JP2012092076A - 新規４−ビニルフェノール重合化合物 - Google Patents

Abstract

【課題】優れた抗癌活性、リパーゼ阻害活性及びチロシナーゼ阻害活性を有する新規４−ビニルフェノール重合化合物及び該化合物を効率よく製造する方法、さらに前記該化合物を含有する抗肥満剤、皮膚疾患治療剤及び抗癌剤、美白剤さらには前記該化合物を含有する食品、医薬品又は化粧品を提供すること。
【解決手段】下記式（１）:

で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩とｐ−クマル酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより該化合物を生成することを特徴とするその製造方法、及び前記式（１）で表される該化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗肥満剤、皮膚疾患治療剤、抗癌剤、美白剤さらには食品、医薬品又は化粧品。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規４−ビニルフェノール重合化合物及びその製造方法、前記新規４−ビニルフェノール重合化合物を含むリパーゼ阻害剤、抗肥満剤、皮膚疾患治療剤、抗癌剤、チロシナーゼ阻害剤、美白剤、食品、医薬品、又は化粧品に関するものである。

ｐ−クマル酸は植物の二次代謝産物の一つであり、例えば樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となるほか、フラボノイドなどの機能性成分の前駆体にもなっており、天然界に比較的多く存在する成分である。また、ｐ−クマル酸としては、プラムをはじめとして、多くの果物の果実や果皮、プロポリスなどにも含まれていることが知られている。これらは全て食経験がある植物であるため、ｐ−クマル酸は、人に対する安全性も高い成分である。

ｐ−クマル酸については、その生理機能に関連した先行技術がある。例えば、ｐ−クマル酸をはじめ、桂皮酸類を有効成分とする抗ヘリコバクター・ピロリ剤（特許文献１）、フェルラ酸及び／又はｐ−クマル酸を有効成分とする皮膚改善剤（特許文献２）、クマル酸をはじめ、プロポリスの抽出物に含まれる桂皮酸類を有効成分とする血管新生抑制剤（特許文献３）が挙げられる。
また、ｐ−クマル酸誘導体に関連した先行技術がある。例えば、クマル酸を化学合成させたリグニン類を有効成分とする抗菌剤（特許文献４）、カフェイン酸アミド誘導体又はエステル誘導体を有効成分とするアディポネクチン産生増強剤（特許文献５）、ｐ−クマル酸二量体を原料とした抗菌剤であるベンゾフランカルボキサミド誘導体の合成方法（特許文献６）が挙げられる。
また、ｐ−クマル酸誘導体やｐ−クマル酸誘導体は、植物中にも多く含まれていることから、リンゴ、ナシ又はモモの未熟果実の果実ポリフェノールとして、ｐ−クマル酸誘導体やｐ−クマル酸誘導体などを含む酸化防止剤、血圧降下剤、抗変異原性作用剤、アレルギー抑制剤、抗う蝕剤及び消臭剤（特許文献７）が挙げられる。
このようにｐ−クマル酸やｐ−クマル酸誘導体は優れた有用性を示すものが多いことから、原料やリード化合物としてのｐ−クマル酸やｐ−クマル酸誘導体を効率的に製造する技術開示もなされている。例えば、組み換え体を用いた微生物によるｐ−ヒドロキシ桂皮酸（ｐ−クマル酸）などの製造法方（特許文献８）が示される。

このような状況から、有用なｐ−クマル酸関連化合物である４−ビニルフェノール重合化合物を容易に工業化できる効率的な生成方法の確立が望まれていた。

特開平１１−１０６３３５公報 特許第３３３０９６１号 特開２００７−２２３９４８号公報 特許第４３９５６２３号 特開２００７−２６２０５０号公報 特開２００８−１８９５５４号公報 特開２００２−４７１９６号公報 特表２００５−５２２１８０号公報

本発明者らは、ｐ−クマル酸及びｐ−クマル酸誘導体に関する前記の状況を鑑みて、新規な生理活性を有するｐ−クマル酸関連化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにｐ−クマル酸をアルカリ条件下で加熱処理することで、前記ｐ−クマル酸関連化合物である新規４−ビニルフェノール重合化合物を生成できることを初めて見出し、さらに前記新規４−ビニルフェノール重合化合物が原料であるｐ−クマル酸には認められない優れた抗癌活性、リパーゼ阻害活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することを明らかにし、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は、優れた抗癌活性、リパーゼ阻害活性及びチロシナーゼ阻害活性を有する新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩及び該新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有するリパーゼ阻害剤、抗肥満剤、皮膚疾患治療剤、抗癌剤、チロシナーゼ阻害剤及び美白剤、さらには前記新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品、医薬品、又は化粧品を提供することを目的とする。

本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：

で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
〔２〕前記〔１〕記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなるリパーゼ阻害剤、
〔３〕前記〔１〕記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなる抗肥満剤、
〔４〕前記〔１〕記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなる皮膚疾患治療剤、
〔５〕前記〔１〕記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる抗癌剤、
〔６〕前記〔１〕記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなるチロシナーゼ阻害剤、
〔７〕前記〔１〕記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなる美白剤、
〔８〕前記〔１〕記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする食品、医薬品又は化粧品、
〔９〕ｐ−クマル酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物を生成することを特徴とする式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩の製造方法
に関する。

本発明の前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、原料のｐ−クマル酸が持たないリパーゼ阻害活性、抗癌活性、チロシナーゼ阻害活性を有することから、リパーゼ阻害剤、抗癌剤、チロシナーゼ阻害剤を提供することができる。また、これらの作用を奏することから、本発明により、優れた抗肥満剤、皮膚疾患治療剤、抗癌剤及び美白剤を提供することができる。
また、本発明の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、前記のような生理活性に優れることに加えて、安全性にも優れることから、食品、医薬品、又は化粧品に配合することができる。

図１は、実施例１で行ったＨＰＬＣの分析結果を示す。「Ａ」が新規４−ビニルフェノール重合化合物のピークを示す。 図２は実施例４の細胞増殖抑制試験より得られた結果を示すグラフである。 図２の縦軸は細胞生存率を、横軸は各試料の濃度を示している。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の新規４−ビニルフェノール重合化合物は、式（１）：

で表される構造を有する。

本発明では、前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物は、薬学的に許容可能な塩でもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩； アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩（以下、本発明の新規４−ビニルフェノール重合化合物と略する）は、前駆体であるｐ−クマル酸には認められない強いリパーゼ阻害活性、抗癌活性、チロシナーゼ阻害活性を有する化合物である。

本発明の新規４−ビニルフェノール重合化合物は、ｐ−クマル酸を含有する組成物を、アルカリ条件下で加熱処理することで、生成することができる。

本発明の新規４−ビニルフェノール重合化合物は、ｐ−クマル酸以外の原料を用いて化学合成することも可能ではあるが、その場合有害な触媒や溶媒、反応副産物等の不純物を除去するための徹底した精製工程が必要であり、産業化する上でコスト面において大きな障害がある。これに対して、本発明の製造方法は、比較的安価に入手できるｐ−クマル酸をアルカリ条件下で加熱処理する工程を有する方法であるため、化学合成方法のように有害な試薬や、危険な工程を必要としない効率的で安全な製造方法である。

本発明の製造方法では、新規４−ビニルフェノール重合化合物の前駆体としてｐ−クマル酸が必要である。ｐ−クマル酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のp−クマル酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、その後の所望の反応が進み最終的に本発明の新規４−ビニルフェノール重合化合物が得られるから、混合物であっても問題ない。ただし、回収量の観点からは、ｐ−クマル酸が１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、様々な果実やジュース、濃縮果汁、又は、破棄されることの多い果皮の抽出物、プロポリス又はその抽出物あるいは前記特許文献８等に記載される先行技術に示されるような微生物発酵によるｐ−クマル酸含有培養液等が挙げられる。

本発明の製造方法では、前記ｐ−クマル酸の純品又はｐ−クマル酸含有混合物を、適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであればｐ−クマル酸の溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類には特に制限はなく、ｐ−クマル酸が十分に溶解する溶媒であれば良いが、メタノールやエタノールのみか、水とメタノール、水とエタノールの混合液を使用することが、安全性やコスト面から望ましい。特に、最終的な精製を十分に適用せずに得られた生成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面からエタノールや含水エタノールの使用が望ましい。

上記で得られたｐ−クマル酸含有溶液を、アルカリ性に調整する。例えば、ｐ−クマル酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加しｐＨを調整しても良いし、前述のｐ−クマル酸含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ｐＨは最終的に７．１以上であれば生成反応が進むが、ｐＨ１３．０を超えると生成反応と同時に、他の化合物の生成反応や目的化合物の分解も一方で生じるために本発明の４−ビニルフェノール重合化合物の最終的な回収量が低下する。したがって、本発明の製造方法において生成反応開始時のｐ−クマル酸含有溶液のｐＨは７．０〜１３．０が望ましい。

また、ｐ−クマル酸含有溶液中のｐ−クマル酸の濃度に制限はない。中でも、ｐ−クマル酸の濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットがあるため、前記濃度は各々の溶媒に対しｐ−クマル酸が飽和する濃度近辺が好ましい。また、ｐ−クマル酸を飽和する濃度以上で含有させてもよい。この場合、生成反応前の時点では、ｐ−クマル酸は前記溶媒中に完全に溶解していなくともよい。溶解していないｐ−クマル酸は生成反応が進むにつれて徐々に溶解することになる。

ｐ−クマル酸含有溶液をアルカリ性に調整するために使用できるｐＨ調整剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が望ましい。また、生成反応時のｐ−クマル酸含有溶液のｐＨ変化を極力抑える場合には、緩衝溶液を用いても良い。

本発明の製造方法では、前記アルカリ性に調整されたｐ−クマル酸含有溶液を加熱処理する。所望の生成反応を効率的に進ませるために、ｐ−クマル酸含有溶液の加熱温度は９０℃以上が必要である。溶媒の沸点から考え、加圧加温処理を行うことが望ましい。例えば、開放容器にｐ−クマル酸含有溶液を入れ高温で容器を加温する、密閉容器にｐ−クマル酸含有溶液を入れ加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的にｐ−クマル酸含有溶液の温度が９０℃以上に達することが必要である。また、回収効率面から、溶液温度が均一に９０℃〜１５０℃になることがさらに好ましい。加熱温度が１５０℃を超えると、所望の生成反応以外の反応が行われるため、回収効率が低くなる。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の生成反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近でｐ−クマル酸含有溶液の加熱処理をする場合は、５分〜３００分の加熱時間が望ましい。また、加熱処理の回数は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良く、効率面から回数を判断すればよい。

前記のようにしてｐ−クマル酸含有溶液をアルカリ条件下で加熱処理することで、本発明の４−ビニルフェノール重合化合物を含有した混合物が得られる。特に、安全な原料のみを用いて本発明の４−ビニルフェノール重合化合物が得られた場合には、前記混合物の状態で使用することが可能である。例えば、天然由来のｐ−クマル酸をエタノール溶媒に溶解し炭酸水素ナトリウムを加え、加熱反応させた場合には、混合物として食品原料の一つとして使用が可能である。

また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記混合物を濃縮して本発明の４−ビニルフェノール重合化合物の濃度を高める、あるいは精製し純品を得ることができる。前記濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で前記混合物から本発明の４−ビニルフェノール重合化合物を抽出して濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。濃縮物や精製物から最後に減圧乾燥や凍結乾燥により溶媒除去すると、粉末状の前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の純品を得ることができる。

前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、後述のように、優れたリパーゼ阻害活性、抗癌活性、及びチロシナーゼ阻害活性を有するために、本化合物を有効成分として含有する抗肥満剤、皮膚疾患治療剤、抗癌剤及び美白剤を提供することができる。また、前記抗肥満剤、皮膚疾患治療剤、抗癌剤及び美白剤では、他の有効成分を含有しても良い。

また、前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、前記抗肥満効果、皮膚疾患治療効果、抗癌効果、美白効果を目的として、液状、ペースト状、ゲル状、及び固形状の食品、医薬品、又は化粧品等として使用することができる。

例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせて、また医薬品の場合には、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤と組み合わせて、前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を使用することが出来る。特に、本化合物の生理活性分野を考慮すると、抗肥満効果によるメタボリックシンドロームなどの生活習慣病の予防、癌予防・癌治療等の健康維持増進、さらには疾病治癒分野において用いることが好ましい。またニキビ治療や予防、美白を目的とした美容分野における化粧品などで用いることが望ましい。

前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。

前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を医薬用途で使用する場合、例えば、本化合物の摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。例えば、１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。

前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。食品の形態としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、例えば、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。

また、前記式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を医薬品又は食品として経口から投与又は摂取する場合には、常法に基づいて、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等としてもよい。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできるし、胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒等には公知の可溶化処理を施すこともできし、常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。

前記化粧品としては、ローション、乳液、クリーム、パック剤、仕上げ化粧品、頭髪用化粧品、洗顔剤、浴剤、制汗剤等が挙げられる。これらの化粧品では、リパーゼ阻害効果からニキビ治癒、チロシナーゼ阻害効果から美白作用に特に効果が期待され、美白及びニキビ予防・治癒等の目的で利用することができる。

前記医薬品又は食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１：新規４−ビニルフェノール重合化合物の生成）
ｐ−クマル酸（和光純薬工業（株）製）５００ｍｇをエタノール１０ｍｌに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（和光純薬業（株）製）１０ｍｌを加えた混合液（ｐH＝７．５）をオートクレーブ（商品名「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、三洋電機（株）製）にて１３０℃、４０分間加熱した。得られた反応後組成物１ｍｌをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、このうちの１０μｌをＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ₂Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
注入：１０μｌ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）

得られたクロマトグラムを図１に示す。上図が生成反応前の溶液中のｐ−クマル酸、下図が生成反応後の溶液のクロマトグラムを示している。生成反応によりｐ−クマル酸が減少し、増大したピークがいくつか確認されたことから、複数の化合物が生成されていることが確認された。中でも、Ａのピークで示された化合物は、ｐ−クマル酸から、生成されていることがわかる。

（実施例２：新規４−ビニルフェノール重合化合物の単離・構造決定）
実施例１で得られた反応物における図１のＡで示したピークに含まれる化合物を、分取ＨＰＬＣにより単離した。常法に従って、乾燥したところ、Ａから黄色粉末状の新規４−ビニルフェノール重合化合物（以下、ＵＨＡ７０１１）が３２ｍｇ得られた。

次いで、前記ＵＨＡ７０１１の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は３６０．４４５８であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
ＵＨＡ７０１１
理論値Ｃ２４Ｈ２４Ｏ３（Ｍ⁺）： ３６０．４４５６
分子式Ｃ₂₄Ｈ₂₄Ｏ₃

次に、前記ＵＨＡ７０１１を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３C−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、ＵＨＡ７０１１が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。このことから、式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。

なお、ＮＭＲ測定値について、式（１）で表されるＵＨＡ７０１１の各部位を

とし、１Ｈ核磁気共鳴スペクトル、１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１で示す。
値はδ、ｐｐｍで、メタノール−ｄ３で測定した値である。

また、ＵＨＡ７０１１の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水： 不溶
メタノール： 可溶
エタノール： 可溶
ＤＭＳＯ： 可溶
クロロホルム： 可溶
酢酸エチル： 可溶

（実施例３：ＵＨＡ７０１１の抗癌作用）
次に癌細胞に対する各化合物の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。

ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチジャパン（株）製）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、バイオロジカルインダストリー社製）を含む高栄養培地ＲＰＭＩ−１６９０（シグマアルドリッチジャパン（株）製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μｌずつ播種した。

試料は、ｐ−クマル酸（和光純薬工業（株）製）と、本発明品であるＵＨＡ７０１１の2種類を用いた。試料調製については、各々の化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、及び1００μＭとなるように調整し、試験を開始した。

生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８」（商品名、ドージンドー・モレキュラー・テクノロジー（株）製）を用いたＭＴＴ法にて行った。試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液を１０μｌ添加し、よく攪拌した。１時間の遮光反応後にプレートリーダー（「ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０」、バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した（図２）。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ₅₀（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した（表２）。
これらの結果から、ＵＨＡ７０１１には、強い癌細胞増殖抑制能が認められた。この効果は、ｐ−クマル酸には全く認められず、ｐ−クマル酸をｐ−クマル酸重合化合物に変換する有意性が強く示唆された。

（実施例４：ＵＨＡ７０１１のリパーゼ阻害作用）
リパーゼに対する各化合物の阻害作用を見るため、ラット腸由来リパーゼを用いての阻害作用試験を行った。
リパーゼは、ラット由来腸アセトンパウダー（シグマアルドリッチジャパン（株）製）１００ｍｇを１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）１ｍｌに懸濁して４℃で１時間撹拌し、これを遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４５分間、４℃）した上清を１５００倍希釈したものをリパーゼ溶液として使用した。

試料は、ｐ−クマル酸と、本発明品であるＵＨＡ７０１１の２種類を用いた。試料調製については、各々の化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、０．1ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭに調製したものを使用した。

活性測定には「リパーゼキットＳ」（商品名、大日本製薬（株）製）を使用した。まず、リパーゼキットＳのカタログに記載の調製法に従い発色液を調製した。発色液を７０μｌ、エステラーゼ阻害剤を２μｌ、リパーゼ溶液を１０μｌ、試料を１０μｌ（終濃度１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ）混合した反応液を調製し、３０℃で５分間プレインキュベートした後に基質溶液を８μｌ添加して反応を開始した。１０分間の反応後、リパーゼキットＳのカタログに記載の調製法に従い調製した反応停止液を１５０μｌ添加して反応を停止した。これを測定波長４１５ｎｍの吸光度測定をおこなった。試料の溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した反応液をポジティブコントロールとし、リパーゼ溶液の代わりに１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）１０μｌを添加したものをネガティブコントロールとした。これらから得られたデータを基に算出したリパーゼ阻害率と各化合物濃度の関係から、リパーゼ活性を５０％阻害する濃度ＩＣ₅₀（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した（表３）。
これらの結果からＵＨＡ７０１１には高いリパーゼ阻害活性が認められた。この効果はｐ−クマル酸では認められないことから，ｐ−クマル酸をｐ−クマル酸重合化合物に変換する有意性が強く示唆された。

したがって、ＵＨＡ７０１１は優れたリパーゼ阻害作用を奏することから、抗肥満剤として、さらにはメタボリックシンドローム予防剤として有用であると考えられる。また、皮膚におけるリパーゼ阻害はニキビ予防・治癒に有効であるから、ニキビ予防・治癒などの皮膚疾患治療剤としても有用であると考えられる。

（実施例５：ＵＨＡ７０１１のチロシナーゼ阻害作用）
チロシナーゼに対する各化合物の阻害作用を見るため、マッシュルーム由来チロシナーゼ（シグマアルドリッチジャパン（株）製）を用いての阻害作用試験を行った。

試料は、ｐ−クマル酸と、本発明品であるＵＨＡ７０１１の２種類を用いた。試料調製については、各々の化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、０．２５ｍＭ、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、３．７５ｍＭ、５ｍＭに調製したものを使用した。

測定は既存の活性検出法によって行なった。まず、Ｌ―ＤＯＰＡ（和光純薬工業（株）製）を１００ｍMリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）で２．４ｍＭになるように調製した。また、上記の濃度で調製した試料２０μｌと１００ｍMリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）３０μｌを混合した。反応液には１００ｍMリン酸ナトリウムバッファー９０μｌ、Ｌ―ＤＯＰＡ溶液４０μｌ（終濃度４８０μＭ）、試料２０μｌ（終濃度１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μM、２００μＭ）を混合した。これを３７℃で５分間加温し、同様に加温したチロシナーゼ溶液（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで調製）を５０μｌ（１０U／ｍｌ）添加し反応を開始した。１０分間の反応後、メラニンの吸収波長（４７５ｎｍ）の吸光度を測定した。コントロールとしてチロシナーゼ溶液の代わりに１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）１０μｌを添加したものをネガティブコントロールとした。これらから得られたデータを基に算出したチロシナーゼ阻害率と各化合物濃度の関係から、チロシナーゼ活性を５０％阻害する濃度ＩＣ₅₀（５０％阻害濃度）を算出した（表４）。
これらの結果からＵＨＡ７０１１には高いチロシナーゼ阻害活性が認められた。この効果はｐ−クマル酸では認められないことから，ｐ−クマル酸をｐ−クマル酸重合化合物に変換する有意性が強く示唆された。

したがって、ＵＨＡ７０１１は優れたチロシンキナーゼ作用を奏することから、メラニンの合成を抑えることによる美白剤等の化粧品として有用であると考えられる。

（実施例６：加熱温度によるＵＨＡ７０１１の生成量の違い）
ｐ−クマル酸５０ｍｇ、エタノール１ｍｌ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌの混合溶液（ｐＨ＝７．５）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍｌをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。

その結果、９０℃を超える条件下においてＵＨＡ７０１１の生成は確認できた。ｐ−クマル酸からＵＨＡ７０１１の生成比率は７０℃で非生成、９０℃で非生成、１１０℃で１重量％、１３０℃で６重量％であった。すなわち、１３０℃での加熱が最も効率的であった。

（実施例７：ＵＨＡ７０１１含有エキスの調製）
プロポリス水抽出エキス１０ｇ、エタノール１０ｍｌ、炭酸水素ナトリウム１ｇ加えて調製した混合溶液（ｐH＝８．５）を、オートクレーブにて１３０℃、６０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、エキスを１１ｇ得た。得られたエキス中には、実施例６と同様の手法で確認したところＵＨＡ７０１１が０．００３ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返してエキスの量を増やした

（実施例８：ＵＨＡ７０１１を含有する食品）
実施例７で得たエキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。本ミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、肥満を改善したり、肥満を予防したり、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。

（実施例９：ＵＨＡ７０１１を含有する医薬品）
実施例１及び２と同様の方法で得たＵＨＡ７０１１をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに吸着させた後に、減圧乾燥させた。これを常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ７０１１を１０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、肥満改善や肥満防止、癌の治癒や改善を目的とする医薬品として有効に利用できる。

（実施例１０：ＵＨＡ７０１１を含有する化粧品）
テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット１重量部、ポリオキシエチレンステアリルエーテル０．５重量部、親油型モノステアリン酸グリセリン１重量部、ピルビン酸０．５重量部、ステアリルアルコール０．５重量部、アボガド油１重量部、実施例１及び２と同様の方法で得たＵＨＡ７０１１の０．１重量部を、常法に従って溶解させ、これに、乳酸ナトリウム１重量部、プロピレングリコール５重量部、カルボキシビニルポリマー０．１重量部、ごく少量の香料及び精製水８９．３重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、乳液を得た。本乳液は、美白やニキビなどの皮膚疾患治療や予防効果をもつ薬用化粧品として有効に利用できる。

Claims (9)

1. 下記式（１）：
   

   

   で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
2. 請求項１記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなるリパーゼ阻害剤。
3. 請求項１記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなる抗肥満剤。
4. 請求項１記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなる皮膚疾患治療剤。
5. 請求項１記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる抗癌剤。
6. 請求項１記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなるチロシナーゼ阻害剤。
7. 請求項１記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩からなる美白剤。
8. 請求項１記載の新規４−ビニルフェノール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする食品、医薬品又は化粧品。
9. ｐ−クマル酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより下記式（１）:
   

   

   で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物を生成することを特徴とする式（１）で表される新規４−ビニルフェノール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩の製造方法。

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