JP2011525523A5 - - Google Patents
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Claims (24)
- 凝固FVIII の精製または濃縮方法であって、
マトリックスに結合する部分を含むマルチモーダル樹脂上でクロマトグラフィーを使用し、前記部分が、混合物中で、イオン相互作用および、その他の種類の相互作用によって、FVIIIと相互作用することができ、
以下の工程
−高イオン強度の水溶液中にFVIIIを含有するフラクションを提供する工程;
−FVIIIを含有するフラクションをマルチモーダル樹脂と接触させる工程;
−任意に、吸着されたFVIIIを有する前記マルチモーダル樹脂を水性洗浄緩衝液で洗浄する工程;
−pH 6〜8で正に荷電する、リシン、アルギニン、ヒスチジンおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも一つのアミノ酸を含む水性溶出緩衝液で、FVIII含有フラクションを溶出する工程;および
−任意に、FVIII含有フラクションを精製または濃縮形態で回収する工程
を含む、方法。 - 前記部分が、水性環境において、イオン相互作用および、水素結合および疎水性相互作用から選択される他の種類の相互作用によって、FVIIIと相互作用することができる、請求項1の方法。
- FVIIIが組み替えFVIIIであることを特徴とする、請求項1または2のいずれか一項の方法。
- 組み替えFVIIIがB-ドメイン欠失FVIIIであることを特徴とする、請求項3の方法。
- 前記水溶液が、25℃で25〜200 mS/cmの導電率に対応する高塩溶液中にFVIIIを含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項の方法。
- リシン、アルギニン、またはヒスチジンが>0.4Mの濃度で存在することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項の方法。
- 前記溶出緩衝液が、少なくとも一つの水酸基を含有する有機化合物、少なくとも一つのCa2+イオンの供給源、緩衝液のイオン強度を調節する少なくとも一つの化合物、少なくとも一つの非イオン性洗浄剤、および、pHを6〜8に調節する少なくとも一つの緩衝物質をさらに含んでいることを特徴とする、請求項6の方法。
- 前記の水酸基を含有する有機化合物がアルコールであることを特徴とする請求項7の方法。
- 前記の緩衝液のイオン強度を調節する化合物が無機塩であることを特徴とする請求項7または8の方法。
- 前記緩衝物質がpHを中性値に調節する緩衝物質であることを特徴とする請求項7〜9のいずれか一項の方法。
- 前記の水酸基を含有する有機化合物が、メタノール、プロパノール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールよりなる群から選択され;前記のCa2+の供給源がCaCl2であり;前記の緩衝液のイオン強度を調節する化合物が、KClおよびNaClよりなる群から選択され;前記非イオン性洗浄剤が、ツイーン20、ツイーン80およびプルロニックF68よりなる群から選択され;前記緩衝物質が、pH 6〜8の間で、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、HEPES、MESおよび酢酸ナトリウムよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項7〜10のいずれか一項の方法。
- 前記洗浄緩衝液を前記マルチモーダル樹脂に適用して、FVIIIを放出する前に、混入物質を洗い流し、FVIIIを保持することを特徴とする、請求項7〜11のいずれか一項の方法。
- 前記「マルチモーダル」クロマトグラフィー樹脂が少なくとも一つの以下の部分を含有することを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項の方法:
a. 正に荷電したN-ベンジル-N-メチルエタノールアミンリガンド、
b. 負に荷電した2-(ベンゾイルアミノ)ブタン酸リガンド、
c. フェニルプロピルリガンド、
d. N-ヘキシルリガンド、
e. 4-メルカプト-エチル-ピリジンリガンド、
f. 3-((3-メチル-5-((テトラヒドロフラン-2-イルメチル)-アミノ)-フェニル)-アミノ)-安息香酸リガンドまたはそれらの組み合わせ。 - 前記「マルチモーダル」クロマトグラフィー樹脂が、以下の市販の樹脂;HEPハイパーセル(商標);PPAハイパーセル(商標);カプト・アドヘア(商標);カプトMMC(商標); MEPハイパーセル(商標)から選択されることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項の方法。
- 前記マルチモーダルクロマトグラフィー工程が、FVIIIアフィニティークロマトグラフィー工程と組み合わさり、ここで、前記アフィニティーがイーストで発現するタンパク質に基づくリガンドによって与えられることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項の方法。
- 前記精製手順が、化学的不活化工程、サイズに基づく除去工程、クロマトグラフィー工程またはそれらの組み合わせであって、工程が病原体の除去を目的とする種々の生理学的特性に基づく工程を含む、病原体の除去/不活化工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項の方法。
- 前記精製手順が以下の工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項の方法:
i.アニオン性膜;
ii.カチオンマルチモーダル樹脂;
iii.カチオン交換樹脂;
v.脂質エンベロープウイルスの化学的不活化工程;
vi.タンパク質リガンドに基づくアフィニティー樹脂、イーストにおいて発現される抗体断片よりなるVIIISelectリガンド、またはアニオンマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂;
vii.平均孔径20 nmでの病原体濾別工程;
viii. アニオン交換樹脂;
ix.サイズ排除クロマトグラフィー樹脂。 - アニオン性膜がDNA低減のためのアニオン性膜であることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 脂質エンベロープウイルスの化学的不活化がトリ-n-ブチルホスフェートおよびトリトンX-100を用いる溶媒/洗浄剤不活化であることを特徴とする請求項17または18に記載の方法。
- 前記カチオン交換工程のFVIIIの溶出条件がCaに基づき、濃度が0.15〜0.25Mの範囲であり、前記溶出緩衝液の総導電率が25℃で25mS/cmを超えないことを特徴とする、請求項17〜19のいずれか一項の方法。
- 最終精製工程後の純度が>4000 IU/mgタンパク質であり、DNA含量が、<1000 pg/1000 IU FVIIIであることを特徴とする、請求項17〜20のいずれか一項の方法。
- 最終精製工程後の純度が>9000 IU/mgタンパク質であることを特徴とする、請求項21の方法。
- 最終精製工程後の純度が>10 000 IU/mgタンパク質であることを特徴とする、請求項21の方法。
- DNA含量が<100 pg/1000 IU FVIIIであることを特徴とする、請求項21〜23のいずれか一項の方法。
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