JP2012165745A - 血管内皮増殖因子2 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトVEGF−2抗体、ヒトVEGF−2抗体フラグメント、またはそれらの改変体が開示される。そのような抗体を産生するためのプロセスもまた提供される。本発明は、疾患または障害を予防、処置、または改善するための方法および組成物に関し、この方法は、動物(好ましくは、ヒト)に、有効量の1つ以上のVEGF−2抗体またはVEGF−2抗体フラグメントあるいはそれらの改変体を投与する工程を包含する。1つの実施形態において本発明の1次抗体は、モノクローナル抗体である。
【選択図】なし
Description
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドに特異的な抗体、そのような抗体の使用、ならびにそのような抗体の産生に関する。本発明のポリペプチドは、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーとして同定された。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒト血管内皮増殖因子2(VEGF−2)である。本発明の抗体は、そのようなVEGF−2ポリペプチドに対して特異的である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
ミノ酸の4つの異なる形態を有する。VEGF121およびVEGF165は、可溶性でありそして新脈管形成を促進し得る。一方、VEGF189およびVEGF−206は、細胞表面におけるヘパリン含有プロテオグリカンに結合される。VEGFの時期的および空間的な発現は、血管の生理学的増殖に相関していた(Gajdusek,C.M.,およびCarbon,S.J.,Cell Physiol.139:570−579,(1989);McNeil,P.L.ら、J.Cell.Biol.109:811−822,(1989))。その高親和性結合部位は、組織切片において内皮細胞上のみに位置付けられる(Jakeman,L.B.ら、Clin.Invest.89:244−253,(1989))。この因子は、下垂体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、そしていくつかのヒト神経膠腫と関係している(Plate,K.H.Nature 359:845−848(1992))。興味深いことに、VEGF121またはVEGF165の発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に、ヌードマウス中で腫瘍を形成する能力を与える(Ferrara,N.ら、J.Clin.Invest.91:160−170(1993))。抗VEGFモノクローナル抗体によるVEGF機能の阻害は、免疫不全マウスにおける腫瘍増殖を阻害することが示された(Kim,K.J.,Nature 362:841−844(1993))。さらに、VEGFレセプターのドミナントネガティブ変異体が、マウスにおける神経膠芽腫増殖を阻害することが示された。
本発明のポリペプチドは、ヒトVEGFに対するアミノ酸配列相同性に基づいて、新規な血管内皮増殖因子として推定的に同定された。
本発明のなお別の局面によれば、そのようなポリペプチドに対する抗体、およびそのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供され、そして、このような抗体を利用するためのプロセスが提供される。
しくはVEGF−2の改変体に免疫特異的に結合する、抗体(抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれらからなる分子を含む)を包含する。特に、本発明は、ヒトVEGF−2のポリペプチド(例えば、配列番号2または配列番号4、配列番号18)またはポリペプチドフラグメントもしくは改変体、全長VEGF−2、VEGF−2ポリペプチドのプロタンパク質形態、成熟VEGF−2ポリペプチド、またはVEGF−2ポリペプチドの分泌形態に免疫特異的に結合する抗体(抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれらからなる分子を含む)を包含する。
断ツールとして本発明の抗体を使用することを包含する。
(項目1)
1次抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗体は、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)69D09 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(b)69D09 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(c)69D09 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(d)69D09 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(e)69D09 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;および
(f)69D09 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該1次抗体が、VEGF−2ポリペプチドを免疫特異的に阻害する、ポリヌクレオチド。
(項目2)
項目1に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記VEGF−2ポリペプチドが以下:
(a)配列番号18のアミノ酸1−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(b)配列番号18のアミノ酸32−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(c)配列番号18のアミノ酸103−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(d)配列番号18のアミノ酸112−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(e)配列番号18のアミノ酸103〜227からなる各々2つからなるポリペプチド二量体VEGF−2;
(f)各々が配列番号18のアミノ酸103〜227からなる2つのポリペプチドからなる二量体VEGF−2ポリペプチド;
(g)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(h)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(i)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(j)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(k)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;および
(m)配列番号18のVEGF−2ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列、
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
(項目3)
項目1〜2のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗体が、69D09scFvのVHドメインを含む2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
(項目4)
項目1〜2のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗体が、69D09 scFvのVHドメインを含む2次抗体に少なくとも95%、少なくと
も96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
(項目5)
項目1〜2のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗
体が、69D09 scFvのVHドメインおよび定常ドメインを含む2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
(項目6)
項目1〜2のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗体が、69D09 scFvのVLドメインおよび定常ドメインを含む2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
(項目7)
項目1〜2のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗体が、69D09 scFvのVHドメインおよびVHドメインを含む2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
(項目8)
項目1〜2のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗体が、69D09 scFvのVHドメインおよび定常ドメインならびにVLドメインおよび定常ドメインを含む2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一である、単離されたポリヌクレオチド。
(項目9)
上記定常ドメインがIgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインである、項目5に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目10)
上記定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目6に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目11)
上記第1の定常ドメインがIgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインであって、上記第2定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目8に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目12)
上記1次抗体がFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv、またはジスルフィド結合Fvである、項目1〜2のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目13)
上記1次抗体がモノクローナル抗体である、項目1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目14)
上記1次抗体がヒト抗体である、項目1〜13のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目15)
上記1次抗体がヒト化抗体である、項目1〜13のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目16)
上記ポリヌクレオチドが、異種ポリヌクレオチドに融合されている、項目1〜15のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目17)
項目1〜16のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。(項目18)
項目17に記載のベクターを含む、宿主細胞。
(項目19)
項目1〜16のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。(項目20)
抗体を作製するための方法であって、以下:
(a)項目1〜16のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる抗体を発現させる工程;および
(b)該抗体を回収する工程を包含する、方法。
(項目21)
項目20に記載の方法により作製される抗体。
(項目22)
1次抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該1次抗体は、以下:
(a)72D09 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(b)25A07 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(c)32G10X scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(d)30E06X scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(e)17D06 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(f)16C10 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(g)16B06 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(h)19B09 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(i)20D05 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(j)20G02 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(k)20G11 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(l)72D09 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(m)25A07 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(n)32G10X scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(o)30E06X scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(p)17D06 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(q)16C10 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(r)16B06 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(s)19B09 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(t)20D05 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(u)20G02 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(v)20G11 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(w)72D09 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(x)25A07 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(y)32G10X scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(z)30E06X scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(aa)17D06 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ab)16C10 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ac)16B06 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ad)19B09 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ae)20D05 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(af)20G02 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ag)20G11 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ah)72D09 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ai)25A07 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(aj)32G10X scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ak)30E06X scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(al)17D06 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(am)16C10 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(an)16B06 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ao)19B09 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ap)20D05 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(aq)20G02 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ar)20G11 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(as)72DO9 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(at)25A07 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(au)32G10X scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(av)30E06X scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(aw)17D06 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(ax)16C10 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(ay)16B06 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(az)19B09 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(ba)20D05 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(bb)20G02 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(bc)20G11 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(bd)72D09 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(be)25A07 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bf)32G10X scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bg)30E06X scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bh)17D06 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bi)16C10 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bj)16B06 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bk)19B09 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bl)20D05 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bm)20G02 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;および
(bn)20G11 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、ここで、該1次抗体が、免疫特異的にVEGF−2ポリペプチドを阻害する、単離されたポリヌクレオチド。
(項目23)
項目23に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記VEGF−2ポリペプチドは、以下:
(a)配列番号18のアミノ酸1−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(b)配列番号18のアミノ酸32−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(c)配列番号18のアミノ酸103−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(d)配列番号18のアミノ酸112−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(e)各々が配列番号18のアミノ酸103〜227からなる2つのポリペプチドからなる二量体VEGF−2ポリペプチド;
(f)各々が配列番号18のアミノ酸103〜227からなる2つのポリペプチドからなる二量体VEGF−2ポリペプチド;
(g)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(h)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(i)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEG
F−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(j)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(k)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;および
(m)配列番号18のVEGF−2ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
(項目24)
項目22〜23のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目25)
項目22〜23のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVLドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目26)
項目22〜23のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目27)
項目22〜23のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVLドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目28)
項目22〜23のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインおよびVLドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目29)
項目22〜23のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なく
とも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインおよび定常ドメインならびにVLドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目30)
上記定常ドメインが、IgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインである、項目26に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目31)
上記定常ドメインが、κ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目27に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目32)
上記第1の定常ドメインがIgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインであって、上記第2定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目29に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目33)
上記抗体がFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv、またはジスルフィド結合Fvである、請求22〜23のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目34)
上記1次抗体がモノクローナル抗体である、項目22〜33のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目35)
上記1次抗体がヒト抗体である、項目22〜34のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目36)
上記1次抗体がヒト化抗体である、項目22〜34のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目37)
上記ポリヌクレオチドが、異種ポリヌクレオチドに融合されている、項目22〜36のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目38)
項目22〜37のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目39)
項目38に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
(項目40)
項目22〜37のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、単離され
た宿主細胞。
(項目41)
抗体を作製するための方法であって、以下:
(a)項目22〜37のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる抗体を発現させる工程;および
(b)該抗体を回収する工程を包含する、方法。
(項目42)
項目41に記載の方法により作製される抗体。
(項目43)
2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一な1次抗体であって、該2次抗体が、以下:
(a)69D09 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(b)69D09 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(c)69D09 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(d)69D09 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(e)69D09 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;および
(f)69D09 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該1次抗体がVEGF−2ポリペプチドを免疫特異的に阻害する、単離された1次抗体。
(項目44)
項目43に記載の単離された1次抗体であって、上記単離された1次抗体が、以下:
(a)配列番号18のアミノ酸1−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(b)配列番号18のアミノ酸32−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(c)配列番号18のアミノ酸103−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(d)配列番号18のアミノ酸112−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(e)各々が配列番号18のアミノ酸103〜227からなる2つのポリペプチド二量体VEGF−2;
(f)各々が配列番号18のアミノ酸103〜227からなる2つのポリペプチドからなる二量体VEGF−2ポリペプチド;
(g)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(h)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(i)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(j)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(k)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(1)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;および
(m)配列番号18のVEGF−2ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列からなる群より選択されるVEGF−2ポリペプチドに免疫特異的に結合する、単離された1次抗体。
(項目45)
項目43〜44のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体が、69D09
scFvのVHドメインを含む、単離された1次抗体。
(項目46)
項目43〜44のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該1次抗体が
、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体が、69D09 scFvのVHドメインを含む、単離された1次抗体。
(項目47)
項目43〜44のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体が、69D09
scFvのVHドメインおよび定常ドメインを含む、単離された1次抗体。
(項目48)
項目43〜44のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体が、69D09
scFvのVLドメインおよび定常ドメインを含む、単離された1次抗体。
(項目49)
項目43〜44のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体が、69D09
scFvのVHドメインおよびVHドメインを含む、単離された1次抗体。
(項目50)
項目43〜44のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体が、69D09
scFvのVHドメインおよび定常ドメインならびにVLドメインおよび定常ドメインを含む、単離された1次抗体。
(項目51)
上記定常ドメインが、IgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインである、項目47に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目52)
上記定常ドメインが、κ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目48に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目53)
上記第1の定常ドメインがIgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインであって、上記第2定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目50に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目54)
上記単離された1次抗体がFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv、またはジスルフィド結合Fvである、請求43〜44のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目55)
上記1次抗体がモノクローナル抗体である、項目43〜54のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目56)
上記単離された1次抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、項目43〜55のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目57)
項目43〜56のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体は、以下:
(a)10−7M以下の解離定数(KD);
(b)10−8M以下の解離定数(KD);
(c)10−9M以下の解離定数(KD);
(d)10−10M以下の解離定数(KD);
(e)10−11M以下の解離定数(KD);
(f)10−12M以下の解離定数(KD);
からなる群より選択される解離定数(KD)を有する、単離された1次抗体。
(項目58)
項目43〜57のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体は、以下:
(a)10−3/sec以下のオフレート
(b)10−4/sec以下のオフレート
(c)10−5/sec以下のオフレート
(d)10−6/sec以下のオフレート
(e)10−7/sec以下のオフレート
からなる群より選択されるオフレートを有する、単離された1次抗体。
(項目59)
上記単離された1次抗体が、VEGF−2ポリペプチドのアゴニストである、項目43〜58のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目60)
上記単離された1次抗体が、VEGF−2ポリペプチドのアンタゴニストである、項目43〜58のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目61)
項目43〜60のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体が、以下:
(a)VEGF−2の中和;
(b)flk−1へのVEGF−2の結合の阻害;
(c)flk−4へのVEGF−2の結合の阻害;
(d)flk−1のVEGF−2誘導性リン酸化の阻害;
(e)血管内皮細胞のVEGF−2誘導性増殖の阻害;
(f)リンパ球内皮細胞のVEGF−2誘導性増殖の阻害;
(g)新脈管形成の阻害;および
(h)VEGF−2活性の増強、
からなる群より選択される活性を有する、単離された1次抗体。
(項目62)
項目43〜61のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該抗体が以下:
(a)腫瘍増殖の阻害;
(b)腫瘍転移の阻害、
からなる群より選択される活性を有する、単離された1次抗体。
(項目63)
項目43〜62のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体が、検出可能な標識または放射性標識にカップリングされているか、または結合体化されている、単離された1次抗体。
(項目64)
上記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、発光標識、または生物発光標識である、項目63に記載の単離された1次抗体。
(項目65)
異種ポリペプチドにカップリングされているか、または結合体化している、項目43〜64のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目66)
治療的薬剤に結合体化している、項目43〜65のいずれか1項に記載の単離された1
次抗体。
(項目67)
上記治療的薬剤が、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、または抗新脈管形成剤である、項目66に記載の単離された1次抗体。
(項目68)
上記治療的薬剤が、抗有糸分裂薬、アントラシクリン、毒素、またはアポトーシス剤である、項目66に記載の単離された1次抗体。
(項目69)
上記単離された1次抗体が細胞傷害性薬剤に結合体化している、項目43〜68のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目70)
単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体が、VEGF−2ポリペプチド上の、項目43〜69のいずれか1項に記載の単離された1次抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する、単離された1次抗体。
(項目71)
薬学的に受容可能なキャリア中の、項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目72)
項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を発現するように操作された、細胞株。
(項目73)
項目72に記載の細胞株から発現された、単離された1次抗体。
(項目74)
上記細胞がNSO細胞またはCHO細胞である、項目72に記載の細胞株。
(項目75)
項目74に記載の細胞株から発現された、単離された1次抗体。
(項目76)
上記単離された1次抗体が、ウェスタンブロットにおいてVEGF−2レセプターに免疫特異的に結合する、項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目77)
上記単離された1次抗体が、ELISAにおいてVEGF−2レセプターに免疫特異的に結合する、項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目78)
疾患または障害を処置、予防、または改善するための方法であって、動物に、項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を投与する工程を包含する、方法。
(項目79)
上記動物がヒトである、項目78に記載の方法。
(項目80)
上記疾患または障害が、以下:
(a)炎症性疾患または炎症性障害;
(b)増殖性障害;
(c)腫瘍;
(d)腫瘍転移;
(e)乳癌;
(f)脳癌;
(g)前立腺癌;
(h)結腸癌;
(i)リンパ管腫;
(j)感染症;
(k)カポージ肉腫;
(l)自己免疫疾患;
(m)慢性関節リウマチ;
(n)乾癬;
(o)糖尿病性網膜症;
(p)VEGF−2の異常発現に関連する疾患または障害;
(q)VEGF−2機能の欠失に関連する疾患または障害;
(r)VEGF−2レセプターの異常発現に関連する疾患または障害;および
(s)VEGF−2レセプター機能の欠失に関連する疾患または障害;
からなる群より選択される、項目78〜79のいずれか1項に記載の方法。
(項目81)
上記単離された1次抗体が、化学療法剤と組み合わせて投与される、項目78〜80のいずれか1項に記載の方法。
(項目82)
上記単離された1次抗体が、放射線療法と組み合わせて投与される、項目78〜81のいずれか1項に記載の方法。
(項目83)
上記単離された1次抗体が、予防的に動物に投与される、項目78〜82のいずれか1項に記載の方法。
(項目84)
VEGF−2ポリペプチドの発現を検出するための方法であって、該方法が、以下:
(a)項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のVGEF−2ポリペプチドの発現をアッセイする工程;および
(b)VEGF−2ポリペプチドのレベルを、VEGF−2ポリペプチドの標準レベル(例えば、正常な生物学的サンプルにおけるレベル)と比較する工程、
を包含する、方法。
(項目85)
癌または他の過剰増殖性障害を検出、診断、予後、またはモニターする方法であって、該方法は、以下:
(a)項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のVGEF−2ポリペプチドの発現をアッセイする工程;および
(b)VEGF−2ポリペプチドのレベルを、VEGF−2ポリペプチドの標準レベルと比較する工程、
を包含する、方法。
(項目86)
項目43〜70のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を備える、キット。
(項目87)
コントロールの抗体を備える、項目86に記載のキット。
(項目88)
単離された1次抗体であって、該1次抗体は、以下:
(a)72D09 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(b)25A07 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(c)32G10X scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(d)30E06X scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(e)17D06 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(f)16C10 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(g)16B06 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(h)19B09 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(i)20D05 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(j)20G02 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(k)20G11 scFvのVHドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(l)72D09 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(m)25A07 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(n)32G10X scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(o)30E06X scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(p)17D06 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(q)16C10 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(r)16B06 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(s)19B09 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(t)20D05 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(u)20G02 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(v)20G11 scFvのVHドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(w)72D09 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(x)25A07 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(y)32G10X scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(z)30E06X scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(aa)17D06 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ab)16C10 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ac)16B06 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ad)19B09 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ae)20D05 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(af)20G02 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ag)20G11 scFvのVHドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(ah)72DO9 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ai)25A07 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(aj)32G10X scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ak)30E06X scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(al)17D06 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(am)16C10 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(an)16B06 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ao)19B09 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ap)20D05 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(aq)20G02 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(ar)20G11 scFvのVLドメインの少なくとも1つのCDR領域;
(as)72DO9 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(at)25A07 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(au)32G10X scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(av)30E06X scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(aw)17D06 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(ax)16C10 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(ay)16B06 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(az)19B09 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(ba)20D05 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(bb)20G02 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(bc)20G11 scFvのVLドメインの少なくとも2つのCDR領域;
(bd)72D09 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(be)25A07 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bf)32G10X scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bg)30E06X scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bh)17D06 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bi)16C10 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bj)16B06 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bk)19B09 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bl)20D05 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;
(bm)20G02 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域;および
(bn)20G11 scFvのVLドメインの少なくとも3つのCDR領域、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100同一である、ここで、該1次抗体が、VEGF−2ポリペプチドを免疫特異的に阻害する、単離された1次抗体。
(項目89)
項目88に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体は、以下:
(a)配列番号18のアミノ酸1−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(b)配列番号18のアミノ酸32−419を含むVEGF−2ポリペプチド;
(c)配列番号18のアミノ酸103−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(d)配列番号18のアミノ酸112−227を含むVEGF−2ポリペプチド;
(e)各々配列番号18のアミノ酸103〜227からなる2つのポリペプチドからなる二量体VEGF−2ポリペプチド;
(f)各々が配列番号18のアミノ酸103〜227からなる2つのポリペプチドからなる二量体VEGF−2ポリペプチド;
(g)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(h)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(i)ATCC寄託番号97149に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(j)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる全長VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(k)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされるプロタンパク質VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;
(1)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAによりコードされる分泌VEGF−2ポリペプチドのアミノ酸配列;および
(m)配列番号18のVEGF−2ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるVEGF−2ポリペプチドに免疫特異的に結合する、単離された1次抗体。
(項目90)
項目88〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目91)
項目88〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVLドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目92)
項目88〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目93)
項目88〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVLドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目94)
項目88〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインおよびVLドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目95)
項目88〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインおよび定常ドメインならびにVLドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目96)
項目88〜89のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該1次抗体が、2次抗体に少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一であり、該2次抗体は、以下:
(a)72D09;
(b)25A07;
(c)32G10X;
(d)30E06X;
(e)17D06;
(f)16C10;
(g)16B06;
(h)19B09;
(i)20D05;
(j)20G02;および
(k)20G11
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のVHドメインを含む、単離された1次抗体。
(項目97)
上記定常ドメインがIgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインである、項目93に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目98)
上記定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目94に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目99)
上記第1の定常ドメインがIgG定常ドメインまたはIgA定常ドメインであって、上記第2定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目96に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目100)
上記単離された1次抗体がFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv、またはジスルフィド結合Fvである、項目88〜89のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目101)
上記1次抗体がモノクローナル抗体である、項目88〜100のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
(項目102)
上記1次抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、項目88〜101のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目103)
項目88〜102のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体は、以下:
(a)10−7M以下の解離定数(KD);
(b)10−8M以下の解離定数(KD);
(c)10−9M以下の解離定数(KD);
(d)10−10M以下の解離定数(KD);
(e)10−11M以下の解離定数(KD);および
(f)10−12M以下の解離定数(KD);
からなる群より選択される解離定数(KD)を有する、単離された1次抗体。
(項目104)
項目88〜103のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体は、以下:
(a)10−3/sec以下のオフレート
(b)10−4/sec以下のオフレート
(c)10−5/sec以下のオフレート
(d)10−6/sec以下のオフレート
(e)10−7/sec以下のオフレート
からなる群より選択されるオフレートを有する、単離された1次抗体。
(項目105)
上記単離された1次抗体が、VEGF−2ポリペプチドのアゴニストである、項目8
8〜104のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目106)
上記単離された1次抗体が、VEGF−2ポリペプチドのアンタゴニストである、項目88〜104のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目107)
項目88〜106のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体が、以下:
(a)VEGF−2の中和;
(b)flk−1へのVEGF−2の結合の阻害;
(c)flk−4へのVEGF−2の結合の阻害;
(d)flk−1のVEGF−2誘導性リン酸化の阻害;
(e)血管内皮細胞のVEGF−2誘導性増殖の阻害;
(f)リンパ球内皮細胞のVEGF−2誘導性増殖の阻害;
(g)新脈管形成の阻害;および
(h)VEGF−2活性の増強、
からなる群より選択される活性を有する、単離された1次抗体。
(項目108)
項目88〜107のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該抗体が以下:
(a)腫瘍増殖の阻害;および
(b)腫瘍転移の阻害、
からなる群より選択される活性を有する、単離された1次抗体。
(項目109)
項目88〜108のいずれか1項に記載の単離された1次抗体であって、該単離された1次抗体が、検出可能な標識または放射性標識にカップリングされているか、または結合体化されている、単離された1次抗体。
(項目110)
上記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、発光標識、または生物発光標識である、項目109に記載の単離された1次抗体。
(項目111)
異種ポリペプチドにカップリングされているか、または結合体化している、項目88〜110のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目112)
治療的薬剤に結合体化している、項目88〜111のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目113)
上記治療的薬剤が、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、または抗新脈管形成剤である、項目112に記載の単離された1次抗体。
(項目114)
上記治療的薬剤が、抗有糸分裂薬、アントラシクリン、毒素、またはアポトーシス剤である、項目112に記載の単離された1次抗体。
(項目115)
上記単離された1次抗体が細胞傷害性薬剤に結合体化している、項目88〜114のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目116)
単離された抗体であって、該単離された抗体が、VEGF−2ポリペプチド上の、項目88〜115のいずれか1項に記載の単離された1次抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する、単離された抗体。
(項目117)
薬学的に受容可能なキャリア中の、項目88〜116のいずれか1項に記載の単離さ
れた1次抗体。
(項目118)
項目88〜116のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を発現するように操作された、細胞株。
(項目119)
項目118に記載の細胞株から発現された、単離された1次抗体。
(項目120)
上記細胞がNSO細胞またはCHO細胞である、項目118に記載の細胞株。
(項目121)
項目120に記載の細胞株から発現された、単離された1次抗体。
(項目122)
上記単離された1次抗体が、ウェスタンブロットにおいてVEGF−2レセプターに免疫特異的に結合する、項目88〜116のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目123)
上記単離された1次抗体が、ELISAにおいてVEGF−2レセプターに免疫特異的に結合する、項目88〜116のいずれか1項に記載の単離された1次抗体。
(項目124)
疾患または障害を処置、予防、または改善するための方法であって、動物に、項目88〜116のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を投与する工程を包含する、方法。(項目125)
上記動物がヒトである、項目124に記載の方法。
(項目126)
上記疾患または障害が、以下:
(a)炎症性疾患または炎症性障害;
(b)増殖性障害;
(c)腫瘍;
(d)腫瘍転移;
(e)乳癌;
(f)脳癌;
(g)前立腺癌;
(h)結腸癌;
(i)リンパ管腫;
(j)感染症;
(k)カポージ肉腫;
(l)自己免疫疾患;
(m)慢性関節リウマチ;
(n)乾癬;
(o)糖尿病性網膜症;
(p)VEGF−2の異常発現に関連する疾患または障害;
(q)VEGF−2機能の欠失に関連する疾患または障害;
(r)VEGF−2レセプターの異常発現に関連する疾患または障害;および
(s)VEGF−2レセプター機能の欠失に関連する疾患または障害;
からなる群より選択される、項目124〜125のいずれか1項に記載の方法。
(項目127)
上記単離された1次抗体が、化学療法剤と組み合わせて投与される、項目124〜126のいずれか1項に記載の方法。
(項目128)
上記単離された1次抗体が、放射線療法と組み合わせて投与される、項目124〜127のいずれか1項に記載の方法。
(項目129)
上記単離された1次抗体が、予防的に動物に投与される、項目124〜128のいずれか1項に記載の方法。
(項目130)
VEGF−2ポリペプチドの発現を検出するための方法であって、該方法が、以下:
(a)項目88〜116のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のVGEF−2ポリペプチドの発現をアッセイする工程;および
(b)VEGF−2ポリペプチドのレベルを、VEGF−2ポリペプチドの標準レベル(例えば、正常な生物学的サンプルにおけるレベル)と比較する工程、
を包含する、方法。
(項目131)
癌または他の過剰増殖性障害を検出、診断、予後、またはモニターする方法であって、該方法は、以下:
(a)項目88〜116のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のVGEF−2ポリペプチドの発現をアッセイする工程;および
(b)VEGF−2ポリペプチドのレベルを、VEGF−2ポリペプチドの標準レベルと比較する工程、
を包含する、方法。
(項目132)
項目88〜116のいずれか1項に記載の単離された1次抗体を備える、キット。
(項目133)
コントロールの抗体を備える、項目132に記載のキット。
本発明の1つの局面に従って、図1の推定アミノ酸配列(配列番号2)(これは、クローン化されたcDNAを配列決定することによって決定された)を有するVEGF−2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。cDNAクローン(これは、1995年5月12日に、American Type Tissue Collection(ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110−2209に寄託され、そしてATCC受託番号97149を与えられた)を配列決定することによって、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を得た。
と)。さらに、PDGF/VEGFファミリーの特徴であるPXCVXXXRCXGCCN(配列番号8)が、VEGF−2において保存される(図3を参照のこと)。VEGF−2と、VEGFと2つのPDGFとの間の相同性は、タンパク質配列レベルにおいてである。ヌクレオチド配列の相同性は、全く検出され得ず、従って、単純なアプローチ(例えば、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション)を介してVEGF−2を単離することは困難である。
ードするヌクレオチド配列;(e)ATCC寄託番号75698に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟VEGF−2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;または(f)(a)、(b)、(c)、(d)、もしくは(e)のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
th predetermined sites on proteins.Science 219:660〜666を参照のこと。Science 219:660−666。タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、しばしば、タンパク質の一次配列で示され、一連の単純な化学法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域(すなわち免疫原性エピトープ)またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。極端に疎水性であるペプチドおよびそれらの6以下の残基は、一般に、模倣されたタンパク質に結合する抗体を誘導する際に非効果的であり;より長い可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含む可溶性ペプチドは、通常、効果的である。Sutcliffeら、前出第661頁。例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素HA1ポリペプチド鎖の配列の75%をカバーする8〜39個の残基を含む、これのガイドラインに従って設計された20個のペプチドのうちの18個は、HA1タンパク質またはインタクトなウイルスと反応する抗体を誘導し;そしてMuLVポリメラーゼ由来の12/12ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質由来の18/18は、それぞれのタンパク質を沈降させた抗体を誘導した。
−191まで、配列番号2の約Ile−201から約Thr−209まで、配列番号2の約Ala−216から約Tyr−224まで、配列番号2のAsp−244から約His−254まで、配列番号2の約Gly−258から約Glu−266まで、配列番号2の約Cys−272から約Ser−280まで、配列番号2の約Pro−283から約Ser−291まで、配列番号2の約Cys−296から約Gln−304まで、配列番号2の約Ala−307から約Cys−316まで、配列番号2の約Val−319からCys−335まで、配列番号2の約Cys−339から約Leu−347まで、配列番号2の約Cys−360から約Glu−373まで、配列番号2の約Tyr−378から約Val−386まで、および配列番号2の約Ser−388から約Ser−396まで、のアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、VEGF−2タンパク質の抗原性エピトープを保有することが、Jameson−Wolf抗原性指数の分析により決定されている。
of peptides:specificity of antigen−antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131−5135。この「同時多数ペプチド合成(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis)(SMPS)」プロセスは、Houghtenら(1986)に対する米国特許第4,631,211号にさらに記載されている。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに入れられ、固相法に包含される多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にしている。完全に手動の手順により、500〜1000以上の合成を、同時に行わせることが可能である。Houghtenら、前出、第5134頁。
、固相表面に吸着させた遊離のペプチドを使用して検出され得る抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために必要とされ得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当該分野で周知の方法に従って、固相上のペプチドへ吸着させ、そして選択された抗体を溶出することによる、抗ペプチド抗体の選択により増大され得る。
さらに、VEGF−2は、SDS−PAGEゲルにおいて泳動した場合、発現の際にタンパク質分解的に切断され、以下のサイズのポリペプチドフラグメントを生じるようである(サイズはおよそである)(例えば、図6〜8を参照のこと):80、59、45、43、41、40、39、38、37、36、31、29、21、および15kDa。これらのポリペプチドフラグメントは、そのタンパク質のN末端部分およびC末端部分の両方でタンパク質分解切断された結果である。これらのタンパク質分解的に生成されたフラグメント、特に21kDaのフラグメントは、活性を有するようである。
et(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Val(409);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Cys(408);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Arg(407);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Cys(406);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Val(405);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Glu(404);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Glu(403);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Ser(402);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Gly(398);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Pro(397);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Lys(393);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Met(263);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Asp(311);Met(1)、Glu(23)、またはAla(24)〜Pro(367);Met(1)〜Ser(419);Met(1)〜Ser(228);Glu(47)〜Ser(419);Ala(111)〜Lys(214);Ala(112)〜Lys(214);His(113)〜Lys(214);Tyr(114)〜Lys(214);Asn(115)〜Lys(214);Thr(116)〜Lys(214);Thr(103)〜Leu(215);Glu(104)〜Leu(215);Glu(105)〜Leu(215);Thr(106)〜Leu(215);Ile(107)〜Leu(215);Lys(108)〜Leu(215);Phe(109)〜Leu(215);Ala(110)〜Leu(215);Ala(111)〜Leu(215);Ala(112)〜Leu(215);His(113)〜Leu(215);Tyr(114)〜Leu(215);Asn(115)〜Leu(215);Thr(116)〜Leu(215);Thr(103)〜Ser(228);Glu(104)〜Ser(228);Glu(105)〜Ser(228);Thr(106)〜Ser(228);Ile(107)〜Ser(228);Lys(108)〜Ser(228);Phe(109)〜Ser(228);Ala(110)〜Ser(228);Ala(111)〜Ser(228);Ala(112)〜Ser(228);His(113)〜Ser(228);Tyr(114)〜Ser(228);Asn(115)〜Ser(228);Thr(116)〜Ser(228);Thr(103)〜Leu(229);Glu(104)〜Leu(229);Thr(103)〜Arg(227);Glu(104)〜Arg(227);Glu(105)〜Arg(227);Thr(106)〜Arg(227);Ile(107)〜Arg(227);Lys(108)〜Arg(227);Phe(109)〜Arg(227);Ala(110)〜Arg(227);Ala(111)〜Arg(227);Ala(112)〜Arg(227);His(113)〜Arg(227);Tyr(114)〜Arg(227);Asn(115)〜Arg(227);Thr(116)〜Arg(227);Thr(103)〜Ser(213);Glu(104)〜Ser(213);Glu(105)〜Ser(213);Thr(106)〜Ser(213);Ile(107)〜Ser(213);Lys(108)〜Ser(213);Phe(109)〜Ser(213);Ala(110)〜Ser(213);Ala(111)〜Ser(213);Ala(112)〜Ser(213);His(113)〜Ser(213);Tyr(114)〜Ser(213);Asn(115)〜Ser(213);Thr(116)〜Ser(213);Thr(103)〜Lys(214);Glu(104)〜Lys(214);Glu(105)〜Lys(214);Thr(106)〜Lys(214);Ile(107)〜Lys(214);Lys(108)〜Lys(214);Phe(109)〜Lys(214);Ala(110)〜Lys(214);Glu(105)〜Leu(229);Thr(106)〜Leu(229);Ile(107)〜Leu(229);Lys(108)〜Leu(229);Phe(109)〜Leu(229);Ala(110)〜Leu(229);Ala(111)〜Leu(229);Ala(112)〜Leu(229);His(113)〜Leu(229);Tyr(
114)〜Leu(229);Asn(115)〜Leu(229);Thr(116)〜Leu(229)。
ミノ酸欠失を有するポリペプチドを提供し、それらは一般に、配列番号2において残基m−nを有するとして記載され得、ここで、nおよびmは、上記のような整数である。
失を有する欠失変異体もまた含まれる。このような変異体には、上記のN末端欠失変異体およびC末端欠失変異体の全ての組み合わせが含まれる。
子を含むゲノムクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの例には、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のDNA配列を使用することによって遺伝子のコード領域を単離することが含まれる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、どのライブラリーのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用される。
レオチドのヌクレオチド配列(例えば、寄託されたcDNAもしくは配列番号1に示されるようなヌクレオチド配列)に由来する20以上の連続したヌクレオチドを意図する。当然、ポリA配列(例えば、配列番号1もしくは3に示されるVEGF−2 cDNAの3N末端ポリ(A)領域)、またはT(もしくはU)残基の相補ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ(A)ストレッチまたはそれらの相補体を含む任意の核酸分子(例えば、実際には任意の二重鎖cDNAクローン)にハイブリダイズするので、本発明の核酸の一部分にハイブリダイズさせるために使用する本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
(1990)において提供され、ここでこの筆者らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを示している。
F(オープンリーディングフレーム)、または本明細書中に記載される任意の特定のフラグメントであり得る。
ド配列が問い合わせアミノ酸配列の各100個のアミノ酸あたり5つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同一であることを意図する。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列におけるアミノ酸残基の5%までが、挿入、欠失、(消えない(indels))または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列内の1つ以上の連続する群においてのいずれかに分散される。
わせ配列と一致/整列しない対象配列のN末端またはC末端に残基は存在しない。この場合、FASTDBによって算出される同一性パーセントは、手動で補正されない。繰り返すが、FASTDBアラインメントにおいて示されるような、問い合わせ配列と一致/整列しない対象配列のN末端およびC末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
本発明はさらに、図1もしくは図2の推定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
付けられるVEGF−2ポリペプチドフラグメントおよびポリヌクレオチドフラグメントもまた、好ましい。保存されたドメイン内に存在する配列番号2のポリペプチドフラグメントは、本発明によって具体的に意図される(表2を参照のこと)。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、意図される。
.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307−377(1993))。
れ得る(Smithら、J.Mol.Biol.224:899−904(1992)およびde Vosら、Science 255:306−312(1992))。
の部分を含む。
任意のVEGF−2ポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用され得る。例えば、VEGF−2ポリペプチドは、第2のタンパク質に融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。VEGF−2ポリペプチドに対して惹起される抗体は、VEGF−2に結合することによって、この第2のタンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、細胞の位置を輸送シグナルに基づいて標的とするので、VEGF−2ポリペプチドは、他のタンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
オチドはまた、本発明に含まれる。
VEGF−2ポリヌクレオチドおよびVEGF−2ポリペプチドは、1つ以上の生物学的活性について試験するためのアッセイに用いられ得る。VEGF−2ポリヌクレオチドおよびVEGF−2ポリペプチドが、特定のアッセイにおいて活性を示す場合、VEGF−2が、その生物学的活性に関連した疾患に関与し得る可能性がある。従って、VEGF−2またはVEGF−2抗体を用いて、この関連する疾患を処置し得る。
新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡は、阻害の影響が勝っている平衡である。Rastinejadら、Cell 56:345〜355(1989)。新生血管形成が正常な生理学的条件下(例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス)において生じる、それらの稀な例において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に定められる。病的な新脈管形成の条件(例えば、固形腫瘍増殖に特徴的)の下において、これらの調節は制御することができない。調節されない新脈管形成は病原化し、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼内障害ならびに乾癬を含む異常な新生血管形成により支配される。例えば、Mosesら、Biotech.9:630〜634(1991);Folkmanら、N.Engl.J.Med.、333:1757〜1763(1995);Auerbachら、J.Microvasc.Res.29:401〜411(1985);Folkman、Advances in Cancer Research編、KleinおよびWeinhouse編、Academic Press、New York、175〜203頁(1985);Patz、Am.J.Opthalmol.94:715〜743(1982);ならびにFolkmanら、Science 221:719〜725(1983)による概説を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。FolkmanおよびKlagsbrun、Science 235:442〜447(1987)。
症(任意の原因による)、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
ースラー−ウェーバー(Osler−Weber)症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。
Res.51:22〜26、1991);硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体(SP−PG)(この化合物の機能は、ステロイド(例えば、エストロゲンおよびクエン酸タモキシフェン)の存在によって、増強され得る);スタウロスポリン;基質代謝の調節因子(例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、d,L−3,4−デヒドロプロリン、チアプロリン、α,α−ジピリジル、アミノプロピオニトリルフマレートを含む);4−プロピル−5−(4−ピリジニル)−2(3H)−オキサゾロン;メトトレキサート;ミトザントロン;ヘパリン;インターフェロン;2マクログロブリン−血清;ChIMP−3(Pavloffら、J.Bio.Chem.267:17321〜17326、1992);キモスタチン(Tomkinsonら、Biochem J.286:475〜480、1992);シクロデキストリンテトラデカサルフェート;エポネマイシン
;カンプトテシン;フマギリン(Ingberら、Nature 348:555〜557、1990);チオリンゴ酸金ナトリウム(「GST」;MatsubaraおよびZiff、J.Clin.Invest.79:1440〜1446、1987);アンチコラゲナーゼ−血清;α2−抗プラスミン(Holmesら、J.Biol.Chem.262(4):1659〜1664、1987);ビサントレン(National Cancer Institute);ロベンザリット二ナトリウム(N−(2)−カルボキシフェニル−4−クロロアントロニル酸(chloroanthronilic acid)二ナトリウム、または「CCA」;Takeuchiら、Agents Actions 36:312〜316、1992);サリドマイド;Angostaticステロイド;AGM−1470;カルボキシアミノイミダゾール(carboxynaminolimidazole);およびメタロプロテイナーゼインヒビター(例えば、BB94)。
VEGF−2抗体は、免疫細胞の増殖、分化、または動員(走化性)を活性化または阻害することによって、免疫系の不全または障害を処置するのに有用であり得る。免疫細胞は、造血と称されるプロセス、すなわち、多能性幹細胞から骨髄性細胞(血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ)およびリンパ系細胞(Bリンパ球およびTリンパ球)を産生するプロセスを介して発生する。これらの免疫不全または免疫障害の病因は、遺伝性、体細胞性(例えば、ガンまたはいくつかの自己免疫障害)、後天性(例えば、化学治療または毒素による)、または感染性であり得る。さらに、VEGF−2抗体は、特定の免疫系疾患または免疫系障害のマーカーまたは検出因子として使用され得る。
群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、結膜炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギヤンバレー症候群、インスリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症性眼病。
本発明のVEGF−2抗体を用いて、過剰増殖性障害(新生物を含む)を処置または検出し得る。VEGF−2抗体は、直接的または間接的な相互作用によって障害の増殖を阻害し得る。あるいは、VEGF−2抗体は、過剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。
同様に、他の過剰増殖性障害はまた、VEGF−2抗体によって処置または検出され得
る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖、および上記に列挙した器官系に位置する、新生物以外の任意の他の過剰増殖性疾患。
VEGF−2ポリペプチドは、VEGF−2に結合する分子について、またはVEGF−2が結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。VEGF−2とその分子の結合は、VEGF−2または結合した分子の活性を、活性化(アゴニスト)、増大、阻害(アンタゴニスト)あるいは減少し得る。このような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば、レセプター)または小さい分子が挙げられる。
の産生を阻害または増強し得る因子を、適切に操作された細胞あるいは組織から発見し得る。
別の実施形態において、本発明は、組成物を、VEGF−2ポリペプチドについてのレセプターを発現する標的化細胞、またはVEGF−2ポリペプチドの細胞結合形態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
VEGF−2ポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするための、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチドを、アンタゴニスト
活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性をアッセイする工程を包含する。
本発明はまた、VEGF−2ポリペプチドに結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定された結合分子を含む。これらの結合分子は、例えば、VEGF−2ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト(例えば、VEGF−2抗体)として有用である。そのような抗体は、本発明に従って、以下に詳細に記載される治療実施形態において使用され得る。
37(9):1233−1251;Ohlmeyerら、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922−10926;Erbら、1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422−11426;Houghtenら、1992,Biotechniques 13:412;Jayawi
ckremeら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1614−1618;Salmonら、1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11708−11712;PCT公開番号WO93/20242;ならびにBrennerおよびLerner、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5381−5383。
249:386−390;Fowlkesら、1992;BioTechniques
13:422−427;Oldenburgら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5393−5397;Yuら、1994、Cell 76:933−945;Staudtら、1988、Science 241:577−580;Bockら、1992、Nature 355:564−566;Tuerkら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6988−6992;Ellingtonら、1992、Nature 355:850−852;米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号、および米国特許第5,198,346号(全てLadnerらに対して);RebarおよびPabo、1993、Science 263:671−673;ならびにPCT公開番号WO94/18318を参照のこと。
好ましくは約6〜約22アミノ酸であり得る。別の実施形態において、結合ポリペプチドは、15〜100の範囲のアミノ酸、または20〜50の範囲のアミノ酸を有する。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、ならびに組換え技術によるVEGF−2ポリペプチドまたはペプチドの生成のためにこれらを使用する方法に関する。
クターであり得る)を用いて遺伝子操作(形質導入されるか、形質転換されるか、またはトランスフェクトされる)される。このベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または本発明のVEGF−2遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地において培養され得る。培養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現のために選択される宿主に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
定されない:細菌細胞(例えば、E.coli、Salmonella typhimu
riumおよびStreptomyces);真菌細胞(例えば酵母);昆虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9);動物細胞(例えば、CHO、COS、およびBowes黒色腫);ならびに植物細胞。適切な宿主の選択は、
本明細書の教示により当業者の範囲内であると考えられる。
ベクター)を含み、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入され
ている。この実施形態の好ましい局面において、この構築物はさらに、上記配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを含む)を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性:pQE70、pQE60、およびpQE−9(Qiagenから入手可能);pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから入手可能);ならびにptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmaciaから入手可能)。好ましい真核生物性ベクターのうちには以下がある:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG(Stratageneから入手可能);ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmaciaから入手可能)。他の適切なベクターが、当業者に容易に明らかである。
51:255〜267(1987)。lacIq遺伝子は、lacオペレーター配列に結合し、そして下流(すなわち、3’)配列の転写を阻止するレプレッサ−タンパク質をコードする。しかし、lacIq遺伝子産物は、ラクトースまたは特定のラクトースアナログ(例えば、イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシド(IPTG))のいずれかの存在下でlacオペレーターから解離する。従って、VEGF−2は、pHE4aベクターを含む誘導されていない宿主細胞において、測定可能な量で産生されない。しかし、IPTGのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、VEGF−2コード配列の発現を生じる。
CORRELATIONS、第4版(1997)、802〜807頁に概説されている。
または選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。2つの適切なベクターは、pKK232−8およびpCM7である。特に有名な細菌性プロモーターには、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、λ PRプロモーター、PLプロモーターおよびtrpプロモーターが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期SV40プロモーターおよび後期SV40プロモーター、レトロウイルス由来のLTRプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Iプロモーターが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分当該分野の技術レベルの範囲内である。
を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で挿入することにより構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、そして所望により宿主内での増幅を提供するために1つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、およびPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。
i.USA 86:8932〜8935(1989);およびZijlstraら、Nature 342:435〜438(1989)を参照のこと(これらの開示の各々は、これら全体が参考として援用される))。
って形成される。このような共有結合的会合は、(例えば、配列番号2に示される、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる)ポリペプチド配列に含まれる1つ以上のアミノ酸残基を含み得る。1つの例において、この共有結合的な会合は、ネイティブ(すなわち、天然に存在する)ポリペプチド中で相互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋である。別の例において、この共有結合的な会合は、化学的、または組換え的操作の結果である。あるいは、このような共有結合的な会合は、VEGF−2融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる1つ以上のアミノ酸残基を含み得る。1つの例において、共有結合的な会合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある(例えば、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。特定の例において、この共有結合的な会合は、本発明のVEGF−2−Fc融合タンパク質に含まれる異種配列間にある(本明細書中に記載される通り)。別の特定の例において、本発明の融合タンパク質の共有結合的な会合は、共有結合的に会合する多量体を形成し得る別のTNFファミリーリガンド/レセプターメンバーなど(例えば、オセテオプロテゲリン(oseteoprotegerin)(例えば、国際公開番号WO98/49305を参照のこと。この内容は、その全体が、本明細書中に参考として援用される))からの異種ポリペプチド配列間にある。
本発明のVEGF−2ポリペプチドは、血管内皮細胞およびリンパ内皮細胞についての強力なマイトジェンである。図12および13において示されるように、配列番号2のVEGF−2のポリペプチド(最初の46アミノ酸を差し引く)は、血管内皮細胞についての強力なマイトジェンであり、そしてそれらの成長および増殖を刺激する。このポリペプチドをコードするVEGF−2核酸配列について実施されたノーザンブロット分析の結果(ここでは、いくつかのヒト組織由来の20mgのRNAを32P−VEGF−2でプローブした)は、このタンパク質が心臓および肺において活性に発現されることを例示する。これはマイトジェン活性のさらなる証拠である。
って、さらなる局面において、末梢動脈血管を処置するためにVEGF−2アゴニスト抗体を使用するためのプロセスが提供される。好ましくは、VEGF−2アゴニスト抗体は、末梢動脈疾患を軽減または処置するために、個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は、以下に記載される。
本発明者らは、VEGF−2が、血管内皮細胞の増殖を刺激し、内皮細胞移動を刺激し、CAMアッセイにおいて脈管形成を刺激し、突発性高血圧ラットにおいて血圧を下げ、そしてウサギにおける虚血性四肢への血流を増加することを示した。従って、VEGF−2の活性を高めるアゴニスト抗体は、心臓血管障害(四肢虚血のような末梢動脈疾患を含
む)を処置するために使用され得る。
は当該分野で公知である。VEGF−2抗体は、下記でより詳細に記載される、薬学的組成物の一部として投与され得る。VEGF−2抗体を送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するための遺伝子治療方法に関する。この遺伝子治療法は、本発明のVEGF−2ポリペプチドの発現を達成するために、核酸(DNA、RNA、およびアンチセンスDNAまたはRNA)配列を動物へ導入することに関する。この方法は、プロモーター、および標的組織によるこのVEGF−2ポリペプチドの発現のために必要な任意の他の遺伝的エレメントに作動可能に連結された、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達の技術は、当該分野で公知であり、例えば、本明細書中に参考として援用されるWO90/11092を参照のこと。
2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;Pharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL;ならびにInvitrogenから入手可能なpEF1/V5、pcDNA3.1、およびpRc/CMV2が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明白である。
テル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分野で公知である。
リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入について報告する。米国特許第4,897,355号、同第4,946,787号、同第5,049,386号、同第5,459,127号、同第5,589,466号、同第5,693,622号、同第5,580,859号、同第5,703,055号および国際公開第WO94/9469号(これらは本明細書中で参考として援用される)は、DNAを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第5,589,466号、同第5,693,622号、同第5,580,859号、同第5,703,055号および国際公開第WO94/9469号(これらは本明細書中で参考として援用される)は、DNA−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提供する。
Gene Therapy、1:5〜14(1990)にて記載されるようなPE501、PA317、R−2、R−AM、PA12、T19−14X、VT−19−17−H2、RCRE、RCRIP、GP+E−86、GP+envAm12およびDAN細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4沈殿が挙げられるが、それらに限定されない。1つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
国特許第5,652,224号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば、アデノウイルスベクターAd2が有用であり、そしてヒト293細胞にて増殖され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのE1領域を含み、そして構成的にElaおよびElbを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ad2に加えて、他の多様なアデノウイルス(例えば、Ad3、Ad5、およびAd7)もまた、本発明において有用である。
配列は、当該分野において公知の方法を用いて化学合成され得る。
VEGF−2核酸配列およびVEGF−2ポリペプチドはまた、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベクターの製造に関連するインビトロの目的のため、およびヒトの疾患を処置するための診断薬および治療薬の生産のために使用され得る。例えば、VEGF−2は、血管内皮細胞のインビトロでの培養のために使用され得、ここで、VEGF−2は10pg/ml〜10ng/mlの濃度で馴化培地に添加される。
本発明はまた、VEGF−2アゴニストまたはVEGF−2アンタゴニストである化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法に関する。そのような方法の一例は、コマイトジェン(comitogen)Con Aの存在下でヒト内皮細胞の増殖を有意に刺激するVEGF−2の能力を利用する。内皮細胞を得、そしてCon−A(Calbiochem,La Jolla,CA)を補充した反応混合物中で96ウェル平底培養プレート(Costar,Cambridge,MA)で培養する。Con−A、本発明のポリペプチド、およびスクリーニングされるべき化合物を添加する。37℃でのインキュ
ベーションの後、3[H]を取り込むに十分な時間、1FCiの3[H]チミジン(5Ci/mmol;1Ci=37BGq;NEN)を培養物に断続的に添加し、そしてグラスファイバーフィルター(Cambridge Technology,Watertown,MA)上に回収する。3連の培養物の平均の3[H]チミジン取り込み(cpm)を、液体シンチレーションカウンター(Beckman Instruments,Irvine,CA)を使用して決定する。化合物を除いたコントロールアッセイと比較して有意な3[H]チミジン取り込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。
60(1991);遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現してVEGF−2の産生を阻害し得る。
VEGF−2抗体は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。そのような組成物は、治療的有効量のポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。そのようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。処方物は、投与の形態に合わせるべきである。
ブプロモーターであり得る。
本発明はまた、VEGF−2核酸配列における変異の存在に関する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部としての、VEGF−2遺伝子の使用に関する。
AS,USA 85:4397−4401(1985))。
本発明の配列はまた、染色体同定に価値がある。その配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。さらに、染色体上
の特定の部位を同定する必要性が現在存在する。実際の配列データ(反復多型のデータ)に基づく染色体マーキング試薬は、染色体位置のマーキングのために現在ほとんど利用可能ではない。本発明による、DNAの染色体へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子とそれらの配列とを相関付ける際の重要な第1の工程である。
Hopkins University,Welch Medical Libraryからオンラインで利用可能)において見い出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、連鎖解析(物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝)を介して同定する。
罹患した個体および罹患していない個体の比較は、一般的に、染色体における構造的変化(例えば、欠失または転座)を探索することを第1に含み、この変化は、染色体のスプレッドから可視的であるか、またはそのcDNA配列に基づくPCRを用いて検出可能である。最終的に、何人かの個体からの遺伝子の完全な配列決定は、変異の存在を確認しか
つ多型性からの変異を区別するために必要とされる。
本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によって、インビボでVEGF−2を阻害することに関する。アンチセンス技術を用いて、3重らせんの形成またはアンチセンスDNAもしくはアンチセンスRNAを通して遺伝子発現を制御し得る。これらの方法は両方とも、DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、成熟ポリヌクレオチド配列の5’コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、10〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され(三重らせん−Leeら、Nucl. Acids Res.,6:3073(1979);Cooneyら、Science,241:456(1988);およびDervanら、Science,251:1360(1991)を参照のこと)、それにより、VEGF−2の転写および産生を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のVEGF−2への翻訳をブロックする(アンチセンス−Okano,J.Neurochem.,56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。
本発明は、配列番号2、配列番号4または配列番号18のアミノ酸配列を有するポリペプチド(またはそのフラグメントもしくは改変体)のエピトープ、あるいは、、ATCC受託番号97149もしくは75698に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされるかまたは配列番号1もしくは配列番号3の配列の相補物またはATCC受託番号97149もしくは75698に含まれる配列の相補物、上記で規定されたようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる全長ポリペプチドのエピトープ(またはそのフラグメントもしくは改変体)を、含むかあるいはそれらからなる、ポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列(例えば、配列番号2、配列番号4および配列番号18で開示された配列)のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および上記で定義されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
、またはそのフラグメントが免疫原である場合、インビボで抗体応答を誘発するタンパク質の一部として規定される。一方、抗体が結合し得るポリペプチド領域が、「抗原決定基」または「抗原性エピトープ」として規定される。タンパク質のインビボでの免疫原性エピトープの数は、一般に抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysenら、(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002を参照のこと。しかし、抗体は、それが免疫原性エピトープであるか否かに関わらず、ファージディスプレイのような方法を用いることによって、任意の抗原性エピトープに対して作製され得る。例えば、Petersen G.ら(1995)Mol.Gen.Genet.249:425−431を参照のこと。従って、本発明には、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方が含まれる。
抗体は、好ましくは、これらの領域から、またはこれらの領域の別個のフラグメントから、調製される。しかし、抗体は、本明細書中に記載されるように、ペプチドの任意の領域から調製され得る。好ましいフラグメントは、VEGF−2のそのレセプター(例えば、flk−1、またはflt−4)への結合を減少するかまたは完全に妨げる抗体を産生する。抗体は、全長VEGF−2またはそのレセプターの部分(例えば、VEGF−2ポリペプチドの分泌形態またはこれらの領域の任意の部分)に対して開発され得る。抗体はまた、特定の機能的部位(例えば、レセプター結合部位、あるいは、グリコシル化されるか、リン酸化されるか、ミリストイル化されるか、またはアミド化される部位)に対して開発され得る。
連続するアミノ酸残基の長さ」とは、7アミノ酸残基の長さ、または7アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の任意の整数を意味する。詳細には、7と全長のポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の各整数およびどの整数も、本発明に含まれる。
n peptide)(MAP)として合成され得る。MAPは、非免疫抗原性リジン核に結合する特定のペプチドの複数のコピーからなる。Mapペプチドは、通常、MAP−4ペプチドまたはMAP−8ペプチドとしてしばしば称される4または8コピーのペプチドを含む。非限定的な例として、MAPは、ポリエチレングリコール−ポリスチレン(PEG−PS)支持体に結合するリジン核マトリックスにおいて合成され得る。目的のペプチドは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を使用してリジン残基において合成される。例えば、Applied Biosystems(Forster City,CA)は、MAP樹脂(例えば、MAPを合成するために使用され得るFmoc樹脂4分枝(Fmoc Resin 4 Branch)およびFmoc樹脂8分枝(Fmoc Resin 8 Branch)など)を提供する。樹脂からのMAPの切断は、当該分野で公知の標準トリフルオロ酢酸(TFA)ベースのカクテルを使用して実施される。MAPの精製(脱塩を除く)は、必要ではない。MAPペプチドは、MAPとこのペプチドを由来とするネイティブのタンパク質の両方を認識する抗体を惹起する免疫ワクチンとして使用され得る。
疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択(例えば、当該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による)により上昇し得る。
d.Sci.USA 88:8972−897)。この系において、目的の遺伝子は、ワクシニア組換えプラスミドへサブクローン化され、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、6つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳時に融合される。このタグは、融合タンパク質についてのマトリクス結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、Ni2+ニトリロ酢酸−アガロースカラム上へロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
本発明は、さらに、抗体およびT細胞抗原レセプター(TCR)に関する。この抗体およびT細胞抗原レセプター(TCR)は、(特定の抗体−抗原結合のアッセイについて当該分野で周知の免疫アッセイにより決定される場合)、本発明のポリペプチド、本発明の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、あるいは配列番号2、配列番号4、もしくは配列番号18の改変体、あるいは全長ポリペプチド(またはそのフラグメントもしくは改変体)、プロタンパク質ポリペプチド配列、あるいはATCC受託番号97149もしくは75698に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる分泌ポリペプチド、および/あるいはエピトープを特異的に結合する。
四量体である。
つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部は、主に抗原の認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。この鎖のカルボキシ末端部は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類され、それぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとして抗体のイソタイプを規定する。一般的に、Fundamental Immunology 第7章(Paul,W.編、第二版、Raven Press、N.Y.(1989))(その全体が全ての目的のために参考として援用される)を参照のこと。各軽鎖/重鎖の対の可変領域は、抗体の結合部位を形成する。
含む分子)をいう。本発明の抗体としては、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む)、IgA(IgA1およびIgA2を含む)、IgD、IgE、またはIgMおよびIgYが挙げられる。好ましい実施形態において、免疫グロブリンはIgG1イソタイプである。別の好ましい実施形態において、この免疫グロブリンはIgG2イソタイプである。別の好ましい実施形態において、この免疫グロブリンはIgG4イソタイプである。免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖の両方を有し得る。IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY重鎖は、κまたはλ形態の軽鎖と対になり得る。
97149または75698に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる全長VEGF−2タンパク質ではない。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、VEGF−2タンパク質の分泌形態およびATCC寄託番号97149または75698に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる全長VEGF−2タンパク質の両方を結合する。
他の抗原と交差反応しない。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、VEGF−2に免疫特異的に結合し、そして、例えば、VEGF、VEGF−1、VEGF−3(VEGF−B)、VEGF−4(VEGF−D)、PDGFaまたはPDGFbのような、VEGF/PDGFファミリーの他のメンバーと交差反応しない。
参照のこと)、ならびに/あるいは、腫瘍増殖および/または腫瘍転移を阻害する能力(例えば、実施例37および38を参照のこと)。必要に応じて、本発明の抗体は、本明細書中で具体的に言及された少なくとも1つの抗体と同じエピトープに結合する。このようなエピトープへの結合は、当該分野で公知のアッセイを使用して、慣用的に決定され得る。
ノ酸配列を有するVHドメインまたはVLドメインの一部(例えば、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、またはVL CDR3)、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。1つの実施形態では、VEGF−2のそのレセプター(例えば、flk−1および/またはflt−4)への結合を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表2において言及されたscFvのVLドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2のそのレセプター(例えば、flk−1および/またはflt−4)への結合を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体(または、scFvフラグメントもしくはFabフラグメント)由来のVHドメインおよびVLドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。1つの実施形態では、VEGF−2のそのレセプター(例えば、flk−1および/またはflt−4)への結合を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2のそのレセプター(例えば、flk−1および/またはflt−4)への結合を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVLドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、VEGF−2のそのレセプター(例えば、flk−1および/またはflt−4)への結合を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVH CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、VEGF−2のそのレセプター(例えば、flk−1および/またはflt−4)への結合を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVL CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
CDR2、またはVL CDR3)、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。1つの実施形態では、VEGF−2により誘導されるElk−1のリン酸化を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表2において言及されたscFvのVLドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2により誘導されるElk−1のリン酸化を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体(または、scFvフラグメントもしくはFabフラグメント)由来のVHドメインおよびVLドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。1つの実施形態では、VEGF−2により誘導されるElk−1のリン酸化を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2により誘導されるElk−1のリン酸化を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVLドメイ
ン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、VEGF−2により誘導されるElk−1のリン酸化を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVH
CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、VEGF−2により誘導されるElk−1のリン酸化を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVL CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
CDR1、VL CDR2、またはVL CDR3)、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。1つの実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメイン、またはそのフラグ
メントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表2において言及されたscFvのVLドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体(または、scFvフラグメントもしくはFabフラグメント)由来のVHドメインおよびVLドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。1つの実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVLドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVH CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表2において言及されたscFvのVL CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
提供し、この抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメインまたはVLドメインの一部(例えば、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、またはVL CDR3)を含むか、あるいはそれらからなる。限定することのない例として、「VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる」抗体は、VEGF−2がそのレセプター(例えば、flk−1またはflt−4)に結合する能力、VEGF−2がVEGF−2シグナル伝達カスケードを刺激する(例えば、VEGF−2により誘導されるElk−1のリン酸化を増加させる(実施例35を参照のこと))能力、VEGF−2が血管および/またはリンパ性内皮細胞の増殖を誘導する能力(例えば、実施例34を参照のこと)、ならびに/あるいはVEGF−2が新脈管形成を促進する能力を増加させる抗体である。1つの実施形態では、VEGF−2の活性を増強させる抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなり、そして表2において言及されたscFvのVLドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2の活性を増強させる抗体は、本発明の単鎖抗体(または、scFvフラグメントもしくはFabフラグメント)由来のVHドメインおよびVLドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。1つの実施形態では、VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表2において言及されたscFvのVHドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表2において言及されたscFvのVLドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表2において言及されたscFvのVH CDRドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表2において言及されたscFvのVH CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体を増強させる抗体は、表2において言及されたscFvのVL CDR、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表2において言及されたscFvのVL CDR3、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
つ、3つ、もしくはそれより多いVH CDRのアミノ酸配列、または表2において言及されたscFvの任意の1つ、2つ、3つ、もしくはそれより多いVL CDRのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなる。好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、表2において言及されたscFvのVH CDR3のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなり、この融合タンパク質は、VEGF−2に免疫特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、表2において言及されたscFvの少なくとも1つのVHドメインのアミノ酸配列、および表2において言及されたscFvの少なくとも1つのVLドメインのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、融合タンパク質のVHドメインおよびVLドメインは、本発明の単鎖抗体(または、scFvフラグメントもしくはFabフラグメント)に対応する。さらに別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、表2において言及されたscFvの任意の1つ、2つ、3つ、もしくはそれより多いVH CDRのアミノ酸配列、および表2において言及されたscFvの任意の1つ、2つ、3つ、もしくはそれより多いVL CDRのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多いVHCDRまたはVLCDRが、本発明の単鎖抗体(または、scFvフラグメントもしくはFabフラグメント)に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
既知の保護基/ブロック基(blocking group)による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これらに制限されない公知の技術によって実施され得る。さらに、誘導体は、1つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
Laboratory Press,第2版、1988);Hammerlingら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND T−CELL HYBRIDOMAS 563−681(Elsevier,N.Y.1981)(上記の参考文献は、その全体が参考として援用される)を参照のこと。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を介して生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそれを産生する方法に由来する抗体ではない。
換B細胞株を産生するためのプロトコル(例えば、Current Protocols
in Immunology、Coligenら編、1994、John Wiley
& Sons、NY(これは、その全体が本明細書中で参考として援用される)の第7.22章に概略されるプロトコル)が、当該分野で一般的に知られている。形質転換のためのB細胞の供給源は、一般的にヒト末梢血であるが、形質転換のためのB細胞はまた、以下に挙げられる他の供給源に由来し得るが、これらに限定されない:リンパ節、扁桃腺、脾臓、腫瘍組織、および感染した組織。一般的に組織は、EBV形質転換の前に単一細胞懸濁液になされる。さらに、B細胞を含むサンプル中のT細胞を物理的に取り除くか、またはT細胞を不活化(例えば、シクロスポリンAを用いる処理によって)する工程がとられ得る。なぜなら、抗EBV抗体について血清陽性の個体由来のT細胞は、EBVによるB細胞の不死化を抑制し得るからである。一般的に、ヒトB細胞を含むサンプルにEBVを接種し、そして3〜4週間培養する。EBVの代表的な供給源は、B95−8細胞株(ATCC#VR−1492)の培養上清である。EBV形質転換の物理学的徴候は、一般的に、3〜4週間の培養期間の最後に観察され得る。位相差顕微鏡によって、形質転換された細胞は、大きく、明瞭で、毛様(hairy)に見え、そして細胞の密集したクラスター状に凝集する傾向にあり得る。一般的に、最初EBV株はポリクローナルである。しかし、過剰に長期にわたった細胞培養物のEBV株は特定のB細胞クローンの選択的な増殖の結果としてモノクローナルまたはポリクローナルになり得る。あるいは、ポリクローナル性のEBV形質転換株は、適切な融合パートナでサブクローニング(例えば、限界希釈培養によって)され得るか、または融合され得、そして限界希釈でプレートされ、モノクローナルB細胞株を入手し得る。EBV形質転換細胞株のための適切な融合パートナーとして、マウス骨髄腫細胞株(例えば、SP2/0、X63−Ag8.653)、ヘテロ骨髄腫細胞株(ヒト×マウス;例えば、SPAM−8、SBC−H20、およびCB−F7)、およびヒト細胞株(例えば、GM 1500、SKO−007、RPMI 8226、およびKR−4)が挙げられる。従って、本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはこれらのフラグメントに対するポリクローナル性またはモノクローナル性のヒト抗体を作製する方法を提供し、この方法は、ヒトB細胞のEBV形質転換を包含する。
1994)、Eur.J.Immunol.24:952−958;Persic,L.ら(1997)、Gene 187 9−18;Burton,D.R.ら(1994)、Advances in Immunology 57:191−280;PCT/GB91/01134;WO 90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO 92/18619;WO 93/11236;WO 95/15982;WO 95/20401;ならびに米国特許第5,698,426号;同第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,580,717号;同第5,427,908号;同第5,750,753号;同第5,821,047号;同第5,571,698号;同第5,427,908号;同第5,516,637号;同第5,780,225号;同第5,658,727号;および同第5,733,743号(これらの参考文献は、本明細書中でその全体が参考として援用される)。
5,530,101号および同第5,585,089号)、ベニヤリング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)(EP 0 592 106号;EP 0 519 596号;Padlan,E.A.(1991)、Molecular Immunology 28(4/5):489−498;Studnicka,G.M.ら(1994)、Protein Engineering 7(6):805−814;Roguska M.A.ら(1994)、PNAS 91:969−973)、およびチェーンシャッフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得る。また、米国特許第4,444,887号、同第4,716,111号、同第5,545,806号、および同第5,814,318号;ならびにWO98/46645を参照のこと(これらの参考文献は、その全体において参考として援用される)。
類似した技術を用いて、選択された抗原に対して指向するヒト抗体を提供することに従事し得る。
17:2445〜2456(1998);OhageおよびSteipe、J.Mol.Biol.291:1119〜1128(1999);Ohageら、J.Mol.Biol.291:1129〜1134(1999);WirtzおよびSteipe、Protein Sci.8:2245〜2250(1999);Zhuら、J.Immunol.Methods 231:207〜222(1999);およびこれらにおいて引用されている参考文献。特に、CCR5イントラボディーが、Steinbergerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:805〜810(2000)によって産生されている。
本発明による抗体は、挿入されたヒト抗体産生ゲノムの実質的な部分を有するが、外因性マウス抗体の産生を欠損させるトランスジェニックマウスの使用により調製され得る(例えば、XenoMouse系統はAbgenix Inc.,Fremont,CAから入手可能)。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生し得、そしてマウス免疫グロブリン分子および抗体の産生を欠損する。同じことを達成す
るために使用される技術が、特許、出願および本明細書中に開示される参考文献に開示される。
:146〜156(1997)、GreenおよびJakobovits J Exp.Med.188:483〜495(1998)、Green、Journal of Immunological Methods 231:11〜23(1999)および米国特許出願番号08/759,620(1996年12月3日出願)(これらの開示は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
471 151 B1(1996年6月12日許可公開)、国際特許出願番号WO 94/02602(1994年2月3日公開)、国際特許出願番号WO 96/34096(1996年10月31日公開)および同WO 98/24893(1998年6月11日公開)もまた参照のこと。上記列挙した特許、出願、および参考文献のそれぞれの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
のscFvおよび/または分子をコードする核酸分子であるように、本発明によって包含される。
る。
る。
つ以上のscFvのVLドメインに含まれるいずれかの1つ、2つ、または3つ以上のVL CDRのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。特に、本発明は、VEGF−2に免疫特異的に結合する抗体を提供し、この抗体は、表2で参照される1つ以上のscFvのVLドメインに含まれるVL CDR1のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。別の実施形態において、VEGF−2に免疫特異的に結合する抗体は、表2で参照される1つ以上のscFvのVLドメインに含まれるVL CDR2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。好ましい実施形態において、VEGF−2に免疫特異的に結合する抗体は、表2で参照される1つ以上のscFvのVLドメインに含まれるVL CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。VEGF−2もしくはVEGF−2フラグメントまたはこれらの改変体に免疫特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントまたはこれらの改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子はまた、これらの抗体、分子、フラグメントおよび/または改変体をコードする核酸分子のように本発明によって包括される。
本発明はまた、一般に、単離された、本発明の抗体(抗体フラグメントまたはその改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む)をコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、表2において参照されるscFvのいずれか1つのVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメイン、および表2において参照されるscFvのいずれか1つのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含むか、あるいはこれらからなる抗体(抗体フラグメントまたはこれらの改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む)をコードする。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、表2において参照されるscFvのいずれか1つのVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメイン、または表2において参照されるscFvのいずれか1つのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含むか、あるいはこれらから構成される抗体(抗体フラグメントまたはこれらの改変体を含むか、あるいはそれから構成される分子を含む)をコードする。
体を提供し、VEGF−2またはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する。当業者に公知の標準的技術を使用して、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入し得、この変異としては、例えば、アミノ酸置換を生じる部位指向変異誘発およびPCR媒介性変異誘発が挙げられる。好ましくは、改変体(誘導体を含む)は、参照のVHドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLドメイン、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3と比較して、50個未満のアミノ酸置換、40個未満のアミノ酸置換、30個未満のアミノ酸置換、25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。あるいは、変異は、コード配列の全てまたは一部と共に、例えば、飽和変異誘発によって、ランダムに導入され得、そして、得られた変異体は、生物学的活性についてスクリーニングされて、活性(例えば、VEGF−2に結合する能力)を保持する変異体を同定し得る。
bel,F.M.ら編、1989、Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates,Inc.およびJohn Wiley&Sons,Inc.,New
York、6.3.1〜6.3.6頁および2.10.3頁を参照のこと)。これらの抗体をコードする核酸分子はまた、本発明によって包含される。
本発明の抗体(抗体フラグメントまたは改変体を含む)は、当該分野で公知の任意の方法によって産生され得る。例えば、本発明に従って、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得ることが理解される。特定の抗体についてのcDNAまたはゲノムクローンをコードする配列は、例えば、適切な哺乳動物宿主細胞もしくは非哺乳動物宿主細胞の形質転換のため、またはファージディスプレイライブラリーを作成するために使用され得る。さらに、本発明のポリペプチド抗体は、化学的に合成され得るか、または組換え発現系の使用を介して産生され得る。
たVHドメインは、適切な免疫グロブリン定常領域(例えば、それぞれ、VHドメインについてのヒトIgG1定常領域またはIgG4定常領域、ならびにκVLドメインおよびλVLドメインについてのヒトκ定常領域またはλ定常領域)を発現するベクターにクローン化され得る。好ましくは、VHドメインまたはVLドメインを発現するベクターは、選択された発現系における重鎖および軽鎖の発現を指向するのに適したプロモーター、分泌シグナル、免疫グロブリン可変領域についてのクローニング部位、免疫グロブリン定常領域、およびネオマイシンのような選択マーカーを含む。VHドメインおよびVLドメインはまた、必要な定常領域を発現する単一のベクターにクローン化され得る。次いで、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターを、当業者に公知の技術を使用して、細胞株に同時トランスフェクトし、安定してかまたは一過的に全長抗体(例えば、IgG)を発現する細胞株を作製する(例えば、Guoら、J.Clin.Endocrinol.Metab.82:925〜31(1997)およびAmesら、J.Immunol.Methods 184:177−86(1995)(これらは、本明細書中にその全体が参考として援用される)を参照のこと)。
Spring Harbor,NYおよびAusubelら編、1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される)を参照のこと)を用いて操作されて、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および/または挿入を作製するような、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し得る。
合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択され得るかまたは同定され得る(例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を使用して)。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられるが、これらに限定されない:Brinkmanら、J.Immunol.Methods 182:41〜50(1995);Amesら、J.Immunol.Methods 184:177〜186(1995);Kettleboroughら、Eur.J.Immunol.24:952〜958(1994);Persicら、Gene 187 9〜18(1997);Burtonら、Advances in Immunology 57:191〜280(1994);PCT出願番号PCT/GB91/01134;PCT公開WO 90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO 92/18719;WO 93/11236;WO 95/15982;WO 95/20401;WO97/13844;および米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,717号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、同第5,735,743号、および同第5,969,108号(これらの各々は、本明細書中にその全体が参考として援用される)。
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、細胞内免疫(すなわち、内部抗体技術)、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。抗体を産生する方法としては、ハイブリドーマ技術、EBV形質転換、および本明細書中に考察される他の方法ならびに以下に議論されるような組換えDNA技術の使用を含むが、これらに限定されない。
分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えDNA技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換えDNA技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域(例えば、PCT公開 WO86/05807;PCT公開 WO89/01036;および米国特許第5,122,464号を参照のこと)をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない:抗体をコードする配列がlacZをコードする領域と共にベクターにインフレーム(in frame)で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるE.coli発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO J.2:1791(1983));pINベクター(Inouye&Inouye、Nucleic Acids Res.13:3101−3109(1985);Van Heeke&Schuster、J.Biol.Chem.24:5503−5509(1989))など。pGEXベクターもまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このpGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、GST部分から放出され得る。
578T、HTB2、BT20およびT47Dのような乳癌細胞株、ならびに、例えば、CRL7030およびHs578Bstのような正常な乳腺細胞株、が挙げられるがこれらに限定されない。
Wiley&Sons、NY(1994);Colberre−Garapinら、J.Mol.Biol.150:1(1981)(これらはその全体が本明細書中に参考として援用される)。
ingtonおよびHentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、Vol.3(Academic Press、New York、1987)を参照のこと)。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生もまた増加する(Crouseら、Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
本発明のポリペプチドに組換えにより融合され、または化学的に結合(共有結合および非共有結合の両方を含む)された抗体は、本発明にさらに含まれる。この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使用され得る。例えば、Harborら、上記、および第WO93/21232号;EP0,439,095;Naramura,M.ら(1994)、Immunol.Lett.39:91−99;米国特許第5,474,981号;Gillies,S.O.ら(1992)、PNAS 89:1428−1432;Fell,H.P.ら(1991)、J.Immunol.146:2446−2452を参照のこと。上記参考文献は、その全体が参考として援用される。
用される)を含むがこれらに限定されない)に融合され得、キメラポリペプチドを生じる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび/または抗体(そのフラグメントまたは改変体を含む)は、ヒト血清アルブミンの成熟形態(すなわち、欧州特許第0
322 094号の図1および2において示されるようにヒト血清アルブミンのアミノ酸1〜585)(これは、本明細書中にその全体が参考として援用される)と融合される。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび/または抗体(そのフラグメントまたは改変体を含む)は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基1〜xを含むか、またはそれからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、xは、1〜585の整数であり、そしてアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミン活性を有する。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび/または抗体(そのフラグメントまたは改変体を含む)は、米国特許第5,766,883号(本明細書中にその全体が参考として援用される)に記載されるように、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基1〜zを含むか、またはそれからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、zは、369〜419の整数である。本発明の融合タンパク質をコードするポリペプチドもまた、本発明によって包含される。このような融合タンパク質は、例えば、精製を容易にし、そして、インビボ半減期を増加し得る。本発明のポリペプチドに融合または結合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使用され得る。例えば、Harborら、上記、およびPCT公開WO93/21232号;EP439,095;Naramuraら、Immunol.Lett.39:91−99(1994);米国特許第5,474,981号;Gilliesら、PNAS
89:1428−1432(1992);Fellら、J.Immunol.146:2446−2452(1991)を参照のこと。これらは、その全体が参考として援用される。
定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している(EP 394,827;Trauneckerら、Nature 331:84−86(1988))。ジスルフィド連結二量体構造(IgGに起因する)を有する抗体に融合または結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る(Fountoulakisら、J.Biochem.270:3958−3964(1995))。多くの場合、融合タンパク質のFc部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る(EP A 232,262)。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Fc部分を欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、Fc部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、hIL−5のようなヒトタンパク質は、hIL−5のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにFc部分と融合されてきた(Bennettら、J.Molecular Recognition 8:52−58(1995);Johansonら、J.Biol.Chem.270:9459−9471(1995)を参照のこと)。
、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、および97Ruが挙げられる。
ンパク質としては、例えば、毒素(例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素);タンパク質(例えば、腫瘍壊死因子、a−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス剤(例えば、TNF−α、TNF−β、AIM I(国際公開第WO97/33899号を参照のこと)、AIM II(国際公開第WO97/34911号を参照のこと)、Fasリガンド(Takahashiら、Int.Immunol.6:1567−1574(1994))、VEGI(国際公開第WO99/23105号を参照のこと))、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬(例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン);または生物学的応答改変剤(例えばリンホカイン、インターロイキン−1(「IL−1」)、インターロイキン−2(「IL−2」)、インターロイキン−6(「IL−6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM−CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)、または他の増殖因子など)、が挙げられ得る。
Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、243−56頁(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery(第二版)、Robinsonら(編)、623−53頁(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」、Monoclonal Antibodies ’84:Biological And Clinical Applications、Pincheraら(編)、475−506頁(1985);「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら(編)、303−16頁(Academic Press 1985)、およびThorpeら、「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody−Toxin Conjugates」、Immunol.Rev.62:119−58(1982)を参照のこと。
本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には
、特定の細胞型の分化および/または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス(すなわち、プレート)に付着した抗体を用いる「パンニング」、ならびにフローサイトメトリー(例えば、米国特許第5,985,660号;およびMorrisonら、Cell,96:737−49(1999)を参照のこと)が挙げられる。
本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的アッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使用する、少し例を挙げると、BIAcore分析(例えば、実施例33を参照)、FACS(蛍光活性化細胞分離装置)分析、免疫蛍光検査、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である(例えば、Ausubelら(編)、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley&Sons Inc.,New Yorkを参照のこと。これはその全体が本明細書中で参考として援用される)。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単に記載される(しかし限定として意図されない)。
X−100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム(pH7.2)、1%Trasylol)のような、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼインヒビター(例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム)を補充した溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、4℃である時間(例えば、1〜4時間)インキュベートする工程、プロテインAおよび/またはプロテインGのセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約1時間以上、4℃でインキュベートする工程、ビーズを溶解緩衝液で洗浄する工程およびビーズをSDS/サンプル緩衝液中に再懸濁する工程、を包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原に対する抗体の結合を増加し、そしてバックグラウンドを減少する(例えば、セファロースビーズとともに細胞溶解物を予め洗浄する)ように改変され得るパラメータに関して、よく知っている。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら(編)、1994、Current Protocols in Molecular Biology、Vol.1、John Wiley&Sons,Inc.,New York(10.16.1)を参照のこと。
Sons,Inc.,New York,11.2.1を参照のこと。
定化されたVEGF−2を有するチップへの抗体の結合およびこのチップからの解離を分析する工程を包含する。
本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を、1つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体(本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む)ならびに本発明の抗体をコードする核酸(本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む)が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および/または活性に関連した疾患、障害または状態(本明細書中に記載する任意の1つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない)を処置、阻害または予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および/または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および/または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
−8Mより小さい解離定数すなわちKdを有する結合親和性が挙げられる。なおさらに好ましい結合親和性としては、5×10−9M、10−9M、5×10−10M、10−10M、5×10−11M、10−11M、5×10−12M、10−12M、5×10−13M、10−13M、5×10−14M、10−14M、5×10−15M、または10−15Mより小さい解離定数すなわちKdを有する結合親和性が挙げられる。
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および/または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の多数の方法のいずれかにより(例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することにより(例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター(米国特許第4,980,286号を参照のこと)を用いた感染により)、あるいは、裸のDNAの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃;Biolistic、Dupont)の使用により、あるいは脂質もしくは細胞表面のレセプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェクトすることにより、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドとそれを結合させて投与することにより(例えば、WuおよびWu,J.Biol.Chem.262:4429−4432(1987)を参照のこと)(レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る)達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック(fusogenic)ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る(例えば、PCT公開第WO92/06180号;同第WO92/22635号;同第WO92/20316号;同第WO93/14188号、同第WO93/20221号を参照のこと)。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞DNA中に組み込まれ得る(KollerおよびSmithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932−8935(1989);Zijlstraら,Nature 342:435−438(1989))。
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら,Science 252:431−434(1991);Rosenfeldら,Cell 68:143−155(1992);Mastrangeliら,J.Clin.Invest.91:225−234(1993);PCT公開第WO94/12649号;およびWangら,Gene Therapy 2:775−783(1995)に見出され得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビトロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および/または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る(例えば、PCT公開第WO94/08598号:StempleおよびAnderson,Cell 71:973−985(1992);Rheinwald,Meth.Cell Bio.21A:229(1980);ならびにPittelkowおよびScott,Mayo Clinic Proc.61:771(1986)を参照のこと)。
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および/または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術(ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない)を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養中において増殖され、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましくは本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される(例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない)。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
ルにより容易にされ得る)により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
Controlled Release,LangerおよびWise(編),CRC
Pres.,Boca Raton,Florida(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,SmolenおよびBall(編),Wiley,New York(1984);RangerおよびPeppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)を参照のこと;Levyら,Science 228:190(1985);Duringら,Ann.Neurol.25:351(1989);Howardら,J.Neurosurg.71:105(1989)もまた参照のこと)。さらに別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、僅かな全身用量しか必要としない(例えば、Goodson,Medical Applications of Controlled Release,(前出),第2巻,115〜138頁(1984)を参照のこと)。
により、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること(例えば、Joliotら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864−1868(1991)を参照のこと)などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞DNA内に組み込まれ得る。
は障害の抑制および予防)において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイを、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外插され得る。
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およびそのアナログを、診断目的のために使用して、本発明のポリペプチドの異常な発現および/または活性に関連する疾患、障害および/または状態を検出、診断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出を提供し、これは、(a)目的のポリペプチドに特異的な1つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および(b)この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
))が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識(例えば、グルコースオキシダーゼ);放射性同位体(例えば、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)、およびテクネチウム(99Tc));発光標識(例えば、ルミノール);ならびに蛍光標識(例えば、フルオレセインおよびローダミン)、ならびにビオチンが挙げられる。
,050号)。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断層撮影法を用いて患者(patent)から検出される。さらに別の実施形態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像(MRI)を用いて患者から検出される。
本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。1つの実施形態においては、キットは、1以上の容器中に、本発明の抗体(好ましくは精製された抗体)を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態においては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合を検出するための手段を備える(例えば、この抗体は、検出可能な基質(例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物)と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第二の抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る)。
、この固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
attachment)(代表的には、遊離アミン基を介する)が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
れかである。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
(実施例1)
(ヒト組織および乳癌細胞株におけるVEGF−2の発現パターン)
ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織およびヒト組織中の乳癌細胞株におけるVEGF−2の発現のレベルを試験した。全細胞RNAサンプルを、RNAzolTMBシステム(Biotecx Laboratories,Inc.)を用いて単離した。各々の乳癌組織および特定化された細胞株から単離された約10mgの全RNAを、1%アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。標識反応は、50ngのDNAフラグメントを用いてStratagene Prime−Itキットに従って行った。標識したDNAを、5Prime÷3Prime,Inc(Boul
der,CO)のSelect−G−50カラムを用いて精製した。次いで、フィルターを、0.5M NaPO4および7%SDS中1,000,000cpm/mlの放射性標識した全長VEGF−2遺伝子で、65℃にて一晩ハイブリダイズした。0.5×SSC、0.1%SDSによる室温での2回の洗浄および60℃での2回の洗浄後、次いで、フィルターを、増感スクリーンを用いて−70℃で、一晩露光した。1.6Kdのメッセージが、2つの乳癌細胞株において観察された。図5、レーン4は、極めて腫瘍形成性の細胞株を示し、これは、増殖についてエストロゲン非依存である。
(インビトロ転写および翻訳による短縮形態のVEGF−2(配列番号4)の発現)
VEGF−2 cDNAをインビトロで転写して、そして翻訳し、短縮形態のVEGF−2および部分VEGF−2 cDNAによりコードされる翻訳可能なポリペプチドの大きさを決定した。pBluescript SKベクター中のVEGF−2の2つの挿入物を、以下の3対のプライマーを用いてPCRにより増幅した;1)M13逆方向および順方向プライマー;2)M13逆方向プライマーおよびVEGFプライマーF4;ならびに3)M13逆方向プライマーおよびVEGFプライマーF5。これらのプライマーの配列は、以下のとおりである。
0)を使用して行った。詳細には、その反応は、12.5FlのTNTウサギ網状赤血球溶解物、2FlのTNT反応緩衝液、1FlのT3ポリメラーゼ、1Flの1mMのアミノ酸混合物(メチオニン非含有)、4Flの35S−メチオニン(>1000Ci/mmol、10mCi/ml)、1Flの40U/μl;RNasinリボヌクレアーゼインヒビター、0.5または1mgのPCR産物を含む。ヌクレアーゼを含まないH2Oを添加して、容量を25Flに合わせた。反応を、30℃で2時間インキュベートした。5μlの反応産物を、4〜20%の勾配SDS−PAGEゲル上で分析した。25%イソプロパノールおよび10%酢酸で固定した後、ゲルを乾燥し、そして70℃で一晩、X線フィルムに露光した。
(バキュロウイルス発現系を使用するVEGF−2のクローニングおよび発現)
N末端の46アミノ酸を含まないVEGF−2タンパク質をコードするDNA配列(ATCC番号97149を参照のこと)を、その遺伝子の5’および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
TGG TCT(配列番号13)を有し、そして制限酵素XbaIに対する切断部位およびVEGF−2の3’配列(終止コドンおよび終止コドン前の15ヌクレオチド配列を含む)に相補的な18ヌクレオチドを含む。
Insect Cell Culture Procedures」Texas Agricultural Experimental Station Bulletin
No.1555(1987)を参照のこと)を使用するVEGF−2タンパク質の発現のために使用する。この発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、続いて制限エンドヌクレアーゼBamHI、Sma1、XbaI、BglIIおよびAsp718についての認識部位を含む。制限エンドヌクレアーゼXho1についての部位は、BamH1部位の上流に位置する。Xho1とBamH1との間の配列は、PAcGp67A(テープ上で静的な)ベクターにおける配列と同じである。シミアンウイルス(SV)40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子が、ポリヘドリンプロモーターと同じ方向で挿入され、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルがこれに続く。ポリヘドリン配列には、同時トランスフェクトされた野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列が両側で隣接される。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1に代わって使用され得る(例えば、pAc373、pVL941およびpAcIM1(Luckow,V.A.およびSummers,M.D.,Virology 170:31−39(1989))。
(COS細胞における組換えVEGF−2の発現)
プラスミドVEGF−2−HAの発現は、ベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)に由来し、このベクターpcDNAI/Ampは以下を含む:(1)SV40複製起点、(2)アンピシリン耐性遺伝子、(3)E.coli複製起点、(4)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位。VEGF−2前駆体全体およびその3’末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、このベクターのポリリンカー領域内にクローン化した。従って、組換えタンパク質の発現は、CMVプロモーター下で指向される。HAタグは、(Wilsonら、Cell 37:767(1984))に以前に記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質
へのHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いた、組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構築ストラテジーは、以下に記載の通りである。
3’配列(CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CAT TTG TGG TCT 3’)(配列番号15)は、XbaI部位、HAタグ、XhoI部位、およびVEGF−2コード配列の最後の15のヌクレオチド(終止コドンは含んでいない)に対する相補配列を含む。
(血管内皮細胞の増殖に対する部分精製したVEGF−2タンパク質の効果)
1日目に、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、4%ウシ胎児血清(FBS)、16ユニット/mlのヘパリン、および50ユニット/mlの内皮細胞増殖補完物(ECGS、Biotechnique,Inc.)を含むM199培地中、2〜5×104細胞/35mmディッシュの密度で播種した。2日目に、培地を、10%FBS、8ユニット/mlのヘパリンを含む、M199で置換した。最初の45アミノ酸残基を欠く配列番号2のVEGF−2タンパク質、(VEGF)および塩基性FGF(bFGF)を、示した濃度で添加した。4日目および6日目に、培地を置換した。8日目に、細胞数を、Coulter Counterで決定した(図12を参照のこと)。
えば、VEGF−2抗体)の効果を試験し得る。
1日目に、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、4%ウシ胎児血清(FBS)、16単位/mlのヘパリン、50単位/mlの内皮細胞増殖補充物(ECGS,Biotechnique,Inc.)を含むM199培地に2〜5×104細胞/35mmディッシュの密度で播種した。2日目に、培地を、10%FBS、8単位/mlのヘパリンを含むM199と置き換えた。最初の45アミノ酸残基を除いた配列番号2の精製VEGF−2タンパク質をこの時点で培地に添加した。4日目および6日目に、培地を新鮮な培地および補充物と置き換えた。8日目に、Coulter Counterで細胞数を決定した(図13を参照のこと)。
線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得られた組織を組織培養培地中に置き、そして小片に分ける。組織の小塊を、組織培養フラスコの湿った表面上に置き、各フラスコ中におよそ10片を置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉し、そして室温に一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを反転させ、そして組織塊をフラスコの底に付着したままにし、そして新鮮な培地(例えば、10% FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するHamのF12培地)を添加する。次いで、これを37℃でおよそ1週間インキュベートする。この時点で新鮮な培地を添加し、その後数日ごとに取り替える。さらに2週間の培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケールアップ(scale)する。
プロデューサー細胞の10cmプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポア(millipore)フィルターを通して濾過して、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去し、そして直ちにプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー(例えば、neo、またはhis)を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。
(実験設計)
ノーザンブロット分析を、ヒト胎児組織および成体組織におけるVEGF−2 mRNAの発現のレベルを試験するために実行した。VEGF−2タンパク質の完全ヌクレオチド配列を含むcDNAプローブを、製造者の指示書に従って、rediprimeoDNA標識システム(Amersham Life Science)を用いて32Pで標識した。標識後、このプローブを、製造者のプロトコール番号PT1200−1に従って、CHROMA SPIN−100*カラム(Clontech Laboratories,Inc.)を使用して精製した。次いで、精製した標識化プローブを、VEGF−2
mRNAについて種々のヒト組織を試験するために使用した。
VEGF−2 mRNAの発現は、血管平滑筋およびいくつかの高度に血管化された組織において豊富である。VEGF−2は、造血活性または血管形成活性と関連する組織、すなわち胎児腎臓、胎児肺、骨髄、胎盤、脾臓および肺組織において有意により高いレベルで発現される。VEGF−2の発現レベルは、成体腎臓、胎児肝臓、成体肝臓、睾丸において低く;そして胎児脳および成体脳においてはほとんど検出不可能である(図14A〜Bを参照のこと)。
生物学的に活性なVFGF−2ポリペプチドを同定および分析するために、VEGF−2の欠失変異体のパネルを、発現ベクターpHE4aを使用して構築した。
E.coliタンパク質発現ベクターpHE4へのVEGF−2 T103−L215
(図1または配列番号18のアミノ酸103〜215)の、ポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびサブクローニングを可能にするために、VEGF−2の所望の領域に相補的な2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した:
5’プライマー(NdeI/STARTおよびコード配列の18ヌクレオチド):
5’−GCA GCA CAT ATG ACA GAA GAG ACT ATA AAA−3’(配列番号19)
3’−プライマー(Asp718、STOP、およびコード配列の15ヌクレオチド):
5’−GCA GCA GGT ACC TCA CAG TTT AGA CAT GCA−3’(配列番号20)
上記の5’プライマー(配列番号19)は、NdeI制限部位を組込み、そして上記の3’プライマー(配列番号20)は、Asp718制限部位を組込む。この5’プライマー(配列番号19)はまた、VEGF−2コード領域に隣接し、そしてVEGF−2コード領域とインフレームであるATG配列を含み、E.coliにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にし、一方3’プライマー(配列番号20)は、VEGF−2コード領域に隣接し、そしてVEGF−2コード領域とインフレームである1つの終止コドン(好ましくは、E.coliで利用されるコドン)を含み、これはE.coliにおける正確な翻訳の終結を確かにする。
E.coliタンパク質発現ベクターpHE4へのVEGF−2 T103−R227(図1または配列番号18のアミノ酸103〜227)の、ポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびサブクローニングを可能にするために、VEGF−2の所望の領域に相補的な2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した:
5’プライマー(NdeI/STARTおよびコード配列の18ヌクレオチド):
5’−GCA GCA CAT ATG ACA GAA GAG ACT ATA AAA−3’(配列番号19)
3’−プライマー(Asp718、STOP、およびコード配列の15ヌクレオチド):
5’−GCA GCA GGT ACC TCA ACG TCT AAT AAT GGA−3’(配列番号21)
上記のプライマーの場合、NdeIまたはAsp718制限部位は、5’プライマーおよび3’プライマーにそれぞれ組込まれていた。この5’プライマー(配列番号19)はまた、VEGF−2コード領域に隣接し、そしてVEGF−2コード領域とインフレームであるATG配列を含み、E.coliにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にし、一方3’プライマー(配列番号21)は、VEGF−2コード領域に隣接し、そしてVEGF−2コード領域とインフレームである1つの終止コドン(好ましくは、E.coliで利用されるコドン)を含み、これはE.coliにおける正確な翻訳の終止を確かにする。
タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。
この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2 GPを、バキュロウイルスリーダーおよびSummersら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bulletin番号1555(1987)に記載されるような標準的な方法を用いて、N−末端およびC−末端欠失させたVEGF−2タンパク質(図1または配列番号18のアミノ酸103〜215)をコードするクローン化されたDNAをバキュロウイルス中に挿入するために使用して、N−末端およびC−末端欠失させたVEGF−2タンパク質を発現させる。この発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスgp67タンパク質の分泌シグナルペプチド(リーダー)ならびにBamHI、XbaI、およびAsp718のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス40(「SV40」)のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同じ方向の弱いDrosophilaプロモーターの制御下にある、E.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介の相同組換えのために両側がウイルス配列で隣接され、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。
図1における、N−末端の102アミノ酸を有さず、かつC−末端の192アミノ酸を有さないVEGF−2タンパク質(すなわち、配列番号18のアミノ酸103〜227)をコードするcDNA配列を、この遺伝子の5’配列および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター(LTR)(Cullenら、Molecular and Cellular Biology,438〜447(1985年3月))およびCMVエンハンサー(Boshartら、Cell 41:521〜530(1985))のフラグメントを含む。マルチプルクローニングサイト(例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、およびAsp718を有する)は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。このベクターはさらに、ラ
ットプレプロインシュリン遺伝子の3Nイントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルを含む。
41:521〜530(1985))から単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位である:BamHI、PvuII、およびNruI。これらのクローニング部位の後では、プラスミドは、3つすべてのリーディングフレームにおける翻訳終止コドン、続いて3Nイントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含む。他の高度に効率的なプロモーター(例えば、ヒトb−アクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス(例えば、HIVおよびHTLVI)由来の長末端反復)もまた、発現のために使用され得る。mRNAのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン遺伝子またはグロビン遺伝子由来の他のシグナルが、同様に使用され得る。
TCG CTG GGC TTC TTC TCT GTG GCG TGT TCT
CTG CTC G−3’(配列番号26))は、Klenowで平滑化されたBamHI部位および開始コドンから開始するVEGF−2コード配列の40ヌクレオチドを含む;3’プライマー(5’−GCA GGG TAC GGA TCC TAG ATT
AGC TCA TTT GTG GTC TTT−3’(配列番号27))は、BamHI部位および終止コドンを含まないVEGF−2コード配列の16ヌクレオチドを含む。
プラスミドpC4Sigは、ヒトIgG Fc部分の配列およびタンパク質シグナル配列を含むプラスミドpC4(受託番号209646)である。
5’プライマー(BamHIおよび26ntのコード配列):
5’−GCA GCA GGA TCC ACA GAA GAG ACT ATA AAA TTT GCT GC−3’(配列番号34):
3’プライマー(XbaI、停止、および15ntのコード配列):
5’−CGT CGT TCT AGA TCA CAG TTT AGA CAT GCA TCG GCA G−3’(配列番号35)。
VEGF−2 T103−L215(図1または配列番号18におけるアミノ酸103〜227)のポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびpC4Sigへのサブクローニングを可能にするために、VEGF−2の所望される領域に相補的な2つのオリゴヌクレオチドプライマー(以下の塩基配列を有する)を合成した:
5’プライマー(BamHIおよび26ntのコード配列):
5’−GCA GCA GGA TCC ACA GAA GAG ACT ATA AAA TTT GCT GC−3’(配列番号34):
3’プライマー(XbaI、停止、および21ntのコード配列):
5’−GCA GCA TCT AGA TCA ACG TCT AAT AAT GGA ATG AAC−3’(配列番号25)。
amHI/XbaIで消化したpC4Sigベクターへサブクローニングした。
発現ベクターpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター(LTR)(Cullenら、Molecular and Cellular Biology,438−447(1985年3月))およびCMVエンハンサーのフラグメント(Boshartら、Cell 41:521−530(1985))を含む。マルチクローニング部位(例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaIおよびAsp718を有する)は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。このベクターは、さらにラットプレプロインシュリン遺伝子の3Nイントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルを含む。
3’プライマー 5’−GAC TGG TAC CTT ATC ACA TAA AAT CTT CCT GAG CC−3’(配列番号29)。
この例示的実施例では、C末端欠失VEGF−2 M1−D311タンパク質(図1または配列番号18におけるアミノ酸1〜311)をコードするクローン化DNAを、このC末端欠失VEGF−2タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターpC4へ挿入する。
3’プライマー 5’−GAC TGG TAC CTT ATC AGT CTA GTT CTT TGT GGG G−3’(配列番号31)。
この例示的実施例では、C末端欠失VEGF−2 M1−Q367タンパク質(配列番号18におけるアミノ酸1〜367)をコードするクローン化DNAを、このC末端欠失VEGF−2タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターpC4へ挿入する。
3’プライマー 5’−GAC TGG TAC CTC ATT ACT GTG GAC TTT CTG TAC ATT C−3’(配列番号33)。
(実験設計)
例えば、実施例4において作製された構築物からのVEGF−2−HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowおよび共同研究者ら(Antibodies:A La
boratory Manual、第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,New York(1988))に記載される方法を用いて、放射性標識化および免疫沈降によって検出した。この目的を達するために、トランスフェクションの2日後に、細胞を35Sシステインを含む培地中で8時間インキュベーションすることにより標識した。Wilsonおよび共同研究者ら(前出)によって記載されるように、細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、次いで界面活性剤含有RIPA緩衝液(150mM NaCl、1%
NP−40、0.1% SDS、1% NP−40、0.5% DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶解した。タンパク質を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈殿させた。次いで、沈殿させたタンパク質をSDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析した。
図16A〜Bに示すように、pcDNA1 VEGF−2HAでトランスフェクトした細胞は、56kdおよび30kdタンパク質を分泌した。この56kdタンパク質(30kdタンパク質ではなく)はまた、細胞溶解物において検出され得るが、コントロールでは検出されない。このことは、30kdタンパク質が56kdタンパク質の切断から生じるようであることを示唆する。HAタグは、VEGF−2のC末端にあるので、この30kdタンパク質は切断されたタンパク質のC末端部分に相当しなければならないが、切断されたタンパク質のN末端部分は、免疫沈降によって検出されない。これらのデータは、哺乳動物細胞において発現されるVEGF−2タンパク質は、分泌されそしてプロセシングされることを示す。
(実験設計)
VEGF−2の発現は、高度に血管化された組織において豊富である。従って、内皮細胞のいくつかの型の増殖の調節におけるVEGF−2の役割を試験した。
増殖因子の有糸分裂活性の評価のために、電子カップリング試薬PMS(フェナジンメトサルフェート)と共に比色定量MTS(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)2H−テトラゾリウム)アッセイを行った(CellTiter96 AQ、Promega)。細胞を、96ウェルプレート(5,000細胞/ウェル)にて0.1mLの血清を補充した培地に播種し、そして一晩付着させた。0.5%FBS中で12時間の血清飢餓後、ヘパリン(8U/ml)を有するかまたは有さずに、条件(0.5%FBS中、bFGF、VEGF165またはVEGF−2)をウェルに48時間添加した。20mgのMTS/PMS混合物(1:0.05)を、1ウェルあたり加え、37℃で1時間インキュベートさせて、その後、ELISAプレートリーダーにおいて490nmでの吸光度を測定した。コントロールウェル(いくつかの培地、無細胞)からのバックグラウンド吸光度を差し引いて、そして7つのウェルについて各条件を並行して行った。Leakら、In Vitro Cell.Dev.Biol.30A:512−518(1994)を参照のこと。
VEGF−2は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および皮膚微小血管内皮細胞の増殖をわずかに刺激した(図17および18)。VEGF−2の刺激効果は、子宮内膜内皮細胞および微小血管内皮細胞の増殖においてより明白である(図19)。子宮内膜内皮細胞(HEEC)は、VEGF−2に対する最高の応答(微小血管内皮細胞に対するVEGFの効果の96%)を示した。VEGF−2に対する微小血管内皮細胞(HMEC)の応
答は、VEGFと比べると73%であった。VEGF−2に対するHUVECおよびBAEC(ウシ大動脈内皮細胞)の応答は、それぞれかなり低く10%および7%であった。VEGF−2タンパク質の活性は、異なる精製の実行の間で変化し、HUVEC増殖に対する特定のバッチの刺激効果は、他のバッチの刺激効果よりも顕著により高かった。
VEGF−2発現は、血管平滑筋細胞において高い。平滑筋は、再狭窄のような血管疾患についての重要な治療標的である。平滑筋細胞に対するVEGF−2の潜在的効果を評価するために、ヒト大動脈平滑筋細胞(HAoSMC)増殖に対するVEGF−2の効果を試験した。
HAoSMC増殖を、例えばBrdUrdの取り込みによって測定し得る。簡単に言えば、4−チャンバスライド上で増殖させたサブコンフルエントな休止細胞を、CRPまたはFITC標識化AT2−3LPでトランスフェクトする。次いで、細胞を10%仔ウシ血清および6mg/ml BrdUrdでパルスする。24時間後、免疫細胞化学を、BrdUrd Staining Kit(Zymed Laboratories)を用いることによって行う。簡単には、細胞を、変性溶液への曝露後、ビオチン化マウス抗BrdUrd抗体と共に4℃で2時間インキュベートし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジンと共にインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、細胞を、顕微鏡試験のためにマウントし、そしてBrdUrd陽性細胞を計数する。BrdUrd指数を、総細胞数に対するBrdUrd陽性細胞の割合として計算する。さらに、BrdUrd染色(核)およびFITC取り込み(細胞質)の同時検出を、明視野照明および暗視野UV蛍光照明の同時使用によって個々の細胞について行う。Hayashidaら、J.Biol.Chem.6;271(36):21985−21992(1996)を参照のこと。
VEGF−2は、PDGFによって誘導された血管平滑筋細胞の増殖に対して阻害効果を有するが、ウシ胎仔血清(FBS)によって誘導された血管平滑筋細胞の増殖に対して阻害効果を有さない(図20)。
内皮細胞移動は、新脈管形成に関与する重要な工程である。
本実施例を用いて、VEGF−2がリンパ内皮細胞移動(lymphatic endothelial cell migration)を刺激し得るという可能性を探求する。現在のところ、このようなモデルの刊行された報告は存在しない。しかし、本発明者らは、血管内皮細胞移動のモデルを、本質的に以下のように、リンパ内皮細胞での使用に適応させる:
内皮細胞移動アッセイを48ウェル微量走化性(microchemotaxis)チ
ャンバを用いて行う(Neuroprobe Inc.,Cabin John,MD;Falk,W.,Goodwin,R.H.J.,およびLeonard,E.J.「A
48 well micro chemotaxis assembly for rapid and accurate measurement of leukocyte migration.」J.Immunological Methods 1980;33:239−247)。8μmの孔径を有するポリビニルピロリドン非含有ポリカーボネートフィルター(Nucleopore Corp.Cambridge,MA)を、0.1%ゼラチンで、少なくとも6時間室温でコートし、そして滅菌空気下で乾燥する。試験物質を、0.25%ウシ血清アルブミン(BSA)を補充したM199中で適切な濃度まで希釈し、そして25μlの最終希釈液を、改変したボイデン装置の下部チャンバに置く。サブコンフルエントな初期の継代(2〜6)のHUVECおよびBMEC培養物を、洗浄し、そして細胞脱離を達成するのに必要とされる最小の時間でトリプシン処理する。下部チャンバと上部チャンバの間にフィルターを置いた後、1%FBSを含む50μlのM199に懸濁した2.5×105の細胞を、この上部コンパートメントに播種する。次いでこの装置を、細胞移動を可能にするために5%CO2を含む加湿したチャンバ中で37℃で5時間インキュベートする。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、そして非移動細胞を有するフィルターの上側を、ラバーポリスマンでスクラップする。このフィルターをメタノールで固定し、そしてGiemsa溶液(Diff−Quick,Baxter,McGraw Park,IL)で染色する。移動を、各ウェル中の3つの無作為の高倍率視野(40×)の細胞を計数することによって定量し、そして全てのグループを4連で行う。
43ウェル微量走化性チャンバを用いてHUVEC移動を試験するアッセイにおいて、VEGF−2は、HUVECの移動を刺激し得た(図21A〜B)。
血管内皮により放出される一酸化窒素は、血管内皮弛緩のメディエータ−であると考えられている。VEGF−1は、VEGF−1に応答した内皮細胞による一酸化窒素の生成を誘導することが実証されている。結果として、VEGF−2活性を、VEGF−2に応答した内皮細胞による一酸化窒素の生成を決定することによってアッセイし得る。
一酸化窒素を、24時間の飢餓および引き続く4時間の様々なレベルのVEGF−1およびVEGF−2への曝露の後のコンフルエントな微小血管内皮細胞の96ウェルプレートにおいて測定する。培地における一酸化窒素を、Griess試薬の使用によって決定し、硝酸レダクターゼによる一酸化窒素由来硝酸の還元後の総亜硝酸塩量を測定する。一酸化窒素放出に対するVEGF−2の効果を、HUVECにおいて試験した。
および500nmol/L)をKIおよびH2SO4を含む検量液に添加することによって得た。NOに対するIso−NO電極の特異性は、真の(authentic)NOガス(1050)からのNOの測定によってあらかじめ決定した。培養培地を除去し、そしてHUVECをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄した。次いで、細胞を、6ウェルプレート中の5mlの濾過したクレブス−ヘンゼライト溶液に添加し、そして細胞プレートを、温度を37℃で維持するためにスライドウォーマー(Lab Line Instruments Inc.)上で保持した。NOセンサープローブを、異なる条件を加える前にウェル中へ垂直に挿入した(溶液の表面の2mm下で電極のチップを保持する)。S−ニトロソアセチルペニシラミン(SNAP)を陽性コントロールとして用いた。放出したNOの量を、1×106個の内皮細胞あたりのピコモル濃度として表わした。報告された全ての値は、各グループにおける4〜6回の測定(細胞培養ウェルの数)の平均であった。Leakら、Biochem.and Biophys.Res.Comm.217:96−105(1995)を参照のこと。
VEGF−2は、VEGFより高いレベルにまで、HUVEC(図22)での一酸化窒素放出を刺激することが可能であった。このことは、VEGF−2が血管透過性および脈管拡張を改変し得ることを示唆した。
新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化に顕著な索形成である。このバイオアッセイは、微小血管内皮細胞がインビトロで培養した場合に毛細管様構造(中空構造)を形成する能力を測定する。
CADMEC(微小血管内皮細胞)をCell Applications Inc.から増殖(継代2)細胞として購入し、そしてCell Applications’ CADMEC増殖培地中で培養し、そして継代5で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、48ウェル細胞培養プレートのウェルをCell Applications’ 付着因子培地(200ml/ウェル)を30分間、37℃でコーティングする。CADMECをコーティングしたウェルに7,500細胞/ウェルで播種し、増殖培地中で一晩培養する。次いで、増殖培地を、コントロール緩衝液または本発明のタンパク質(0.1〜100ng/ml)を含有する300mgのCell Applications’ 索形成培地で置き換え、そして細胞をさらに48時間培養する。毛細管様索の数および長さをBoeckeler VIA−170ビデオ画像分析機の使用によって定量する。全てのアッセイを3連で行う。
VEGF−2は、内皮細胞増殖もまた刺激するIFNaに類似の索形成を阻害することが観察された(図23)。この阻害効果は、索形成プロセスと相互に両立しない内皮細胞増殖の二次的効果であり得る。
ニワトリ漿尿膜(CAM)は、新脈管形成を試験するために十分確立された系である。CAMにおける血管形成は、容易に視覚で確認でき、かつ定量化し得る。VEGF−2がCAMにおいて新脈管形成を刺激し得る能力を試験した。
(胚)
白色レグホーンニワトリ(Gallus gallus)の受精卵および日本ウズラ(Coturnix coturnix)の受精卵を、37.8℃および湿度80%でインキュベートした。16日齢ニワトリの分化したCAMおよび13日齢のウズラ胚を、以下の方法を用いて研究した。
発生4日目に、鶏卵の卵殻に窓を作製した。胚を正常な発生についてチェックし、そして卵をセロテープ(登録商標)で塞いだ。それらを、13日目までさらにインキュベートした。Thermanoxカバースリップ(Nunc,Naperville,IL)を約5mm直径のディスクに切った。滅菌かつ無塩の増殖因子を蒸留水に溶解し、そして約3.3mg/5mlをディスク上にピペットで移した。風乾後、逆にしたディスクをCAMにアプライした。3日後、標本を3%グルタルアルデヒドおよび2%ホルムアミドで固定し、そして0.12M カコジル酸ナトリウム緩衝液でリンスした。それらを実体顕微鏡[Wild
M8]で撮影し、そして上記のように準超薄切片化および超薄切片化するために包埋した。コントロールをキャリアディスク単独で行った。
このデータは、VEGF−2が未処理コントロールと比較して、CAMアッセイにおいて9倍新脈管形成を刺激し得ることを実証する。しかし、この刺激は、VEGF刺激のレベルのわずか45%である(図24)。
(実験計画)
タンパク質活性を試験するため、新脈管形成のためのインビボモデルを確立するために、マウスおよびラットに、20mgのBSA(陰性コントロール)および1mgのbFGFおよび0.5mgのVEGF−1(陽性コントロール)のいずれかを含むメチルセルロースディスクを皮下移植した。
両方のVEGFタンパク質は、肉眼評価によって約2という因子によってマトリゲル細胞性を増強するようであった。
(実験計画)
VEGF−2の虚血に対するインビボ効果を研究するために、ウサギ後肢虚血モデルを、以前に記載された(Takeshita,S.ら、Am.J.Pathol 147:1649−1660(1995))ように1つの大腿動脈の外科的切除によって作製した。大腿動脈の切除は、外腸骨動脈の血栓および閉塞の逆行性増殖を生じる。結論として、虚血四肢に対する血流は、内腸骨動脈に由来する側副血管に依存する(Takeshita,S.ら、Am.J.Pathol 147:1649−1660(1995))。10日の間隔によって、ウサギの術後回復および内因性側副血管の発生を可能にした。手術(0日目)して後10日に、基底血管造影を行った後、虚血四肢の内腸骨動脈を、記載(Riessen,R.ら、Hum.Gene Ther.4:749−758(1993);Leclerc,G.ら、J.Clin.Invest.90:936−944(1992))のように、ヒドロゲルコーティングしたバルーンカテーテルを使用して、動脈遺伝子移入技術により500mgの裸のVEGF−2発現プラスミドでトランスフェクトした。VEGF−2を処置において使用した場合、500mgのVEGF−2タンパク質またはコントロールの単回ボーラスを、1分間にわたって、注入カテーテルを用いて虚血四肢の内腸骨動脈に送達した。30日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギにおいて測定した。
VEGF−2タンパク質(図25A)および裸の発現プラスミド(図25B)の両方は、虚血四肢において以下のパラメーターを回復し得た。血流の回復(血管造影スコア)は、500mgのタンパク質によるものと比較した場合、500mgのプラスミドの投与によってわずかに大きかったようである(図25C)。回復の程度は、別個の試験のVEGFによる程度に匹敵する(データは示さず)。血管拡張薬は、同じ効果を達成できなかった。このことは、血流の回復が、単に血管拡張効果に起因するのではないことを示唆する。
虚血四肢の収縮圧:正常四肢の収縮圧の血圧比。
静止FL:非拡張状態の間の血流
最大FL:十分に拡張した状態の間の血流(また、血管量の間接測定)
血流予備能は、最大FL:静止FLの比を反映する。
これは、側副血管の血管造影によって測定される。スコアは、交差する不透過性動脈をウサギ大腿の総数mで除算した、重複グリッドの円の割合によって決定される。
側副毛細管の数は、後肢から採取した切片を光学顕微鏡で検鏡して決定した。
上記のように、VEGF−2は、血管内皮細胞拡張のメディエータであるNO放出を刺激し得る。血管内皮細胞の拡張は、血圧を低下する際に重要であるため、VEGF−2が自然発症高血圧ラット(SHR)における血圧に影響を及ぼす能力を試験した。VEGF−2は、拡張期血圧の用量依存性低下を引き起こした(図26aおよびb)。300mg/kgの用量を投与した場合、VEGF−2の用量の増加に伴い、拡張期血圧が確実に低下し、これは統計学的有意に達した。この用量において観察した変化は、アセチルコリンでみられた変化と異ならなかった(0.5mg/kg)。平均動脈圧(MAP)の減少もまた観察した(図26cおよびd)。VEGF−2(300mg/kg)およびアセチルコリンは、正常レベルに対してこれらのSHR動物のMAPを低下させた。
(実験計画)
評価パラメーターは、皮膚血流、皮膚温度、および第VIII因子、免疫組織化学的ま
たは内皮のアルカリホスファターゼ反応を含む。皮膚虚血の間のVEGF−2発現は、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて研究する。
a)虚血皮膚
b)虚血皮膚創傷
c)通常創傷
実験プロトコルは、以下を包含する:
a)3×4cm(単一の有茎完全厚ランダム皮膚弁)を作製(動物の下部背上の筋皮弁)
b)虚血皮膚における切除による創傷(直径4〜6mm)(皮膚弁)
c)以下の種々の投薬範囲での切除による創傷のVEGF−2での局所的処置(創傷後0、1、2、3、4日目):1mg〜100mg
d)組織学的研究、免疫組織化学的研究およびインサイチュ研究のための創傷後3、5、7、10、14および21日目での創傷組織採取。
VEGF−2を用いた脈管形成治療を、新規な治療ストラテジーとして開発して、末梢性動脈疾患において虚血周辺の血流の回復を得た。
実験プロトコルは、以下を包含する:
a)大腿動脈の片側を結紮して、後肢の虚血筋肉を作製し、後肢の他方の片側は、コントロールとして用いる。
c)虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、VEGF−2発現および組織学の分析のために1週、2週および3週で採取する。生検もまた、対側性の後肢の正常筋肉の他方の片側で行う。
VEGF−2を、側副血管の発生を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後に新たな血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。VEGF−2発現の改変をインサイチュで調査する。
実験プロトコルは、以下を包含する:
a)心臓を、ラットの左側を開胸して露出させる。直ちに、左冠状動脈を細い(6〜0)縫合糸で閉塞し、そして胸郭を閉じる
b)20mg〜500mgの範囲の投薬量でVEGF−2タンパク質を、2〜4週間の間1週あたり静脈内および/または筋肉内で3回(おそらくそれより多く)送達する
c)外科手術30日後に、心臓を取り出し、そして形態分析およびインサイチュ分析のために薄片化する。
この動物モデルは、VEGF−2の新血管形成に対する効果を示す。
実験プロトコルは、以下を包含する:
a)角膜の中央から間質層へ、1〜1.5mm長の切開を作製する
b)眼の外側角膜に向き合う切開の縁の下にスパチュラを挿入する
c)ポケットを作製する(その基底は、眼の縁から1〜1.5mm)
d)50mg〜500mgのVEGF−2を含むペレットを、ポケット内に配置する
e)VEGF−2処置を20〜500mgの範囲の投薬量で角膜創傷に局所的に適用し得る(毎日処置(daily treatment)を5日間)。
このプロトコルにおいて、VEGF−2ポリペプチドおよび/またはVEGF−2抗体を、以下に記載されるような角膜に挿入されるフィルターディスクを用いて、ラットの角膜に送達する。
無菌角膜フィルターディスクを、標準傾斜カットオフおよび平板化チップの周りの機械傾斜グラウンドを有する滅菌した20Gの注射針を用いて、生物学的に安全なフード下で、0.45μmの細孔サイズのMillipore HAWP01300フィルターからスタンピングする。スタンピングディスクを、24Gスタイレットによって20G注射針から除去する。VEGF−2ポリペプチドおよび/またはVEGF−2抗体溶液を、以下のように滅菌濾過した1×TBS(50mM Tris−HCl pH7.4/150mM NaCl)中で調製する。このコントロール群は、1×TBSまたはフラッグペプチドのみを受ける。
一般的に、体重175〜200gである20匹のSprague Dawleyラットを、これらの実施例のために使用する。手術の日に、それぞれの動物を、ケタミン(50mg/kg im;Phoenix番号NDC 57319−291−02)、キシラジン(10mg/kg im;Phoenix番号NDC57319−326−26)およびアセプロマジン(1.0mg/kg im;Fermenta番号117−531)で麻酔する。ラットを麻酔した後、感覚毛を切り取り、そしてラットに0.5mg/kgの硫酸アトロピン(RBI番号A−105;Lot番号69H0545)を注射する。このラットを、滅菌した包帯で巻く。滅菌したグローブを外科的手順のために使用する。外科的領域(眼および周囲の毛)を、生理食塩水、次いで5%のポビドンヨード(Perdue Frederick番号H8151−K97;Lot番号6H31)で洗浄する。次いで、この眼を、滅菌した生理食塩水で洗浄し、そして2滴の2%リドカインHCl(Phoenix番号NDC−57319−093−05;Lot番号0080991)を眼に滴下する。眼を、生理食塩水で潅漑し、手順の間に乾燥するのを防ぐ。角膜輪部から滅菌した番号15のメスの2mmの刃を用いて切開する。角膜の厚さの約半分を切開する。切開した後、滅菌した顕微手術のハサミを使用して、縁から約0.75mmの切開の点から伸長するポケットを作製する。予浸した(氷上の滅菌したペトリ皿で20μLのそれぞれの試験溶液中で一晩浸す)ディスクを、ディスクの主要な縁が、角膜輪部から1mmとなるようこのポケットに挿入する。
手術の5日後、このラットに、0.5mg/kgのアトロピンを服用させる。散瞳を観察する際、動物を安楽死させる。それぞれのラットの眼を、ImagePro Plus
を用いて4.0倍でデジタル画像化する。表面積(画素)および密度(目的の領域のパーセント)を、フィルターディスクの直下およびどちらかの側の領域で定量化する。9つの表面積測定を、1つの眼あたりで獲得する。平均の脈管形成の表面積をそれぞれの眼に対して獲得する。
(実験計画)
実験プロトコルは、以下を包含する:
1.糖尿病db+/db+ マウスモデル
VEGF−2が治癒プロセスを促進することを決定するために、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを使用する。db+/db+マウスにおける完全厚創傷治癒モデルは、十分に特徴づけられており、臨床的に明らかであり、そして創傷治癒の欠陥の再現可能なモデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ、顆粒形成組織の形成および再上皮形成(re−epithelialization)に依存する(Gartner,M.H.ら、J.Surg.Res.52:389(1992);Greehalgh,D.G.ら、Am.J.Pathol.136:1235(1990))。
Pathol.136:1235−1246(1990))。
遺伝性糖尿病の雌性C57BL/KsJ(db+/db+)マウスおよびそれらの非糖尿病の(db+/+m)ヘテロ接合性同腹仔を本研究に使用した(Jackson Laboratories)。6週齢の動物を購入し、そして研究を開始した時は8週齢であった。動物は、個々に飼育し、そして食物および水を無制限に与えた。全ての操作は、無菌技術を使用して行なった。実験は、Human Genome Sciences,Inc.のInstitutional Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animalsの規則およびガイドラインに従って行なった。
創傷プロトコルは、以前に報告された方法(Tsuboi、R.およびRifkin、D.B.、J.Exp.Med.172:245−251(1990))に従って行なう。手短に言えば、創傷当日に、動物を脱イオン水中に溶解したAvertin(0.01mg/mL)、2,2,2−トリブロモエタノールおよび2−メチル−2−ブタノールの腹腔内注射により麻酔する。動物の背側領域を剃毛し、そして皮膚を、70%エタノール溶液およびヨードで洗浄する。外科手術領域を、創傷の前に滅菌ガーゼを用いて乾燥させる。次いで、全厚8mmの創傷を、Keyらの組織パンチを用いて作製する。創傷後すぐに、周囲の皮膚を創傷の拡大を排除するために、やさしく伸ばす。創傷は、実験の期間中開いたままにする。処置の適用は、創傷の日から、5日間連続で局所的に行なう。処置の前に、創傷を滅菌生理食塩水およびスポンジのガーゼでやさしく洗浄する。
10動物づつの3つのグループ(5匹が糖尿病性コントロールであり、そして5匹が非糖尿病性コントロールである)を、1)ビヒクルプラセボコントロール、2)VEGF−2について評価した。
創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸における面積の測定、および創傷の総平方面積を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷面積(0日目)と処置後の創傷面積(8日目)との間の違いを確立することにより、見積もる。1日目の創傷面積は、64mm2であった(皮膚パンチの大きさに対応する)。計算は、以下の式を使用して行なった:[8日目の開口面積]−[1日目の開口面積]/[1日目の開口面積]。
試料を10%緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋ブロックを、創傷表面に垂直に切り出し(5mm)、そしてReichert−Jungミクロトームを使用して切断する。通常のヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を、二等分した創傷の断面で行なう。創傷の組織学試験を使用して、治癒過程および修復された皮膚の形態的外観が、VEGF−2での処置により変化するかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮化および上皮の成熟度の存在の検査を含んだ(Greenhalgh,D.G.ら、Am.J.Pathol.136:1235(1990))。実験条件の伏せられた観測者が、目盛りつきレンズマイクロメーターを使用する。
(再上皮化)
組織切片は、ABC Elite検出システムを使用して、ポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体を用いて免疫組織化学的に染色する。ヒトの皮膚を、陽性組織コントロールとして使用し、一方非免疫IgGを、陰性コントロールとして使用する。ケラチノサイト増殖を、目盛りつきレンズマイクロメーターを使用して、創傷の再上皮化の程度を評価することにより決定する。
皮膚試料における増殖細胞核抗原/サイクリン(PCNA)を、ABC Elite検出システムを用いて抗PCNA抗体(1:50)の使用により実証する。ヒト結腸癌を、陽性組織コントロールとして使用し、そしてヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして使用する。各試料は、一次抗体の脱落、および非免疫マウスIgGとの置換を有する切片を含んだ。これらの切片の順位は、わずかな増殖を反映するスケールの低い側から、強い増殖を反映する高い側への0〜8のスケールでの、増殖の程度に基づく。
例示的なデータを、片側t検定を使用して分析する。0.05より大きいp値を、有意とみなす。
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系において十分に実証されている(Wahl,S.M. Glucocorticoids and Wound healing.Anti−Inflammatory Steroid Action:Basic and Clinical Aspects.280−302(1989);Wahl,S.M.ら、J.Immunol.115:476−481(1975);Werb,Z.ら、J.Exp.Med.147:1684−1694(1978))。糖質コルチコイドは、新脈管形成の阻害、血管透過性(Ebert,R.H.ら、An.Intern.Med.37:701−705(1952))、線維芽細胞の増殖、およびコラーゲン合成(Beck,L.S.ら、Growth Factors.5:295−304(1991);Haynes,B.F.ら、J.Clin.Invest.61:703−797(1978))の減少および循環する単球の一過性減少の生成(Haynes,B.F.ら、J.Clin.Invest.61:703−797(1978);Wahl,S.M.「Glucocorticoids and Wound healing」Antiinflammatory Steroid Action:Basic and Clinical Aspects、Academic Press、New York、280〜302頁(1989))により創傷治癒を遅らせる。創傷治癒の減弱に対するステロイドの全身投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である(Beck,L.S.ら、Growth Factors.5:295−304(1991);Haynes,B.F.ら、J.Clin.Invest.61:70
3−797(1978);Wahl,S.M.「Glucocorticoids and wound healing」Antiinflammatory Steroid
Action:Basic and Clinical Aspects、Academic Press、New York、280〜302頁(1989);Pierce,G.F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2229−2233(1989))。
重量が、250〜300gの若い成体雄性Sprague Dawleyラット(Charles River Laboratories)を本実施例に使用する。動物を、8週齢で購入し、そして9週齢で研究を開始した。ラットの治癒応答を、創傷時にメチルプレドニゾロンの全身投与(17mg/kg/ラット筋肉内)により損なわせる。動物を個々に飼育し、そして食物および水を無制限に与える。全ての操作は、無菌技術を使用して行なう。本研究は、Human Genome Sciences,Inc.のInstitutional Animal Care and Use Committee
and the Guidelines for the Care and Use
of Laboratory Animalsの規則およびガイダンスに従って行なう。
創傷プロトコルは、上述のA節に従って行なう。創傷の日に、動物を、ケタミン(50mg/kg)およびキシラジン(5mg/kg)の筋肉内注射で麻酔する。動物の背側領域を剃毛し、そして皮膚を、70%エタノール溶液およびヨード溶液で洗浄する。外科手術領域を、創傷の前に滅菌ガーゼを用いて乾燥させる。全厚8mmの創傷を、Keyの組織パンチを用いて作製する。創傷は、実験の期間中開いたままにする。試験材料の適用は、創傷の日から7日間連続で、およびメチルプレドニゾロンの投与に引き続いて、一日1回、局所的に行なう。処置の前に、創傷を滅菌生理食塩水およびスポンジのガーゼでやさしく洗浄する。
10動物ずつの4つのグループ(5匹がメチルプレドニゾロンで処置、そして5匹は、
糖質コルチコイドを有さない)を、1)未処置グループ、2)ビヒクルプラセボコントロール、3)VEGF−2処置グループについて評価する。
創傷閉鎖は、垂直軸および水平軸の面積を測定すること、および創傷の総面積を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、開始時の創傷面積(0日目)と処置後の創傷面積(8日目)との間の差異を確立することにより、見積もる。1日目の創傷面積は、64mm2であった(皮膚パンチの大きさに対応する)。計算は、以下の式を使用して行なった:[8日目の開口面積]−[1日目の開口面積]/[1日目の開口面積]。
標本を10%緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋ブロックを、創傷表面に垂直に切り出し(5mm)、そしてOlympusミクロトームを使用して薄切する。通常のヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を、二等分した創傷の断面で行なった。創傷の組織学試験は、治癒過程および修復された皮膚の形態的外観が、VEGF−2での処置により改善されたかどうかの評価を可能にする。目盛りつきレンズマイクロメータを機械的な観察者が使用して、創傷間隙の距離を決定した。
実験データを、片側t検定を使用して分析する。0.05未満のp値を、有意であるとみなす。
4つの特定のペプチド(SP−40、SP−41、SP−42およびSP−43と命名された)を、産生した。これらを用いて、VEGF−2プロセシングを分析するためのモノクローナル抗体を産生する。このペプチドを以下に示す:
1.「SP−40」:MTVLYPEYWKMY(配列番号18のアミノ酸70〜81)2.「SP−41」:KSIDNEWRKTQSMPREV(配列番号18のアミノ酸120〜136(131位でC−>S変異に注意のこと))
3.「SP−42」:MSKLDVYRQVHSIIRR(配列番号18のアミノ酸212〜227)
4.「SP−43」:MFSSDAGDDSTDGFHDI(配列番号18のアミノ酸263〜279)
(実施例26:リンパ水腫(lymphadema)動物モデル)
この実験的アプローチの目的は、ラット後肢でのリンパ性循環系のリンパ管形成および再形成におけるVEGF−2の治療的効果を試験するために、適切かつ一致するリンパ水腫モデルを生成することである。有効性を、発症した後肢の体積の膨張、リンパ管の定量、総血液血漿タンパク質、および組織変化により測定する。急性リンパ水腫を、7〜10日間観察する。おそらくより重要なことに、水腫の慢性的な進行は、3〜4週間まで続く。
手術の開始に先立って、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採取した。約350gの雄性ラットに、Pentobarbitalを投与する。引き続いて、右足を、膝から股関節部にかけて剃毛した。剃毛した領域を、70%エタノールに浸漬したガーゼで拭き取る。血液を血清総タンパク質試験のために採取する。外周および体積測定を、足への色素の注入の前に、2つの測定レベルのマーキング(背側の足のptの中間で、踵より0.5cm上)後に行なった。右足および左足の両方の背側の皮内に、0.05mlの1% Evan’s Blueを注入する。次いで、外周および体積測定を、足への色素
の注入に続いて行なう。
肢の動きを防ぐために短いガス麻酔下で、布のテープを使用して、肢の外周を測定する。測定は、距骨および背側の足で、2人の異なる人により行ない、次いで、その2つの記録の平均を取る。記録は、コントロールの肢および水腫の肢の両方から取る。
外科手術の日、動物をPentobarbitalを用いて麻酔し、そして手術の前に試験する。毎日の体積測定のために、動物を簡単なハロタン麻酔し(急激に固定化し、そしてすぐに回収する)、両方の脚を剃毛し、そして脚に防水性マーカーを用いて同様に印付けする。最初に、脚を水につけ、次いで、個々の印のレベルを機器につけ、次いでBuxco edemaソフトウェア(Chen/Victor)により測定する。データを1人の人が記録し、一方他の人は、印の領域に対して肢をつける。
総タンパク質およびCa2+比較のために、外科手術の前、次いで終了時に、血液を採取し、遠心分離(spin)し、そして血清を分離する。
血液を採取した後、動物を組織収集のために調製する。肢を、quillitineを用いて切断し、次いで、実験用の脚およびコントロールの脚の両方を、結紮法で切断し、そして秤量した。第二の秤量を、脛骨−踵骨関節(tibio−cacaneal joint)を解体したときに行ない、そして足を秤量した。
膝の後ろ(膝窩)の領域に位置する横筋を解体し、そして金属の骨組みを配置し、凍結ゲルで満たし、冷却メチルブタン中に漬け、標識したサンプルバッグ中に入れ、切り出すまで−80ECで置いた。切り出す際に、筋肉をリンパ節について蛍光顕微鏡で観察した。他の免疫/組織学的方法が、現在評価されている。
本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するためにインビボでの遺伝子治療方法を使用することである。この遺伝子治療方法は、VEGF−2の発現を増加させるために、動物中への、プロモーターに作動可能連結されたVEGF−2を含む裸の核酸(DNA、RNA、およびアンチセンスDNAまたはRNA)の導入に関する。このような遺伝子治療および送達技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、WO90/11092、WO98/11779;米国特許第5693622号、同第5705151号、同第5580859号;Tabata,H.ら(1997)Cardiovasc.Res.35(3):470−479、Chao,Jら(1997)Pharmacol.Res.35(6):517−522、Wolff,J.A.(1997)Neuromuscul.Disord.7(5):314−318、Schwartz,B.ら(1996)Gene Ther.3(5):405−411、Tsurumi,Y.ら、(1996)Circulation 94(12):3281−3290(本明細書に参照として引用される)を参照のこと。
様に、循環の血漿およびリンパチャネルのリンパ液によって占められる空間である。これらは、これらの細胞を含む組織中への注射によって、都合良く送達され得る。これらは、好ましくは、持続性の、分化した非分裂細胞に送達され、そしてこの非分割細胞において発現されるが、送達および発現を、未分化細胞または完全には分化していない細胞(例えば、血液幹細胞または皮膚線維芽細胞のような)において達成し得る。好ましくは、これらを動脈中への直接注射によって送達する。
遺伝子治療の1つの方法は、線維芽細胞(これは、VEGF−2ポリペプチドを発現し得る)を患者に移植することである。一般的に、線維芽細胞は皮膚生検によって被験体から得られる。得られた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に置き、約10片を各フラスコに置く。このフラスコを逆さまにし、密栓し、そして室温で一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを反転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定したままにし、そして新鮮な培地(例えば、10%FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するHam’s F12培地)を添加する。次いで、フラスコを37℃で約1週間インキュベートする。
培養後、線維芽細胞の単層が出現する。この単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケールアップする。
本発明に従った遺伝子治療の別の方法は、例えば、以下に記載されるような相同的組換えを介した、内因性VEGF−2配列をプロモーターと作動可能に結合させる工程を包含する:1997年6月24日に発行された米国特許第5,641,670号;1996年9月26日に公開された国際公開第WO 96/29411号;1994年8月4日に公開された国際公開第WO 94/12650号;Kollerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932−8935 (1989);およびZijlstraら、Nature 342:435−438(1989)。この方法は、標的細
胞中に存在するが、その細胞中で発現しないか、または所望より低いレベルで発現する遺伝子の活性化を包含する。
HEPES(pH7.3)、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、6mM デキストロース)中で再懸濁する。この細胞を再度遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を1mg/ml アセチル化ウシ血清アルブミンを含む、エレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。最終的な細胞懸濁物は、約3×106細胞/mlを含む。エレクトロポレーションは、再懸濁後すぐに行うべきである。
VEGF−2ポリペプチドをまた、トランスジェニック動物で発現し得る。任意の種の動物(マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ブタ、ミクロピッグ(micro−pig)、ヤギ、ヒツジ、ウシ(cow)および非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー)を含むが、これらに限定されない)は、トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施形態において、本明細書中に記載された技術またはそうでなければ当該分野において公知の技術を使用して遺伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現させる。
リペプチドの生物学的な機能を詳しく述べる際に、ならびにこのような状態または障害を緩和する際に有効な化合物のスクリーニングの際に有用な動物モデル系が挙げられるが、これらに限定されない本発明のトランスジェニック動物を使用する。
内因性VEGF−2遺伝子発現はまた、標的化相同性組換えを使用してVEGF−2遺伝子および/またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって減少され得る(例えば、Smithiesら、Nature 317:230−234(1985);ThomasおよびCapecchi、Cell 51:503−512(1987);Thompsonら、Cell 5:313−321(1989)を参照のこと;これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される)。例えば、内因性のポリヌクレオチド配列(この遺伝子のコード領域か、または調節領域のいずれか)に相同性のDNAによって隣接する、本発明の変異型、非機能的ポリヌクレオチド(または完全に関連のないDNA配列)を選択マーカーおよび/または陰性の選択マーカーを有するか、または有さずに、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトするために使用し得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を使用して、目的の遺伝子を含むが発現しない細胞中でノックアウトを生成する。標的化相同的組換えを介した、このDNA構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性の標的化遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究分野および農業分野において特に適している(例えば、ThomasおよびCapecchi 1987およびThompson 1989、前出)。しかし、このアプローチは、組換えDNA構築物が当業者に明らかな適切なウイルスベクターを使用してインビボで直接投与されるか、または必要とされる部位に標的化される場合、ヒトにおいての使用に慣用的に適合し得る。
らの細胞を、周知の技術を使用して投与し得、この技術は、導入細胞に対して宿主免疫応答の発生を妨げる。例えば、それらの細胞をカプセル化形態で導入し得、これは、初期の細胞外環境との成分の交換を可能にするが、導入細胞は、宿主免疫系によって認識されることを可能にしない。
(VHドメインおよびVLドメインの同定およびクローニング)
特定の抗体を発現する細胞株由来のVHドメインおよびVLドメインを同定しそしてクローニングするための1つの方法は、VHおよびVL特異的プライマーを用いて抗体発現細胞株から作成されたcDNAに対してPCRを実施することである。手短に言うと、RNAを細胞株から単離し、そしてEBV細胞株によって発現された抗体のVHドメインおよびVLドメインを増幅するために設計したRT−PCRのためのテンプレートとして使用した。細胞をTRIzol(登録商標)試薬(Life Technologies,Rockville.MD)中で溶解し、そして5分の1容量のクロロホルムを加えて抽出し得る。クロロホルム添加後、この溶液を室温で10分間インキュベートし、そして卓上遠心機中で、14,000rpmで15分間4℃で遠心分離した。その上清を回収し、そして等量のイソプロパノールを用いて、RNAを沈殿させた。沈殿したRNAを、卓上遠心機中で、14,000rpmで15分間4℃での遠心分離によってペレット化した。遠心分離後、その上清を捨て、そして75%のエタノールで洗浄した。洗浄後、そのRNAを再び800rpmで5分間4℃で遠心した。その上清を捨て、そしてそのペレットを風乾した。RNAをDEPC水に溶解し、そして60℃で10分間加熱した。光学濃度測定を用いて、RNAを定量し得る。
(VEGF−2結合ポリペプチドの親和性のBIAcore分析)
VEGF−2抗体のVEGF−2への結合は、例えば、BIAcore分析によって分析し得る。VEGF−2(もしくは他の抗原に対するVEGF−2抗体の親和性を知りたい物質に対する他の抗原)またはVEGF−2抗体のいずれかを、N−エチル−N’(ジメチルアミノプロピル)カルボイイミド(carboiimide)/N−ヒドロキシスクシニミド化学を用いて、アミン基を介してBIAcoreセンサーチップ(CM5チップ)に共有結合的に固定化し得る。VEGF−2抗体またはVEGF−2(もしくはVEGF−2抗体の親和性を知りたい物質に対する他の抗原)、それぞれの種々の希釈物は、50マイクロリットルの容量全てについて25マイクロリットル/分で、フローセル中の誘導体化したCM5チップ上を流れる。結合したタンパク質の量は、HBS緩衝液(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005% 界面活性剤p20)でのフローセルの洗浄中に定量し得る。目的のタンパク質についての結合特異性は、目的のタンパク質の存在下で、可溶性競合物との競合によって決定される。
VEGF−2処置は、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞が増殖するのを誘導する。VEGF−2処置細胞においてこの活性を可能にするために、以下のアッセイを使用する。さらに、VEGF−2抗体が、内皮細胞の増殖を誘導するVEGF−2タンパク質の能力を阻害し得るかどうかを決定するためにもまた、このアッセイを使用し得る。下記のプロトコルは、VEGF−2抗体の阻害活性を試験するためのアッセイを明示するが、当業者は、このアッセイを容易に改変して、内皮細胞増殖を誘導するVEGF−2タンパク質の能力を試験するために、VEGF−2抗体を取り除き得る。
ウシのリンパ管内皮細胞(bLEC)細胞(ATCC番号.PTA−1149)を、75cm2フラスコ内の完全培地(DMEM、10%の、熱で不活化したFBS(Biow
hittakerのカタログ番号;14−502F)、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、5ml/500mlの非必須アミノ酸溶液(NEAA)の培地、150μg/ml ウシの脳抽出物(ウシの脳抽出物は、Maciagら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,5674−5678(1979)に記載されるように調製する)、100μg/mlのヘパリン)中で増殖させる。コンフルーエンスに達したら、75cm2フラスコから培地を除き、そして細胞を20mlのPBS(カルシウムもマグネシウムも含まない)で1回洗浄し、次いで、4mlのトリプシン−EDTAで覆い(cover)、そして3〜5分間インキュベーターに戻した。次いで、静かに揺り動かして(gentle agitation)プラスティックからその細胞を剥がし、トリプシンを不活化するために4mlの完全培地を加える。次に、この細胞懸濁物を、15mlの遠心チューブに打つし、そして1000rpmで5分間遠心して細胞をペレット化する。その上清は除去し、そしてその細胞ペレットを完全培地に再懸濁する。この細胞を1:3に分けて、CO2インキュベーター内で37℃で維持する。培地は、細胞を分ける必要性にかかわらず、週に2回交換する。
1日目:外側の列を除いて、96ウェルプレート中で1ウェルにつき3500個の細胞でbLECをプレーとし、そして完全培地中で一晩培養する。後日、
2日目:完全培地を除去し、そして100マイクロリットルの飢餓培地(飢餓培地)(:EBM(Cloneticsのカタログ番号;CC−3121)、0.5% FBS)を加える。
VEGF−2は、Elk−1タンパク質をリン酸化するキナーゼを活性化するVEGF−2応答細胞におけるシグナル伝達カスケードを誘導する。VEGF−2処置細胞においてこの活性を可能にするために、以下のアッセイを使用する。さらに、VEGF−2抗体が、Elk−1のリン酸化を誘導するVEGF−2タンパク質の能力を阻害し得るかどうかを決定するためにもまた、このアッセイを使用し得る。下記のプロトコルは、VEGF−2抗体の阻害活性を試験するためのアッセイを明示するが、当業者は、このアッセイを容易に改変して、Elk−1リン酸化を誘導するVEGF−2タンパク質の能力を試験するために、VEGF−2抗体を取り除き得る。
05% BSA(低い内毒素)中に0.2マイクログラム/ミリリットルでのVEGF−2(例えば、全長のタンパク質またはVEGF−2の分泌形態)の常用ストック溶液を調製する。
GST−Elk1融合タンパク質(Cell Signaling Technologies 番号;9184、またはBoston Biologicals番号;1010)をPBSで10μg/mLまで希釈し、そして96−ウェルのDynex Microlite 2プレート(Catalogue番号;7417)に1ウェルにつき50マイクロリットル加える。プレートを静かに叩いて、液体が底部を完全に覆うようにする。室温で一晩または37℃で1時間、インキュベートする。プレートを、1ウェルにつき250マイクロリットルの洗浄緩衝液(0.05% Tween20、PBS+PBST)で1回洗浄する。次に、1ウェルにつきブロッキング緩衝液(1.0% Nonfat Dry Milk、PBST)150マイクロリットルを用いて、ウェル中の使用されていない結合部位をブロックし、そして1時間室温でインキュベートする。次いで、1ウェルにつき250マイクロリットルの洗浄緩衝液でプレートを3回洗浄する。アッセイプレートの各ウェルに、15マイクロリットルのサンプル(2連で)および10マイクロリットルの水を加える。1ウェルにつき25マイクロリットルの2×キナーゼ緩衝液(2×キナーゼ反応緩衝液(100mM Hepes(pH7.5)、20mM MgCl2、5mM NaF、0.2mM オルトバナジウム酸ナトリウム、1mM DTT[フレッシュなものを加える]、1mM ATP[フレッシュなものを加える])を各ウェルに加えて、キナーゼ反応を開始する。精製し、活性化し、そして不活化したERK1/2キナーゼ(それぞれ、Stratagene、番号206110および番号206120)をコントロールとして含む。室温で1時間インキュベートする(1〜3時間の間、反応は直線である)。
(腫瘍血管新生のVEGF−2抗体の効果を研究するための容量チャンバーモデル)
マウスにおける透明ウィンドウシステムでの微小血管生理学の複数の局面の特性は、血管新生、炎症、微小血管輸送、組織の拒絶反応、および腫瘍生理学に関する貴重なデータを提供している(Melder,R.Jら、Biophys.J.69:2131−2138、(1995);Fukumura,D.ら、Cancer Res.55:4824−4829,(1995);Yamada,S.ら、Blood,86:3487−3492,(1995);Yamada,S.,ら、Blood,86:4707−4708,(1995);Melder,R.J.,ら、Microvas.Res.50,35−44,(1995);Melder,R.J.ら、Nature Medicine
2:992−997,(1996);Dellian,M.,ら、Am.J.Path.149:59−71,(1996);ならびにLeunig M.,ら、Cancer
Res 52:6553−60(1992))。このアッセイを使用して、皮膚または軟膜表面の間質性コンパートメント(interstitial compartment)に直接投与されるVEGF−2ポリペプチドが、微小血管系の構造および機能における変化を誘導するという仮説を試験し得る。これらの研究は、特に、観測ウィンドウ内に存在する脈管構造および移植ゲル中のこれらのタンパク質に応答して発達する新生脈管構造に対する活性を特徴付ける。以下の観察がなされる:
a)VEGF−2ポリペプチドでの処置に応答して皮膚または軟膜表面に生じる血管網状組織(血管網状組織)の長さ、直径および密度;
b)処置した血管床での血流速度および白血球の流量;
c)処置した血管床での回転白血球および接着性白血球の頻度;
d)VEGF−2ポリペプチドでの処置に対する応答における、皮膚または軟膜表面での血管網状組織の存在の浸透性;
e)ウィンドウ調製物内に移植したコラーゲンディスクにおける、VEGF−2ポリペプチドに対する脈管形成応答;
f)ウィンドウ調製物内に移植したコラーゲンディスクにおける、血流速度 白血球の流量ならびに回転白血球および接着性白血球の数;
g)皮膚または頭部のウィンドウ調製物内に移植したコラーゲンディスクにおける、VEGF−2ポリペプチドに対する応答における血管由来の血管網状組織の浸透性。
/nuマウスを使用する利点は、以下を含め、数倍である(several−fold):a)研究期間の間、免疫応答の可能性を減少させる、b)皮膚における色素沈着および毛の欠如に起因する光学を改善する、c)同様の種々の研究を用いて、経過の一貫性を維持する。
グループ 1:緩衝液中の試験サンプル(用量1)
グループ 2:緩衝液中の試験サンプル(用量2)
グループ 3:緩衝液中の試験サンプル(用量3)
グループ 4:緩衝液およびBSAコントロール
グループ 5:ポジティブコントロール(bFGF、10ng)
滅菌したタンパク質溶液を10μl容量として、背部の皮膚ウィンドウを有するマウスのウィンドウ調製物内に直接投与する。あるいは、上記に列挙されるようなタンパク質濃縮物を含む滅菌したコラーゲン/スクラルフェートディスクを、脈管形成能の評価のためにウィンドウ調製物に配置する。滅菌した抗体溶液を静脈内に投与する。
(動物調製)
外科的手順を、Swissヌードマウスにおいて実施する。外科的手順について、動物(20〜30g)を体重1kgにつき90mgのケタミンおよび9mgのキシラジンのカクテルを皮下注射して麻酔する。外科的手順全てが、蒸気滅菌、気体滅菌または化学的に滅菌されている設備を備える水平な層状の流動性フードにおいて、特定の条件下で実施される。このベンチの無菌性は、使用しない場合、U.V.光によって維持される。手術中は、加熱作業面の手段によって、動物の体温を一定に維持する。マウス全てを別々に微小隔離飼育機(microisolator)ケージに収容し、そして処置全てを層状の流動性フード中で行う。手術後、任意の不快/苦痛について動物を観察する。不快の基準としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:体重減少(20%)、移動不能、自傷の証拠、または食べることもしくは飲むことが出来ないこと。移植後3日間、ブプレノルフィン(0.1mg/kg q 12時間)を鎮痛薬として使用する。手術後3日間、不快のサインを示す任意の動物は、CO2吸入を用いて安楽死させる。
チャンバーを、Leunigら、Cancer Res 52:6553−6560(1992)に記載されるように移植する。手短に言うと、このチャンバーを、チャンバーが背部表面上に広がる2層の皮膚(すなわち、「皮膚を挟む(pinch of skin)」)上に配置されるように、位置付ける。背部皮膚組織弁の一面の全厚さを、直径約15mmの円形領域で除去する。組織弁(表皮、筋膜、および横紋筋からなる)の第2の部位は、チャンバーのフレームおよび開口部(「ウィンドウ」)上に配置され、滅菌した、ガラスのカバースリップでカバーする。このチャンバーを、縫合糸(絹、4−0)を用いて適所に配置し、この縫合糸は、チャンバーの上部に沿って広がった皮膚および穴を介して通される.マウスは、72時間で回復できる。
マウスを、体重1kgにつき90mgのケタミンおよび9mgのキシラジンのカクテルのs.c.注射により麻酔し、次いで、滅菌したプラスチックステージアセンブリ上に配置する。次いで、透過照明(背部表面ウィンドウ)または後の100μlのBSA−FITC注射(1mg/ml、i.v.)および落射証明(頭部ウィンドウ)を用いて、ウィンドウの血管地図を作成する。血管床のビデオ録画を、オフライン分析のための倍率範囲(1×〜40×)およびデジタルフレームで行う。血管密度、血流速度、および血管の寸法(剪断速度分析)について、画像を定量化する。さらに、毛細管細静脈および後毛細管細静脈のビデオ顕微鏡法後に、10μlのローダミン6−G注射によって循環する白血球相互作用を評価する。透過性測定を、5分、10分、15分および20分でのBSA輸送の画像オフライン分析から行う。正常血管床および脈管形成血管床の毛細管密度の定量を、5セットの実験マウスおよびコントロールマウスの観察を7日間隔(計28日間)でビデオテープのオフライン分析から行う。
(結腸癌LS174T背部チャンバーモデル)
結腸癌(LS174T)は、VEGF−2ポリペプチドを産生/分泌する。従って、VEGF−2抗体による処置が、LS174T腫瘍増殖を遅らせるかまたは阻止するか、あるいはさらにLS174T腫瘍後退に作用するかを試験することは特に興味深い。この仮説を試験するために、上記の背部チャンバーモデルが、背部チャンバー内の腫瘍増殖および血管新生を研究するために適し得る。
(MDA−MB−231腫瘍におけるVEGF−2抗体処置の効果)
このMDA−MB−231細胞株(ATCC番号;HTB−26)は、乳癌細胞株である。以下のアッセイを用いて、VEGF−2抗体での処置がMDA−MB−231腫瘍増
殖を遅らせるかまたは阻止するかどうか、あるいはMDA−MB−231腫瘍退行に作用するかどうかをを試験する。以下の実施例は、MDA−MB−231細胞を必要とする実験プロトコルの概要を述べるが、当業者は、他の腫瘍型に対するVEGF−2抗体の処置の効果を試験するためにこのプロトコルを容易に改変し得る。
(カナダ)
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官(Commi
ssioner of Patents)が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(ノルウェー特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addressee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国特許法第3.25(3)号規定)。
出願人はここにおいて、出願が(特許および統制委員会(National Board of Patents and Regulations)により)公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ATCC寄託番号97149
(英国)
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(デンマーク特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、出願が(スウェーデン特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s GuideのVolume Iのannex Zに
記載された書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
(カナダ)
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官(Commi
ssioner of Patents)が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(ノルウェー特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addressee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国特許法第3.25(3)号規定)。
出願人はここにおいて、出願が(特許および統制委員会(National Board of Patents and Regulations)により)公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ATCC寄託番号75698
(英国)
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(デンマーク特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、出願が(スウェーデン特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s GuideのVolume Iのannex Zに
記載された書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
(カナダ)
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官(Commi
ssioner of Patents)が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(ノルウェー特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addressee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国特許法第3.25(3)号規定)。
出願人はここにおいて、出願が(特許および統制委員会(National Board of Patents and Regulations)により)公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ATCC寄託番号PTA−4095
(英国)
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(デンマーク特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、出願が(スウェーデン特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s GuideのVolume Iのannex Zに
記載された書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
(カナダ)
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官(Commi
ssioner of Patents)が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(ノルウェー特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addressee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国特許法第3.25(3)号規定)。
出願人はここにおいて、出願が(特許および統制委員会(National Board of Patents and Regulations)により)公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ATCC寄託番号PTA−4179
(英国)
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(デンマーク特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、出願が(スウェーデン特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s GuideのVolume Iのannex Zに
記載された書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
(カナダ)
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官(Commi
ssioner of Patents)が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(ノルウェー特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addressee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国特許法第3.25(3)号規定)。
出願人はここにおいて、出願が(特許および統制委員会(National Board of Patents and Regulations)により)公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ATCC寄託番号PTA−4096
(英国)
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(デンマーク特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、出願が(スウェーデン特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s GuideのVolume Iのannex Zに
記載された書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
(カナダ)
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官(Commi
ssioner of Patents)が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(ノルウェー特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addressee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国特許法第3.25(3)号規定)。
出願人はここにおいて、出願が(特許および統制委員会(National Board of Patents and Regulations)により)公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ATCC寄託番号PTA−4180
(英国)
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
出願人はここにおいて、出願が(デンマーク特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、出願が(スウェーデン特許庁により)公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s GuideのVolume Iのannex Zに
記載された書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
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