JP2011529691A5

JP2011529691A5 -

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Publication number: JP2011529691A5
Application number: JP2011521359A
Authority: JP
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2012-08-30

Description

別の態様によると、DNA分析を実施するための方法が提供される。以下の工程が含まれる:
a.鋳型DNA分析物を第1のプライマーセットおよび第2のネステッドプライマーセットを用いて増幅させる工程であって、該第2のネステッドプライマーセットの第1のメンバーが5'側の配列

を含み、かつ該増幅させる工程が高忠実度DNAポリメラーゼを使用する、工程;
b.水性媒体中で第3のプライマーセット、および

オリゴヌクレオチドでコーティングされたストレプトアビジンビーズを使用して該増幅鋳型を増幅させる工程であって、
該第3のプライマーセットの第1のメンバーが、5'側の配列

を含み、該第3のプライマーセットの第2のメンバーが、5'側の配列

を含む、工程;
c.水相としての該水性媒体および油/乳化剤混合物を使用して油中水型エマルジョンを調製する工程;
該ビーズ上で該鋳型を増幅させるために該エマルジョンを熱サイクル処理する工程;
界面活性剤を使用して該エマルジョンを破壊して油相を除去する工程;
d.該ビーズ上の該増幅鋳型と突然変異特異的プローブ、対応する野生型プローブ、ならびに該鋳型の一部分に対して相補的である、該突然変異特異的プローブおよび該対応する野生型プローブとは異なるアンプリコン特異的プローブとの混合物を形成する工程であって、該プローブの各々が蛍光標識され、該プローブの各々が別個の発光スペクトルを有する、工程;
e.該混合物中の該増幅された鋳型を熱変性させ、かつ該プローブを該鋳型にハイブリダイズさせるために該混合物を塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）の存在下で冷却する工程;
f.フローサイトメトリーを用いて、該ビーズ上の該増幅鋳型にハイブリダイズした蛍光標識プローブ各々の量を検出するために、該ハイブリダイズした鋳型を分析する工程。

図1A〜1Cは、ctDNAの測定を示す図である。図1Bは、被験者の腫瘍に由来するDNAの従来型Sangerシークエンシング法を描出しており、本分析の第1工程を提示している。血漿サンプル中の腫瘍由来DNAを定量するための手法は、図1Cに示した。リアルタイムPCRが血漿中のDNAフラグメントの総数を測定するために使用されている一方、BEAMingは、蛍光プローブであるCy5およびCy3で標識された野生型フラグメントに対する突然変異体の比率を測定する。図2A〜2Dは、BEAMingから得られた典型的なフローサイトメトリーデータを示す図である。4枚のグラフは、治療中の相違する時点に被験者6（APC G4189T）から入手したデータを例示している。北西四半分のドットおよび南東四半分のドットは、各々野生型および変異型フラグメントに結合したビーズを表す。北東四半分のドットは、野生型および突然変異両方のDNA鋳型を含有していたエマルジョン微液滴中に包含されていた結果として野生型および変異型フラグメント両方に結合したビーズを表す¹⁵。各四半分内の数は、測定した各集団についてのビーズの絶対計数を表す。（図2A）術前には、変異型DNAフラグメントの割合は13.4％であった。（図2B）術後（第3日）には、変異型DNAフラグメントの割合は0.015％へ低下した。（図2C）術後（第48日）には、変異型DNAフラグメントの割合は0.11％へ増加し、疾患の再発を示唆した。（図2D）第244日に、被験者は進行性疾患を有し、変異型DNAフラグメントの割合はさらに0.66％へ増加した。図3A〜3Bは、ctDNAおよびCEAによって検出される、無再発生存率を示す図である。（図3A）検出可能な術後ctDNAレベルを有する被験者対検出不能な術後ctDNAレベルを有する被験者における無再発生存率の相違（P＝0.006、Mantel-Cox対数順位検定による）。（図3B）検出可能な術後CEAレベルを有する被験者対検出不能な術後CEAレベルを有する被験者における無再発生存率の相違（P＝0.03、Mantel-Cox対数順位検定による）。図4A〜4Cは、個々の試験被験者におけるctDNA、CEAおよびイメージング動態の比較を示す図である。各被験者について、上方、中央、および下方のグラフは、ctDNAレベル、イメージング法によって評価した腫瘍容量、およびCEAレベルを表す。水平の線は正常レベルの上限を表す:ctDNAレベルについてはサンプル1例当たり1個の変異型DNAフラグメント、腫瘍直径については0.0cm、およびCEA存在量については5.0ng/mL。図4C:患者8は、S状結腸腺癌および左右両方の肝葉への単発性転移を有していた。この被験者は、S状結腸切除術および左側肝区域切除術を受けた（手術1）。右側の肝転移はそのまま残されたが、被験者は全身性化学療法により治療された（化学療法1）。120日目に、右肝切除術が実施された（手術2）。術後、被験者は4カ月にわたり全身性化学療法により治療された（化学療法2）。図4B:患者11は、S状結腸腺癌および2つの肝転移を有していたので術前に全身性化学療法により治療された（化学療法1）。この被験者は、S状結腸切除術、左肝葉切除術および単発性右側肝病巣のRFA（高周波アブレーション）を受けた（手術1）。2カ月後のイメージング試験は、肝臓での再発を示し、この被験者は右肝切除術を受けた（手術2）。再発の高リスクを考慮して、化学療法が再開始された（化学療法2）。8カ月後に、イメージング法は3つの再発性肝病巣および疑わしい腹腔リンパ節を示した。この被験者はこれらの病変へのRFAおよび腹腔リンパ節の切除術を受けた（手術3）。術後、この被験者は追加の化学療法を受けた（化学療法3）;しかしその後のイメージング法で多発性肺転移が明らかになった。図4A:患者5は、本試験への登録時点（第0日）に再発性疾患のために左肝切除術を受けた。左上葉内の疑わしい肺結節を除いて、手術直後に疾患の証拠は見られなかった。15カ月後、疾患再発が認められ、肝臓および肺の両方に病巣が見いだされた。図5A〜5Bは、結腸直腸癌を有する患者由来の糞便サンプル中で変異型DNAを検出するためのBEAMingに基づく手法を示す略図である。（図5A）全糞便DNAから出発する、本プロセスにおける段階を示す図である。工程1は、変異型および野生型一本鎖DNA分子の配列特異的捕捉の結果を示している。クエリーされた突然変異部位を含む遺伝子フラグメントをPCRにより増幅した後に、当該DNAをPCR産物内の配列に相補的なオリゴヌクレオチド（球体上のスパイク）に結合した磁性ビーズ（球体）と混合する（工程2）。工程3では、この混合物は油中水型エマルジョン中の数十億個の微小区画に分離される。これらの区画の小さな部分は単一ビーズおよび単一DNA鋳型分子を含有するが、大多数の区画はどちらも含有していない（例えば、中央の空の気泡）。工程4においてこれらのエマルジョンに対してPCRが実施されると、個々のDNAフラグメントはそれらを含有する微小区画内で増幅させられ、ビーズの表面に共有結合するようになる。結果として生じるビーズは、同一DNAフラグメントの何万個ものコピーでコーティングされる。工程5では、ビーズはエマルジョンから回収され、結合した当該DNAの配列が、パネルに示したように対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ASH）によって判読される（図5B）。（図5B）BEAMingによって磁性マイクロビーズ上で増幅したDNAは、非共有結合DNAストランドを取り除くために最初に変性させる。様々に標識された蛍光プローブは、ビーズに共有結合した相補的標的DNAにハイブリダイズさせる。次にフローサイトメトリーを使用してビーズを個別に計数し、それによって糞便または血漿サンプル中に最初に存在する変異型対野生型フラグメントの比率を決定する。図6A〜図6Dは、フローサイトメトリーによって分析したビーズの散布図を示している。正常リンパ球DNA（図6A）または患者4由来の糞便DNA（図6B）を用いたAPC C4132T突然変異についてのBEAMingアッセイ。リンパ球DNAについては分析したビーズの総数（全四半分）は253,723個であり、変異型DNAを含有するビーズはなかった（南西四半分、すなわち第4四半分）。患者4について分析したビーズの総数は192,513個であり、その内747個は突然変異体であった。（図6C）患者12由来の糞便DNAを用いたKRAS G38AについてのBEAMingアッセイを示す図であるが、この患者の腫瘍はこの突然変異を含有していなかった。初期増幅のために使用したDNAポリメラーゼによって導入され、陰性と判定された305,449個の分析したビーズ中に5個の変異型ビーズが存在した。（図6D）腫瘍にKRAS G38Aが含有されていた患者7由来の糞便DNAのアッセイを示す図である。計333,630個のビーズを分析したが、その内685個のビーズが変異型であった。図7A〜7Dは、CRCを用いて患者の糞便から単離した正常および変異型DNAの質および量を示す図である。（図7A）実験の設計の略図。糞便DNAは、患者特異的DNA突然変異を含む、サイズの相違するプライマー対を用いて増幅させた。リアルタイムPCRを使用して、各アンプリコンサイズに対して得られた糞便DNAフラグメントの総数を決定した。増幅したフラグメントは、引き続いてBEAMingによって分析され、正常（図7B）および変異型（図7C）DNAフラグメントの総数ならびに糞便中に存在する変異型対正常分子の割合（図7D）が決定された（-●-患者2、-■-患者4、-▲-患者7、-▼-患者14）。糞便DNA内の突然変異およびTNMステージを示す図である。水平のバーは変異型DNAのメジアン（中央値）割合を示している。ひげは、各指定のステージについて見いだされた最小値および最大値を表す。糞便DNAおよび血漿DNAの増幅のために使用したプライマー。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの対（SEQ ID NO:10〜53）;Tag 1（SEQ ID NO:54）、Tag 2（SEQ ID NO:55）。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションのためのプローブの配列、SEQ ID NO:56〜154。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションのためのプローブの配列、SEQ ID NO:56〜154。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションのためのプローブの配列、SEQ ID NO:56〜154。フラグメントサイジングのために使用したプライマー、SEQ ID NO:155〜182;Tag 1、SEQ ID NO:183。感度の概略。 SBEおよびシークエンシングによって決定した腫瘍DNAおよび糞便DNA中の突然変異を示す図である。 SBEおよびシークエンシングによって決定した腫瘍DNAおよび糞便DNA中の突然変異を示す図である。切除後のctDNAクリアランスを示す図である。y軸は、患者9の血漿中のctDNAのレベルを示している。x軸は、切除からの経過時間を表しており、ゼロは腫瘍切除時点である。半減期を計算するために、Marquardt-Levenbergアルゴリズムに基づいてカーブフィッティング（f(t)＝a-λt）を実施したところ、114分間の半減期を得た。術前および術後の血漿中の全DNAフラグメントを示す図である。箱ひげ図は、ベースライン時（第0日）、術後（第1日）、退院日（第2〜5日）、および初回フォローアップ時（第13〜56日）にリアルタイムPCRによって推定した、血漿2mL中のDNAフラグメントの総数を示している。図16A-1〜図16E-3は、図4に示したデータに加えて、全患者についての分子生物学的、臨床的、および放射線学的データを示す図である。同一血漿サンプル中での血漿CEAとctDNAレベルの比較を示す図である。個別クラスタリングについて補正した、CEAおよびctDNAレベルを比較した偏残差プロット（partial residual plot）を示している。この比較には、全患者のCEAおよびctDNA値を使用した。患者内のクラスタリングについて補正した後には、CEAレベルとctDNAレベルとの間に穏当な全相関が見られた（r²＝0/2、P＜0.001）。血漿採取のスケジュールを示す図である。評価した18例の結腸直腸癌患者の特徴を列挙した図である。ダイレクトシークエンシングによって分析した26個のアンプリコンを示す図である。フォワードプライマー（SEQ ID NO:184〜235）。リバースプライマー（SEQ ID NO:236〜287）。Tag 1（SEQ ID NO:288）。Tag 2（SEQ ID NO:289）。ダイレクトシークエンシングによって分析した26個のアンプリコンを示す図である。フォワードプライマー（SEQ ID NO:184〜235）。リバースプライマー（SEQ ID NO:236〜287）。Tag 1（SEQ ID NO:288）。Tag 2（SEQ ID NO:289）。アンプリコンの各試験のBEAMingのために使用したプライマーを示す図である。フォワードプライマー（SEQ ID NO:290〜305）。リバースプライマー（SEQ ID NO:306〜321）。Tag 1（SEQ ID NO:322）。Tag 2（SEQ ID NO:323）。アンプリコンの各試験のために使用したプローブを示す図である（各々、SEQ ID NO:324〜383）。アンプリコンの各試験のために使用したプローブを示す図である（各々、SEQ ID NO:324〜383）。本試験の1つにおける患者の特徴を示す図である。相違する患者についてCEAおよびctDNAレベルを比較した図である。相違する患者についてCEAおよびctDNAレベルを比較した図である。相違する患者についてCEAおよびctDNAレベルを比較した図である。

本プロセスにおける第2工程は、リアルタイムPCRによる血漿中のDNAフラグメントの総数の推定である（図1A〜1C）。術前（第0日）には、上述した被験者18例における血漿1mL当たりメジアン4,000個のフラグメントが存在した（第10〜第90パーセンタイルの範囲、DNAフラグメント1,810〜12,639個/mL）。

実施例4:癌胎児性抗原との比較
癌胎児性抗原（CEA）は、結腸直腸癌を有する被験者において疾患を追跡するための標準バイオマーカーであり、この疾患の管理において通常使用されている¹⁰。試験登録前には、被験者18例中10例だけが＞5ng/mL（正常範囲の限界値）のCEAレベルを有していた（図23）。2つのアッセイ（ctDNA対CEA）間の感度におけるこの相違は、統計的有意であった;各々56％対100％（P＝0.008、McNemar検定）。さらに、術前に陽性CEAレベルを有していた被験者においてさえ、完全腫瘍切除はctDNAを用いて観察されたより少ない有意なCEAの減少を生じさせた（各々ctDNA対CEAにおける99.0％対32.5％のメジアン減少;P＜0.001、Studentのt検定）。患者内のクラスタリングについて補正後には、CEA存在量とctDNAレベルとの間に穏当な全相関が見られた（r²＝0.20、P＜0.001、図17）。最後に、第24〜48日の初回術後フォローアップ来院時に測定すると、CEAレベルが再発疾患を予測する能力はctDNAレベルの能力ほど顕著ではなかった（P＝0.03、Mantel-Cox対数順位検定による、図3b）。

Claims

以下の工程を含む、腫瘍量をモニタリングするための方法:
癌患者の血液もしくは糞便の試験サンプル中において、突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントのコピー数を測定する工程であって、該突然変異が、該癌患者の腫瘍組織中には存在するが該患者の正常組織中には存在せず、該コピー数が、該患者における腫瘍量の指標である、工程。
腫瘍組織中の遺伝子における突然変異を検出する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
正常組織中の遺伝子における突然変異の非存在を決定するために患者の正常組織を試験する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
前記遺伝子が、腫瘍中では突然変異していることが多いが、ヒトの正常組織中では変異していない、請求項1記載の方法。
試験サンプル中の突然変異を有していない遺伝子のDNAフラグメントのコピー数を測定する工程;および
比率を提供するために、前記突然変異を有するDNAフラグメントのコピー数を、該試験サンプル中の該突然変異を有していない遺伝子のDNAフラグメントのコピー数で割る工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。
癌患者の試験サンプル中のDNAの総量を測定してDNAの該総量に対する比率を標準化する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から2カ月以内に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から1週間以内に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から1日以内に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から2日後に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から2日後に検出された場合に腫瘍再発を予測する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から4時間より後に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
突然変異が、癌患者の腫瘍DNAのヌクレオチドシークエンシングによって検出される、請求項2記載の方法。
突然変異が、突然変異特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションによって検出される、請求項2記載の方法。
突然変異が、APC、KRAS、TP53、およびPIK3CAからなる群から選択される遺伝子内にある、請求項1記載の方法。
突然変異が、腫瘍抑制遺伝子または発癌遺伝子内にある、請求項1記載の方法。
測定する工程が、対立遺伝子特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションを使用する、請求項1記載の方法。
測定する工程が、エマルジョン中のビーズ上での増幅を使用する、請求項1記載の方法。
DNAフラグメントが、エマルジョン中での増幅の前に増幅させられる、請求項18記載の方法。
DNAフラグメントが、対立遺伝子特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションの前に熱変性させられ、かつ塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）の存在下で冷却される、請求項17記載の方法。
冷却が、少なくとも0.1℃/秒程度に緩徐である、請求項20記載の方法。
試験サンプルが血液である、請求項1記載の方法。
試験サンプルが糞便であり、かつ腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項1記載の方法。
測定する工程が、腫瘍量の増加、減少、または安定性をモニタリングするため複数の時点に実施される、請求項1記載の方法。
以下の工程を含む、DNA分析を実施する方法:
第1のプライマーセットおよび第2のネステッドプライマーセットを用いて鋳型DNA分析物を増幅させる工程であって、該第2のネステッドプライマーセットの第1のメンバーが5'側の配列

を含み、かつ該増幅させる工程が高忠実度DNAポリメラーゼを使用する、工程;
水性媒体中で第3のプライマーセット、および

オリゴヌクレオチドでコーティングされたストレプトアビジンビーズを使用して該増幅鋳型を増幅させる工程であって、
該第3のプライマーセットの第1のメンバーが、5'側の配列

を含み、該第3のプライマーセットの第2のメンバーが、5'側の配列

を含む、工程;
水相としての該水性媒体および油/乳化剤混合物を使用して油中水型エマルジョンを調製する工程;
該ビーズ上で該鋳型を増幅させるために該エマルジョンを熱サイクル処理する工程;
界面活性剤を使用して該エマルジョンを破壊して油相を除去する工程;
該ビーズ上の該増幅鋳型と突然変異特異的プローブ、対応する野生型プローブ、ならびに該突然変異特異的プローブおよび該対応する野生型プローブとは異なる該鋳型の一部分に対して相補的であるアンプリコン特異的プローブとの混合物を形成する工程であって、該プローブの各々が蛍光標識され、該プローブの各々が別個の発光スペクトルを有する、工程;
該混合物中の増幅された鋳型を熱変性させ、かつ該プローブを該鋳型にハイブリダイズさせるために該混合物を塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）の存在下で冷却する工程;
フローサイトメトリーを用いて、該ビーズ上の増幅鋳型にハイブリダイズした蛍光標識プローブ各々の量を検出するために該ハイブリダイズした鋳型を分析する工程。
ストレプトアビジンビーズが、

を含む

オリゴヌクレオチドでコーティングされる、請求項25記載の方法。
エマルジョンを破壊する工程が3回実施される、請求項25記載の方法。