KR20220126039A - 대장암 재발 예측용 바이오마커 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EMC1, APOL1, ZBED3, TMEM268, TMEM214, SRPRA, RPS6KA4, RAB15, NINJ1, L3MBTL2, ETS2, 및 CABLES2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커 측정용 시약을 포함하는 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물, 그 조성물을 이용한 대장암 재발 예측 방법 및 그 키트에 관한 것이다. 본 발명은 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있는 마커를 개발하게 되어, 대장암 환자 치료 전략 수립에 기여할 수 있다.

Description

대장암 재발 예측용 바이오마커 및 그 용도{Biomarker for predicting recurrence of colorectal cancer and use thereof}

본 발명은 대장암 재발 예측용 바이오마커 및 그 바이오마커를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 대장암 재발 예측용 조성물 및 키트 등을 포함하는 용도에 관한 것이다.

대장암(colorectal cancer)이란 대장에 생긴 암세포로 이루어진 악성종양으로, 대장은 파이프 모양의 관으로 안쪽에서부터 점막층, 점막하층, 근육층, 장막층 등 4개의 층으로 나뉘어져 있는데, 대부분의 대장암은 대장의 점막에서 발생하는 선암이며, 이 외에도 림프종, 육종, 편평상피암, 다른 암의 전이성 병변 등이 있다.

대장암은 전 세계에서 세 번째로 많이 발병하는 암으로 연간 100만 건 이상이 발병하는 것으로 알려져 있고, 국내에서도 2015년 기준 남녀 전체에서 암 발생률 2위, 2016년 기준 암 사망률 3위를 기록하였으며, 사망 환자의 대부분은 전이에 의한 것으로 알려져 있다. 대장암은 초기에 진단이 될 경우 5년 생존율이 90%에 달하지만 초기 대장암은 아무런 증상이 없어 3, 4기로 진행된 후에야 발견되는 경우가 많고 s자 결장경이나 대장내시경 등을 통해서 진단해야하므로 조기진단에 많은 어려움이 있다.

또한, 대장암 수술을 받은 후 약 40%의 환자에서 대부분 2~3년 내에 원래 암이 있던 부위 또는 간, 폐, 골수 등에 재발이 나타난다고 보고되어 있다. 따라서 보다 간편하고 효율적인 대장암 검사를 통해 조기에 진단하는 것이 무엇보다 중요하며, 대장암 수술 후에도 재발여부를 쉽고 효율적으로 진단하는 것 또한 중요하다.

현재까지 대장 내시경의 침습성, 고비용, 위험 인자 존재, 분변검사의 낮은 특이성이나 민감성의 단점이 제시되어옴에 따라서 덜 침습적이며 더욱 효과적이고 안정적인 대장암 진단 방법의 개발이 필요하게 되었으며, 이에 따라 대장암을 진단하거나 재발 예후를 예측할 수 있는 바이오마커에 관한 연구가 다양하게 이루어져 왔다.

현재 대장암의 진단 및 재발 예후 예측 등에 사용되는 바이오마커로써 CEA(Carcinoembryonic Antigen)가 대표적으로 임상에서 이용되고 있는데, CEA는 광범위한 상피성 악성종양에 대한 종양표지자로 여러 암에서 증가하는 경향을 보이지만 특히, 대장암의 병기, 예후 판정, 재발 판정에 보편적으로 이용되고 있다.

또한, 이와 더불어 CA199,CA125, 또는 CA153 등을 마커로 사용하기도 하지만 상기 마커들은 특이성 및 민감도가 낮아 위양성 판정의 가능성이 있다고 보고되어 있다(Zhou et al, 2012, Zhao et al, 2015)

따라서 대장암에서 특이성이 높고 재발을 정확하게 예측할 수 있는 바이오마커를 발굴하는 것이 매우 중요하다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제10-2019-0113106호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 대장암 재발 예측 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 대장암 재발 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 대장암 재발 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 대장암 재발 예측에 대한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 EMC1, APOL1, ZBED3, TMEM268, TMEM214, SRPRA, RPS6KA4, RAB15, NINJ1, L3MBTL2, ETS2, 및 CABLES2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커 측정용 시약을 포함하는 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 조성물은 EMC1, APOL1, 및 ZBED3 바이오마커로 구성된 조성물에 대한 측정용 시약을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,

상기 시약은 상기 각 바이오마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,

상기 핵산 서열 또는 핵산 서열의 단편은 상기 각 바이오마커를 특이적 결합할 수 있는 프라미어, 또는 프로브, 또는 프라이머 및 프로브인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,

상기 시약은 상기 각 바이오마커의 역전사 중합효소연쇄반응, 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 라이게이션 기반 중합효소 연쇄반응, 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,

상기 바이오마커는 대장암 3기 환자 시료로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여,

대장암 재발이 의심되는 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;

상기 시료에서 EMC1, APOL1, ZBED3, TMEM268, TMEM214, SRPRA, RPS6KA4, RAB15, NINJ1, L3MBTL2, ETS2, 및 CABLES2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현량을 측정하는 단계;

상기 측정 결과를 대조군의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계;

및

상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 발현량에 변화가 있는 경우, 이를 대장암 재발로 판정하는 단계

를 포함하는, 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 검출은 교잡, 핵산 증폭 또는 RNA 시퀀싱 방법에 의한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,

상기 교잡은 마이크로어레이 분석, 상기 핵산 증폭은 역전사효소중합연쇄반응법인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 생물학적 시료는 대장암 환자의 조직, 전혈, 혈장 또는 혈청인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,

상기 방법은 초음파 검사, 복강경 검사, 조직검사, 대장암 표지 인자 검사, 경정맥신우조영술, 대장내시경검사, 컴퓨터단층촬영, 자기공명영상, 또는 양전자단층촬영 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 사용되는 시약을 포함하는 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 80명의 한국인 대장암 환자로부터 유래한 종양조직과 종양조직 주변 정상조직으로부터 RNA-seq 데이터를 생산하고, 이로부터 예후 예측 마커를 탐색하였음. 샘플을 재발군 (25)과 비재발군 (55)개로 나눈 다음, 발현 양상을 재발군의 정상과 비재발군의 정상, 재발군의 종양과 비재발군의 종양을 비교하여, 치료 예후에 따라 발현이 유의하게 달라진 유전자 발현 탐색하였다.

또한, 샘플을 TNM stage에 따라 2기 샘플과 3기 샘플을 나눈다음 앞서 언급한 유전자 발현차이를 재발군과 비재발군 비교하였다.

이로부터, 3기 샘플의 종양 주변조직 정상조직의 재발군과 비재발군에서 유의한 발현차이를 보이는 12개 바이오마커 유전자를 선별하였다.

본 발명에서 중요한 점은 재발암의 정상조직 (RC-n)과 비재발암의 정상조직 (RC-n) 비교에서 가장 효과가 좋으며, 특히 3기 대장암 샘플을 대상으로 했을 때 가장 효과가 좋은 바이오 마커들이다.

본 발명에서 대상으로 하는 질병인 “대장암”은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 악성 종양을 의미하며, 대장암 환자는 대부분 전이에 의해 사망하는 것으로 보고되어 있다. 대장암은 초기에 진단이 될 경우 5년 생존율이 90%에 달하지만 초기 대장암은 아무런 증상이 없어 3, 4기로 진행된 후에야 발견되는 경우가 많고 고비용의 침습성인 대장내시경 등을 통해서 진단해야하므로 조기진단에 많은 어려움이 있고, 수술 후의 재발율이 약 40%에 달한다고 알려져 있다.

따라서 보다 간편하고 효율적인 대장암 검사를 통해 조기에 진단하고 재발을 예측하는 것이 무엇보다 중요하다.

본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다.

상술하면, 본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 질환의 치료 후 재발 여부 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 진단은 대장암의 재발 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.

본 발명에서 용어 “바이오마커” 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 대장암이 재발한 환자의 정상 조직과 재발하지 않은 환자의 정상 조직 또는 재발한 환자의 대장암을 포함하는 조직과 재발하지 않은 환자의 대장암을 포함하는 조직의 유전자 발현의 차이를 통하여 얻어진 물질로, 정상 검체 (대조군)에 비하여 재발이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 핵산을 포함한다.

본 발명원에 따른 바이오마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개의 조합으로 사용될 수 있으며, 기존의 마커 및/또는 진단방법등과 함께 사용될 수 있다.

당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.

본 발명에서 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 (교잡) 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 본 발명에 따른 마이크로알엔에이의 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본 발명에 따른 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본 발명에서 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.

본 발명에 따른 일 구현예에서는 EMC1, APOL1, ZBED3, TMEM268, TMEM214, SRPRA, RPS6KA4, RAB15, NINJ1, L3MBTL2, ETS2, 및 CABLES2로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이오마커 유전자 또는 이들의 조합이 사용된다.

본 발명에서 “생물학적 시료”란 생물유래의 장기, 조직, 세포 또는 체액을 일컫는 것이다. 생물학적 시료의 예로는 조직 절편, 전혈, 혈장, 혈청, 소변 또는 혈액 유래의 백혈구, 적혈구 또는 혈소판, 또는 조직 또는 세포 배양물을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

또한 하나 이상의 상기 시료가 혼합되어 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 대장암 재발이 의심되는 환자로부터 통상의 시료 수득방법에 의해 대상체로부터 직접 수득한 것이거나 또는 종전에 분리되어 보관된 것일 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 조직, 세포, 전혈, 혈청 또는 혈장과 같은 혈액시료가 사용된다.

본원에 따른 일구현예에서 이러한 시료는 수술, 방사선요법, 항암화학요법 또는 기타 치료 전에 수득된다.

일 구현예에서는 조직, 세포, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 대장암이 발생 또는 재발한 또는 발생또는 재발이 의심되는 또는 발생 또는 재발 가능성이 있는 대상체에서 수득한 조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 조직 또는 혈액의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 대상체는 질환에 걸린 것으로 의심되는 포유류, 질환에 걸린 후 치료가 되었으나 재발이 의심되는 포유류, 특히 인간을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예후(prognosis)”란, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 대장암의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미하는 것이나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

상기 바이오마커의 발현을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 DNA 및/또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다.

방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 바이오마커의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

증폭된 산물은 주형으로 사용한 분자와 상응하는 서열을 가지며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서 예를 들면 젤 전기영동, 실시간 PCR 분석, SSCP (single strand conformational polymorphism), RFLP(restriction fragment length polymorphism), CZE(capillary zone electrophoresis), WAVE (HPLC-based nucleic acid analyzing technology), 마이크로칩을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또한 본 발명의 바이오마커 유전자는 직접적 또는 간접적 방법에 의해 검출될 수 있다. 직접적 방법에서 바이오마커는 이에 결합된 검출가능한 표지로 표지되고 이어 비드와 같은 고상지지체에 연결된 프로브에 결합된 후 표지된 바이오마커를 스크리닝하여 검출된다.

대안적으로 직접 검출에 표지된 프로브가 사용될 수 있으며, 바이오마커와 특이적 결합 후 표지된 프로브의 스크리닝을 통해 검출된다. 일 구현예에서는 증폭된 바이오마커는 목적하는 핵산을 캡쳐할 수 있는 프로브와 컨쥬게이션된 비드를 이용하여 검출된다. 다른 구현예에서 프로브는 형광물질로 표지될 수 있다.

간접적 검출방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면 바이오티닐화 프로브를 스트렙타비딘 컨쥬게이트된 염료와사용하여 결합된 핵산을 검출할 수 있다. 스트렙타비딘 분자는 증폭된 바이오마커 유전자의 바이오틴 표지에 결합하며, 결합된 바이오마커 유전자는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 염료에 의해 검출된다. 이러한 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 염료는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면 Phycolink(R) Streptavidin R-Phycoerythrin (PROzyme)이 사용될 수 있다.

검출을 위한 표지자 (label)는 이로 제한하는 것은 아니나, 광방출, 광산란, 광흡수 물질과 같은 검출가능한 형광, 화학발광 또는 생발광 신호를 생성 또는 소거할 수 있는 화합물을 포함하며, 예를 들면 Garman A, Non-Radioactive Labeling, Academic Press 1997을 참조할 수 있다.

형광 물질은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니다 플루오레신 (예를 들면 미국특허 6,020,481), 로다민 (예를 들면 미국 특허 6,191,278), 벤조페녹사진 (예를 들면 미국특허 6,140,500), 공여체와 수용체를 포함하는 에너지 전이 형광 염료 (예를 들면 미국특허 5,945,526) 및 사이아나인 (예를 들면 WO1997-45539), 리사민, 파이코에리쓰린, Cy2, Cy3, Cy35, Cy5, Cy55,Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPYR6G,BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, 6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red,Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetramethylrhodamine, 및/또는 Texas Red는 물론 기타 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 형광 모이어티를 포함한다.

형광염료는 6-carboxyfluorescein; 2′,4′,1,4,-tetrachlorofluorescein; 및 2′,4′,5′,7′,1,4-hexachlorofluorescein를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서는 형광 표지로 SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein (“FAM”), TET, ROX, VICTM, 또는 JOE가 사용된다. 일 구현예에서는 리포터 형광물질과 소거형광물질의 두 개의 형광물질로 표지된 프로브가 사용되며, 이 경우 형광물질은 구분이 가능한 파장이 스펙트럼을 방출하는 형광물질이 사용된다.

또한 표지자는 핵산의 결합을 향상, 안정화 또는 핵산의 결합에 영향을 미칠 수 있는 화합물 예를 들면 에씨디움 브로마이드 및 SYBR-Green을 포함하는 인터칼레이터, 마이너그루브 결합체 및 가교가능한 작용기가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, Blackburn et al, eds “DNA and RNA Structure” in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)을 참조할 수 있다.

따라서 본원에 따른 조성물은 상술한 방법 중 어느 하나 이상의 방법에 사용되는 시약을 포함할 수 있다.

본 발명의 진단 또는 재발 예후 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물,용액 또는 장치로 구성된다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다.

상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RNA 시퀀싱을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

또한 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 본 발명의 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제,DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 본 발명의 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 재발 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 방법에 따라 대장암 환자 유래 종양 주위 부위 조직에서 분리한 시료 내 본 발명의 바이오마커의 발현 수준이 정상인과 차이가 날 경우에 대장암 재발 가능성이 높다고 판정할 수 있고,

또한 대장암 수술 후의 환자 유래 종양 주위 부위 조직에서 분리한 시료 내 본 발명의 바이오마커의 발현 수준이 정상인과 차이가 있는 경우에 대장암 재발 예후를 예측할 수 있다.

상기 바이오마커의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응

(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA),마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "대장암의 재발 예후 예측을 위한 정보제공방법"은 재발 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 대장암의 예후 예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

본 방법은 특정 기간 동안 예를 들어 1년에 걸쳐 수차례 수행될 수 있으며, 발현 패턴의 변화 추이 모니터링에 사용될 수 있다.

마커의 종류에 따라 발현의 증가 또는 감소를 대장암 상태와 연관지을 수 있다. 동일 대상체에 대한 종전의 검사수치 또는 대조군의 수치와 비교하여, 대장암 특히 재발 대장암의 발병, 진행, 악화 등의 판단에 사용될 수 있다. 시간의 경과에 따른 대장암 마커의 변화를 근거로 대장암의 진행 또는 재발을 막기 위한 예방적 조치를 취할 수 있다.

또한 대장암의 재발 확진을 위해, 바이오마커는 보조 수단으로 사용될 수 있으며, 다른 진단 방법 예를 들면 조직검사, 초음파, 컴퓨터단층촬영 (computerized axial tomography (CT scan)) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging (MRI)) 검사와 함께 사용될 수 있다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있는 마커를 개발하게 되어, 대장암 환자 치료 전략 수립에 기여할 수 있으며.

본 발명의 바이오마커는 수술, 항암제 및 방사선 치료 후의 예후 예측이 가능한 마커로 임상 현장에서 예후 판별하고, 환자 맞춤형 치료 전략 수립하는 데 기여함으로써 시장성이 큰 마커가 될 수 있을 것이다.

도 1은 Pattern5B 117개 유전자의 그룹별 비교 heatmap을 나타낸 그림,
도 2는 재발을 유의하게 예측하는 유전자들의 odd ratio table 및 plot에 관한 그림,
도 3은 odd ratio가 유의한 12개 유전자로 다시 구성한 heatmap과 Recurrence Predict Score를 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:RNA-seq 데이터 수집

https://www.kobis.re.kr/ (샘플 ID : KBRS20191011, KBRS20181121 및 KBRS20181023)에서 CRC 샘플에서 추출한 대량 mRNA-seq 데이터를 다운로드했다.

모든 염기 서열 분석 데이터는 삼성 서울 병원에서 생산되었다. TMN 4 단계의 샘플을 제외한 후 55 개의 'nRC'샘플과 25 개의 'RC'샘플로 구성된 총 160 개의 샘플이 본 발명에서 분석되었다.

'nRC'와 'RC'를 정의하기 위해 후 향적 임상 정보가 사용되었다.

본 발명에서 언급했듯이 'nRC'의 NAT와 종양은 각각 'nRC-n'과 'nRC-t'로 명명되었으며 'RC'의 NAT와 종양은 'RC-n'과 'RC-t'로 각각 명명되었다.

실시예 2:유전자 발현의 정량화

레퍼런스 매핑 및 raw 리드의 계산은‘STAR’(Dobin, A. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15-21 (2013)) 및‘HTseq’(Anders, S., Pyl, P. T. & Huber, W. HTSeq―a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics 31, 166-169 (2015))파이프 라인을 사용하여 수행되었다.

요약하면, 'FastQC'프로그램 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/)을 사용하여 샘플의 raw read 품질을 확인했다.

레퍼런스 게놈 파일‘GRCh38.p12’는‘genomeGenerated’옵션을 사용하여‘STAR’v020201에 의해 인덱싱되었다. 'fastq'파일에서 확인된 read는 'STAR'v020201을 사용하여 색인된 인간 게놈 참조에 정렬되었다.

정렬된 read는 'htseq-count'를 사용하여 정량화되었다.

주석은 Ensembl (gencode v29)의 GTF 파일을 사용하여 수행되었다.

실시예 3: DEG 분석

DEG는 R 패키지‘DESeq2’(Love, M. I., Huber, W. & Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014))을 사용하여 추정되었다.

두 개의 임계 값, 조정된 P 값 (즉, Q- 값) <0.01 및 |log₂fold 변화 (fc)| > 1 (즉, abs (log2fc))은 하우스 키핑 유전자를 제외한 후 종양과 정상 조직 간의 유전자 발현을 비교하여 DEG를 추정하는데 적용되었다.

하우스 키핑 유전자 목록은 두 개의 독립적인 연구, 즉 Eisenberg et al.(2013)[Eisenberg, E. & Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. TRENDS in Genetics 29, 569-574 (2013)] 및 Chang et al. (2011)[Chang, C. et al. Identification of human housekeeping genes and tissue-selective genes by microarray meta-analysis. PloS one 6, e22859 (2011)]의 3,804 개의 유전자와 2,064 개의 유전자에서 중복된 목록으로 얻어졌다.

실시예 4: 유전자 온톨로지 분석

유전자 온톨로지 (GO) 분석은 'GSEA MSigDB' (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/annotate.jsp)를 사용하여 수행되었다(Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 15545-15550 (2005); Liberzon, A. et al. Molecular signatures database (MSigDB) 3.0. Bioinformatics 27, 1739-1740 (2011)).

유전자의 생물학적 기능은 ' GO : BP '옵션, 여기서 P- 값 <0.05 (FDR 방법에 의해 조정됨)를 충족하는 기능 용어만 선택되었다.

실시예 5:분산 분석 (ANOVA) 테스트

먼저 'Shapiro' 테스트 (P> 0.05)를 통해 4 개 그룹의 CRC 샘플, 즉 'nRC-n', 'RC-n', 'nRC-t', 'RC-t'에 대한 데이터의 정규성을 확인했다[Shapiro, S. S. & Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples)Biometrika 52, 591-611 (1965)].

4 개 그룹 모두에 대한 정규성 기대치를 충족하는 발현을 가진 유전자에 대해서는 Tukey 테스트(Abdi, H. & Williams, L. J. Tukey's honestly significant difference (HSD) test. Encyclopedia of research design 3, 583-585 (2010))에 의한 사후 hoc 테스트와 함께 ANOVA를 수행했다.

그러나 적어도 하나의 그룹에 대한 정규성 기대치를 충족하지 못하는 발현을 가진 유전자에 대해서는 pairwise-Wilcox 테스트에 의한 사후 hoc 테스트와 함께 Kruskal-Wallis 테스트를 수행했다.

사후 hoc 테스트는 유전자가 4 개 그룹간에 유의하게 다르게 발현되는지 여부에 대한 P- 값을 제공했다. 그 후, ANOVA에 의해 선택된 유전자는 종양 샘플과 정상 샘플 사이의 중첩되는 상향/하향 조절된 DEG에 따라 10 개의 다른 서브그룹의 패턴으로 분할되었다.

실시예 6: 침윤성 백혈구 마커 유전자 목록

암 침윤 백혈구 마커 유전자 목록은 Patrick Danaher et al. (2017) [Danaher, P. et al. Gene expression markers of tumor infiltrating leukocytes. Journal for immunotherapy of cancer 5, 18 (2017)]으로부터 추출하였다.

4 개의 다른 세포 유형 (B 세포, T 세포, CD8 + T 세포, 헬퍼 T 세포)을 포함하는 림프 하위 집합을 나타내는 총 18 개의 마커 유전자 및 3 개의 세포 유형( 수지상 세포 (DCs), 대식세포 및 비만 세포)을 포함하는 골수 하위 집합을 나타내는 12 개의 마커 유전자를 얻었다.

상기 본 발명의 데이터 분석의 모든 통계 분석은 R 패키지 'Bioconductor'[Huber, W. et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature methods 12, 115-121 (2015)]를 사용하여 수행되었다.

다양한 플롯은 R 패키지 'ggplot2'[ Wickham, H. in ggplot2: elegant graphics for data analysis (springer, 2016)]을 사용하여 구성되었다.

상기 실시예의 결과는 아래와 같다.

도 1은 Pattern5B 117개 유전자의 그룹별 비교 heatmap을 나타낸다.

ANOVA를 통해서 밝혀낸 Pattern5B의 117개 유전자들을, 대장암의 재발 여부를 구별하는 마커유전자 후보로 선정했다.

그리고 본 발명에서 밝혀낸 마커 유전자들이 이미 잘 알려진 예후인자인 TNM stage의 영향과 독립적이라는 것을 확인하기 위해 샘플을 TNM stage 2기와 3기로 구분하여 분석을 진행했다.

Heatmap상에서 볼 수 있듯 Pattern5B의 117개 유전자들이 TNM stage를 구분했음에도 불구하고 정상조직간 비교(nRC-n vs RC-n)에서 대장암의 재발 여부를 구별할 수 있으며, 특히 TNM stage 3기에서 그 양상이 뚜렷하게 관찰되는 것을 확인 할 수 있다.

도 2는 재발을 유의하게 예측하는 유전자들의 odds ratio table 및 plot에 관한 그림으로,

도 1에서 밝힌 마커유전자들의 발현에 따른 대장암의 재발 예측 정도를 정량적으로 판단하기 위해, 각 그룹별 비교에서 유전자들의 odds ratio를 계산했다.

odds ratio는 z-score를 기반으로 측정된 유전자 발현의 up or down을 통해 계산되었다.

유전자의 odds ratio가 높을수록, 발현이 증가했을 때 대장암의 재발 가능성이 높다고 판단할 수 있다.

117개 유전자의 odds ratio를 계산후 통계적 유의성을 추정하여 보정된 p-value값이 0.05 미만인 유전자를 선별했고, 그 결과 TNM stage 3기 내의 정상조직을 비교한 그룹에서 12개의 유전자와, 종양조직을 비교한 그룹에서 2개의 유전자를 도출했다.

도 3은 odds ratio가 유의한 12개 유전자로 다시 구성한 heatmap과 Recurrence Predict Score를 나타낸 그림으로,

TNM stage3기의 정상조직을 비교한 분석에서 선별된 12개의 유전자 발현으로 다시 heatmap을 구성했고, nRC-n과 RC-n이 명확하게 구별된 것을 확인할 수 있다.

그리고 12개 마커 유전자의 odds ratio 합에 기반해 Recurrence Predict Score를 계산하였으며, 그 score에 의해 nRC-n과 RC-n이 구별되는것 또한 확인할 수 있다.

또한 상위 3개의 마커를 이용하여서도 재발을 예측할 수 있음을 보여준다.

Claims (12)

1. EMC1, APOL1, ZBED3, TMEM268, TMEM214, SRPRA, RPS6KA4, RAB15, NINJ1, L3MBTL2, ETS2, 및 CABLES2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커 측정용 시약을 포함하는 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 EMC1, APOL1, 및 ZBED3 바이오마커로 구성된 조성물에 대한 측정용 시약을 포함하는 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 시약은 상기 각 바이오마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편을 포함하는 것인, 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 핵산 서열 또는 핵산 서열의 단편은 상기 각 바이오마커를 특이적 결합할 수 있는 프라미어, 또는 프로브, 또는 프라이머 및 프로브인, 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 시약은 상기 각 바이오마커의 역전사 중합효소연쇄반응, 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 라이게이션 기반 중합효소 연쇄반응, 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 바이오마커는 대장암 3기 환자 시료로부터 유래한 것을 특징으로 하는 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 조성물.
   
7. 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
   대장암 재발이 의심되는 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;
   상기 시료에서 EMC1, APOL1, ZBED3, TMEM268, TMEM214, SRPRA, RPS6KA4, RAB15, NINJ1, L3MBTL2, ETS2, EMC1, 및 CABLES2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현량을 측정하는 단계;
   상기 측정 결과를 대조군의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계;
   및
   상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 발현량에 변화가 있는 경우, 이를 대장암 재발로 판정하는 단계
   를 포함하는, 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 검출은 교잡, 핵산 증폭 또는 RNA 시퀀싱 방법에 의한 것인, 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 교잡은 마이크로어레이 분석, 상기 핵산 증폭은 역전사효소중합연쇄반응법인, 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
   
10. 제 7 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 대장암 환자의 조직, 전혈, 혈장 또는 혈청인, 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
    
11. 제 7 항에 있어서,
    상기 방법은 초음파 검사, 복강경 검사, 조직검사, 대장암 표지 인자 검사, 경정맥신우조영술, 대장내시경검사, 컴퓨터단층촬영, 자기공명영상, 또는 양전자단층촬영 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 재발 대장암의 진단 또는 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
    
12. 제 7 항의 방법에 사용되는 시약을 포함하는 대장암 재발 예측 또는 재발 대장암 진단용 키트.

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