JP2011529691A - 腫瘍動態を評価するための循環変異型dna - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌の分野に関する。詳細には、本発明は、癌の診断、予後診断、治療薬およびモニタリングに関する。
癌は、細胞増殖を制御する遺伝子の連続的変化の結果として発生する。例えば結腸もしくは乳腺の腫瘍などの充実性腫瘍では、平均するとおよそ80個の遺伝子が、実質的にすべての腫瘍細胞中には存在するが正常細胞中には存在しないわずかな突然変異を持っていることが示されている1。このことにより、これらの体細胞突然変異は、高度の特異的バイオマーカーとして機能する潜在力を有している。体細胞突然変異は、理論上では、これまでに記載された任意の他のバイオマーカーより新生物にとってはるかに特異的な指標である。このため現代の癌研究にとっての1つの課題は、体細胞突然変異をツールとして活用して疾患の検出を改善し、かつ最終的には個々の転帰に積極的に影響を及ぼすことである。
a.鋳型DNA分析物を第1のプライマーセットおよび第2のネステッドプライマーセットを用いて増幅させる工程であって、該第2のネステッドプライマーセットの第1のメンバーが5'側の配列
を含み、かつ該増幅させる工程が高忠実度DNAポリメラーゼを使用する、工程;
b.水性媒体中で第3のプライマーセットを使用して該増幅鋳型を増幅させる工程であって、該第3のプライマーセットの第1のメンバーが、5'側の配列
を含み、該第3のプライマーセットの第2のメンバーが、5'側の配列
、および
オリゴヌクレオチドでコーティングされたストレプトアビジンビーズを含む、工程;
c.水相としての該水性媒体および油/乳化剤混合物を使用して油中水型エマルジョンを調製する工程;
該ビーズ上で該鋳型を増幅させるために該エマルジョンを熱サイクル処理する工程;
界面活性剤を使用して該エマルジョンを破壊して油相を除去する工程;
d.該ビーズ上の該増幅鋳型と突然変異特異的プローブ、対応する野生型プローブ、ならびに該鋳型の一部分に対して相補的である、該突然変異特異的プローブおよび該対応する野生型プローブとは異なるアンプリコン特異的プローブとの混合物を形成する工程であって、該プローブの各々が蛍光標識され、該プローブの各々が別個の発光スペクトルを有する、工程;
e.該混合物中の該増幅された鋳型を熱変性させ、かつ該プローブを該鋳型にハイブリダイズさせるために該混合物を塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)の存在下で冷却する工程;
f.フローサイトメトリーを用いて、該ビーズ上の該増幅鋳型にハイブリダイズした蛍光標識プローブ各々の量を検出するために、該ハイブリダイズした鋳型を分析する工程。
結腸直腸癌(CRC)は、米合衆国内の癌関連死の2番目に多い原因である。CRCは、肝臓およびその他の臓器への遠隔転移前の任意の段階で検出された場合、一般には外科的切除によって治癒させることができる。残念なことに約35%の患者は、潜在性もしくは検出可能いずれかのそのような遠隔転移を診断時点に有しており、この疾患からの実質的に全死亡の原因となっている。結腸直腸新生物に対するスクリーニング試験、詳細には大腸内視鏡検査の重要性は、最近数年間における大衆の意識を高める様々な運動において強調されてきた。これはCRC関連死の減少に寄与してきた可能性が高いが、しかし今なお極めて多数の人々が外科的に治癒不能な癌を有すると診断されていることは、この問題に関する現在の努力が不十分であるという事実を証明している。具体的には、大腸内視鏡検査やその他の侵襲性手技を補完することができ、そのような不都合かつ侵襲性の手技を受けることを躊躇する患者に提供することができる非侵襲性試験が、緊急に必要とされている。この必要性は、バーチャル大腸内視鏡検査、血便についての改良されたアッセイ、糞便中の癌細胞もしくはタンパク質についての免疫組織学的試験、および遺伝的もしくはエピジェネティック変化についてのDNAをベースとする試験を含む、早期検出のための新規試験の開発を刺激してきた(Ouyang DL, Chen JJ, Getzenberg RH, Schoen RE. Noninvasive testing for colorectal cancer:a review. Am J Gastroenterol 2005;100:1393-403)。
被験者および試験設計。本試験は、the Johns Hopkins Medical Institutionsの施設内治験審査委員会によって承認された。被験者は、the Johns Hopkins Sidney Kimmel総合癌センターで外科的に治療されている原発性または転移性結腸直腸癌を有する場合に適格であった。2005年10月から2006年7月までの間に、患者31例が結腸直腸癌を有すると診断され、手術の可能性についての術前評価中にスクリーニング検査を受けた。28例の被験者が本試験に参加することに同意したが、これらの内7例は治療の候補者ではないと見なされ、被験者2例はフォローアップ中に死亡し、被験者1例は結腸直腸癌以外の医学的状態を有することが見いだされ、18例の参加者が残った。各被験者は、手術の前後および2007年10月までの彼らの術後経過中の既定間隔中に入手された血漿サンプル中でctDNAを評価する(図18)ことに同意した。本発明者らは、被験者18例から162例の血漿サンプルを予め採取した。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織が各被験者から入手され、The Johns Hopkins Medical Institutesの外科病理学研究室によって通常の方法を使用して処理された。本発明者らは、臨床評価が完了すると盲験法で腫瘍組織および血漿サンプルの分析を実施した。腫瘍のサイズをコンピュータ断層撮影法を用いて放射線学的に測定し、腫瘍量を推定するためにはcm単位の断面積測定値を使用した。
BEAMingによる循環変異型ctDNAの定量は、癌を有する被験者における疾患を評価するための個別化手法を提示する。このプロセスにおける第1工程は、被験者の腫瘍における体細胞突然変異の同定である(図1A〜1B)。図19は、本試験で評価された結腸直腸癌を有する被験者の特徴を列挙している。4種の遺伝子を被験者18例由来の腫瘍におけるダイレクトシークエンシングによって評価すると、腫瘍の各々は少なくとも1つの突然変異を有することが見いだされた(図20)。
本発明者らは、本試験の経過中に計22例の手術後に被験者18例を評価した(図19)。術前(第0日)に決定したctDNAレベルは、サンプル1例当たり1.3〜23,000個の変異鋳型の範囲内で大きく変動した(サンプル1例当たりメジアン99個の変異鋳型;範囲:第10〜第90パーセンタイル、3〜2,837個)。これらの手術中17例は全顕性腫瘍組織の完全切除を含んでいたが、5例は不完全切除であった。完全切除を受けた全被験者では退院日(手術から2〜10日後)までのctDNAレベルにおける急落が観察され、これはctDNAにおける99.0%のメジアン減少(範囲:第10〜第90パーセンタイル、58.9〜99.8%;図24A〜24C)であった。この減少は手術の24時間後に既に明白であった(96.7%のメジアン減少、範囲:第10〜第90パーセンタイル、31.4〜100.0%)。完全切除後の初期の複数回の時点に血漿がサンプリングされた被験者の評価を通して、本発明者らは、術後のctDNAの半減期が114分間であると推定した(図15)。
癌胎児性抗原(CEA)は、結腸直腸癌を有する被験者において疾患を追跡するための標準バイオマーカーであり、この疾患の管理において通常使用されている10。試験登録前には、被験者18例中10例だけが>5ng/mL-1(正常範囲の限界値)のCEAレベルを有していた(図23)。2つのアッセイ(ctDNA対CEA)間の感度におけるこの相違は、統計的有意であった;各々56%対100%(P=0.008、McNemar検定)。さらに、術前に陽性CEAレベルを有していた被験者においてさえ、完全腫瘍切除はctDNAを用いて観察されたより少ない有意なCEAの減少を生じさせた(各々ctDNA対CEAにおける99.0%対32.5%のメジアン減少;P<0.001、Studentのt検定)。患者内のクラスタリングについて補正後には、CEA存在量とctDNAレベルとの間に穏当な全相関が見られた(r2=0.20、P<0.001、図17)。最後に、第24〜48日の初回術後フォローアップ来院時に測定すると、CEAレベルが再発疾患を予測する能力はctDNAレベルの能力ほど顕著ではなかった(P=0.03、Mantel-Cox対数順位検定による、図3b)。
本試験のために、以前の試験を通して獲得されていた、結腸直腸癌を有する被験者由来の標本を評価した7。被験者は、家族歴によって決定されるCRCに対する平均リスク状態にあり、いずれのタイプの癌についても個人歴は有していなかった。非特異的腹部症状または皮膚の基底細胞癌もしくは扁平上皮癌の病歴を有する患者は除外しなかった。糞便および血液標本は大腸内視鏡検査の6〜12日後およびその後の手術のための任意の腸管前処置の前に採取した。本試験には、以前に同定された癌症例40例中25例を含めたが7、これは15症例が不適正な量の残留物を有していたからである。患者の特徴は、表1に要約した:患者中7例はステージI、7例はステージII、8例はステージIII、2例はステージIVそして1例はステージ未確定の癌を有していた。血液サンプルは、患者25例中16例からEDTAを含むBD Vacutainer試験管(Becton Dickinson社、米合衆国ニュージャージー州フランクリンレイクス(Franklin Lakes, NJ USA))中に採血した。血漿は、1380gでの30分間にわたる血液の遠心分離によって調製した。上清を新しい試験管に移し、再遠心した。遠心分離後、血漿は、残留している細胞破片を除去するためにMillipore Ultrafree-MC 0.45μフィルターデバイス(Millipore社、米合衆国マサチューセッツ州ビルリカ(Billerica,MA,USA))へ移した。フィルターデバイスに1,380gで15分間にわたる遠心分離にかけた。透明になった血漿を新規試験管に移し、処理するまで-20℃で保管した。
以前に報告されたように、外科的切除後に得られた組織を突然変異分析のために使用した5,4。手短には、急速冷凍またはパラフィン包埋した顕微解剖腫瘍組織は、QIAamp DNAミニキット(Qiagen社、カリフォルニア州バレンシア(Valencia,CA))を用いて腫瘍DNAを単離するために使用した。全DNAサンプルは、一塩基伸長(SBE)アッセイを用いて、そしてPIK3CAのエクソン9および20、CTNNBlのエクソン3、ならびにAPCのエクソン15についてのシークエンシング手法を用いて、APC、TP53、およびKRASにおける22の共通突然変異を分析した。シークエンシングは、4つの別個のシークエンシング反応において各々がR110標識AcyloTerminatorヌクレオチド(PerkinElmer社)ならびにThermoSequenase(GE社)およびAcycloPol(PerkinElmer社)の混合物を含有する一本鎖DNA鋳型を使用して実施した。結合した2つのマーカーパネルは、本試験のために入手できる24例の腫瘍サンプル中での少なくとも1つの突然変異を同定することができた(表2)。SBEおよびシークエンシングの感度は、各々75%(18/24)および79%(19/24)であった(図13)。
標的遺伝子に富んでいるヒトDNA(APC、TP53、KRAS、およびPIK3CA)は、可逆的電気泳動捕捉親和性プロトコル(RECAP)8を使用して全糞便DNAから精製した。
DNAは、QIAamp MinEluteウイルス真空キット(Qiagen社)を製造業者が推奨するとおりに使用して2mLの血漿から精製した。DNAは、EBバッファー(Qiagen社)中に溶出させ、-20℃で保存した。以前に記載したように9、血漿から単離した全DNAの量は、ヒトLINE-1定量的リアルタイムPCRアッセイの修正バージョンを用いて定量した。詳細は、実施例6に記した。
血漿および糞便DNAをBEAMingによって体細胞突然変異について分析した。総計すると、33種の相違する突然変異分析のために18の増幅プライマーセットを設計した。各糞便サンプルについて、計30,000のゲノム当量を分析した。1ゲノム当量は3.3pgのゲノムDNAであると規定され、半数体細胞中に存在するDNA量と同等である。2mLの血漿から精製されたDNAに対応する量を各BEAMingアッセイのために使用した。初回増幅は、各々が250μLの血漿と同等の鋳型DNAまたは糞便DNAの3,750ゲノム当量を含有する、複数の50μLのPCR反応液中で実施した。各反応は、5×Phusion高忠実度バッファー、1.5単位のHotstart Phusionポリメラーゼ(どちらもNEB社)、0.2μMの各プライマー、0.25mMの各dNTP、および0.5mMのMgCl2から構成された。ネステッドPCR反応は、選択した標的領域のために実施した;第2回増幅のためには、2μLの初回PCRを、相違するプライマーを使用した以外は上記に記載したものと同一の構成の20μLのPCR反応液に加えた。プライマー配列およびサイクリング条件は図9に列挙した。PCR産物をプールし、希釈し、PicoGreen dsDNAアッセイ(Invitrogen社)を使用して定量した。BEAMing方法については以前に記載されており10、本試験において使用した修正については本明細書に記載した。
本発明者らは、APC(20)、KRAS(4)、PIK3CA(4)、またはTP53(5)のいずれかにおける33種の相違する塩基変化を検出するためのBEAMingの性能を評価した。BEAMing法は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)手法がビーズ結合DNAの分析のために開発されたという重要な相違以外は以前に記載されたとおりに実施した(図1A〜1C)。ハイブリダイゼーションは、固定化した野生型もしくは変異型DNA配列に相補的な、等モル濃度の蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて実施した。全33種の塩基変化についての最適対立遺伝子識別には、初期変性工程、その後の塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)をベースとするバッファー中での緩徐な冷却プロセス11によって達した。本発明者らが評価することを試みた全突然変異(1〜5bpの範囲内の転位、塩基転換、挿入または欠失)は、この単一TMACに基づくハイブリダイゼーション法を使用すると、高い信号対騒音比で上首尾で検出された。
BEAMingは変異型DNA鋳型を検出するためだけではなくそれらの存在量を精密に定量するためにも使用できるので、CRC患者の糞便中に存在する無細胞変異型および正常DNAの量および質の両方を決定するために使用できた。このため本発明者らは、CRC患者の糞便中に存在する変異型DNAフラグメントのサイズを分析することによって本試験を開始した。このために、6つのPCRプライマーセットは、局所性結腸直腸癌を有する患者4例において見出された様々なAPC突然変異を含むDNAフラグメントの増幅のために設計された。患者中2例はステージIの癌を有し、2例はステージIIの癌を有していた(図11)。これらのプライマーを用いて得られたアンプリコンのサイズは104bp〜1,197bpの間で変動し、突然変異は各アンプリコンの中央に位置した(図7A)。各アッセイにおいて等質量(181mg)の糞便から精製したDNAを使用した。変異型もしくは正常鋳型分子の数は、変異型もしくは正常DNA配列に結合したビーズの各割合に定量的リアルタイムPCRによって測定したDNA濃度を掛けることによって計算した。全4例の患者において、増幅可能な正常DNAフラグメントの数は、アンプリコンのサイズが増加するにつれて減少した。患者2では、この減少は3倍に過ぎなかったが、他の3例の患者ではこの減少は1,000倍までとより激しかった(図7B)。変異型DNAフラグメントはサイズとともに、類似ではあるが同一ではない方法で減少した(図7C)。結果として、変異型DNAフラグメントの割合は最小アンプリコン中で最高であった(図7D);患者4および14では、最大アンプリコンサイズ(1200bp)が使用された場合には変異型DNAフラグメントを検出できなかった。これらの知見は、糞便DNA中の突然変異についての試験の感度が小さなアンプリコンを使用することによって最適化できることを示唆した点で重要であった。この結果に基づいて、本試験のその後の段階で使用した全BEAMingアッセイは、可能である場合は必ず約100bpの、そして決して126bpを超えないアンプリコンを用いて実施した(図9)。
本試験に含まれた患者25例の臨床病理学的特徴を表1にまとめた。
血液および血漿の16対の適合サンプルを分析のために入手できた。各サンプルについて、患者の腫瘍内で見いだされた突然変異の1つを分析のために選択した。表2において認められるように、これらの患者16例中14例(87.5%)は、検出可能なレベルで突然変異を含有していた。変異型DNAフラグメントは血漿サンプルの小さな比率で見いだされた(16例中8例[50%];血漿および糞便アッセイにおける陽性患者の数間の相違についてのp値は、精密McNemar検定によると0.07であった)。両方の試験について陰性であったのは患者1例(患者5)だけで、患者1例は陰性糞便試験結果を有したが、血漿試験結果は陽性であった(患者16)。陽性と判定された患者では、変異型DNAのメジアン割合は糞便(0.37%)および血漿(0.42%)中で類似であった。
18例の腫瘍標本を肝臓または結腸手術後に採取し、ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。10μmの切片を作製し、PEN膜スライド(Palm GmbH社、独国ベルンリート(Bernried, Germany))上に載せた。切片は脱パラフィン化し、ヘマトキシリン&エオシンで染色した。全標本について、MicroBeamレーザー顕微解剖機器(Palm社)を用いて完全に乾燥させた標本から切除した腫瘍組織の存在を確認するために組織学検査を実施した。切除した腫瘍組織は15μLのATLバッファー(Qiagen社)および10μLのプロテイナーゼK(20mg/mL;Invitrogen社)中で一晩かけて60℃で消化させた。DNAは、QIAamp DNAマイクロキット(Qiagen社)を製造業者のプロトコルにしたがって使用して単離した。単離したDNAは、以下に記載するようにhLINE-1定量的PCRによって定量した。
腫瘍組織から単離した全DNAサンプルをAPC(19)の26領域、KRAS(1)の1領域、PIK3CA(2)の2領域、およびTP53(4)の4領域においてダイレクトSangerシークエンシングを使用して突然変異について分析した。FFPE組織中のDNAの変性に起因して、アンプリコンサイズは、長さ74〜132bpとなるように選択した。初回PCRは、鋳型DNAの50〜100ゲノム当量(GE)(1GEは3.3pgのヒトゲノムDNAと同等である)、0.5単位のPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社)、1×PCRバッファー(67mMのTris-HCl、pH8.8、67mMのMgCl2、16.6mMの(NH4)2SO4、および10mMの2-メルカプトエタノール)、2mMのATP、6%(v/v)のDMSO、1mMの各dNTP、ならびに0.2μMの各プライマーを含有する10μLの反応容量中で実施した。プライマーセットの配列は、図20に列挙した。増幅は、以下の条件下で実施した:94℃で2分間;94℃で15秒間、68℃で30秒間、70℃で15秒間の3サイクル;94℃で15秒間、65℃で30秒間、70℃で15秒間の3サイクル;94℃で15秒間、62℃で30秒間、70℃で15秒間の3サイクル;94℃で15秒間、59℃で30秒間、70℃で15秒間の40サイクル。次に1μLの初回増幅液を、相違するプライマーを使用した以外は上記に記載したものと同一構成の第2の10μLのPCR反応混合液に加えた(図10)。第2回(ネステッド)PCR反応は、以下の条件を使用して温度サイクル処理にかけた:94℃で2分間;95℃で15秒間、58℃で30秒間、70℃で15秒間の15サイクル。PCR産物はAMpureシステム(Agencourt社、マサチューセッツ州ベバリー(Beverly, MA))を使用して精製し、BigDye Terminator v3.1(Applied Biosystems社)を使用して両方向からシークエンシングした。シークエンシングに使用したプライマーは、最初の30塩基についての配列の質を向上させるために5'側先端に付着した30bpのpolyTタグを有していた(Tag 1プライマー:
;M13プライマー:
)。シークエンシング反応は、自動96-キャピラリーDNAシークエンサー(Spectrumedix社、ペンシルベニア州ステートカレッジ(State College,PA))上で分解させた。データ分析は、Mutation Explorer(SoftGenetics社、ペンシルベニア州ステートカレッジ(State College,PA))を用いて実施した。
血漿サンプルから単離した全DNAの量は、ヒトLINE-1定量的リアルタイムPCRアッセイの修正バージョン1を用いて定量した。ヒトLINE-1ファミリーの最も豊富なコンセンサス領域内のサイズが様々に相違する領域を増幅させるために3種のプライマーセットを設計した(79bpのフォワード:
、79bpのリバース:
;97bpのフォワード:
、97bpのリバース:
;127bpのフォワード:
、127bpのリバース:
)。PCRは、2μLの血漿と同等の鋳型DNA、0.5単位のPlatinum Taq DNAポリメラーゼ、1×PCRバッファー(上記参照)、6%(v/v)のDMSO、1mMの各dNTP、1:100,000の希釈率のSYBR Green I(Invitrogen社)、および0.2μMの各プライマーからなる25μLの反応容量で実施した。増幅は、iCycler(Bio-Rad社)内で以下のサイクリング条件を使用して実施した:94℃で1分間;94℃で10秒間、67℃で15秒間、70℃で15秒間の2サイクル;94℃で10秒間、64℃で15秒間、70℃で15秒間の2サイクル;94℃で10秒間、61℃で15秒間、70℃で15秒間の2サイクル;94℃で10秒間、59℃で15秒間、70℃で15秒間の35サイクル。標準として保存するために、各プレート構成には様々な希釈率の正常ヒトリンパ球DNAを組み入れた。閾値サイクル数は、Bio-Rad分析ソフトウエアを使用してPCRベースライン値を減じて決定した。各定量は、2回ずつ実施した。全DNAは、突然変異について評価されるアンプリコンのサイズに最も近いLINE-1アンプリコンを用いて計算した(図11)。アンプリコンが2つの相違するLINE-1アンプリコンへ同等に近い場合は、平均濃度を使用した。血漿を用いたコントロール実験では、本発明者らは、LINE配列のアッセイによって評価されたゲノム当量の数がAPC、KRAS、PIK3CA、またはRASのゲノム当量(GE)の数と高度に相関することを見いだした。GEを測定するためにこれらの個別遺伝子ではなくむしろLINE配列をベースとするアッセイを選択したのは、ゲノム内での高度の繰返しの性質のゆえに、後者の方が前者よりも、GEを測定するのに必要な血漿がはるかに少量であったためである。
20個の突然変異を分析するために、相違する12種のプライマーセットを設計した(図11)。2mLの血漿から精製されたDNAを各BEAMingアッセイのために使用した。高忠実度DNAポリメラーゼを用いた初回増幅は、8つの別個の50μLのPCR反応液中で実施したが、これらは各々250μLの血漿からの鋳型DNA、5×Phusion高忠実度PCRバッファー(NEB社)、1.5単位のHotstart Phusionポリメラーゼ(NEB社)、0.2μMの各プライマー、0.25mMの各dNTP、および0.5mMのMgCl2を含有していた。温度サイクル処理は、図11に記載したように実施した。図11に列挙したプライマーを使用して、第2回PCR(ネステッド)は、最初の構成と同一構成の20μLのPCR反応液に2μLの初回増幅液を加えることによって実施した。PCR産物をプールし、希釈し、PicoGreen dsDNAアッセイ(Invitrogen社)を使用して定量した。蛍光強度はCytoFluorマルチウエルプレートリーダー(PE Biosystems社)を使用して測定し、DNA量はλファージDNA参照標準を用いて計算した。
、8μMのTag 2
およびTag 1オリゴヌクレオチド
がコーティングされた約6×107の磁性ストレプトアビジンビーズ(MyOne、Invitrogen社)を含有する150μLのPCR混合液を調製した。150μLのPCR反応液、600μLの油/乳化剤ミックス(7%のABIL WE09、20%の鉱油、73%のTegosoft DEC(Degussa Goldschmidt Chemical社、バージニア州ホープウェル(Hopewell,VA))、および1個の5mm径スチール製ビーズ(Qiagen社)を96ディープウエルプレート1.2mL(Abgene社)に加えた。エマルジョンは、このプレートをTissueLyser(Qiagen社)内において15Hzで10秒間、次に17Hzで7秒間攪拌することによって調製した。エマルジョンは、8個のPCRウエル内に分注し、94℃で2分間;94℃で10秒間、68℃で45秒間、70℃で75秒間の3サイクル;94℃で10秒間、65℃で45秒間、70℃で75秒間の3サイクル、94℃で10秒間、62℃で45秒間、70℃で75秒間の3サイクル;94℃で10秒間、59℃で45秒間、70℃で75秒間の50サイクルで温度サイクル処理にかけた。
図16A-1〜16E-3も参照されたい。
患者1は、最初は直腸癌のために低位前方切除術を受けたが、PET/CTスキャニングを用いて複数の肝転移を有することが見いだされた。この患者は5-フルオロウラシル、オキサリプラチン(FOLFOX)およびベバシズマブを用いる術後化学療法(化学療法)を2サイクルにわたり受けたところ、反復イメージングによって良好な応答が明らかになった。本試験登録時に、この患者は右肝切除術および左肝葉楔状切除術および胆嚢摘出術を受け(手術)、その後に5-フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチンおよびベバシズマブを用いる化学療法を受けた(化学療法)。反復イメージングは、複数の新規肺病巣および2つの新規肝病巣を明らかにした。様々な他の化学療法レジメンを利用したが、疾患の継続的進行が生じた。この患者は現在は第I相臨床試験に参加することが検討されている。
Claims (27)
- 以下の工程を含む、腫瘍量をモニタリングするための方法:
癌患者の血液もしくは糞便の試験サンプル中において、突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントのコピー数を測定する工程であって、該突然変異が、該癌患者の腫瘍組織中には存在するが該患者の正常組織中には存在せず、該コピー数が、該患者における腫瘍量の指標である、工程。 - 腫瘍組織中の遺伝子における突然変異を検出する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 正常組織中の遺伝子における突然変異の非存在を決定するために患者の正常組織を試験する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
- 前記遺伝子が、腫瘍中では突然変異していることが多いが、ヒトの正常組織中では変異していない、請求項1記載の方法。
- 試験サンプル中の突然変異を有していない遺伝子のDNAフラグメントのコピー数を測定する工程;および
比率を提供するために、該突然変異を有するDNAフラグメントのコピー数を、該試験サンプル中の該突然変異を有していない遺伝子のDNAフラグメントのコピー数で割る工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 癌患者の試験サンプル中のDNAの総量を測定してDNAの該総量に対する比率を標準化する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
- 突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から2カ月以内に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から1週間以内に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から1日以内に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から2日後に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から2日後に検出された場合に腫瘍再発を予測する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 突然変異を有する遺伝子のDNAフラグメントが腫瘍切除から4時間より後に検出された場合にアジュバント療法を勧告する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 突然変異が、癌患者の腫瘍DNAのヌクレオチドシークエンシングによって検出される、請求項2記載の方法。
- 突然変異が、突然変異特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションによって検出される、請求項2記載の方法。
- 突然変異が、APC、KRAS、TP53、およびPIK3CAからなる群から選択される遺伝子内にある、請求項1記載の方法。
- 突然変異が、腫瘍抑制遺伝子または発癌遺伝子内にある、請求項1記載の方法。
- 測定する工程が、対立遺伝子特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションを使用する、請求項1記載の方法。
- 測定する工程が、エマルジョン中のビーズ上での増幅を使用する、請求項1記載の方法。
- DNAフラグメントが、エマルジョン中での増幅の前に増幅させられる、請求項18記載の方法。
- DNAフラグメントが、対立遺伝子特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションの前に熱変性させられ、かつ塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)の存在下で冷却される、請求項17記載の方法。
- 冷却する工程が、少なくとも0.1℃/秒程度に緩徐である、請求項20記載の方法。
- 試験サンプルが血液である、請求項1記載の方法。
- 試験サンプルが糞便であり、かつ腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項1記載の方法。
- 測定する工程が、腫瘍量の増加、減少、または安定性をモニタリングするため複数の時点に実施される、請求項1記載の方法。
- 以下の工程を含む、DNA分析を実施する方法:
第1のプライマーセットおよび第2のネステッドプライマーセットを用いて鋳型DNA分析物を増幅させる工程であって、該第2のネステッドプライマーセットの第1のメンバーが5'側の配列
を含み、かつ該増幅させる工程が高忠実度DNAポリメラーゼを使用する、工程;
水性媒体中で第3のプライマーセットを使用して該増幅鋳型を増幅させる工程であって、該第3のプライマーセットの第1のメンバーが、5'側の配列
を含み、該第3のプライマーセットの第2のメンバーが、5'側の配列
、および
オリゴヌクレオチドでコーティングされたストレプトアビジンビーズを含む、工程;
水相としての該水性媒体および油/乳化剤混合物を使用して油中水型エマルジョンを調製する工程;
該ビーズ上で該鋳型を増幅させるために該エマルジョンを熱サイクル処理する工程;
界面活性剤を使用して該エマルジョンを破壊して油相を除去する工程;
該ビーズ上の該増幅鋳型と突然変異特異的プローブ、対応する野生型プローブ、ならびに該突然変異特異的プローブおよび該対応する野生型プローブとは異なる該鋳型の一部分に対して相補的であるアンプリコン特異的プローブとの混合物を形成する工程であって、該プローブの各々が蛍光標識され、該プローブの各々が別個の発光スペクトルを有する、工程;
該混合物中の増幅された鋳型を熱変性させ、かつ該プローブを該鋳型にハイブリダイズさせるために該混合物を塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)の存在下で冷却する工程;
フローサイトメトリーを用いて、該ビーズ上の増幅鋳型にハイブリダイズした蛍光標識プローブ各々の量を検出するために該ハイブリダイズした鋳型を分析する工程。 - エマルジョンを破壊する工程が3回実施される、請求項25記載の方法。
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