JP2011525380A - リン酸カルシウムを含有する生体材料 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
− 支持体が顆粒形態で使用された場合、均一な液体ペースト、
− 支持体がモノリスの形態で使用された場合、その空洞が液体で満たされたモノリス
の形態である。
(a)支持体、例えばBCP又はHAが配置される無菌の内部空洞を含む無菌デバイス
(b)凝固剤を含む無菌リザーバ
を含むキットの形態であり得る。
I−凝固に対するBCP及びHAの効果
1.原理:
原理は、手術室で実施した即時的な手順を伴う。原理は、ポリプロピレンシリンジのボディにおいて、BCP粒子及び凝固剤CaCl2を混合することにある。骨欠損が認められた部位におけるこの生体材料の移植により、生体材料の周囲における凝固が促進される。
2.1.二相性リン酸カルシウム粒子:
二相性リン酸カルシウム(BCP)生体材料は、60%のヒドロキシアパタイト(HA;Ca10(PO4)6(OH)2)、及び40%のリン酸三カルシウム(TCP;Ca3(PO4)2)から構成される。40ミクロン〜200ミクロンの大きさのBCP粒子は、Graftys SARL社(Aix-en-Provence, France)により提供された。粒子を、180℃で2時間加熱することにより滅菌した。
C57BL/6マウス(Janvier, Le Genest-St-Isle, France)血漿中のカルシウム濃度を測定した。この血漿は、1800gで15分間の遠心分離により、ヘパリン上で採取した血液から調製した。ヘパリンは、血漿中カルシウム濃度を変化させない抗凝固剤として使用する。解析は、Hitachi製の自動デバイス(Orleans, France)において実施した。
図1A〜図1Dに示したように、その中をプランジャ(3)が移動する中空の円筒形ボディ(2)を含むシリンジ(1)を使用する。プランジャにより閉止されていないボディ(2)の端部では、シリンジのボディはフィルタストッパ(4)により閉止される。プランジャの端部(5)とフィルタストッパ(4)との間のシリンジのボディ(2)には、BCPの顆粒(6)がある(図1A)。その使用の前に全体を滅菌した。フィルタストッパ(4)を担持しているシリンジの端部を、1%の濃度のCaCl2の水溶液(8)を満たした容器(7)に配置する。プランジャ(3)の後方への動きにより溶液(8)がシリンジ(1)のボディ(2)中に引き上げられる(図1B)。BCP粒子に溶液を含浸させるために全体を10分間静置し、その後プランジャ(3)により、CaCl2の過剰の溶液(8)をフィルタストッパ(4)により排出する(図1C)。フィルタ(9)をフィルタストッパ(4)から取り外し、プランジャ(3)に対して圧力をかけることにより、溶液(8)を含浸させたBCP顆粒(6)を手術部位(10)上に堆積させることが可能となる(図1D)。その後移植部位を再び塞ぐ(工程は示していない)。
3.1.凝固に対するヒドロキシアパタイト及びTCPの効果:
1ml容シリンジのボディの中に、50mgのHA粉末又はTCP粉末を配置した。HA又はTCPのいずれかを含有する各シリンジに100μlの血液を加えた。この混合物をホイール(wheel)上に配置して、凝固時間(すなわち10分)の間、血液における懸濁液中に粉末を留まらせた。各実験において、他と同様に(すなわちホイール上で10分)処理した100μlの全血を含有する1つのシリンジが、凝固に関する陽性対照の役割を果たした。10分後、ホイールを停止し、シリンジを回収し、それらの端部を切断し、シリンジプランジャを用いて押すことにより血液/粉末混合物を引き抜く。粉末の周囲における血液の凝固が、観察される又は観察されない。各実験を3回繰り返した。
対照:凝固に関する陽性対照。塊及び血清凝集物(serum extrudate)が観察された。
抗凝固剤の非存在下で新たに採取し、直ぐにBCP粒子(50mg)と混合した血液(100μl)が凝固しないことが観察された。この抗凝固効果は、CaCl2(20μlの1%CaCl2溶液)の添加により消失し、BCPによる血漿中カルシウムの取り込みを示唆する。BCPとの接触前後における血漿中のカルシウム濃度を測定することによりこの仮説を確認した。これに関して、ヘパリン(血漿中カルシウム濃度を変化させない抗凝固剤)上で採取したC57BL/6マウス血液から血漿を調製した。BCPの存在下で、2.06±0.06mmol/l(正常値)からBCPの存在下における0.59±0.07mmol/lまでの血漿中カルシウム濃度の減少が観察された。
1.原理:
50mgの一定分量のBCP(60/40)微小粒子、又は50mgの一定分量のHA若しくはβ−TCPを、50μlのH2O又は50μlのCaCl2・2H2Oの2.5mMの溶液のいずれかと接触させ、終夜56℃で乾燥させた。これらの生体材料を、96ウェルマイクロプレートのウェル中に堆積させた。ヘパリン(カルシウムレベルに干渉しない抗凝固剤)上で採取したC57BL/6マウス血液から調製した100μlの血漿を、各ウェルに添加する。インキュベーションの15分後、800gで2分間プレートを遠心分離し、血漿のカルシウム濃度をアッセイするために上清を採取した。カルシウムアッセイは、QuantiChromカルシウムアッセイキット(Centaur, Brussels, Belgium)を使用して、また製造業者の取扱説明書に従って実施した。これに関して、5μlの一定分量の上清を、200μlのフェノールスルホンフタレイン(遊離のカルシウムの存在下で青色の安定な錯体を形成する色素)の溶液と接触させた。3分間のインキュベーション後、試料中のカルシウム濃度に正比例する612nmで測定した呈色強度を得る。各プレートにおいて、以下のカルシウム濃度(0mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM)を使用して較正範囲を調製する。
血漿と接触させた、微小粒子形態のBCP及びまたHA粉末が、上記血漿のカルシウム濃度の相当のかつ有意な減少を誘導することが認められた(図2)。カルシウム濃度の減少はBCP及びHAに関しては類似しており、β−TCPに関しては観察されない。血漿単独に関して得られた値(1.960±0.044mM)、BCPの存在下における血漿に関して得られた値(0.871±0.160mM)、及びHAの存在下における血漿に関して得られた値(0.840±0.121mM)に基づいて、カルシウムの取り込みをBCP又はHA50mg当たりカルシウム0.125μmolと評価した。
1.原理:
BCP及びHAにより誘導される凝固の抑制と血漿中カルシウムの減少との間の因果関係が存在することを実証するために、50μlの150mM NaCl又は50μlの2.5mM CaCl2・2H2Oの添加後に、50mgの一定分量のBCP(60/40)微小粒子、及び50mgの一定分量のHA粉末に対する凝固試験を実施した。
抗凝固剤で処理していない血液の添加、及び15分間の回転の後で、BCP及びHAへのカルシウムの事前添加によりこれら2つの生体材料と接触させた血液の凝固を再確立することが可能となることが認められた(図3A)。
上で記載した試験時に粘着性のゲル化インプラントの形成がないことにより可視化されるBCPの抗凝固効果は、分子レベルでは、塊の枠組みを形成するフィブリンネットワークの形成の抑制に対応する。フィブリンネットワークの存在を走査型電子顕微鏡観察により解析した。これに関して、抗凝固剤を添加していない100μlの血液を、50mgのBCP、又はカルシウムの存在下でインキュベートしその後乾燥した50mgのBCPと混合することにより、インプラントを調製した。ホイール上での15分の回転後、混合物を型から取り出し、0.1Mリン酸緩衝液(pH7)中に1.6%のグルタルアルデヒドを含有する固定溶液中に直接浸漬した。試料をその後洗浄し、漸増濃度のアルコールのボウル(bowls)を使用して脱水し、ヘキサメチルジシラザン(Sigma-Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France)中に5分間浸漬し、常温で乾燥した。アルミニウム支持体上にマウントして金/パラジウムで4分間カバーした(Polaron、A5100、UK)後、走査型電子顕微鏡(日本電気株式会社、6700F、日本)を使用して解析を実施する。
Claims (15)
- 少なくとも1つのカルシウム由来の凝固剤の溶液を含浸させたリン酸カルシウムベースの支持体を含む生体材料であって、該支持体はヒドロキシアパタイト及びBCPから選択され、該凝固剤は1mMol/l〜50mMol/lの範囲の濃度を有する水溶液の形態であり、凝固剤溶液とHA又はBCPとの割合は体積/体積基準でHA又はBCPの体積に対して凝固剤溶液0.5〜5である、生体材料。
- 前記カルシウム由来の凝固剤が、HA又はBCP1g当たりカルシウム2.5μmol〜60μmol、好ましくはHA又はBCP1g当たりカルシウム5μmol〜40μmolの範囲の割合で存在する、請求項1に記載の生体材料。
- 前記凝固剤がCaCl2である、請求項1又は2に記載の生体材料。
- 前記支持体がモノリス形態である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の生体材料。
- 前記支持体が顆粒形態である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の生体材料。
- ポリマー、セラミック粒子、薬学的分子、天然又は合成の成長因子、バイオマーカー、造影剤、及び組織又は細胞の調製物から選択される添加物も少なくとも1つ含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の生体材料。
- 骨欠損を充填する方法におけるインプラントとしての使用のための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の生体材料。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の生体材料と骨接合との組合せ。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の生体材料を製造する方法を実施するためのキットであって、HAベース又はBCPベースの支持体と1mM/l〜50mM/lの範囲の濃度を有する水溶液の形態のカルシウム由来の凝固剤との組合せを含み、凝固剤溶液とHA又はBCPとの割合は体積/体積基準でHA又はBCPの体積に対して凝固剤溶液0.5〜5である、キット。
- 前記凝固剤がCaCl2である、請求項9に記載のキット。
- (a)前記支持体が配置される無菌の内部空洞を含む無菌デバイス、
(b)前記凝固剤を含む無菌リザーバ、
を含む、請求項9又は10に記載のキット。 - 前記デバイス(a)が、骨欠損が認められた領域に前記生体材料を適用することを可能とする手段を含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載のキット。
- 前記デバイス(a)がシリンジから成る、請求項9〜12のいずれか一項に記載のキット。
- 骨組織の産生のための支持体としての、請求項1〜7のいずれか一項に記載の生体材料のin vitro又はex vivoでの使用。
- 骨インプラントを製造するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の生体材料のin vitro又はex vivoでの使用。
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