特異性抗体を形成する。ペプチドリンカーは、表１に記載のアミノ酸配列のうちの１又は２以上を含むことができ、さらに任意に選択されたアミノ酸を含むことができる。ペプチドリンカーは、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは１０〜５０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列からなるペプチドである。好ましくは、ｂ）記載のペプチドリンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明の一実施形態において、ペプチドリンカーは、(ＧｘＳ)ｎ［式中、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｘ＝３かつｎ＝３，４，５又は６であるか、ｘ＝４かつｎ＝２，３，４又は５であり、好ましくはｘ＝４かつｎ＝２又は３であり、さらに好ましくはｘ＝４かつｎ＝２である（すなわち(Ｇ₄Ｓ)₂）。］である。（ＧｘＳ）ｎで表されるペプチドリンカーには、追加のＧ（すなわちグリシン）が付加されてもよい（例えばＧＧ，ＧＧＧ等)。

本発明において「単鎖リンカー」という用語は、アミノ酸配列（好ましくは合成起源のアミノ酸配列）を有するペプチドを意味する。本発明の単鎖リンカーは、ＶＨ及びＶＬドメインを連結し、単鎖Ｆｖを形成するために用いられる。好ましくは、ｃ）記載の単鎖リンカーは、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明の一実施形態において、単鎖リンカーは、（ＧｘＳ）ｎ［式中、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｘ＝３かつｎ＝４，５又は６であるか、ｘ＝４かつｎ＝３，４又は５であり、好ましくはｘ＝４かつｎ＝４又は５であり、さらに好ましくはｘ＝４かつｎ＝４である。］である。

さらに、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ）は、好ましくは、ジスルフィドで安定化されている。単鎖抗体のジスルフィド安定化は、単鎖抗体の可変領域間にジスルフィド結合を導入することにより達成される（例えば、WO 94/029350，Rajagopal, V.等, Prot. Engin. 10(12) (1997) 1453-59; Kobayashi, H.等, Nuclear Medicine and Biology 25 (1998) 387-393; 又は Schmidt, M.等, Oncogene 18 (1999) 1711-1721）。

ジスルフィド安定化単鎖抗体（単鎖Ｆｖ）の一実施形態において、本発明の抗体に含まれる単鎖抗体の可変領域間のジスルフィド結合は、各単鎖抗体に関し、下記から独立して選択される：
i） 重鎖可変領域の４４位−軽鎖可変領域の１００位、
ii） 重鎖可変領域の１０５位−軽鎖可変領域の４３位、又は
iii） 重鎖可変領域の１０１位−軽鎖可変領域の１００位。

本発明の一実施形態において、本発明の抗体に含まれる単鎖抗体の可変領域間のジスルフィド結合は、重鎖可変領域の４４位と軽鎖可変領域の１００位との間に形成される。本発明の一実施形態において、本発明の抗体に含まれる単鎖抗体の可変領域間のジスルフィド結合は、重鎖可変領域の１０５位と軽鎖可変領域の４３位との間に形成される。

本発明の一実施形態において、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ）は、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ）の可変領域ＶＨ及びＶＬ間に、上記追加のジスルフィド安定化を有しないことが好ましい。

本発明のさらなる実施形態において、二重特異性抗体は下記特徴を有する。
２つの抗原結合部位は、それぞれ、各組が親抗体である単一特異性二価抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域からなる２組の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって形成され、両抗原結合部位とも同一のエピトープに結合し、
追加の２つの抗原結合部位は、それぞれ、１つの単鎖抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって形成され、
単鎖抗体は、それぞれ、ペプチドリンカーを通じて、１つの重鎖又は１つの軽鎖に連結しており、各抗体鎖末端は１つの単鎖抗体のみ連結している。

本発明のさらなる実施形態において、四価の二重特異性抗体は、ａ）記載の単一特異性二価（完全長）抗体部分がＥＧＦＲに結合し、ｃ）記載の２つの単一特異性一価単鎖抗体がＩＧＦ-１Ｒに結合することを特徴とする。

本発明のさらなる実施形態において、四価の二重特異性抗体は、ａ）記載の単一特異性二価（完全長）抗体部分がＩＧＦ−１Ｒに結合し、ｃ）記載の２つの単一特異性一価単鎖抗体がＥＧＦＲに結合することを特徴とする。

ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体が四価である本発明の第１の実施形態の構造において、抗原Ａ及びＢのうちの一方がＥＧＦＲであり、他方がＩＧＦ−１Ｒである。この構造は、図１及び２の模式図に示されるように、抗原Ａに結合する完全長抗体に、抗原Ｂに結合する２つの単鎖Ｆｖ（ジスルフィドで安定化されていてもよい）がペプチドリンカーを通じて連結されている。

四価抗体に係る第２の実施形態において、四価の二重特異性抗体は、
ａ）２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなり、第１の抗原（２つの抗原ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの一方）に特異的に結合する完全長抗体、並びに
ｂ）第２の抗原（２つの抗原ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのうちの他方）に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメント
からなり、ｂ）記載の単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、ａ）記載の完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において融合されている。

本発明の一実施形態において、第２の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、完全長抗体に、該完全長抗体の各重鎖又は各軽鎖のＣ末端において融合している。

本発明の一実施形態において、第２の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、完全長抗体に、該完全長抗体の各重鎖のＣ末端において融合している。

本発明の一実施形態において、第２の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて、完全長抗体に、該完全長抗体の各軽鎖のＣ末端において融合している。

「単鎖Ｆａｂフラグメント」（図１１参照）は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ），抗体定常領域１（ＣＨ１），抗体軽鎖可変領域（ＶＬ），抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）及びリンカーからなるペプチドであって、これらの抗体領域及びリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、下記順序のうちの１つの順序で配置されている：
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ，
ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１，
ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１，又は
ｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；
ここで、上記リンカーは、少なくとも３０個、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸からなるポリペプチドである。単鎖Ｆａｂフラグメントである、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ，ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１，ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬは、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間の天然のジスルフィド結合を通じて安定化している。「Ｎ末端」という用語は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を意味する。「Ｃ末端」という用語は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を意味する。

本発明の好ましい一実施形態において、単鎖Ｆａｂフラグメントにおける抗体領域及びリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、下記順序のうちの１つの順序で配置されている：
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ，又は
ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１。
より好ましくはＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１である。

本発明の好ましい別の実施形態において、単鎖Ｆａｂフラグメントにおける抗体領域及びリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、下記順序のうちの１つの順序で配置されている：
ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１，又は
ｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。

本発明において「ペプチドコネクター」という用語は、アミノ酸配列（好ましくは合成起源のアミノ酸配列）を有するペプチドを意味する。本発明のペプチドコネクターは、単鎖Ｆａｂフラグメントを完全長抗体のＣ末端又はＮ末端に融合させ、本発明の多重特異性抗体を形成するために用いられる。好ましくは、ペプチドコネクターは、少なくとも５個、好ましくは５〜１００個、さらに好ましくは１０〜５０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明の一実施形態において、ペプチドコネクターは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｘ＝３かつｎ＝３，４，５又は６かつｍ＝０，１，２又は３であるか、ｘ＝４かつｎ＝２，３，４又は５かつｍ＝０，１，２又は３であり、好ましくはｘ＝４かつｎ＝２又は３であり、さらに好ましくはｘ＝４かつｎ＝２である。］である。本発明の一実施形態において、ペプチドコネクターは、(Ｇ₄Ｓ)₂である。

本発明において「リンカー」という用語は、アミノ酸配列（好ましくは合成起源のアミノ酸配列）を有するペプチドを意味する。本発明において、これらのペプチドは、ａ）ＶＨ−ＣＨ１をＶＬ−ＣＬに、ｂ）ＶＬ−ＣＬをＶＨ−ＣＨ１に、ｃ）ＶＨ−ＣＬをＶＬ−ＣＨ１に、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１をＶＨ−ＣＬに連結し、本発明の下記単鎖Ｆａｂフラグメントを形成するために用いられる：
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ，
ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１，
ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１，又は
ｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。

単鎖Ｆａｂフラグメントにおけるリンカーは、少なくとも３０個、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明の一実施形態において、リンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｘ＝３かつｎ＝８，９又は１０かつｍ＝０，１，２又は３であるか、ｘ＝４かつｎ＝６，７又は８かつｍ＝０，１，２又は３であり、好ましくはｘ＝４かつｎ＝６又は７かつｍ＝０，１，２又は３であり、さらに好ましくはｘ＝４かつｎ＝７かつｍ＝２である。］である。本発明の一実施形態において、リンカーは(Ｇ₄Ｓ)₆Ｇ₂である。

単鎖Ｆａｂフラグメントにおいて、ＣＬ領域−ＣＨ１領域間の天然のジスルフィド結合に加え、以下の位置−位置間に追加のジスルフィド結合を導入することにより、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）をジスルフィド安定化してもよい：
i） 重鎖可変領域の４４位−軽鎖可変領域の１００位，
ii） 重鎖可変領域の１０５位−軽鎖可変領域の４３位，又は
iii） 重鎖可変領域の１０１位−軽鎖可変領域の１００位（いずれの位置もＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリングである）。

そのような追加のジスルフィド結合による単鎖Ｆａｂフラグメントの安定化は、単鎖Ｆａｂフラグメントの可変領域ＶＨ−ＶＬ間にジスルフィド結合を導入することにより達成される。非天然のジスルフィド架橋を単鎖Ｆｖの安定化のために導入する技術は、例えば、WO 94/029350, Rajagopal, V. 等, Prot. Engin. (1997) 1453-59; Kobayashi, H. 等,; Nuclear Medicine and Biology, Vol. 25, (1998) 387-393; 又は Schmidt, M. 等, Oncogene (1999) 18, 1711-1721 に記載されている。本発明の一実施形態において、本発明の抗体に含まれる単鎖Ｆａｂの可変領域−可変領域間に導入される追加のジスルフィド結合は、重鎖可変領域の４４位−軽鎖可変領域の１００位間のジスルフィド結合である。本発明の一実施形態において、本発明の抗体に含まれる単鎖Ｆａｂの可変領域−可変領域間に導入される追加のジスルフィド結合は、重鎖可変領域の１０５位−軽鎖可変領域の４３位間のジスルフィド結合である（いずれの位置もＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリングである）。

本発明の一実施形態において、単鎖Ｆａｂフラグメントは、単鎖Ｆａｂフラグメントの可変領域ＶＨ−ＶＬ間の追加のジスルフィド結合によって安定化されていないことが好ましい。

四価の二重特異性抗体に関する本発明の第２の実施形態において、好ましくは、四価の二重特異性抗体は、２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメント（好ましくはＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、それぞれ、ａ）記載の完全長抗体の２つの重鎖の２つのＣ末端、又は２つの軽鎖の２つのＣ末端に融合されている。そのような融合の結果として、２つの同一の融合ペプチド（（ｉ）重鎖と単鎖Ｆａｂフラグメントとの融合ペプチド、又は（ｉｉ）軽鎖と単鎖Ｆａｂフラグメントとの融合ペプチド）が生じ、これを完全長抗体の軽鎖又は重鎖とともに共発現させることにより、本発明の二重特異性抗体が得られる（図１２，１３及び１４参照）。

別の実施形態において、四価の二重特異性抗体は、ａ）記載の完全長抗体部分がＥＧＦＲに結合し、ｂ）記載の２つの単鎖ＦａｂフラグメントがＩＧＦ−１Ｒに結合することを特徴とする。

別の実施形態において、四価の二重特異性抗体は、ａ）記載の完全長抗体部分がＩＧＦ−１Ｒに結合し、ｂ）記載の２つの単鎖ＦａｂフラグメントがＥＧＦＲに結合することを特徴とする。

別の実施形態において、二重特異性抗体は、定常領域がヒト由来であることを特徴とする。

別の実施形態において、二重特異性抗体は、その定常領域が、ヒトＩｇＧ１サブクラスの定常領域、又は変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスの定常領域であることを特徴とする。

別の実施形態において、二重特異性抗体は、その定常領域が、ヒトＩｇＧ２サブクラスの定常領域であることを特徴とする。

別の実施形態において、二重特異性抗体は、その定常領域が、ヒトＩｇＧ３サブクラスの定常領域であることを特徴とする。

別の実施形態において、二重特異性抗体は、その定常領域が、ヒトＩｇＧ４サブクラスの定常領域、又は追加の変異Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４サブクラスの定常領域であることを特徴とする。

本発明の二重特異性抗体が、向上した特性を有することが判明している。本発明の二重特異性抗体は、個々の抗体を１つだけ又は２つ組み合わせて適用する場合と比較して、又は公知の二重特異性抗体（Lu, D. 等, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 及び J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72）と比較して、それと少なくとも同一の又はそれよりも増大したｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性／抗腫瘍作用を示す。また、本発明の二重特異性抗体は、公知の二重特異性抗体（Lu, D. 等, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 及び J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72）と比較して、それよりも向上したｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的安定性を示す。さらに、本発明の二重特異性抗体は、個々の抗体を１つだけ又は２つ組み合わせて適用する場合と比較して、モジュレートされた（modulated）受容体ダウンレギュレーション／内在化を示す。さらに、本発明の二重特異性抗体は、投与量及び／又は投与頻度の減少並びに付随するコスト削減等の利点をもたらすことができる。

本発明において「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体領域全体を意味する。定常領域は、抗原結合に直接的には関係しないが、様々なエフェクター機能を呈する。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、抗体は、クラス：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、これらのうちの幾つかはさらにサブクラス、例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４というサブクラス，ＩｇＡ１及びＩｇＡ２というサブクラスに分類される。重鎖定常領域は、抗体クラスの相違に対応して、それぞれ、α，δ，ε，γ及びμと呼ばれる。軽鎖定常領域は、５つの抗体クラス全てでみられ、κ（kappa）及びλ（lambda）と呼ばれる。

本発明において「ヒト由来定常領域」という用語は、サブクラスＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のヒト抗体の重鎖定常領域、及び／又は軽鎖定常領域κ又はλを意味する。そのような定常領域は当業界で周知であり、例えば、Kabat, E.A. 等の刊行物に記載されている（例えば Johnson, G. 及び Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788）。ＩｇＧ４サブクラスの抗体が、減少したＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合性を示す一方、その他のＩｇＧサブクラスの抗体は、強力な結合性を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８，Ａｓｐ２６５，Ａｓｐ２７０，Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖鎖の欠失），Ｐｒｏ３２９，Ｌｅｕ２３４，Ｌｅｕ２３５，Ｇｌｙ２３６，Ｇｌｙ２３７，Ｉｌｅ２５３，Ｓｅｒ２５４，Ｌｙｓ２８８，Ｔｈｒ３０７，Ｇｌｎ３１１，Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５といった残基に変異が生じた場合にも、減少したＦｃ受容体結合性を示す（Shields, R., L. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J. 等, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A. 等, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434）。本発明の一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、減少したＦｃＲ結合性を有し、親抗体である単一特異性二価（完全長）抗体は、ＦｃＲ結合性の観点から、ＩｇＧ４サブクラス又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ２サブクラスの抗体であって、Ｓ２２８，Ｌ２３４，Ｌ２３５及び／又はＤ２６５に変異が生じたものであるか、それとともに又はそれに代えてＰＶＡ２３６変異が生じたものである。本発明の一実施形態において、親抗体である単一特異性二価（完全長）抗体における変異は、Ｓ２２８Ｐ，Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｌ２３５Ｅ及び／又はＰＶＡ２３６である。本発明の別の実施形態において、親抗体である単一特異性二価（完全長）抗体における変異は、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ、並びにＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである。重鎖定常領域は配列番号２７及び２８に示される。本発明の一実施形態において、親抗体である単一特異性二価（完全長）抗体の重鎖定常領域は、配列番号２７において変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａが生じたものである。本発明の他の実施形態において、親抗体である単一特異性二価（完全長）抗体の重鎖定常領域は、配列番号２８において変異Ｓ２２８Ｐが生じたものである。本発明の他の実施形態において、親抗体である単一特異性二価（完全長）抗体の軽鎖定常領域は、配列番号２９記載のものである。

抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞障害）に直接的に関係する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスにおいて、補体因子Ｃ１qが定常領域に結合することにより開始される。抗体に対するＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における特定のタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。そのような定常領域結合部位は当業界で公知であり、例えば Lukas, T.J. 等, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., 及び Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R. 等, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E. 等, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E. 等, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. 等, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A. 等, Immunology 86 (1995) 319-324; 及び EP 0 307 434 に記載されている。そのような定常領域結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４，Ｌ２３５，Ｄ２７０，Ｎ２９７，Ｅ３１８，Ｋ３２０，Ｋ３２２，Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）によって特徴づけられる。

「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」という用語は、エフェクター細胞存在下での本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣの測定は、好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥＧＦＲ発現細胞の調製物を、エフェクター細胞の存在下、本発明の抗体で処理することにより行われる。エフェクター細胞としては、例えば、単球又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞若しくは不死化（permanently growing）ＮＫ細胞株等の、新鮮分離したＰＢＭＣ又は軟膜から精製したエフェクター細胞が挙げられる。

「補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）」という用語は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスにおいて、補体因子Ｃ１ｑがＦｃ部分に結合することにより開始されるプロセスを意味する。抗体に対するＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における特定のタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。そのようなＦｃ部分の結合部位は当業界で公知である（上記参照）。そのようなＦｃ部分の結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４，Ｌ２３５，Ｄ２７０，Ｎ２９７，Ｅ３１８，Ｋ３２０，Ｋ３２２，Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）によって特徴づけられる。サブクラスＩｇＧ１，ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑ及びＣ３の結合を含む補体活性化を示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３に結合しない。

モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、それらのオリゴ糖成分を改変（engineering）することにより促進することができ、例えば、Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, 及び US 6,602,684 に記載されている。ＩｇＧ１型抗体は、最も一般的に治療抗体として用いられており、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に、保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合する２つの二分岐複合オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との緊密な関係を形成しており、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介する上で必須である（Lifely, M.R. 等, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R. 等, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., 及び Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。Umana, P. 等（Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 及び WO 99/54342）は、分岐（bisected）オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）の、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性を有意に増大させることを示している。Ａｓｎ２９７糖鎖の構成の変異又は欠失は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合にも影響を与える（Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J. 等, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C. 等, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147）。

モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を促進させる方法は、例えば、WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO 2007/031875，Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)，WO 99/154342，WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2004/065540，WO 2005/011735，WO 2005/027966，WO 1997/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835 及び WO 2000/061739，又は、例えば、Niwa, R. 等, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T. 等, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 及び US 2005/0249722 に報告されている。

したがって、本発明の一実施形態において、二重特異性抗体（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスのＦｃ部分、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのＦｃ部分を含む場合）は、Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）において、フコース量が６５％以下である糖鎖でグリコシル化されている。本発明の別の実施形態において、糖鎖のフコース量は５％〜６５％、好ましくは２０％〜４０％である。本発明において「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域の２９７位又はその付近に位置するアミノ酸であるアスパラギンを意味する。抗体の軽微な配列変異によって、Ａｓｎ２９７は、数個のアミノ酸（通常、±３アミノ酸以下）を隔てて２９７位の上流又は下流に位置する場合がある（すなわち、２９４位〜３００位の間）。本発明の一実施形態に係るグリコシル化抗体において、ＩｇＧサブクラスは、ヒトＩｇＧ１サブクラス，変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス、又はＩｇＧ３サブクラスである。本発明の別の実施形態において、糖鎖のＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）量は１％以下、及び／又は糖鎖のＮ末端α−１，３−ガラクトース量は１％以下である。糖鎖は、好ましくは、ＣＨＯ細胞で組換体として発現させた抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す。

「ＣＨＯ細胞で組換体として発現させた抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す」という表現は、本発明の二重特異性抗体の定常領域のＡｓｎ２９７における糖鎖が、フコース残基を除き、同一の抗体を非修飾ＣＨＯ細胞で発現させた場合（例えば WO 2006/103100）と同一の構造及び糖残基配列を有することを意味する。

本発明において「ＮＧＮＡ」という用語は、糖残基Ｎ−グリコリルノイラミン酸を意味する。

ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化はＡｓｎ２９７で生じ、コアがフコシル化され、末端に２個以下のＧａｌ残基を有する二分岐複合オリゴ糖でグリコシル化される。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの重鎖定常領域の詳細は、Kabat, E.A. 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), 及び Bruggemann, M. 等, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W. 等, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527 に記載されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に基づいて、Ｇ０，Ｇ１（α−１，６−又はα−１，３−），又はＧ２グリカン残基と呼ばれる（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型のグリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 に記載されている。非糖修飾（non-glycomodified）ＣＨＯ宿主細胞で組換体として発現される抗体は、通常、Ａｓｎ２９７において、少なくとも８５％の量でフコシル化されている。本発明の二重特異性抗体の定常領域における修飾オリゴ糖は、ハイブリッド糖又は複合糖であってもよい。好ましくは、分岐（bisected）の還元/非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド糖である。本発明の別の実施形態において、分岐（bisected）の還元／非フコシル化オリゴ糖は複合糖である。

本発明において「フコース量」は、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖鎖構造（例えば、複合糖鎖構造、ハイブリッド糖鎖構造及び高マンノース糖鎖構造）の総量に対する、Ａｓｎ２９７の糖鎖のフコース量を意味し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定され、平均値が算出される。フコースの相対量は、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理したサンプル中で同定された全ての糖鎖構造（例えば、複合糖鎖、ハイブリッド糖鎖、並びにオリゴマンノース及び抗マンノース糖鎖構造）に対するフコース含有糖鎖構造のパーセンテージであり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定される。

本発明の全ての二重特異性抗体に関し、「ＧＥ」は糖鎖改変（glycoengineered）を意味する。

本発明の別の態様において、二重特異性抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを示し、ヒト由来のＩｇＧ１又はＩｇＧ３（好ましくはＩｇＧ１）サブクラスの定常領域を有し、Ｆｃγ受容体及び／又は補体因子Ｃ１ｑに結合する抗体である。このようなＦｃ受容体及び／又は補体因子Ｃ１ｑに結合する抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を引き起こす。

本発明の抗体は、組換え技術によって産生される。したがって、本発明の一態様は、本発明の抗体をコードする核酸であり、本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸を含む細胞である。組換えによる製造方法は当業界で周知であり、原核細胞及び真核細胞中でタンパク質を発現させた後、抗体を単離し、通常、薬学的に許容可能な純度まで精製することが含まれる。宿主細胞中での抗体の発現に関し、それぞれ修飾軽鎖及び修飾重鎖をコードする複数の核酸が標準的方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、適当な原核又は真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞，ＮＳ０細胞，ＳＰ２／０細胞，ＨＥＫ２９３細胞，ＣＯＳ細胞，ＰＥＲ.Ｃ６細胞，酵母，Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で実施され、細胞（上清又は溶解後の細胞）から抗体が回収される。抗体を組換体として産生する一般的方法は当業界で周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. 等, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 に記載されている。

二重特異性抗体は、培地から適宜分離され、その際、慣用のイムノグロブリン精製方法、例えば、プロテインＡ−セファロース，ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー，ゲル電気泳動，透析又はアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、慣用技術を用いて容易に単離及び配列決定することができる。そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの取得源としてハイブリドーマ細胞を利用することができる。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いで、ＨＥＫ２９３細胞，ＣＨＯ細胞等の宿主細胞にトランスフェクトするか、イムノグロブリンタンパク質の産生に必要な場合には骨髄腫細胞にトランスフェクトし、宿主細胞中で組換えモノクローナル抗体を合成することができる。

二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体（又は突然変異体）は、適当なヌクレオチド変異の抗体ＤＮＡへの導入により、又はヌクレオチド合成により調製することができる。但し、そのような修飾は、非常に限定された範囲（例えば、上記した範囲）のみで実施可能である。例えば、修飾は、上記した抗体の特徴（例えば、ＩｇＧアイソタイプ及び抗原結合性）を変化させるものではないが、組換体産生収率、タンパク質安定性又は精製効率を向上させるものであってよい。

ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する本発明の二重特異性抗体は、ＥＧＦＲをダウンレギュレーションさせる。Ａ５４９細胞のＥＧＦＲのダウンレギュレーションは、ある実施形態では少なくとも約３０％であり、別の実施形態では少なくとも約３５％でり、さらに別の実施形態では少なくとも約４０％である。

ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する本発明の二重特異性抗体は、ＩＧＦ−１Ｒをダウンレギュレーションさせる。二重特異性Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）又はＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）によるＨ３２２Ｍ細胞のＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションは、ある実施形態では最大で約１５％であり、別の実施形態では最大で約２０％であり、さらに別の実施形態では最大で４０％である（７５μｇタンパク質／ｍＬ）。

本発明において「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体を産生するように遺伝子操作可能な任意の種類の細胞系を意味する。ある実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞が宿主細胞として用いられる。本発明において、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換可能に用いられ、それら全てが子孫細胞を含意する。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語には、初代細胞及び、継代数にかかわらず、それらに由来する培養物が含まれる。また、全ての子孫細胞において、人工的又は非人工的な変異により、ＤＮＡ含量が完全には同一でなくなっていてもよい。子孫細胞には、初代形質転換細胞でスクリーニングされた機能及び生物活性と同一の機能及び生物活性を有する様々な子孫細胞が含まれる。

ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M. 等, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M. 等, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 に記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y. 等, Nucl. Acids. Res. 30 E9 (2002) に記載されている。可変領域のクローニングは、例えば、Orlandi, R. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 及び Norderhaug, L. 等, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、例えば、Schlaeger, E. J., 及び Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83 及び Schlaeger, E. J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 に記載されている。

原核細胞に適する制御配列としては、例えば、プロモーター、オペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞に関しては、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルの使用が知られている。

核酸は、別の核酸配列に対して機能的関係で配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列又は分泌リーダー（secretory leader）がプレタンパク質として発現され、ポリペプチドの分泌に関与する場合、そのＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写を制御する場合、そのＤＮＡはコード配列に作動可能に連結され；あるいは、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されている場合、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結される。一般的には、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列同士が隣接（近接）することを意味し、分泌リーダーの場合にはリーディング・フレーム中で隣接（近接）することを意味する。但し、エンハンサーは隣接（近接）している必要はない。連結は、簡便な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを慣用技術に従って用いることができる。

減少したフコース量を有する本発明の抗体は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド及びＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を、Ｆｃ領域のオリゴ糖を本発明に従ってフコシル化する量で発現するように遺伝子操作した糖鎖修飾宿主細胞中で発現させることができる。ある実施形態では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドである。また、宿主細胞のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を US 6,946,292 に従って減少又は欠失させ、グリコ改変型（glycomodified）宿主細胞を産生することができる。抗体フコシル化の量は、例えば、発酵条件により、又は異なるフコシル化量を有する少なくとも２つの抗体の組み合わせにより、所定量とすることができる。

減少したフコース量を有する本発明の抗体は、次の工程を含む方法によって宿主細胞中で産生することができる：（ａ）ＧｎＴＩＩＩ活性及び／又はＭａｎＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞を、抗体産生が可能な条件であって、抗体のＦｃ領域に存在するオリゴ糖のフコシル化が本発明に従った量で可能な条件の下で培養する工程；並びに（ｂ）抗体を単離する工程。ある実施形態において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドであり、好ましくは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインと、異種ゴルジ体内在ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインとを含み、ゴルジ体局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン，β（１，２）−Ｎ−アセチルアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の局在化ドメイン，マンノシダーゼＩの局在化ドメイン，β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（「ＧｎＴＩＩ」）の局在化ドメイン，及びα−１，６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群より選択される。好ましくは、ゴルジ体局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩ由来のものである。

本発明において「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」とは、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドに対する、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基のβ−１，４結合型の付加を触媒することができるポリペプチドを意味する。これには、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（NC−IUBMB（Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）に従い、β−１，４−マンノシル−糖タンパク質 ４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（EC2.4.1.144）としても知られている）の活性に類似する（但し、同一である必要はない）酵素活性を呈する融合ポリペプチドが含まれ、酵素活性は、用量依存的又は非依存的な特定の生物学的アッセイで測定される。用量依存性が存在する場合、ＧｎＴＩＩＩと比較して、それと同一である必要はないが、その所定の活性の用量依存性と実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩと比較して、それよりも高い活性を示すか、あるいは、最大で約２５倍低い活性、好ましくは最大で約１０倍低い活性、さらに好ましくは最大で約３倍低い活性を示す）。本発明において「ゴルジ体局在化ドメイン」という用語は、ゴルジ体内在ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、ゴルジ複合体内の位置における該ポリペプチドの固定化（anchoring）に関与するアミノ酸配列を意味する。一般的には、局在化ドメインは、酵素のアミノ末端「テール（tail）」を含む。

フコース量が減少した本発明の抗体の産生に関し、同様に、改変型糖鎖を有する抗体の産生が可能である又は可能となるように遺伝子操作された宿主細胞を用いることができる。そのような宿主細胞は、さらに、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する１又は２以上のポリペプチドを増加したレベルで発現するように遺伝子操作されている。そのような宿主細胞としてＣＨＯ細胞が好ましい。同様に、増加したＡＤＣＣを有する抗体組成物を産生する細胞（例えば、US 6,946,292）が好ましい。

細胞成分又はその他の夾雑物（例えば、その他の細胞核酸又はタンパク質）を除去するために、抗体の精製を標準的方法、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理，ＣｓＣｌバンディング，カラムクロマトグラフィー，アガロースゲル電気泳動及びその他の周知の方法（例えば Ausubel, F. 等, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 参照）によって実施することができる。タンパク質精製に関し、様々な方法が確立され、広く用いられており、例えば、微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー），イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂），アニオン交換（アミノエチル樹脂）及びミックスモード（mixed-mode）交換），チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β−メルカプトエタノール及びその他のＳＨリガンド），疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース，アザ−アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂又はｍ−アミノフェニルボロン酸を使用），金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（II）−及びＣｕ（II）−アフィニティー材料を使用），サイズ排除クロマトグラフィー、並びに電気泳動法（例えば、ゲル電気泳動，キャピラリー電気泳動等）（Vijayalakshmi, M., A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）が挙げられる。

本発明の一態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物の製造における本発明の抗体の使用である。本発明のさらに別の態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物の製造方法である。別の態様において、本発明は、本発明の抗体を含有し、医薬担体とともに製剤化された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。

驚くべきことに、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する本発明の二重特異性抗体は、その親である単一特異性の抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体と比較して、又はＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する公知の二重特異性抗体（Lu, D. 等, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 及び J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72）（これらの二重特異性抗体は、それぞれの親抗体の組み合わせと比較して、ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞に対して低下した効果を示すのみである。）と比較して、癌細胞に対する向上した抗増殖特性を有する。

本発明の別の態様は、癌の処置のための医薬組成物である。

本発明の別の態様は、癌の処置のための医薬の製造における本発明の抗体の使用である。

本発明の別の態様は、癌患者を処置する方法であって、該処置を必要とする患者に本発明の抗体を投与することを含む方法である。

本発明において「医薬担体」には、任意の又は全ての溶媒，分散媒，コーティング剤，抗菌及び抗真菌剤，等張及び吸収遅延剤，並びに生理学的に許容され得る担体が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内，筋肉内，皮下，非経口，脊髄又は表皮の投与（例えば、注射又は点滴）に適したものである。

本発明の組成物は、当業界で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与経路及び／又は方法は、望まれる結果に応じて変更される。本発明の化合物をある投与経路で投与するために、該化合物を、その不活性化を防止する物質でコーティングすること、又は該物質とともに同時投与することが必要となるかもしれない。例えば、化合物は、適当な担体、例えば、リポソーム又は希釈剤に含ませて対象に投与してもよい。薬学的に許容され得る希釈剤としては、例えば、生理食塩水及び水性バッファー溶液が挙げられる。医薬担体としては、例えば、滅菌注射液又は分散液を即席で調製するための滅菌水溶液又分散液及び滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質に用いられるそのような担体及び薬剤は当業界で公知である。

本発明において「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という表現は、腸内及び局所投与以外の投与形態を意味し、通常は注射による投与形態であり、特に限定されるわけではないが、例えば、静脈内，筋肉内，動脈内，くも膜下，関節包内，眼窩内，心腔内，皮内，腹腔内，経気管，皮下，表皮下，関節内，被膜下，くも膜下，髄腔内，硬膜外及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。

本発明において、癌という用語は、増殖性疾患を意味し、例えば、リンパ腫，リンパ性白血病，肺癌，非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌，細気管支肺胞上皮癌（bronchioloalviolar cell lung cancer），骨癌，膵臓癌，皮膚癌，頭若しくは頸部の癌，皮膚若しくは眼内黒色腫，子宮癌，卵巣癌，直腸癌，肛門部の癌，胃癌（stomach cancer, gastric cancer），結腸癌，乳癌，子宮癌，卵管カルシノーマ，子宮内膜カルシノーマ，頸部カルシノーマ，膣カルシノーマ，外陰カルシノーマ，ホジキン病，食道癌，小腸癌，内分泌系癌，甲状腺癌，副甲状腺癌，副腎癌，軟部組織サルコーマ，尿道癌，陰茎癌，前立腺癌，膀胱癌，腎臓若しくは尿管癌，腎細胞癌，腎盂カルシノーマ，中皮腫，肝細胞癌，胆嚢癌，中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍，脊髄腫瘍（spinal axis tumor），脳幹グリオーマ，多形性膠芽腫，アストロサイトーマ，神経鞘腫，上衣腫，髄芽腫，髄膜腫，扁平上皮癌，下垂体腺腫及びユーイング肉腫、上記癌の難治性形態及び上記癌の１又は２以上の組み合わせが含まれる。

また、これらの組成物は、佐剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有してもよい。微生物の混入の防止は、上記滅菌処理並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の含有によって確保することができる。また、糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含有させることが望ましい場合もある。さらに、注射可能な医薬剤形の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤の含有によって達成することができる。

選択した投与経路にかかわらず、本発明の化合物は適当な水和物の形態で使用することができ、及び／又は、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の慣用の方法で薬学的に許容可能な剤形に製剤化することができる。

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物及び投与様式において、患者に毒性を生じることなく所望の治療効果を達成するのに有効な有効成分の量の範囲で変更可能である。選択される投与量レベルは、様々な薬物動態学的因子、例えば、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄率、処置期間、特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、一般的健康状態及び既往歴、並びに医療の分野で周知の因子に基づく。

組成物は無菌であって、該組成物をシリンジで送達可能な程度に流動性をもつ。好ましい担体としては、水に加えて、等張性緩衝化食塩水が挙げられる。

適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散系の場合には必要な粒径の維持により、又は界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、組成物は、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール（例えばマンニトール及びソルビトール）、塩化ナトリウム等を含有することが好ましい。

本発明において「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は、互換可能に用いられ、その全てに子孫細胞が含まれる。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語には、初代細胞及び、継代数にかかわらず、それらに由来する培養物が含まれる。また、全ての子孫細胞において、人工的又は非人工的な変異により、ＤＮＡ含量が完全には同一でなくなっていてもよい。子孫細胞には、初代形質転換細胞でスクリーニングされた機能及び生物活性と同一の機能及び生物活性を有する様々な子孫細胞が含まれる。異なる意味が意図される場合には文脈から明らかとなるであろう。

本発明において「形質転換」という用語は、ベクター／核酸を宿主細胞に移入する工程を意味する。障壁となる細胞壁を有しない細胞を宿主細胞として用いる場合、トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム沈殿法（Graham, F.L., 及び Van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467）によって実施することができる。但し、ＤＮＡを細胞に導入するためのその他の方法、例えば、核注入、原形質融合等を使用することもできる。原核細胞又は実質的な細胞壁構築を含む細胞を用いる場合、例えば、トランスフェクションの１つの方法として、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理（Cohen, S.N. 等, PNAS. 69 (1972) 2110-2114）を用いることができる。

本発明において「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写される工程及び／又は転写後にｍＲＮＡ（転写産物とも呼ばれる）がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される工程を意味する。転写産物及びコードされるポリペプチドは、まとめて遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞中での発現には、ｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。

「ベクター」は、核酸分子、特に、自己複製する核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間へ運ぶ。この用語には、ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への組み入れ（例えば、染色体への組み込み）を主要な機能とするベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製を主要な機能とする複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳を主要な機能とする発現ベクターが含まれる。また、上記機能のうち２以上を有するベクターも含まれる。

「発現ベクター」は、適当な宿主細胞に導入されると、転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは、通常、所望の発現産物を生じる機能を有する発現ベクターを含む適当な宿主細胞を意味する。

アミノ酸配列に関する記載
配列番号１：重鎖ＣＤＲ３，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号２：重鎖ＣＤＲ２，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号３：重鎖ＣＤＲ１，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号４：軽鎖ＣＤＲ３，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号５：軽鎖ＣＤＲ２，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号６：軽鎖ＣＤＲ１，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号７：重鎖可変領域，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−I−ＨＨＢ
配列番号８：重鎖可変領域，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＨＨＤ
配列番号９：軽鎖可変領域，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＫＡ
配列番号１０：軽鎖可変領域，ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＫＣ
配列番号１１：重鎖ＣＤＲ３，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１２：重鎖ＣＤＲ２，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１３：重鎖ＣＤＲ１，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１４：軽鎖ＣＤＲ３，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１５：軽鎖ＣＤＲ２，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１６：軽鎖ＣＤＲ１，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１７：重鎖ＣＤＲ３，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号１８：重鎖ＣＤＲ２，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号１９：重鎖ＣＤＲ１，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号２０：軽鎖ＣＤＲ３，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号２１：軽鎖ＣＤＲ２，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号２２：軽鎖ＣＤＲ１，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号２３：重鎖可変領域，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号２４：重鎖可変領域，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号２５：軽鎖可変領域，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号２６：軽鎖可変領域，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２
配列番号２７：ヒトＩｇＧ１由来重鎖定常領域
配列番号２８：ヒトＩｇＧ４由来重鎖定常領域
配列番号２９：κ軽鎖定常領域
配列番号３０：ドメイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）の重鎖１
配列番号３１：ドメイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）の重鎖２
配列番号３２：ドメイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）の軽鎖１
配列番号３３：メイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）の軽鎖２
配列番号３４：ドメイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）の重鎖１
配列番号３５：ドメイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）の重鎖２
配列番号３６：ドメイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）の軽鎖１
配列番号３７：ドメイン交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）の軽鎖２
配列番号３８：ｓｃＦａｂ−Ｆｃ融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ｓｃＦａｂ−Ｆｃの重鎖１
配列番号３９：ｓｃＦａｂ−Ｆｃ融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ｓｃＦａｂ−Ｆｃの重鎖２
配列番号４０：ｓｃＦａｂ−Ｆｃ融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−Ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓ３の重鎖１
配列番号４１：ｓｃＦａｂ−Ｆｃ融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−Ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓ３の重鎖２
配列番号４２：ｓｃＦａｂ−Ｆｃ融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−Ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｗ３Ｃの重鎖１
配列番号４３：ｓｃＦａｂ−Ｆｃ融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−Ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｗ３Ｃの重鎖２
配列番号４４：ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−１の重鎖１
配列番号４５：ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−１の重鎖２
配列番号４６：ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−１の軽鎖１
配列番号４７：ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−２の重鎖１
配列番号４８：ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−２の重鎖２
配列番号４９：ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−２の軽鎖１
以下の実施例、配列表及び図は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の範囲は添付の請求の範囲に示される。本発明の範囲内において、本明細書に記載された工程を変更できることが理解されるであろう。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の設計
ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する本発明の二重特異性抗体は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む。ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位として、配列番号７又は配列番号８記載の重鎖可変領域と、配列番号９又は配列番号１０記載の軽鎖可変領域とを用いることができ、これらは両方ともヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２（その詳細は、WO 2006/082515 に記載されている）に由来する。

ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３又は配列番号２４記載の重鎖可変領域と、配列番号２５又は配列番号２６記載の軽鎖可変領域を含み、これらは両方ともヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）又は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン２２（DSM ACC 2594）（それらの詳細は、WO 2005/005635 に記載されている）に由来する。

以下の実施例１〜２０の全てにおいて、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位である配列番号８記載の重鎖可変領域及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２由来）と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位である配列番号２３記載の重鎖可変領域及び配列番号２５記載の軽鎖可変領域（ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）由来）とを基礎としている。

Ａ）ｓｃＦｖを付加した二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の設計（ｓｃＦｖ−ＸＧＦＲ分子と呼ばれるＸＧＦＲ１及びＸＧＦＲ２命名体）
両抗体の特徴を組み合わせた抗体を作製するために、種々の新規な四価の二重特異性抗体に由来するタンパク質分子を構築した。これらの分子において、１つの抗体の組換え単鎖結合性分子が、組換えタンパク質融合法によって、完全長ＩｇＧ１の形態を保持するその他の抗体に結合される。この第２の抗体は、所望の第２の結合特異性を有する。

ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）と、配列番号８記載の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に由来するＥＧＦＲ結合性単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とに基づいて設計された形態の概要を図１並びに表１及び２に示す。

遺伝子合成及び組換え分子技術によって、配列番号８記載の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）をグリシン・セリン (Ｇ_４Ｓ)ｎ 単鎖リンカーによって連結し、ＥＧＦＲに結合する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成し、これを抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）の軽鎖又は重鎖のＮ末端又はＣ末端のいずれかに結合させた。さらに、ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖのＶＨ領域（Ｋａｂａｔに基づく４４位を含む）及びＶＬ領域（Ｋａｂａｔに基づく１００位を含む）の様々な位置に、システイン残基を公知の方法に従って導入した（例えば、WO 94/029350; Reiter, Y. 等, Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Young, N., M. 等, FEBS Letters Vol. 377 (1995) 135-139; Rajagopal, V. 等, Protein Engineering Vol. 10 1453-59 (1997)）。次いで、タンパク質発現、安定性及び生物活性を評価した。さらに、＜ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端と、ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖとの間に位置する(グリシン_４−セリン)ｎ含有ペプチドリンカーの長さを変化させた。また、ＥＧＦＲに結合する単鎖Ｆｖモジュールの重要部分であるグリシン_４−セリン（Ｇ_４Ｓ）単鎖リンカーの長さを変化させた。これら全ての分子は、組換え法により製造し、精製し、性状決定した。四価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体を作製するために適用した、全ての二重特異性抗体の設計の概要を表１及び２に示す。この研究において、我々は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒを同時に認識し、ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒの一方に特異的に結合する完全長抗体と、ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒの他方に特異的に結合する２つのｓｃＦｖフラグメントとを含む様々なタンパク質分子として、「ＸＧＦＲ」という用語を用いる。

表１は、Ｎ末端又はＣ末端に付加されたｓｃＦｖを有する二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の様々な形態と、対応するＸＧＦＲ１命名体及びＸＧＦＲ２命名体に関する。

ＸＧＦＲ１体は、ａ）ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）と、ｂ）配列番号８記載の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に由来する２つのＥＧＦＲ結合性単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とに基づき、２つのｓｃＦｖは、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８の重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）のいずれかの同一末端（Ｃ末端又はＮ末端）に結合している。

ＸＧＦＲ２体は、ａ）ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２の可変領域ＶＨ（配列番号８）及びＶＬ（配列番号１０）と、ｂ）ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）のＶＨ（配列番号２３）及びＶＬ（配列番号２５）に結合する２つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とに基づく。なお、表中、「−」は「不存在」を意味する。

表２は、様々な長さの単鎖リンカー及びペプチドリンカーを有するＸＧＦＲ１二重特異性抗体に関する。なお、表中、「−」は「不存在」を意味する。

実施例１〜８は、ｓｃＦｖが付加された四価のＸＧＦＲ１及びＸＧＦＲ２分子に関する。

Ｂ）単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）が付加された四価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の設計（ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２命名体）

ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲという用語は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒを同時に認識し、ＥＧＦＲ又はＩＧＦ１Ｒの一方に特異的に結合する完全長抗体と、ＥＧＦＲ又はＩＧＦ１Ｒの他方に特異的に結合する２つのｓｃＦａｂフラグメントとを含む様々なタンパク質分子を表現するために用いられる。

本発明の一実施形態において、四価の二重特異性抗体は、第１の抗原（ＩＧＦ−１Ｒ又はＥＧＦＲの一方）に結合する完全長抗体と、第２の異なる抗原（ＩＧＦ−１Ｒ又はＥＧＦＲの他方）に結合する２つの単鎖Ｆａｂフラグメントとを含み、２つの単鎖Ｆａｂフラグメントは、ペプチドコネクターを通じて完全長抗体に連結しており（２つの単鎖Ｆａｂフラグメントはともに、重鎖の２つのＣ末端又は軽鎖の２つのＣ末端のいずれかに連結している）。以下では、このような実施形態が説明される。単鎖Ｆａｂフラグメントにおける抗体ドメイン及びリンカーは、ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１を、Ｎ末端からＣ末端への方向に、この順序で有する。

＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位の重鎖可変領域ＶＨとして、配列番号２３を用いた。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位の軽鎖可変領域ＶＬとして、配列番号２５を用いた。

＜ＥＧＦＲ＞抗原結合部位の重鎖可変領域ＶＨとして、配列番号８を用いた。＜ＥＧＦＲ＞抗原結合部位の軽鎖可変領域ＶＬとして、配列番号１０を用いた。

遺伝子合成及び組換え分子技術によって、それぞれの抗原結合部位のＶＬ及びＶＨを含むＶＬ−ＣＬ及びＶＨ−ＣＨ１をグリシン・セリン (Ｇ４Ｓ)ｎ Ｇｍリンカーによって連結し、単鎖Ｆａｂフラグメント ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１を得、これを (Ｇ４Ｓ)ｎペプチドコネクターを用いて抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合させた。

さらに、単鎖ＦａｂフラグメントのＶＨ領域（Ｋａｂａｔに基づく４４位を含む）及びＶＬ領域（Ｋａｂａｔに基づく１００位を含む）に、公知の方法に従って、システイン残基を導入した（例えば、WO 94/029350; Reiter, Y. 等, Nature biotechnology (1996) 1239-1245; Young, N. M. 等, FEBS Letters (1995) 135-139; Rajagopal, V. 等, Protein Engineering (1997) 1453-59）。

これら全ての分子は、組換え技術により製造し、精製し、性状決定した。また、タンパク質発現、安定性及び生物活性を評価した。

四価の二重特異性ｓｃＦａｂ＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞，＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体を作製するために適用した抗体設計の概要を表３に示す。この研究において、我々は、「ｓｃＦａｂ−Ａｂ」という用語を、様々な四価のタンパク質分子を表現するために用いる。設計した形態のうち代表例を図１３及び１４並びに表３に示す。

表３は、Ｃ末端に単鎖Ｆａｂフラグメントが付加された二重特異性抗ＩＧＦ１Ｒ及び抗ＥＧＦＲ ｓｃＦａｂ−四価抗体の様々な形態、及び対応するｓｃＦａｂ−Ａｂ命名体に関する。

実施例９〜１３は、単鎖Ｆａｂが付加された四価のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２分子に関する。

材料及び一般的方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E. A. 等（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）によって提供されている。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵナンバリング（Edelman, G. M. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E. A. 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）に従って番号付けされる。

組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を用いてＤＮＡを操作した（Sambrook, J. 等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989）。分子生物学的試薬は、製造者の指示書に従って用いた。

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、化学合成したオリゴヌクレオチドから調製した。特異な制限エンドヌクレアーゼの切断部位が両端に導入された６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、オリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、例えば、ＰＣＲ増幅の後、所定の制限部位（例えば、BamHI/BstEII，BamHI/BsiWI，BstEII/NotI又はBsiWI/NotI）を介してpUCクローニングベクターに基づくpcDNA 3.1/Zeo（+）（Invitrogen）にクローン化することによって、アセンブリした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、配列決定して確認した。遺伝子合成フラグメントは、特定の仕様で Geneart（Regensburg, Germany）に注文した。

ＤＮＡ配列決定
二本鎖配列決定（double strand sequencing）を Sequiserve GmbH（Vaterstetten, Germany）で実施し、ＤＮＡ配列を決定した。

ＤＮＡ及びタンパク質配列分析並びに配列データ解析
GCG's（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）ソフトウエアパッケージバージョン 10.2 及び Invitrogens Vector NT1 Advance suite バージョン 9.1 を用いて、配列作成、マッピング、分析、アノテーション及び図解を行った。

細胞培養技術
標準的な細胞培養技術を用いた（Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J., S., Dasso, M., Harford, J., B., Lippincott-Schwartz, J., and Yamada, K., M. (eds.), John Wiley and Sons, Inc.）。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中での免疫グロブリン変異体の一過性発現
製造者の指示書に従って FreeStyle^TM 293 発現系（Invitrogen, USA）を用いて、二重特異性抗体をヒト胎児腎臓細胞２９３−Ｆに一過性トランスフェクトして発現させた。すなわち、FreeStyle^TM 293-F 細胞懸濁液を FreeStyle^TM 293 発現培地中、３７℃、８％ＣＯ₂で培養し、トランスフェクションの実施日に、細胞を新しい培地に１〜２×１０⁶生存細胞／ｍｌの密度で播種した。３３３μｌの 293fectin^TM（Invitrogen, Germany）と、２５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡとを１：１のモル比で用いて、DNA-293fectin^TM 複合体を Opti-MEM（登録商標）I 培養液（Invitrogen, USA）中で調製し、最終トランスフェクション容量を２５０ｍｌとした。トランスフェクション後７日目に、１４０００ｇで３０分間遠心し、細菌ろ過器（０．２２μｍ）でろ過することにより、二重特異性抗体を含有する細胞培養上清を清澄化した。精製まで上清を−２０℃で保存した。

タンパク質測定
２８０ｎｍ及び３２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いて（Pace, C.N., et. al., Protein Science, 4 (1995) 2411-1423）バックグラウンド補正して、精製抗体及び誘導体のタンパク質濃度を決定した。

上清中の抗体濃度の測定
細胞培養上清中の抗体及び誘導体の濃度を、アフィニティーＨＰＬＣクロマトグラフィーで測定した。すなわち、、UltiMate 3000 HPLC system（Dionex）を用いて、プロテインＡに結合する抗体及び誘導体を含む細胞培養上清を、Applied Biosystems Poros A/20 カラム（200mM KH₂PO₄，100mM クエン酸ナトリウム，pH 7.4）にかけ、マトリックスから溶出させた（溶出液：200mM NaCl，100mMクエン酸，pH 2.5）。溶出したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積に基づいて定量した。標準ＩｇＧ１精製抗体を標準として用いた。

タンパク質精製
プロテインＡ−セファロース^TM（GE Healthcare, Sweden）を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び Superdex 200 サイズ排除クロマトグラフィーによる２工程で、分泌された抗体を上清から精製した。すなわち、二重特異性抗体及び三重特異性抗体を含む清澄化培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（10mM Na₂HPO₄，1mM KH₂PO₄，137mM NaCl及び2.7mM KCl，pH 7.4）で平衡化した HiTrap ProteinA HP（5ml）カラムにかけた。未結合のタンパク質を平衡化緩衝液で洗い流した。二重特異性抗体を０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH 2.8）で溶出させ、タンパク質含有フラクションを０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH 8.5）で中和した。次いで、溶出タンパク質フラクションを集め、Amicon 超遠心ろ過機（MWCO: 30 K, Millipore）で３ｍｌの容量まで濃縮し、２０ｍＭヒスチジン及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ（pH 6.0）で平衡化した Superdex 200 HiLoad 120ml 16/60 ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）にかけた。単量体型抗体を集め、凍結し（snap-frozen）、−８０℃で保存した。サンプルの一部を以後のタンパク質分析及び性状決定に用いた。

精製タンパク質の分析
２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いて、精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を決定した。還元剤（5mM 1,4-ジチオトレイトール）の存在下又は不存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、クマシーブリリアントブルーで染色して、二重特異性抗体の純度を分析した。NuPAGE（登録商標）Pre-Cast gel system（Invitrogen, USA）を製造者の指示書に従って用いた（4〜20% Tris-グリシンゲル）。高性能ＳＥＣによって二重特異性抗体サンプルの凝集物含量を分析した。分析は、Superdex 200 分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare, Sweden）（ランニングバッファー：200mM KH₂PO₄，250mM KCl，pH 7.0，25℃）を用いた UltiMate 3000 HPLC system（Dionex）で実施した。２５μｇのタンパク質をカラムにかけ、流速０．５ｍｌ／分で５０分間、均一濃度溶離（isocratic elution）を行った。安定性分析に関しては、濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ，１ｍｇ／ｍｌ及び３ｍｇ／ｍｌの精製タンパク質を調製し、４℃，３７℃で７日間インキュベートした後、高性能ＳＥＣで評価した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Roche Molecular Biochemicals）を用いた酵素処理によってＮ−グリカンを除去した後、還元された二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性（integrity）を NanoElectrospray Q-TOF 質量分析によって検証した。

実施例１
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＸＧＦＲ１分子の発現及び精製
対応する二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖を、原核細胞及び真核細胞の選択マーカーを有する発現ベクター中に構築した。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ中で増幅し、精製した後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、組換えタンパク質を一過性発現させた（この際、Invitrogen社製の freesyle system を用いた）。７日後、ＨＥＫ２９３細胞の細胞上清を回収し、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。全ての二重特異性抗体の構築物の均一性（Homogeneity）を、非還元条件下及び還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３ａ）において、Ｃ末端及びＮ末端にｓｃＦｖを融合させたポリペプチド鎖は、分子量の計算値に類似する見かけの分子サイズを示した。全ての構築物の発現レベルをプロテインＡ及びＨＰＬＣによって分析したところ、「標準」として用いたＩｇＧの発現収量に類似しており、幾つかの場合には、それよりも若干低かった。最適化していない一過性発現実験において、細胞培養上清１リットルあたりの精製タンパク質の平均タンパク質収量は１〜３６ｍｇであった（図３）。軽鎖（ＸＧＦＲ−４３２０）又は重鎖（ＸＧＦＲ−２３２０）のＣ末端にｓｃＦｖｓが融合した非ジスルフィド安定化構築物において、タンパク質Ａ精製後に回収された所望のサイズのタンパク質は、Ｎ末端にｓｃＦｖが付加されたもの（ＸＧＦＲ１−３３２０及びＸＧＦＲ１−５３２０）よりも多量であった。

精製タンパク質のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー分析によって（「標準」であるＩｇＧとの比較）、ＶＨ及びＶＬ間の鎖間ジスルフィドで安定化されていないｓｃＦｖを含む分子は、凝集する傾向を示した。そのような二重特異性抗体の凝集に関する問題に対処するために、ｓｃＦｖ分子をジスルフィドで安定化させた。そのために、我々は、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬの特定の位置（Ｋａｂａｔナンバリングスキームに基づく位置ＶＨ４４／ＶＬ１００）に、単一のシステイン置換を導入した。これらの変異によって、ＶＨ及びＶＬ間の安定な鎖間ジスルフィドの形成が可能となり、それは同様に、形成されたジスルフィド安定化ｓｃＦｖモジュールを安定化させる。ＦｖのＮ末端又はＣ末端においてｓｃＦｖにＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドを導入すると、全ての構築物に関し、タンパク質発現レベルが向上する（図４参照）。

FreeStyle^TM 293 発現系（Invitrogen, USA）を製造者の指示書に従って使用し、ヒト胎児腎臓細胞２９３−Ｆの一過性トランスフェクションによって、二重特異性抗体を発現させた。すなわち、FreeStyle^TM 293-F 細胞懸濁液を FreeStyle^TM 293 発現培地中、３７℃、８％ＣＯ₂で培養し、トランスフェクションの実施日に細胞を１〜２×１０⁶生存細胞／ｍｌの密度で新しい培養液に播種した。３３３μｌの 293fectin^TM（Invitrogen, Germany）と２５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡとを１：１のモル比で用いて、DNA-293fectin^TM 複合体を Opti-MEM（登録商標）I 培養液（Invitrogen, USA）中で調製し、最終トランスフェクション容量を２５０ｍｌとした。二重特異性抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクション後７日目に、１４０００ｇで３０分間遠心し、細菌ろ過器（０．２２μｍ）でろ過して清澄化した。精製まで上清を−２０℃で保存した。

分泌された抗体を、プロテインＡ−セファロース^TM（GE Healthcare, Sweden）を用いたアフィニティークロマトグラフィーと、Superdex200 サイズ排除クロマトグラフィーとの２工程により、上清から精製した。すなわち、二重特異性抗体及び三重特異性抗体を含有する清澄化培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（10mM Na₂HPO₄，1mM KH₂PO₄，137mM NaCl 及び 2.7mM KCl，pH 7.4）で平衡化した HiTrap ProteinA HP（5ml）カラムにかけた。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗い流した。二重特異性抗体を０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH 2.8）で溶出し、タンパク質含有フラクションを０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH 8.5）で中和した。次いで、溶出タンパク質フラクションを集め、Amicon 超遠心ろ過機（MWCO: 30 K, Millipore）で３ｍｌの容量まで濃縮し、２０ｍＭヒスチジン及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ（pH 6.0）で平衡化した Superdex200 HiLoad 120ml 16/60 ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）にかけた。単量体型抗体フラクションを集め、凍結し（snap-frozen）、−８０℃で保存した。サンプルの一部を以後のタンパク質分析及び性状決定に使用した。

ＸＧＦＲ１−２３２０の精製後の最終収量は０．２７ｍｇであった。一方、ＸＧＦＲ１−２３２１の最終収量は１３．８ｍｇであった。
二重特異性抗体に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の精製及び分析の具体例を図３及び４に示す。

実施例２
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＸＧＦＲ１分子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける安定性
ＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー分析を実施した。
二重特異性抗体サンプルの凝集物含量を高性能ＳＥＣで分析した。分析は、Superdex 200 分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare, Sweden）（ランニングバッファー：200mM KH₂PO₄，250mM KCl，pH 7.0，25℃）を用いて、UltiMate 3000 HPLC システム（Dionex）で実施した。２５μｇのタンパク質を０．５ｍｌ／分の流速でカラムに注入し、５０分間かけて均一濃度溶離を行った。安定性の分析において、濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌの精製タンパク質を調製し、４℃、３７℃及び４０℃で７又は２８日間インキュベートし、次いで、高性能ＳＥＣで評価した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Roche Molecular Biochemicals）を用いた酵素処理によってＮ−グリカンを除去した後、還元された二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性（integrity）を NanoElectrospray Q-TOF 質量分析によって検証した。

精製タンパク質を様々な条件（様々な濃度及び時間）下でＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィーで分析した結果、ｓｃＦｖを含む分子は、標準ＩｇＧｓ−０と比較して、顕著に増加した凝集傾向を示した。

この試験において、我々は、重鎖及び軽鎖からなる２つのヘテロダイマーで構成され、重鎖及び軽鎖のいずれかにｓｃＦｖが結合している、所望の「単量体」分子を特定する。

未修飾ｓｃＦｖを含む分子の強力な凝集傾向とは対照的に、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド安定化構築物をＨＰサイズ排除分析した結果、凝集傾向は顕著に小さいものであった。

二重特異性抗体に関するＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の精製及び分析の具体例を図４に示す。

実施例３
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＸＧＦＲ１分子のＲＴＫ（ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒ）に対する同時結合性
ｓｃＦｖモジュールの結合性、及び異なる二重特異性抗体の形態のＩｇＧモジュールに保持されたＦｖの結合性を、結合性モジュール及び二重特異性抗体が由来する「野生型」ＩｇＧの結合性と比較した。これらの分析は、表面プラズモン共鳴（Biacore）及び細胞−ＥＬＩＳＡを用いて実施した。

二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体の結合特性を、Biacore T100 instrument（Biacore AB, Uppsla）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法で分析した。このシステムは、分子相互作用の研究において確立された技術である。それによって、リガンド／検体の結合を継続的にリアルタイムモニタリングすることができ、様々なアッセイ条件における結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡定数（ＫＤ）を決定することができる。ＳＰＲ法は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面近くの屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化されたリガンドと、注入された溶液中の検体との相互作用によって生じる表面の質量変化の指標となる。分子が、表面に固定化されたリガンドに結合すると、質量は増加し、解離すると、質量は減少する。

アミン結合化学を用いて、捕捉用（Capturing）抗ヒトＩｇＧ抗体をＣＭ５バイオセンサーチップの表面に固定化した。０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３−(Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ)プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１の混合物を用いて（流速５μｌ／分）、フローセルを活性化した。抗ヒトＩｇＧ抗体を酢酸ナトリウム（pH 5.0）に加えて１０μｇ／ｍｌとした結果、表面密度が約１２０００ＲＵとなった。対照のフローセルを、捕捉用抗体の代わりにビヒクルバッファーを用いた点を除き、同様に処理した。表面を１Ｍエタノールアミン／ＨＣｌ（pH 8.5）を加えてブロックした。二重特異性抗体をＨＢＳ−Ｐ中に希釈し、流速５μｌ／分で加えた。接触時間（結合段階）を１分とし、抗体濃度はＥＧＦＲ−ＥＣＤ結合に関しては１〜５ｎＭとし、ＩＧＦ−１Ｒ相互作用に関しては１〜２０ｎＭとした。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０及び１００ｎＭという漸増する濃度で加え、ＩＧＦ−１Ｒを０．２１，０．６２，１．８５，５．６，１６．７及び５０ｎＭという濃度で加えた。接触時間（結合段階）は３分とし、解離時間（ランニングバッファーによる洗浄）は５分とし、両分子の流速は３０μｌ／分とした。全ての相互作用を２５℃（標準的な温度）で実施した。３Ｍ塩化マグネシウムの再生溶液を、６０秒間、流速５μｌ／分で加え、各結合サイクルの後、共有結合していないタンパク質を除去した。シグナルを、１秒あたり１回の頻度で検出した。サンプルは、漸増する濃度で加えた。

二重特異性抗体のＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する同時結合の具体例を図５に示す。
表４は、二重特異性抗体（ＸＧＦＲ命名体）のＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対するアフィニティー（ＫＤ）に関する。

実施例４
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＸＧＦＲ１分子によるＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒのダウンレギュレーション
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）はＩＧＦＲ１シグナル伝達を阻害し、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２はＥＧＦＲによるシグナル伝達を阻害する。様々なＸＧＦＲ１変異体の潜在的な阻害活性を評価するために、両者の受容体のダウンレギュレーションの程度を分析した。

腫瘍細胞のＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）の量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、経時的実験及びその後のＥＬＩＳＡ分析を、ＩＧＦ−ＩＲ及びＥＧＦＲ特異的抗体を用いて実施した。

１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを添加したＲＰＭＩ−ＶＭ培地（PAA，Cat. No. E15-039）中のヒト腫瘍細胞（A549，2×10⁵細胞/ml）を６ウェルプレートに４ｍｌ播種し、実験ごとに新しい培地に変えて、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間培養した。

培地を注意深く除去し、ＲＰＭＩ−ＶＭ培地に希釈した０．０１ｍｇ／ｍｌ ＸＧＦＲ抗体２ｍｌで置換した。３つの対照ウェルについては、培地を、それぞれ、抗体を含まない培地、対照抗体（＜IGF-1R＞HUMABクローン18及び＜EGFR＞ICR62，最終濃度0.01mg/ml）を含む培地、及び緩衝液のみで置換した。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、２４時間後、各プレートをさらなる実験のために取り出した。

培地を注意深く吸引除去し、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。３００μｌ／ウェルの冷ＭＥＳ−細胞溶解緩衝液を加えた（MES，10mM Na₃VO₄及びComplete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）。細胞をセルスクレーパー（Corning, Cat. No. 3010）でかきとり、ウェル内容物をエッペンドルフ反応チューブに移した。細胞フラグメントを１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心することにより除去した。

ＥＧＦＲ検出
９６ウェルのストレプトアビジンマイクロタイタープレート（MTP）をプロトコルに従って調製した（DuoSet ELISA for Human EGFR, RnD systems Cat. No. DY231）。ＰＢＳ中のヒトＥＧＦＲヤギ抗体１４４μｇ／ｍｌをＰＢＳ中に希釈し（１：１８０）、１００μｌ／ウェルをＭＴＰに加えた。ＭＴＰを攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）でプレートを３回洗浄し、３００μｌ／ウェルのＰＢＳ（3% BSA及び0.1% Tween 20 含有）溶液を加えて、攪拌しながら室温（RT）で１時間（h）反応させ、プレートをブロックした。ＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）でプレートを３回洗浄した。

細胞溶解物中のタンパク質量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierce）を用いて測定し、次いで、ＭＥＳ−細胞溶解バッファー（100mM Na₃VO₄（1:100）及びComplete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（1:20）含有）を用いて、細胞溶解物のタンパク質濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調整し、１ウェルあたり１００μｌの細胞溶解物を、予め調製しておいたＭＴＰに加えた。

第２の細胞溶解物の濃度として０．０５ｍｇ／ｍｌを用い、細胞溶解物を希釈し（１:２）、１ウェルあたり１００μｌを予め調製しておいたＭＴＰに加えた。ＭＴＰを攪拌しながら室温でさらに２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で３回洗浄した。

ヒトＥＧＦＲヤギビオチン化抗体をＰＢＳ（3% BSA及び0.2% Tween 20 含有）中に希釈（1:180）し、ＥＧＦＲ検出抗体として３６μｇ／ｍｌの濃度で用いた。１ウェルあたり１００μｌを加え、攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。次いで、ＭＴＰを１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で３回洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰをＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）で希釈（1:200）し、１ウェルあたり１００μｌを二次抗体に加え、攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で６回洗浄した。１ウェルあたり１００μｌの３,３'−５,５'−テトラメチルベンジジン（Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581）を加え、攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。１ウェルあたり２５μｌの１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を加え、室温で５分間インキュベートし、呈色反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

ＩＧＦ−１Ｒ検出
ＡＫ１ａ−ビオチン化抗体（Genmab, Denmark）をＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）で希釈（1:200）し、１ウェルあたり１００μｌ加え、ストレプトアビジン−ＭＴＰ（Roche ID. No.: 11965891001）を調製した。ストレプトアビジン−ＭＴＰを攪拌しながら室温で１時間インキュベートし、次いで、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で３回洗浄した。

ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierce）を用いて細胞溶解物中のタンパク質量を測定し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（pH 7.4）、１００ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄（1:100）及び Complete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（1:20）を用いて、細胞溶解物のタンパク質濃度を０．０４ｍｇ／ｍｌに調整した。１ウェルあたり１００μｌの細胞溶解物を予め調製しておいたストレプトアビジン−ＭＴＰに加えた。

第２の細胞溶解物の濃度として０．０２ｍｇ／ｍｌを用いた。細胞溶解物を希釈し、１ウェルあたり１００μｌを予め調製しておいたストレプトアビジン−ＭＴＰに加えた。非刺激細胞を含む陽性対照を溶解バッファー（50mM Tris（pH 7.4），100mM Na₃VO₄（1:100）及び Complete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（1:20）含有）中に希釈（1:4000）し、１ウェルあたり１００μｌの細胞溶解物を予め調製しておいたストレプトアビジン−ＭＴＰに加えた。陰性対照の場合、１００μｌの溶解バッファーをストレプトアビジン−ＭＴＰのウェルに加えた。

ＭＴＰを攪拌しながら室温でさらに１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ（0.1% Tween20 含有）溶液で３回洗浄した。

ヒトＩＧＦ−１Ｒβウサギ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. sc-713）をＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）中に希釈（1:750）し、ＩＧＦ−１Ｒの検出用抗体として用いた。１ウェルあたり１００μｌを加え、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、ＭＴＰを１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で３回洗浄した。次いで、ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ（Cell signaling Cat. No. 7074）をＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）中に希釈（1:4000）し、１ウェルあたり１００μｌを二次抗体に加え、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で６回洗浄した。１ウェルあたり１００μｌの３,３'−５,５'−テトラメチルベンジジン（Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581）を加え、攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。１ウェルあたり２５μｌの１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を加え、室温でさらに５分間インキュベートし、呈色反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

二重特異性抗体ＸＧＦＲを用いた場合、並びにその親抗体である単一特異性抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８を用いた場合の、Ａ５４９細胞における受容体ダウンレギュレーションの結果を図１２に示す。二重特異性抗体ＸＧＦＲは、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒの両方をダウンレギュレーションする。驚くべきことに、二重特異性抗体ＸＧＦＲは、その親抗体である＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２抗体と比較して、向上したＥＧＦＲのダウンレギュレーションを示した。

実施例５
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＸＧＦＲ１分子によるＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路の阻害
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）は、ＩＧＦＲ１によるシグナル伝達を阻害し、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２は、ＥＧＦＲによるシグナル伝達を阻害する。様々なＸＧＦＲ１変異体の潜在的な阻害活性を評価するために、両経路に対するシグナル伝達阻害の程度を分析した。

各実験において、ＲＰＭＩ培地（PAA, Cat. No.E15-039）（1% PenStrep 添加）中のヒト腫瘍細胞（H322M，2×10⁵細胞/ml）を６ウェルプレートに４ｍｌ播種し、３７℃、５％ ＣＯ₂下、２４時間培養した。

培地を注意深く除去し、ＲＰＭＩ−ＶＭ培地に希釈した０．０１ｍｇ／ｍｌ ＸＧＦＲ抗体２ｍｌで置換した。３つの対照ウェルについては、抗体を含まない培地、対照抗体（＜IGF-1R＞HUMABクローン18及び＜EGFR＞ICR62，最終濃度0.01mg/ml）を含む培地、及び緩衝液のみで培地を置換した。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、２４時間後、各プレートをさらなる処理のために取り出した。

ＥＧＦＲリン酸化の検出
DuoSet（登録商標）IC ヒト ホスホＥＧＦＲ（RnD systems Cat. No. DYC1095-5）を用いた。ホスホＥＧＦＲ捕捉抗体（Cat. No. 841402）を０．８μｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、プレートを調製した。１ウェルあたり１００μｌをＭＴＰに加え、プレートを密閉して室温で一晩インキュベートした。

次いで、捕捉抗体を吸引し、各ウェルを４００μｌ洗浄バッファー（0.05% Tween 20 含有 PBS 溶液（pH7.2-7.4），Cat No. WA126）で５回洗浄し、最終洗浄の後、プレートをクリーンペーパータオルで拭き取った。

３００μｌのブロッキングバッファー（1% BSA，0.05% NaN₃ 含有 PBS 溶液（pH 7.2-7.4））を加え、室温で２時間インキュベートして、プレートをブロックした。次いで、溶液を吸引除去し、各ウェルを４００μｌの洗浄バッファー（0.05% Tween 20 含有 PBS 溶液（pH 7.2-7.4），Cat No. WA126）で５回洗浄し、最終洗浄の後、プレートをクリーンペーパータオルで拭き取った。

細胞をＰＢＳでリンスし、溶解バッファー９（1% NP-40, 20mM Tris（pH8.0）, 137mM NaCl, 10% グリセロール, 2mM EDTA, 1mM 活性化オルトバナジウム酸ナトリウム, 10μg/ml アプロチニン及び 10μg/ml ロイペプチン）を用いて溶解し、細胞密度を１×１０⁷細胞／ｍｌとし、穏やかに攪拌しながら４℃で３０分間インキュベートした。次いで、サンプルを１４,０００ｇで５分間遠心した。次いで、サンプルをきれいな試験管に移した。

細胞溶解物中のタンパク質量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierce）を用いて測定し、次いで、IC Diluent 12（1% NP-40, 20mM Tris（pH 8.0）, 137mM NaCl, 10% グリセロール, 2mM EDTA, 1mM 活性化オルトバナジウム酸ナトリウム）を用いて、細胞溶解物のタンパク質濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ｍｇ／ｍｌに調整した。１ウェルあたり１００μｌの溶解物を予め調製しておいたＭＴＰに加え、プレートを密閉して室温で２時間インキュベートした。

使用直前に、IC Diluent 14（20mM Tris, 137mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.1% BSA, pH 7.2-7.4）を用いて、バイアルごとに、検出抗体を所定の作用濃度（working concentration）まで希釈した。１ウェルあたり１００μｌの検出抗体を加え、プレートを密閉して、暗室中、室温で２時間インキュベートした。次いで、検出抗体を吸引除去し、各ウェルを４００μｌの洗浄バッファー（0.05% Tween 20 含有 PBS 溶液（pH 7.2-7.4）, Cat No. WA126）で５回洗浄し、最終洗浄の後、プレートをクリーンペーパータオルで拭き取った。

１ウェルあたり１００μｌの基質溶液（Cat. No. DY999）を加え、プレートを、暗室中でさらに２０分間インキュベートした。５０μｌの反応停止液（2N H₂SO₄（Cat No. DY994））を加えて十分に混合し、反応を停止させた。
４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

ＩＧＦ−１Ｒリン酸化の検出
ＡＫ１ａ−ビオチン化抗体（Genmab, Denmark）をＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）で希釈（1:200）し、１ウェルあたり１００μｌ加えて、ストレプトアビジン−ＭＴＰ（Roche ID. No.: 11965891001）を調製した。ストレプトアビジン−ＭＴＰを攪拌しながら室温で１時間インキュベートし、次いで、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で３回洗浄した。

細胞溶解物中のタンパク質量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierce）を用いて測定し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（pH 7.4）、１００ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄（1:100）及び Complete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（1:20）を用いて、細胞溶解物のタンパク質濃度を１μＭに調整し、１ウェルあたり１００μｌの溶解物を予め調製しておいたストレプトアビジン−ＭＴＰに加えた。

非刺激細胞を含む陽性対照を、溶解バッファー（50mM Tris（pH 7.4），100mM Na₃VO₄（1:100）及び Complete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（1:20）含有）で希釈（1:4000）し、１ウェルあたり１００μｌの溶解物を予め調製しておいたストレプトアビジン−ＭＴＰに加えた。陰性対照の場合は、１００μｌの溶解バッファーをストレプトアビジン−ＭＴＰのウェルに加えた。

ＭＴＰを攪拌しながら室温でさらに１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で３回洗浄した。

ヒトＩＧＦ−１Ｒ（Tyr1135/1136）／インスリン受容体β（Tyr1150/1151）（19H7）抗体（細胞シグナル伝達, Cat. No. 3024L）をＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）に希釈（1:500）し、ＩＧＦ−１Ｒの検出抗体として用いた。１ウェルあたり１００μｌを加え、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、ＭＴＰを１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で３回洗浄した。次いで、ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ（細胞シグナル伝達，Cat. No. 7074）をＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）に希釈（1:4000）し、１ウェルあたり１００μｌを二次抗体に加え、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で６回洗浄した。１ウェルあたり１００μｌの３,３'−５,５'−テトラメチルベンジジン（Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581）を加え、攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。１ウェルあたり２５μｌの１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を加え、室温でさらに５分間インキュベートし、呈色反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

図７ａ及び７ｂに示されるように、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８の適用は、ＩＧＦＲ１−シグナル伝達アッセイにおいて、特異的なリン酸化シグナルを顕著に減少させたが、ＥＧＦＲ−シグナル伝達を測定した対応アッセイにおいて、効果を示さなかった。同様に、＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２の適用は、ＥＧＦＲ−シグナル伝達アッセイにおいて、特異的なリン酸化シグナルを減少させたが、ＩＧＦ１Ｒ−シグナル伝達を測定した対応アッセイにおいて、効果を示さなかった。同一のモル濃度で同一のアッセイに適用した場合、ＸＧＦＲ１変異体＃２４２１，３４２１及び４４２１は、両アッセイにおいて、野生型抗体と同一の、又は野生型抗体よりも優れた活性を示した。すなわち、ＸＧＦＲ１分子は、両シグナル伝達経路を阻害することができる。

実施例６
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞株のＸＧＦＲ１媒介性増殖阻害
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）は、ＩＧＦ１Ｒを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害する（WO 2005/005635）。同様に、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２も、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示されている（WO 2006/082515）。様々なＸＧＦＲ１変異体の潜在的な阻害活性を腫瘍細胞株増殖アッセイで評価するために、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒを発現するＨ３２２Ｍ細胞における阻害の程度を分析した。

Ｈ３２２Ｍ細胞を、プラスチック表面への付着を防止するポリ−ＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））でコーティングした容器中、ＲＰＭＩ１６４０培地（0.5% FCS 添加）で培養した。このような条件下、Ｈ３２２Ｍ細胞は、高密度な球状物を形成し、三次元的に増殖する（固定非依存性と呼ばれる特性）。これらの球状物は、ｉｎ ｓｉｔｕにおける固形腫瘍の三次元の組織構築及び形成に酷似する。球状培養物を５０又は１００ｎＭから漸増する量の抗体の存在下で５日間インキュベートした。ＷＳＴ変換アッセイを用いて増殖阻害を測定した。Ｈ３２２Ｍ球状培養物を＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８で処理したところ、増殖阻害が観察された。

図８に示されるように、５０ｎＭ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８の適用によって、細胞増殖が５３％減少し、また、同一アッセイにおける５０ｎＭ ＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２の適用によって、細胞増殖が５３％減少した。

両抗体の同時適用（同一濃度）の結果、細胞生存率が２６％（７４％阻害）まで減少した。この結果によって、両ＲＴＫ経路の同時阻害は、一方の経路だけの阻害よりも顕著に大きな、腫瘍細胞株に対する効果を有することが示される。

様々なＸＧＦＲ１−変異体を５０ｎＭのモル濃度で適用した結果、単一分子のみを５０ｎＭのモル濃度で適用した場合よりも顕著に大きな増殖阻害が観察された。

実際に、様々なＸＧＦＲ１−変異体を抗体濃度５０ｎＭで適用した場合、その起源である＜ＥＧＦＲ＞及び＜ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の組み合わせを二倍の抗体濃度１００ｎＭ（50nM ＜IGF-1R＞HUMABクローン18及び50nM ＜EGFR＞ICR62）で適用した場合と比較して、向上した抗増殖活性を示した。

我々は、ＸＧＦＲ１分子が、ＥＧＦＲシグナル伝達又はＩＧＦ１Ｒシグナル伝達のいずれか一方を阻害するＩｇＧと比較して、顕著に増加した増殖阻害活性を有すると結論づけた。さらに、ＸＧＦＲ１分子の活性を＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８及び＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２抗体の混合物の活性と比較すると、混合物よりも明らかに低い濃度（モル及び質量）で、混合物と同一の又混合物よりも優れた活性が達成され得る。

表５は、二重特異性抗体（ＸＧＦＲ命名体）のＨ３２２Ｍ腫瘍細胞に対する抗増殖活性（生存及び阻害）に関する。

実施例７
ＸＧＦＲ１−２４２１，ＸＧＦＲ１−３４２１，ＸＧＦＲ１−４４２１及びＸＧＦＲ１−５４２１の糖鎖改変（glycoengineered）誘導体の調製（ＸＧＦＲ１−２４２１−ＧＥ，ＸＧＦＲ１−３４２１−ＧＥ，ＸＧＦＲ１−４４２１−ＧＥ及びＸＧＦＲ１−５４２１−ＧＥ）
得られた完全抗体重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列を、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした（１つは軽鎖用，１つは重鎖用）。各ベクターは、ＭＰＳＶプロモーターの制御下、合成ポリＡ部位の上流にＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を有する。

リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターでコトランスフェクトし、抗体を産生した。指数関数的に増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。未修飾抗体の産生の場合、細胞に抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターのみを１：１の比率でトランスフェクトした。糖鎖改変（glycoengineered）抗体の産生の場合、細胞を４つのプラスミドでコトランスフェクトした。４つのプラスミドのうち、２つは抗体発現用、１つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用、１つはマンノシダーゼＩＩ発現用であり、それぞれ４：４：１：１の比率とした。Ｔフラスコ中、ＤＭＥＭ培地（10% FCS 添加）を用いて、細胞を付着単層培養物として増殖させ、細胞が５０〜８０％コンフルエントな状態となったときにトランスフェクトした。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションの場合、トランスフェクションの２４時間前に、１４ｍｌのＤＭＥＭ培地（FCS（最終濃度10% V/V）, 250μg/ml ネオマイシン 添加）中、８００万個の細胞を播種し、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で一晩、インキュベーター中でインキュベートした。各Ｔ７５フラスコのトランスフェクションにおいて、４７μｇの総プラスミドベクターＤＮＡ（軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターとの間で均等に分割される）、２３５μｌの１Ｍ ＣａＣｌ₂溶液及び水を加え、ＤＮＡ，ＣａＣｌ₂及び水の溶液を調製し、最終容量を４６９μｌとした。この溶液に、４６９μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２８０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄溶液（pH 7.05）を加え、直ちに１０秒間混合し、室温で２０秒間放置した。懸濁液を１２ｍｌのＤＭＥＭ（2% FCS添加）で希釈し、Ｔ７５に加え、存在する培地を置換した。細胞を３７℃，５％ＣＯ₂、約１７〜２０時間インキュベートし、次いで、培地を１２ｍｌ ＤＭＥＭ（10% FCS含有）で置換した。条件培地をトランスフェクションの５〜７日後に回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、次いで、４０００ｒｐｍで１０分間さらに遠心し、４℃で保存した。

分泌された抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、次いでカチオン交換クロマトグラフィー、最後にサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。その際、Superdex 200 カラム（Amersham Pharmacia）のバッファーをリン酸緩衝食塩水に交換し、純粋な単量体ＩｇＧ１抗体を回収した。抗体濃度を、分光光度計を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度から推定した。抗体を２５ｍＭリン酸カリウム，１２５ｍＭ塩化ナトリウム，１００ｍＭグリシン溶液（pH 6.7）中に調合した。

抗原発現ベクターを、ＧｎＴ−ＩＩＩグリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターと、又はＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター及びゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクターとコトランスフェクションして、ヒト化抗体の糖鎖改変変異体を調製した。非糖鎖改変抗体に関して記載したように、糖鎖修飾抗体を精製し、調合した。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖を下記ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳで分析した。

ＰＮＧａｓｅＦ消化により抗体からオリゴ糖を酵素的に切り離した。この際、抗体は、ＰＶＤＦ膜に固定化されているか又は溶液中に存在している。

切り離されたオリゴ糖を含む消化溶液を得、これを直接ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析用サンプルとして用いるか、又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析用サンプル調製の前にＥｎｄｏＨグリコシダーゼでさらに消化した。

本発明の二重特異性抗体の全てにおいて、ＧＥは糖鎖改変（glycoengineered）を意味する。

実施例８
ＸＧＦＲ１分子のＦｃｇＲＩＩＩａに対する結合及びＡＤＣＣ活性
非糖鎖修飾ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２（WO 2006/082515参照）は、ＲＴＫ媒介増殖刺激シグナルの阻害により抗腫瘍活性を媒介するだけではなく、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣの誘導により有意な抗腫瘍活性を媒介する。同様に、その他の抗体、例えば、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８もＡＤＣＣを誘導することができる。抗体によるＡＤＣＣの誘導の程度は、結合する抗原に依存するだけでなく、ＡＤＣＣ反応を引き起こすＦｃ受容体として知られているＦｃｇＲＩＩＩａに対する定常領域のアフィニティーにも依存する。ＡＤＣＣのメカニズムはＸＧＦＲ１分子にとって望ましいものであるので、これらの分子が「標準的な」抗体と同様にＦｃｇＲＩＩＩａに結合できること、及びこれらの分子が良好なＡＤＣＣ活性を有することが重要である。ｂＦｃｇＲＩＩＩａに対する様々なＸＧＦＲ１分子の結合を分析するために、我々は、既に確立されているBiacoreテクノロジーを採用した（参考文献）。このテクノロジーによって組換体として産生されるＦｃｇＲＩＩＩａドメインに対するＸＧＦＲ１分子の結合が評価される。

全ての表面プラズモン共鳴測定は、BIAcore 3000 instrument（GE Healthcare Biosciences AB, Sweden）を用いて２５℃で実施した。ランニングバッファー及び希釈バッファーとして、ＰＢＳ（1mM KH₂PO₄, 10mM Na₂HPO₄, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH6.0）（0.005%（v/v）Tween 20 含有）を用いた。可溶性ヒトＦｃｇＲＩＩＩａを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH 5.0）中に希釈し、標準的なアミン結合キット（GE Healthcare Biosciences AB, Sweden）を用いて、ＦｃｇＲＩＩＩａ表面密度が約１０００ＲＵとなるように、ＣＭ５バイオセンサーチップに固定化した。固定化において、ＨＢＳ−Ｐ（10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 0.005% 界面活性剤 P20; GE Healthcare Biosciences AB, Sweden）をランニングバッファーとして用いた。ＸＧＦＲ二重特異性抗体をＰＢＳ（pH6.0）（0.005%（v/v）Tween 20 含有）で希釈し、濃度を４５０ｎＭとし、３０μｌ／分の流速で３分間かけてインジェクションした。次いで、センサーチップをＰＢＳ（pH 8.0）（0.005%（v/v）Tween 20 含有）で１分間再生した。データ分析を BIAevaluation ソフトウェア（BIAcore, Sweden）で実施した。
これらの実験の結果を表７に示す。

表６は、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎに対する二重特異性抗体（ＸＧＦＲ命名体）の結合アフィニティーを示す。

これらの分析によって、抗原が結合していないＸＧＦＲ１分子のＦｃｇＲＩＩＩａに対する結合は、野生型ＩｇＧ１分子の結合と区別できないことが明らかとなった。すなわち、これらの生化学アッセイによって、抗原が結合していないＸＧＦＲ１−２４２１及びＸＧＦＲ１−４４２１がＡＤＣＣ媒介受容体ＦｃｇＲＩＩＩａに結合する完全な能力を有することが示された。

抗原の存在下でＸＧＦＲ１分子を用いて、これらの実験を繰り返したところ、可溶性ＦｃｇＲＩＩＩａの結合能に対する何の効果も観察されなかった。

公知の方法（Umana, P.等, Nature Biotechnol. 17（1999）176-180 及び WO 99/54342）に基づき、糖鎖修飾（glycomodified）されたＸＧＦＲ１分子を用いて、このような Biacore 実験をさらに実施した（実施例７参照）。この糖鎖修飾は、ＦｃｇＲＩＩＩａに対するＦｃ領域のアフィニティーを増加させ、それにより、標的細胞に対するＡＤＣＣを増加させる。抗原が結合していない糖鎖修飾ＸＧＦＲ１分子のＦｃｇＲＩＩＩａ結合能を、抗原が結合していない糖鎖修飾野生型ＩｇＧのそれと比較すると、抗原が結合していない糖鎖修飾ＸＧＦＲ１分子では、野生型抗体と比較して、増加した結合アフィニティーを有していた。

表７は、二重特異性抗体（ＸＧＦＲ）のＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎに対する結合アフィニティーを示す。

ＦｃｇＲＩＩＩａに対するＸＧＦＲ１分子の結合能が、腫瘍細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性にどの程度変換されるかを分析するために、我々は細胞アッセイにおいてＡＤＣＣ活性を測定した。これらのアッセイにおいて、ＸＧＦＲ１−２４２１，ＸＧＦＲ１−３４２１，ＸＧＦＲ１−４４２１及びＸＧＦＲ１−５４２１の糖鎖修飾誘導体（ＸＧＦＲ１−２４２１−ＧＥ，ＸＧＦＲ１−３４２１−ＧＥ，ＸＧＦＲ１−４４２１−ＧＥ及びＸＧＦＲ１−５４２１−ＧＥ）を調製し（実施例６参照）、既に記載した BIAcore ADCC-活性アッセイ 及び下記ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイにおいて試験した。

ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、エフェクター細胞として用いるため、Histopaque-1077（Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA）を本質的に製造者の指示書に従って用いて調製した。すなわち、ヘパリン化シリンジを用いて健常ボランティアから静脈血を採取した。ＰＢＳ（Ca⁺⁺ 又は Mg⁺⁺ 不含）を用いて血液を希釈（1:0.75-1.3）し、Histopaque-1077 に積層した。グラジエントを破壊することなく室温、４００×ｇで３０分間遠心した。ＰＢＭＣを含む中間相（interphase）を集め、ＰＢＳ（２つのグラジエント由来の細胞ごとに５０ｍｌ）で洗浄し、室温、３００×ｇで１０分間遠心して回収した。ペレットをＰＢＳで再懸濁した後、ＰＢＭＣをカウントし、室温、２００×ｇで１０分間遠心し、２度目の洗浄を行った。次いで、細胞を適当な培地に再懸濁し、以後の処理で用いた。

ＰＢＭＣに関し、ＡＤＣＣアッセイで用いたエフェクターと標的との比率は２５:１であった。エフェクター細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中、適当な濃度で調製し、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μｌ加えた。標的細胞として、ＤＭＥＭ（10% FCS 含有）中で増殖させたヒトＥＧＦＲ／ＩＧＦＲ発現細胞を用いた（例えばH322M，A549又はMCF-7）。標的細胞をＰＢＳで洗浄し、カウントし、ＡＩＭ−Ｖ中に１ｍｌあたり３０万個の濃度で再懸濁し、３０，０００細胞を含む１００μｌを各マイクロウェルに加えた。抗体をＡＩＭ−Ｖ中に希釈し、５０μｌを予め平板培養しておいた標的細胞に加え、標的細胞と室温で１０分間結合させた。次いで、エフェクター細胞を加え、プレートを５％ ＣＯ₂を含む湿気環境下、３７℃で４時間インキュベートした。細胞毒性検出キット（Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland）を用いてダメージ細胞からの乳酸脱水素酵素（LDH）の放出を測定することにより、標的細胞の殺傷を評価した。４時間のインキュベーションの後、プレートを８００×ｇで遠心した。各ウェルの上清１００μｌを新しい透明な平底９６ウェルプレートに移した。キットの発色基質バッファー１００μｌを各ウェルに加えた。SOFTmax PRO ソフトウェア（Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA）を用いたＥＬＩＳＡリーダー（490nm）により、少なくとも１０分間、呈色反応のＶｍａｘ値を測定した。自然発生ＬＤＨ放出について、標的細胞及びエフェクター細胞だけを含み、抗体を含まないウェルで測定した。最大放出について、標的細胞及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００だけを含むウェルで測定した。二重特異性抗体が媒介する殺傷のパーセンテージについて、次のように算出した：
（ｘ−ＳＲ）/（ＭＲ−ＳＲ）＊１００
［式中、ｘは特定の抗体濃度におけるＶｍａｘを意味し、ＳＲは自然発生放出のＶｍａｘを意味し、ＭＲは最大放出のＶｍａｘを意味する。］

これらのアッセイにおいて、ＡＤＣＣ活性を糖鎖修飾野生型抗体と比較した。その結果によって、糖鎖修飾ＸＧＦＲ１−３４２１−ＧＥ／ＸＧＦＲ１−４４２１−ＧＥ／ＸＧＦＲ１−５４２１−ＧＥは、優れたＡＤＣＣ活性を有していた（図９参照）。

実施例９
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子の発現及び精製
対応する二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖を、原核細胞及び真核細胞選択マーカーを有する発現ベクター中に構築した。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ中で増幅させ、精製し、次いでＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトして組換えタンパク質を一過性発現させた（Invitrogen社製の freesyle system を使用）。７日後、ＨＥＫ２９３細胞上清を回収し、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。全ての二重特異性抗体構築物の均一性（Homogeneity）を、非還元条件下及び還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。還元条件下（図１５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、Ｃ末端又はＮ末端にｓｃＦａｂが融合されたポリペプチド鎖は、分子量の理論値と類似する見掛けの分子サイズを示した。全ての構築物の発現レベルをプロテインＡ−ＨＰＬＣで分析したところ、「標準的な」ＩｇＧの発現収量と類似しており、幾つかの場合には、若干低かった。このような非最適化一過性発現試験において、平均タンパク質収量は、１リットルの細胞上清あたり１．５〜１０ｍｇであった（図１３及び１４）。

精製タンパク質のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー分析によって、組換え分子の凝集傾向が示された。このような二重特異性抗体の凝集に関する問題を解決するため、付加される結合性分子のＶＨ及びＶＬ間にジスルフィド−安定化を導入した。このために、我々は、単一のシステイン置換をｓｃＦａｂのＶＨ及びＶＬ内の所定位置に導入した（Ｋａｂａｔナンバリングスキームに基づく位置ＶＨ４４／ＶＬ１００）。これらの変異によって、ＶＨ及びＶＬ間に安定な鎖間ジスルフィドが形成され、それによって、ひいては、生じたジスルフィド安定化ｓｃＦａｂモジュールが安定化する。ｓｃＦａｂｓにおけるＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドの導入は、タンパク質発現レベルを有意には阻害せず、幾つかの場合には発現収量を向上させた（図１３及び１４参照）。

製造者の指示書に従って FreeStyle^TM 293 発現系（Invitrogen, USA）を用いて、ヒト胎児腎臓細胞２９３−Ｆを一過性トランスフェクションし、二重特異性抗体を発現させた。すなわち、FreeStyle^TM 293-F 細胞懸濁物を FreeStyle^TM 293 発現培地中、３７℃、８％ＣＯ₂で培養し、トランスフェクションの実施日に細胞を新しい培地に密度１〜２×１０⁶生存細胞／ｍｌで播種した。３３３μｌの 293fectin^TM（Invitrogen, Germany）及び２５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを１：１のモル比で用いて、Opti-MEM（登録商標）I 培地（Invitrogen, USA）中で DNA-293fectin^TM 複合体を調製し、最終トランスフェクション容量を２５０ｍｌとした。トランスフェクション後７日目に、組換え抗体誘導体を含む細胞培養上清を１４０００ｇで３０分間遠心し、細菌ろ過器（０．２２μｍ）でろ過し、清澄化した。精製まで、上清を−２０℃で保存した。

プロテインＡ−セファロース^TM（GE Healthcare, Sweden）を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び Superdex200 サイズ排除クロマトグラフィーの ２工程によって、分泌された抗体誘導体を上清から精製した。すなわち、二重特異性抗体及び三重特異性抗体を含む清澄化培養上清を、ＰＢＳバッファー（10mM Na₂HPO₄, 1mM KH₂PO₄, 137mM NaCl 及び 2.7mM KCl, pH7.4）で平衡化した HiTrap プロテインA HP（5ml）カラムにかけた。未結合のタンパク質を平衡化バッファーで洗い出した。抗体誘導体を０．１Ｍクエン酸バッファー（pH 2.8）で溶出させ、タンパク質を含むフラクションを０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH 8.5）で中和した。次いで、溶出させたタンパク質フラクションを集め、Amicon 超遠心ろ過機（MWCO: 30 K, Millipore）で３ｍｌの容量まで濃縮し、２０ｍＭヒスチジン，１４０ｍＭ ＮａＣｌ（pH 6.0）で平衡化した Superdex200 HiLoad 120ml 16/60 ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）にかけた。単量体抗体フラクションを集め、凍結（snap-frozen）し、−８０℃で保存した。サンプルの一部を以後のタンパク質分析及び性状決定に用いた。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び二重特異性抗体誘導体のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）のプロファイルの具体例を図１５及び１６に示す。

図１３及び１４は、一過性発現系で観察された発現収量を示す。対象となる抗体誘導体の全てが、さらなる分析に供するのに十分な量で発現及び精製できた。上清１リットルあたりの発現収量は、１ｍｇ未満から＞３０ｍｇまでの範囲であった。例えば、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−２７２０の精製後の最終収量は１ｍｇ未満であった。一方、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−２７２１の最終収量は１３．８ｍｇであった。この相違は、ＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド安定化が、幾つかのタンパク質において観察されたように、発現収量に対して正の影響を有することを示す。

実施例１０
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ分子の安定性及び凝集傾向
ＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー分析を実施し、組換え抗体誘導体の調製物中に存在する凝集物量を測定した。そのために、二重特異性抗体サンプルを、Superdex 200 分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare, Sweden）を用いた UltiMate 3000 HPLC システム（Dionex）による高性能ＳＥＣで分析した。図１６は、これらの分析の具体例を示す。凝集物は、単量体抗体誘導体を含むフラクションの前の別個のピーク又はショルダー（shoulder）として現れる。この研究において、我々は、重鎖及び軽鎖からなる２つのヘテロダイマーで構成され、それぞれにｓｃＦａｂｓが連結された所望の「単量体」分子を特定する。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Roche Molecular Biochemicals）を用いた酵素処理によってＮ−グリカンを除去した後、還元された二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖並びに融合タンパク質のアミノ酸骨格の完全性を NanoElectrospray Q-TOF 質量分析によって検証した。様々な条件（様々な濃度及び時間を）下での精製タンパク質のＨＰ−サイズ排除クロマトグラフィー分析によって、ｓｃＦａｂｓを含む分子は、標準的なＩｇＧと比較して、凝集が若干増加する傾向にあることが示された。幾つかの分子で観察されたこの凝集傾向は、ｓｃＦａｂモジュールにおけるＶＨ４４／ＶＬ１００鎖間ジスルフィド結合の導入によって改善することができた。

実施例１１
ＲＴＫ（ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒ）に対する二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ分子の結合
様々な二重特異性抗体形態ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲに関し、ｓｃＦａｂ分子の結合及び完全長ＩｇＧ−モジュールに保持される抗原結合部位の結合を、結合モジュール及び二重特異性抗体が由来する「野生型」ＩｇＧの結合と比較した。これらの分析を、表面プラズモン共鳴（Biacore）及び細胞−ＥＬＩＳＡによって実施した。

二重特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体の結合特性を、Biacore T100 instrument（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって分析した。この系は、分子相互作用の研究用として十分に確立されており、様々な設定のアッセイにおいて、リガンド／検体結合の継続的なリアルタイムモニタリング、並びに結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡定数（ＫＤ）の測定が可能である。ＳＰＲ−技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面近くの屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化されたリガンドと、注入された溶液中の検体との相互作用によって生じる表面の質量変化の指標となる。分子が表面に固定化されたリガンドに結合すると質量は増加し、解離すると質量は減少する。

アミン結合化学を用いて、捕捉用抗ヒトＩｇＧ抗体をＣ１バイオセンサーチップの表面に固定化した。フローセルを、０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１混合物を用いて流速５μｌ／分で活性化した。抗ヒトＩｇＧ抗体を酢酸ナトリウム（pH 5.0）中に５μｇ／ｍｌで加え、その結果、表面密度が約２００ＲＵとなった。対照フローセルは、捕捉用抗体の代わりにビヒクルバッファーのみで処理した以外は同様に処理した。表面を、１Ｍエタノールアミン／ＨＣｌ（pH 8.5）のインジェクションによってブロックした。二重特異性抗体をＨＢＳ−Ｐ中に希釈し、５μｌ／分の流速でインジェクションした。抗体に関し、接触時間（結合段階）を１分とし、濃度を１〜５ｎＭとした。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを１．２，３．７，１１．１，３３．３，１００及び３００ｎＭという漸増する濃度でインジェクションし、ＩＧＦ−１Ｒを０．３７，１．１１，３．３３，１０，３０及び９０ｎＭという濃度でインジェクションした。両分子に関し、接触時間（結合段階）を３分とし、解離時間（ランニングバッファーによる洗浄）を５分とし、流速を３０μｌ／分とした。全ての相互作用は２５℃（標準的な温度）で実施した。０．８５％リン酸及び５ｍＭ水酸化ナトリウムの再生溶液を各々に６０秒間、流速５μｌ／分でインジェクションし、各結合サイクル後の非共有結合タンパク質を除去した。１秒あたりに１つのシグナルの割合でシグナルを検出した。サンプルを漸増する濃度でインジェクションした。

ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒに対する二重特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体の同時結合の具体例を図１７ａ−ｄに示す。

表８は、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体（ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０）のアフィニティー（ＫＤ）を示す。

また、培養細胞におけるＦＡＣＳに基づく結合アッセイ及び競合アッセイを、細胞表面に露出しているＲＴＫに対する二重特異性抗体誘導体の結合能を評価するために、実施することができる。図１８は、我々が、ｓｃＦａｂを含む二重特異性ＸＧＦＲ誘導体のＡ５４９癌細胞に対する結合能を試験する際に用いた実験設定を示す。これらの細胞競合アッセイにおいて、抗原であるＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒを発現するＡ５４９細胞を分離し、カウントした。１．５×１０ｅ５細胞を、円錐形９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を沈降（1500rpm, 4℃, 5分）させ、１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７−標識ＩＧＦＩＲ−特異的抗体を含むＰＢＳ（2% FCS（ウシ胎仔血清）含有）を用いて調製した各二重特異性抗体の希釈系列５０μＬ中、４５分間、氷上でインキュベートした。細胞を再度沈降させ、２００μＬのＰＢＳ（2% FCS含有）で２回洗浄した。最後に、細胞をＣｅｌｌＦｉｘ溶液（BD Biosciences）中に再懸濁させ、少なくとも１０分間、氷上でインキュベートした。細胞の平均蛍光強度（ｍｆｉ）をフローサイトメトリー（FACS Canto）で測定した。Ｍｆｉの測定は、２つの独立した染色について、少なくとも２回実施した。フローサイトメトリースペクトルを、さらに FlowJo ソフトウェア（TreeStar）を用いて処理した。最大半量（Half-maximal）の結合を、XLFit 4.0（IDBS）及び用量反応一部位モデル（dose response one site model）205 を用いて測定した。

これらの分析の結果を図１９ａ−ｃに示す。図１９ａ−ｃには、二重特異性ｓｃＦａｂ含有抗体誘導体の腫瘍細胞表面に対する結合性が示される。例えば、二重特異性抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２１の競合実験におけるＩＣ５０は、０．１１μｇ／ｍｌであった。一方、単一特異的抗体のＩＣ５０は、＞５０％高かった（0.18μg/ml）。このように、競合アッセイにおいて、二重特異性ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１抗体誘導体が、その親抗体と比較して増加した活性を示すことは、二重特異性分子が、単一特異性抗体よりも良好に細胞表面に対して結合することを示唆する。

実施例１２
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ分子によるＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーション
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）は、ＩＧＦＲ１−シグナル伝達を阻害し、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２は、ＥＧＦＲによるシグナル伝達を阻害する。様々なｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体の潜在的な阻害活性を評価するために、両者が由来する受容体のダウンレギュレーションの程度を分析した。

腫瘍細胞のＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、ＩＧＦ−ＩＲ及びＥＧＦＲ特異的抗体を用いて、経時的実験及びそれに続くＥＬＩＳＡ分析を実施した。

６ウェルプレートの各ウェルに、ＲＰＭＩ１６４０（10% FCS（PAA, Cat. No. E15-039）及び 1% PenStrep 含有）中のヒト腫瘍細胞（H322M, 5×10⁵細胞/ml）を１ｍｌ播種した。３ｍｌの培地を各ウェルに加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間培養した。

培地を注意深く除去し、ＲＰＭＩ−ＶＭ培地中に希釈した１００ｎＭ ＸＧＦＲ抗体２ｍｌで置換した。対照ウェルでは、培地を、抗体を含まない培地及びバッファーと、対照抗体を含む培地とのいずれかで置換した（＜IGF-1R＞HUMABクローン18 及び＜EGFR＞ICR62 最終濃度 100nM）。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、２４時間後に、さらなる処理のために各プレートを取り出した。

培地を注意深く吸引除去し、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。３００μｌ／ウェルの冷ＭＥＳ−溶解バッファーを加えた（MES, 10mM Na₃VO₄ 及び Complete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）。１時間後、細胞スクラッパー（Corning, Cat. No. 3010）を用いて、細胞を氷上で分離し、ウェル内容物をエッペンドルフ反応チューブに移した。１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、細胞フラグメントを除去した。

ＥＧＦＲ検出
９６ウェルマイクロタイタープレート（MTP）をプロトコル（DuoSet ELISA for Human EGFR, RnD systems Cat. No. DY231）に従って調製した。ＰＢＳ中のヒトＥＧＦＲヤギ抗体１４４μｇ／ｍｌをＰＢＳ中に希釈（1:180）し、１００μｌ／ウェルをＭＴＰに加えた。ＭＴＰを攪拌しながら室温で一晩インキュベートした。。プレートを３回、ＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）で洗浄し、３００μｌ／ウェルのＰＢＳ（3% BSA 及び 0.1% Tween 20含有）溶液で、攪拌しながら室温（RT）で１時間（h）ブロックした。プレートを３回、ＰＢＳ（0.1% Tween 20含有）で洗浄した。

細胞溶解物中のタンパク質量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierce）を用いて測定し、次いで、細胞溶解物のタンパク質濃度を、ＭＥＳ−溶解バッファー（100mM Na₃VO₄（1:100）及び Complete プロテアーゼ阻害剤（1:20）含有）を用いて０．０４ｍｇ／ｍｌに調整し、１ウェルあたり１００μｌの溶解物を予め調製しておいたＭＴＰに加えた。バックグラウンド測定のために、１００μｌの溶解バッファーをＭＴＰのウェルに加えた。

第２の細胞溶解物濃度として０．０２５ｍｇ／ｍｌを用いた。溶解物を１:２に希釈し、１ウェルあたり１００μｌを予め調製しておいたＭＴＰに加えた。ＭＴＰを、攪拌しながら室温でさらに２時間インキュベートし、次いで、３回、ＰＢＳ（0.1% Tween 20）溶液で洗浄した。

ヒトＥＧＦＲヤギビオチン化抗体を１：１８０でＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）中に希釈し、３６μｇ／ｍｌの濃度でＥＧＦＲ検出用抗体として用いた。１００μｌを各ウェルに加え、攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。次いで、ＭＴＰの各ウェルを３回、２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20）溶液で洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰを１:２００でＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20含有）中に希釈し、各ウェルに１００μｌずつ加え、攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。次いで、プレートを６回、ＰＢＳ（0.1% Tween 20含有）溶液で洗浄した。各ウェルに１００μｌずつの３,３'−５,５'−テトラメチルベンジジン（Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581）を加え、攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。各ウェルに２５μｌずつの１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を加え、室温でさらに５分間インキュベートして、呈色反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

ＩＧＦ−１Ｒ検出
ＡＫ１ａ−ビオチン化抗体（Genmab, Denmark）を１:２００でＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）中に希釈し、各ウェルに１００μｌずつ加え、ストレプトアビジン−ＭＴＰ（Roche ID. No.: 11965891001）を調製した。ストレプトアビジン−ＭＴＰを攪拌しながら室温で１時間インキュベートし、次いで、各ウェルを３回、２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20）溶液で洗浄した。

ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierce）を用いて、細胞溶解物中のタンパク質量を測定し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（pH 7.4）、１００ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄（1:100）及び Complete プロテアーゼ阻害剤（1:20）を用いて、細胞溶解物のタンパク質濃度を０．３ｍｇ／ｍｌに調整し、予め調製しておいたストレプトアビジン−ＭＴＰの各ウェルに１００μｌの溶解物を加えた。

第２の細胞溶解物濃度として０．１５ｍｇ／ｍｌを用いた。細胞溶解物を希釈し、予め調製しておいたストレプトアビジン−ＭＴＰの各ウェルに１００μｌを加えた。バックグラウンド測定では、ストレプトアビジン−ＭＴＰのウェルに１００μｌの溶解バッファーを加えた。

ＭＴＰを攪拌しながら室温でさらに１時間インキュベートし、次いで、３回、ＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で洗浄した。

ＩＧＦ−１Ｒ検出用抗体であるヒトＩＧＦ−１Ｒβウサギ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. sc-713）を１：７５０でＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20含有）中に希釈し、各ウェルに１００μｌを加え、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、ＭＴＰの各ウェルを３回、２００μｌのＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で洗浄した。次いで、二次抗体に加えるために、ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ（Cell signaling Cat. No. 7074）を１：４０００でＰＢＳ（3% BSA 及び 0.2% Tween 20 含有）中に希釈し、各ウェルに１００μｌを加え、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを６回、ＰＢＳ（0.1% Tween 20 含有）溶液で洗浄し、各ウェルに１００μｌの３,３'−５,５'−テトラメチルベンジジン（Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581）を加え、攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。各ウェルに２５μｌの１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を加え、室温でさらに５分間インキュベートして、呈色反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

二重特異性ｓｃＦａｂ含有ＸＧＦＲ分子によるＨ３２２Ｍ細胞の受容体ダウンレギュレーション検出結果を、その親である単一特異性抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８と比較して、図２０及び２１に示す。二重特異性抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲは、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒの両方をダウンレギュレーションする。これは、結合モジュールが完全な機能性（生物学的機能性）及び表現型媒介性（phenotype mediation ）を保持することを示す。また、図２１に示すように、二重特異性抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２０は、驚くべきことに、その親である＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２抗体単独と比較して、向上したＥＧＦＲのダウンレギュレーションを示した。

ｓｃＦａｂ含有ＸＧＦＲ１変異体が、同一モル濃度で同一アッセイに適用されたときに、野生型抗体と同一の又は野生型抗体よりも良好な活性を示したという事実は、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子が、両方のシグナル伝達経路を阻害できることを示している。

実施例１３
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞株のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１及びｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２媒介性増殖阻害
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）は、ＩＧＦ１Ｒを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害する（WO 2005/005635）。同様に、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２が、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示されている（WO 2006/082515）。腫瘍細胞株の増殖アッセイにおいて、様々なｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体の潜在的な阻害活性を評価するために、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ１Ｒを発現するＨ３２２Ｍ細胞における阻害の程度を分析した。

Ｈ３２２Ｍ細胞（5000細胞/ウェル）を、ＲＰＭＩ１６４０培地（10% FCS 含有）中で培養した。この際、ポリ−ＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））でコーティングしたディッシュを用いて、プラスチック表面への付着を防止した。このような条件下、Ｈ３２２Ｍ細胞は高密度な球状物を形成し、三次元的に増殖する（固定非依存性（anchorage independence）と呼ばれる特性）。これらの球状物は、ｉｎ ｓｉｔｕにおける固形腫瘍の三次元の組織構築及び形成に酷似する。球状培養物を１００ｎＭの抗体の存在下で７日間インキュベートした。Celltiter Glow ルミネセンスアッセイを用いて、増殖阻害を測定した。Ｈ３２２Ｍ球状培養物を＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８で処理したとき、増殖阻害が観察された。

図２２は、同一のアッセイにおいて、１００ｎＭ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８の適用により細胞増殖が７２％減少したこと、並びに、１００ｎＭ ＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２の適用により細胞増殖が７７％減少したことを示す。両抗体の同時適用（両抗体は 100nM という同一濃度）の結果、細胞の生存は完全に抑制された（100% 阻害）。これは、両ＲＴＫ経路の同時阻害が、一方の経路のみの阻害よりも、腫瘍細胞株に対して強力な（profound）効果を有することを示している。様々なｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体をモル濃度１００ｎＭで適用した結果、単一分子のみを適用した場合よりも顕著に大きな増殖阻害が観察された。実際に、抗体濃度が１００ｎＭである様々なｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体は、細胞増殖の完全な阻害（100%）を示した。一方、単一モジュールの適用では、部分的な阻害のみが生じた。

我々は、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子が、ＥＧＦＲシグナル伝達又はＩＧＦ１Ｒシグナル伝達のいずれかのみを阻害するＩｇＧと比較して、顕著に増大した増殖阻害活性を有すると結論づけた。

実施例１４
ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）（ＶＨ／ＶＬドメイン交換）又はＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）（ＣＨ／ＣＬドメイン交換）の発現及び精製
実施例１及び９記載の方法と同様にして、ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）（WO 2009/080252 に記載されるＶＨ／ＶＬ交換）及びＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）（WO 2009/080253 に記載されるＣＨ／ＣＬ交換）を発現させ、精製した。両方の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体とも、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８記載の重鎖可変領域及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２に由来する）に基づき、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３記載の重鎖可変領域及び配列番号２５記載の軽鎖可変領域（ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）に由来する）に基づく。

プロテインＡ−セファロース^TM（GE Healthcare, Sweden）を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び Superdex 200 サイズ排除クロマトグラフィー後の発現収量は、Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）に関しては２９．６ｍｇ／Ｌであり、Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）に関しては２８．２ｍｇ／Ｌであった。

対応する二重特異性抗体の完全な（部分的に修飾された）軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）に関しては配列番号３０〜３３に示され、Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）に関しては配列番号３４〜３７に示される。

実施例１５
ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）又はＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）によるＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーション
実施例１２と同様にして、実施例１４記載の、ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）（ＶＨ／ＶＬ交換）及びＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）（ＣＨ／ＣＬ交換）によるＨ３２２Ｍ腫瘍細胞のＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションを測定した。

ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）及びＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）によるＥＧＦＲのダウンレギュレーションは、両方とも、単一特異性＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（ca. 41%; 9,38μg タンパク質/ml）によるダウンレギュレーションと比較すると、それと類似するか（Cross-Mab（VH/VL）ca. 41%）又はそれよりも若干高かった（Cross-Mab（VH/VL）ca. 49%）。

ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）及びＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）によるＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションは、両方とも、単一特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８（ca. 85%; 75μg タンパク質/ml）によるダウンレギュレーションと比較すると、それよりも驚くほど有意に低かった（Cross-Mab（VH/VL）ca. 17%）（Cross-Mab（VH/VL）ca. 20%）。

実施例１６
ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）又はＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）によるＨ３２２Ｍ腫瘍細胞株の腫瘍増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
実施例１３と同様にして、実施例１４記載の、ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）（ＶＨ／ＶＬ交換）及びＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）（ＣＨ／ＣＬ交換）によるＨ３２２Ｍ腫瘍細胞株の腫瘍増殖の阻害を測定した。

１００ｎＭの単一特異性抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８の適用によって、細胞増殖は７５％減少し、１００ｎＭの＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２の適用によって、細胞増殖は８９％減少した。

両抗体（両抗体の濃度は 100nM という同一の濃度であり、抗体濃度は全体で 200nM となる）の同時適用によって、細胞生存は完全に抑制された（≧ 100% 阻害）。

ドメインを交換した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｃｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＶＨ／ＶＬ）及びＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ（ＣＨ／ＣＬ）（濃度 100nM）も、それぞれ別々に、完全な細胞増殖阻害（≧ 100%）を示した。

これにより、本発明の二重特異性抗体は、対応する単一特異性の親抗体の組み合わせよりも低い抗体濃度で、腫瘍細胞の増殖を完全に阻害できるが、単一特異性の親抗体は単独では部分的にしか阻害できないことが示される。

実施例１７
ｓｃＦａｂ−Ｆｃを融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ｓｃＦａｂ−Ｆｃの発現及び精製
実施例１及び９記載の方法と同様にして、ｓｃＦａｂ−Ｆｃを融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ−Ｆｃを発現させ、精製した。この二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体においても、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８記載の重鎖可変領域及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２に由来する）に基づき、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３記載の重鎖可変領域及び配列番号２５記載の軽鎖可変領域（ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）に由来する）に基づく。

プロテインＡ−セファロース^TM（GE Healthcare, Sweden）を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び Superdex 200 サイズ排除クロマトグラフィー後の発現収量は、ｓｃＦａｂ−Ｆｃに関しては２９．７ｍｇ／Ｌであった。

表１０は、ｓｃＦａｂ−Ｆｃを融合させた二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ｓｃＦａｂ−Ｆｃの発現及び精製後の収量を示す。

二重特異性抗体ｓｃＦａｂ−Ｆｃにおける関連する完全な（修飾された）重鎖アミノ酸配列は、配列番号３８−３９に示される。

実施例１８
ｓｃＦａｂ−Ｆｃが融合された二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子の発現及び精製
実施例１２と同様にして、実施例１７記載の、ｓｃＦａｂ−Ｆｃが融合された二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体によって引き起こされるＨ３２２Ｍ腫瘍細胞のＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションを測定した。

実施例１９
ｓｃＦａｂ−Ｆｃが融合された二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子による腫瘍細胞株の腫瘍増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
実施例１３と同様にして、実施例１７記載の、ｓｃＦａｂ−Ｆｃが融合された二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体によるＨ３２２Ｍ腫瘍細胞の腫瘍増殖の阻害を測定した。

実施例２０
同所性（orthotopic）Ａ５４９異種移植モデルにおける生存分析
細胞培養
Ａ５４９腺癌細胞（NSCLC）を、最初はＡＴＣＣから入手し、増殖後に国内細胞バンクに寄託した。腫瘍細胞株を通常通りにＤＭＥＭ培地（GIBCO, Switzerland）（10% ウシ胎仔血清（Invitrogen, Switzerland）及び 2mM L-グルタミン（GIBCO, Switzerland）含有）中、３７℃、５％ＣＯ₂の水飽和雰囲気下で培養した。継代培養を、トリプシン／ＥＤＴＡ １ｘ（GIBCO, Switzerland）を用いて３日ごとに分割して実施した。継代１０をインジェクションに用いた。

動物
ＳＣＩＤベージュ雌マウス（実験開始時 8-9 週齢）（購入元 Charles River, Sulzfeld, Germany）を、関連ガイドラインに従った１２時間 明所／１２時間 暗所という１日サイクルの特定病原体不存在条件下で維持した（GV-Solas; Felasa; TierschG）。実験プロトコルは、地方自治体で検討され承認された（P 2005086）。到着後の動物を新しい環境に慣れさせるために観察下で１週間維持した。定期的な健康状態のモニタリングを継続した。

腫瘍細胞インジェクション
インジェクションの日に、Ａ５４９腫瘍細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco, Switzerland）を用いて培養フラスコ（Greiner Bio-One）から採取し、５０ｍｌ培地に移し、１回洗浄し、ＡＩＭ Ｖ（Gibco, Switzerland）中に再懸濁した。さらにＡＩＭ Ｖで洗浄した後、細胞カウンターを用いて細胞濃度を測定した。Ａ５４９細胞のインジェクションのために、最終力価を５．０×１０⁶細胞／ｍｌに調整した。その後、１．０ｍｌツベルクリン注射器（BD Biosciences, Germany）を用いて、２００μｌの該混合物をマウスの外側尾静脈にインジェクションした。

処置
腫瘍細胞の接種２週間後、各群１０匹の動物について、動物処置を開始した。二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ１Ｒ抗体ＸＧＦＲ１−４４２１ＧＥ，ＸＧＦＲ１−２４２１ＧＥ，ＸＧＦＲ１−３４２１ＧＥ，＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２ＧＥ，＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８及び対応するビヒクルを、所定用量で１週間に１度静脈内投与（ｉ.ｖ.）した。実験終了まで１ヶ月間所定用量を投与した。保存しておいた抗体から抗体希釈物を新たに調製して使用した。

表１１は、同所性（orthotopic）Ａ５４９異種移植モデルにおける生存分析の実験設定を示す。なお、表中、「ＧＥ」は糖鎖改変（glycoengineered）を表す。

モニタリング
動物を日々コントロールし、臨床症状及び有害作用、すなわち、呼吸困難、運動障害及び毛の汚れ（scruffy fur）を検出した。動物の試験除外基準は、対応するプロジェクトライセンスに記載され、承認されたものである。

同定/病期診断
マウスをランダムに割り振り、病期診断した。動物はＭ３サイズケージに収容した。

解剖
終了基準（毛の汚れ、背中の丸み、運動異常）に従ってマウスを犠牲にした。全ての動物の肺から、腫瘍を採取し、その後、病理組織分析した（PFA 固定凍結切片）。

生存分析
生存データには、特定の事象が生じるまでの間のデータが含まれ、時間事象（time-to-event）データと呼ばれる場合もある。事象は、例えば、患者の死であり得る。試験終了前に事象の発生が観察されない場合、又は事象の発生前に試験対象が失われる場合、観察は打ち切られる。その場合、正確な生存時間は分からないが、特定の値よりも大きいことが分かる。

生存データは、その特殊な非標準的な分布を示すので、指数関数又はワイブル（Weibull）等の特殊な方法で分析される必要がある。さらに、打ち切られた観察は、バイアス解析なしに無視することはできない。

カプラン・マイヤー（Kaplan-Meier）曲線によって、１以上の群の右側打ち切りの（right-censored）データに関する生存関数が推定される。
表１２は、分位数（quantiles）である生存中央値の概要を示す。なお、表中、「ＧＥ」は糖鎖改変（glycoengineered）を表す。

分位数に関する表は、生存時間の中央値を示す。この表から、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＸＧＦＲ１−４４２１ＧＥ，ＸＧＦＲ１−２４２１ＧＥ，ＸＧＦＲ１−３４２１ＧＥで処理した場合、単一特異性＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２ＧＥで処理した場合と比較して、生存時間の中央値が大きく、＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２ＧＥ及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８の組み合わせで処理した場合と比較して、生存時間の中央値が大きいか、少なくとも同一であることが分かる。

実施例２１
ｓｃＦａｂ−Ｆｃを融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓ３及びＮ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｗ３Ｃの発現及び精製、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ特性
実施例１、９及び１７記載の方法と同様にして、ｓｃＦａｂ−Ｆｃを融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓ３及びＮ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｗ３Ｃを発現させ、精製した。この二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体においても、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８記載の重鎖可変領域及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２に由来する）に基づき、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３記載の重鎖可変領域及び配列番号２５記載の軽鎖可変領域（ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）に由来する）に基づく。

二重特異性抗体Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓ３における関連する完全な（修飾された）重鎖アミノ酸配列は、配列番号４０−４１に示され、Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｗ３Ｃのそれは配列番号４２−４３に示される。

ｓｃＦａｂ−Ｆｃを融合した二価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子Ｎ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓ３及びＮ−ｓｃＦａｂＳＳ−ｓａｌｔ−ｂｒｉｄｇｅ−ｗ３Ｃの発現収量、純度、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ特性は、上記実施例と同様にして測定される。

実施例２２
ｓｃＦａｂ−ＩｇＧを融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−１及びＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−２の発現及び精製、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ特性
実施例１、９及び１７記載の方法と同様にして、ｓｃＦａｂ−ＩｇＧを融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−１及びＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−２（knobs-into-holesテクノロジーを用いて、ＩＧＦ１Ｒに特異的なｓｃＦａｂを、完全長ＥＧＦＲ特異的抗体の１つだけの重鎖のＣ末端に融合させた（他も同様））を発現させ、精製した。この二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体においても、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８記載の重鎖可変領域及び配列番号１０記載の軽鎖可変領域（ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２に由来する）に基づき、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３記載の重鎖可変領域及び配列番号２５記載の軽鎖可変領域（ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587）に由来する）に基づく。

二重特異性抗体ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−１における関連する完全な（修飾された）重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号４４−４６に示され、ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−２のそれは配列番号４７−４９に示される。

ｓｃＦａｂ−ＩｇＧを融合した三価の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体分子ＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−１及びＫｉＨ−Ｃ−ｓｃＦａｂ−２の発現収量及び純度、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ特性は、上記実施例と同様にして測定される。

Claims (12)

1. ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する二重特異性抗体であって、
   i） 各抗原結合部位は、一組の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含み；
   ii） 前記第１の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１記載のＣＤＲ３領域、配列番号２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号４記載のＣＤＲ３領域、配列番号５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号６記載のＣＤＲ１領域を含み；並びに
   iii） 前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１１記載のＣＤＲ３領域、配列番号１２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号１４記載のＣＤＲ３領域、配列番号１５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１６記載のＣＤＲ１領域を含むか；又は、
   前記第２の抗原結合部位は、その重鎖可変領域に、配列番号１７記載のＣＤＲ３領域、配列番号１８記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１９記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号２０記載のＣＤＲ３領域、配列番号２１記載のＣＤＲ２領域及び配列番号２２記載のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体。
2. i） 前記第１の抗原結合部位が、その重鎖可変領域に、配列番号１記載のＣＤＲ３領域、配列番号２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号４記載のＣＤＲ３領域、配列番号５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号６記載のＣＤＲ１領域を含み；並びに
   ii） 前記第２の抗原結合部位が、その重鎖可変領域に、配列番号１１記載のＣＤＲ３領域、配列番号１２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号１４記載のＣＤＲ３領域、配列番号１５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１６記載のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、請求項１記載の二重特異性抗体。
3. i） 前記第１の抗原結合部位が、その重鎖可変領域に、配列番号１記載のＣＤＲ３領域、配列番号２記載のＣＤＲ２領域及び配列番号３記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号４記載のＣＤＲ３領域、配列番号５記載のＣＤＲ２領域及び配列番号６記載のＣＤＲ１領域を含み；並びに
   ii） 前記第２の抗原結合部位が、その重鎖可変領域に、配列番号１７記載のＣＤＲ３領域、配列番号１８記載のＣＤＲ２領域及び配列番号１９記載のＣＤＲ１領域を含むとともに、その軽鎖可変領域に、配列番号２０記載のＣＤＲ３領域、配列番号２１記載のＣＤＲ２領域及び配列番号２２記載のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、請求項１記載の二重特異性抗体。
4. i） 前記第１の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号７又は配列番号８記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号９又は配列番号１０記載の配列を含み、
   ii） 前記第２の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号２３又は配列番号２４記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２５又は配列番号２６記載の配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の二重特異性抗体。
5. i） 前記第１の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号８記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号１０記載の配列を含み、
   ii） 前記第２の抗原結合部位が、その重鎖可変領域として配列番号２３記載の配列を含むとともに、その軽鎖可変領域として配列番号２５記載の配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の二重特異性抗体。
6. 前記抗体が二価、三価又は四価であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
7. 前記抗体が、Ａｓｎ２９７において、糖鎖でグリコシル化されており、前記糖鎖のフコース量が６５％以下であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
9. 癌の処置のための請求項８記載の医薬組成物。
10. 癌の処置のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
11. 癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。
12. 癌の患者を処置する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を前記処置が必要な患者に投与することを含む前記方法。

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