KR20220052467A - Egfr 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 대장암 재발 예측용 조성물 - Google Patents

Egfr 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 대장암 재발 예측용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장암 수술 전 환자의 혈액을 채취하고 얻어진 혈액으로 차세대염기서열 분석을 수행한 결과, EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커가 확인되었으며, 대장암 환자 중 재발된 환자와 재발되지 않은 환자의 혈액에서 상기 EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커가 차이를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커는 대장암 환자의 재발 예후 예측용 조성물, 재발 예후 예측용 키트 및 재발 예후 예측 방법으로 제공될 수 있다.

Description

EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 대장암 재발 예측용 조성물{Composition for predicting recurrence of colorectal cancer comprising single nucleotide polymorphism marker in EGFR gene}
본 발명은 EGFR 유전자 (Gene ID: 1956) 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 조성물, 재발 예후 예측용 키트 및 재발 예후 예측 방법에 관한 것이다.
대장암(colorectal cancer)이란 대장에 생긴 암세포로 이루어진 악성종양으로, 대장은 파이프 모양의 관으로 안쪽에서부터 점막층, 점막하층, 근육층, 장막층 등 4개의 층으로 나뉘어져 있는데, 대부분의 대장암은 대장의 점막에서 발생하는 선암이며, 이 외에도 림프종, 육종, 편평상피암, 다른 암의 전이성 병변 등이 있다. 대장암은 전 세계에서 세 번째로 많이 발병하는 암으로 연간 100만 건 이상이 발병하는 것으로 알려져 있고, 국내에서도 2015년 기준 남녀 전체에서 암 발생률 2위, 2016년 기준 암 사망률 3위를 기록하였으며, 사망 환자의 대부분은 전이에 의한 것으로 알려져 있다. 대장암은 초기에 진단이 될 경우 5년 생존율이 90%에 달하지만 초기 대장암은 아무런 증상이 없어 3, 4기로 진행된 후에야 발견되는 경우가 많고 s자 결장경이나 대장내시경 등을 통해서 진단해야하므로 조기진단에 많은 어려움이 있다. 또한, 대장암 수술을 받은 후 약 40%의 환자에서 대부분 2~3년 내에 원래 암이 있던 부위 또는 간, 폐, 골수 등에 재발이 나타난다고 보고되어 있다. 따라서 보다 간편하고 효율적인 대장암 검사를 통해 조기 진단하는 것이 무엇보다 중요하며, 대장암 수술 후에도 재발여부를 미리 예측하는 것 또한 중요하다.
현재까지 대장 내시경의 침습성, 고비용, 위험 인자 존재, 분변검사의 낮은 특이성이나 민감성의 단점이 제시되어옴에 따라서 덜 침습적이며 더욱 효과적이고 안정적인 대장암 진단 방법의 개발이 필요하게 되었으며, 이에 따라 대장암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있는 바이오마커에 관한 연구가 다양하게 이루어져 왔다. 현재 대장암의 진단 및 예후 예측 등에 사용되는 바이오마커로써 CEA(Carcinoembryonic Antigen)가 대표적으로 임상에서 이용되고 있는데, CEA는 광범위한 상피성 악성종양에 대한 종양표지자로 여러 암에서 증가하는 경향을 보이지만 특히, 대장암의 병기, 예후 판정, 재발 판정에 보편적으로 이용되고 있다. 또한, 이와 더불어 CA199, CA125, 또는 CA153 등을 마커로 사용하기도 하지만 상기 마커들은 특이성 및 민감도가 낮아 위양성 판정의 가능성이 있다고 보고되어 있다.
따라서 대장암에서 특이성이 높은 바이오마커를 발굴하는 것이 매우 중요하다.
대한민국 공개특허 제10-2013-0046457호 (2013.05.08. 공개)
종래 수술적 절제를 통한 병리결과에 의해서 확인이 가능했던 대장암 재발 위험성 평가 방법은 매우 침습적이며, 연속적인 측정이 불가능한 문제점이 확인됨에 따라, 본 발명은 대장암 환자의 혈액 시료를 이용하여 EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 확인함으로써 비침습적이고 정확하게 대장암 재발 예후를 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전형이 변이형인 경우, 대장암이 재발 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 대장암 재발 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 대장암 수술 전 환자의 혈액을 채취하고 얻어진 혈액으로 차세대염기서열 분석을 수행한 결과, EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커가 확인되었으며, 대장암 환자 중 재발된 환자와 재발되지 않은 환자의 혈액에서 상기 EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커가 차이를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 EGFR 유전자 내의 단일염기다형성 마커는 대장암 환자의 재발 예후 예측용 조성물, 재발 예후 예측용 키트 및 재발 예후 예측 방법으로 제공될 수 있다.
도 1은 분리된 환자의 종양 ctDNA를 이용하여 차세대염기서열분석을 수행하여 EGFR 유전자 패널에 단기염기서열변이 (single nucleotide variation, SNV)를 확인한 결과이다.
도 2는 대장암 환자 중 재발된 환자와 재발되지 않은 환자의 혈액에서 분리된 ctDNA를 이용하여 차세대염기서열분석을 수행하여 SNV 검출 차이를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 SNP 마커 조성물을 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 G/A이고, 상기 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드의 대립유전자는 T/A인 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 단일염기다형성(SNP) 변이는 EGFR(c.1562G>A)로, rs2227983로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/A이다. 상기 서열번로 2의 56번째 뉴클레오디드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 단일염기다형성(SNP) 변이는 EGFR(c.1887T>A)로, rs2227984로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자 형은 T/A이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "n N>M" (이때, n은 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다.)은 유전자 염기서열에서 n번째 N 염기가 M 염기로 변이된 것을 의미한다.
상기 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 A일 수 있으므로, r 로 기재하였으며, 상기 서열번호 2의 56번째 뉴클레오디드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는 데, T 또는 A일 수 있으므로, w 로 기재하였다.
본 명세서에서 용어 "예후 예측"은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "다형성(polymorphism)"은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 ‘단일염기다형성’, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.
본 발명은 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 키트를 제공할 수 있다.
상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트가 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다.
프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전형이 변이형인 경우, 대장암이 재발 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 대장암 재발 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계에서, DNA는 대상의 혈액, 피부세포, 점막 세포 및 모발 등 모든 세포로부터 분리될 수 있다. 해당 세포로부터 DNA를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 DNA 추출용 키트를 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 상기 시료는 혈액이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 DNA는 순환종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자형을 확인하는 단계에서는 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 서열분석은 당업계에 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 자동염기서열분석기를 사용하거나, 표적 심층 염기서열분석(targeted deep sequencing; TDS), 드랍렛 디지털 중합효소연쇄반응(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 및 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드인 A이 거나, 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드인 A인 경우 대장암 재발 위험성이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 대장암 환자의 혈액에서 순환종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 추출
정상인과 수술 전 대장암 환자의 혈액을 채취하고, Maxwell RSC를 이용하여 ctDNA를 분리하였다.
먼저, EDTA 튜브에 보관된 전혈(whole blood) 시료를 2000 × g에서 10분간 원심 분리하여 혈장 (plasma)층을 새로운 튜브에 옮겨 담은 후 2000 × g에서 다시 10분간 원심분리하였다.
원심분리한 시료의 상층액 1 ml를 플레이트 웰에 분주하고, Maxwell cartridge를 준비하였으며, 프로그램화된 자동화 장비를 이용하여 ctDNA를 분리하였다.
또한, Quality Control Assays를 수행하여 ssDNA 및 dsDNA를 분리하고, Maxwell RSC를 이용하여 ssDNA 및 dsDNA를 양적 확인하였다.
<실시예 2> 차세대염기서열분석 (Next Generation Sequencing; NGS)을 통한 단일염기다형성(SNP) 확인
실시예 1과 같은 방법으로 각 실험군에서 분리된 ctDNA를 이용하여 차세대염기서열 분석을 수행하였다.
실시예 1과 같은 방법으로 각 실험군에서 분리된 ctDNA를 이용하여 차세대염기서열 분석을 수행하였다.
해당 유전자의 모든 코딩 영역과 엑손-인트론 경계를 포함하여 제작하였다. 이를 위해 바이러스 RNA 샘플을 추출하여 cDNA를 합성하고 일루미나 염기서열 분석 장비에서 분석할 수 있도록 단편화하였다. end-repair, dA-tailing, adapter ligation, PCR을 통한 indexing 과정을 거쳐 염기서열분석장비에서 인식하고 분석할 수 있는 라이브러리로 제작하였다.
준비된 라이브러리는 일루미나의 Nextseq550(Illumina, San Diego, CA, USA)에서 150bp paired-end 방식으로 염기서열분석을 진행하였다.
그 결과, 도 1과 같이 대장암 환자의 EGFR 유전자 영역에서 단일염기다형성 (SNP) 변이가 검출되었으며, 상기 변이 영역은 G1562A (c.1562 G＞A) 및 T1887A (c.1887 T＞A)로 확인되었다.
<실시예 3> EGFR 유전자 변이 영역을 이용한 대장암 재발 예후 예측
앞선 실험에서 확인된 EGFR 유전자 내 변이가 대장암 재발 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있는지 확인을 위해, 대장암 환자 중 재발되지 않은 환자군 (contro)과 대장암이 재발된 환자 (recur)의 혈액시료를 채취하고, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 차세대염개서열 (NGS) 분석을 수행하여 EGFR 유전자 내 변이(SNV)를 확인하였다.
그 결과, 도 2와 같이 대장암이 재발되지 않은 환자군과 비교하여 대장암이 재발된 환자군의 혈액시료에서 EGFR 유전자 내 G1562A 및 T1887A 변이가 매우 높은 수준으로 검출되는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 EGFR 유전자 내 G1562A 및 T1887A 변이의 검출 수준은 대장암 환자의 재발여부 예후 예측을 위한 효과적인 바이오마커로 제공될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Composition for predicting recurrence of colorectal cancer comprising single nucleotide polymorphism marker in EGFR gene <130> ADP-2020-0514 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 113 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> EGFR G1562A <400> 1 aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 60 grtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acg 113 <210> 2 <211> 110 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> EGFR T1887A <400> 2 cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg gaatgcgtgg acaagwgcaa 60 ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct gagtgcatac 110

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 SNP 마커 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 G/A이고, 상기 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드의 대립유전자는 T/A인 것을 특징으로 하는 대장암 재발 예후 예측용 SNP 마커 조성물.
  3. 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 조성물.
  4. 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 대장암 재발 예후 예측용 키트.
  5. 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
    상기 확인된 유전형이 변이형인 경우, 대장암이 재발 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 대장암 재발 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 대장암 재발 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 DNA는 순환종양 DNA (ctDNA)인 것을 특징으로 하는 대장암 재발 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 서열번호 1의 62번째 뉴클레오티드인 A이 거나, 서열번호 2의 56번째 뉴클레오티드인 A인 경우 대장암 재발 위험성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 대장암 재발 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
KR1020200136447A 2020-10-21 2020-10-21 Egfr 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 대장암 재발 예측용 조성물 KR20220052467A (ko)

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KR20130046457A (ko) 2011-10-28 2013-05-08 전남대학교산학협력단 신규한 대장암 진단용 마커 및 이를 이용한 대장암 진단 키트

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