ES2680623T3 - Mezcla de sangre y de partículas de cerámica de fosfatos de calcio bifásicos - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la fabricación de un biomaterial, incluyendo este procedimiento al menos las siguientes etapas: (i) mezcla de un fosfato cálcico bifásico, o BCP, en forma de gránulos de tamaño comprendido entre 40 y 500 μm con sangre, o con un aspirado de médula ósea, en proporciones que varían del 10 al 90 % en peso de BCP por volumen de sangre o médula, en g/ml, (ii) adición a la mezcla de la etapa (i) de al menos un agente coagulante en cantidad suficiente para provocar la coagulación de la sangre o de la médula, (iii) mezcla en condiciones que favorecen la homogeneización del BCP mientras se produce la coagulación.

Description

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DESCRIPCION

Mezcla de sangre y de partículas de cerámica de fosfatos de calcio bifásicos

El objeto de la invención es un nuevo biomaterial basado en sangre coagulada o aspirado de médula ósea coagulado, y partículas cerámicas de fosfatos de calcio bifásicos, un procedimiento para su preparación y su utilización en la fabricación de un implante para permitir la regeneración del tejido óseo.

La reconstrucción de las pérdidas de sustancia ósea, de origen principalmente traumático y más raramente tumoral, es una de las mayores dificultades encontradas por los cirujanos ortopédicos. Los defectos de pequeño tamaño, desde la pseudoartrosis "ajustada" (defecto de consolidación de una fractura donde es posible una pérdida de sustancia) hasta las pérdidas óseas de 5-6 centímetros son, con mucha frecuencia, objeto de un injerto autólogo de tejido óseo esponjoso o cortico-esponjoso extraído de la cresta ilíaca (estándar oro). Los defectos de gran tamaño (> 6 cm) requieren intervenciones mucho más pesadas, transferencias óseas vascularizadas o procedimiento de Masquelet. A pesar de todo, la cantidad de hueso autólogo disponible es limitada, la consolidación ósea sigue siendo aleatoria y estas diferentes técnicas son poderosamente generadoras de complicaciones postoperatorias a nivel del sitio de extracción del trasplante.

Diferentes biomateriales disponibles en la práctica clínica permiten evitar, en teoría, los inconvenientes del injerto autólogo. Desafortunadamente, ninguno de ellos iguala los resultados del injerto óseo y nunca permiten la reconstrucción de las pérdidas de sustancias de gran tamaño.

La mayoría de los sustitutos óseos actualmente estudiados se asocian a los biomateriales de células madre mesenquimatosas obtenidas a partir de médula ósea después de varias semanas de selección y cultivo celular in vitro. Este enfoque es engorroso y costoso, lo que limita las repercusiones clínicas.

L. Okazaki y col., Clin. Oral. Impl Res., 16, 2005, 236-243 describe implantes a base de polvo de hueso desmineralizado o de sangre coagulada. Varios autores han estudiado la asociación de sangre con biomateriales sintéticos: J. Schmid y col., Clin. Oral Impl. Res. 1997:8:75-8 describe implantes a base de polvo de hueso de bovino desmineralizado y sangre. A. Chevrier y col., Osteoarthritis and Cartilage (2007), 15, 316-327, describe implantes a base de una solución de polímero que contiene quitosano en un tampón de glicerol-fosfato y sangre que coagula in situ. B. Wallkamm y col., Clin. Oral Imp. Res., 14, 2003, 734-742 describe implantes a base de sangre y un derivado de poli(ácido láctico) (Polyfibre® o Polyfoam®). Yildérim M. y col., Clin. Oral Impl. Res., 2000, 11, 217-219 describe implantes a base de apatita bovina y sangre venosa. El documento US 2008/0014279 describe un biomaterial constituido por un material granulado recubierto con un gel de polímero, y que puede mezclarse con cualquier tipo de líquido, particularmente sangre, para formar una pasta que se aplica a la espátula o a la jeringuilla allí donde un defecto óseo debe ser rellenado. El documento WO 02/068010 describe un material compuesto basado en médula ósea, comprendiendo este material una matriz implantable, biocompatible y porosa, y un material coagulado, como un coagulado de médula ósea, sangre y plasma. El documento WO2006/058153 describe implantes óseos que comprenden un agente coagulante, p. ej., cloruro de calcio mezclado con un material de reparación ósea (por ejemplo, fosfato de calcio) y sangre o un aspirado de médula ósea. No obstante, estos materiales implantables descritos en la técnica anterior no carecen de inconvenientes:

Los materiales que requieren el cultivo de células de médula ósea antes de una asociación con un soporte (hueso desmineralizado, polímero sintético u otro) son de mayor duración para ser realizados y obligan a hacer una extracción de médula ósea en el individuo a tratar varias semanas antes de la colocación del implante, lo que multiplica las intervenciones y los riesgos asociados con ellas.

Los biomateriales que asocian un soporte y sangre no coagulada no permiten construir un implante.

Si se ha propuesto la asociación de algunos materiales soportes con sangre coagulada, los resultados obtenidos no son siempre satisfactorios, en particular porque el procedimiento no permite la obtención de un biomaterial homogéneo.

Tales materiales resultantes de la asociación de un soporte y sangre, coagulada o no, se han utilizado hasta ahora en cirugía maxilofacial donde los problemas de consolidación ósea son menos críticos, pero han sido poco o nada utilizados en la reparación de huesos diafisarios.

En el caso del documento WO 02/068010, el procedimiento enseñado consiste en el uso de un material de soporte constituido por hueso desmineralizado poroso en forma de gránulos de tamaño mínimo de al menos 1 mm, asociado con fibras de hueso cortical desmineralizado de al menos 5 mm, y con un material coagulado, preferentemente derivado de médula ósea. Todos los ejemplos propuestos comprenden células de la médula ósea.

La invención permite poner remedio a los inconvenientes de la técnica anterior y, en particular, permite obtener un biomaterial implantable de un soporte sintético, por consiguiente, fácil de producir con propiedades constantes y homogéneas, y sangre coagulada, sin que sea necesario utilizar etapas de cultivo, teniendo este material excelente

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biocompatibilidad, que permiten la reconstrucción del tejido óseo de forma rápida. La invención permite también obtener un hueso de excelente calidad en términos de dureza y de vascularización. Además, el procedimiento de fabricación de este biomaterial es sencillo, fácil de realizar, no requiere múltiples intervenciones en el individuo a tratar, y es barato en comparación con los procedimientos de la técnica anterior.

El biomaterial de la invención está en forma de una pasta que comprende al menos un fosfato de calcio bifásico en forma de gránulos, mezclado de forma sustancialmente homogénea con sangre coagulada.

El fosfato de calcio bifásico, BCP, se utiliza en numerosas aplicaciones médicas y dentales. El fosfato de calcio bifásico se ha descrito por primera vez como material de reparación ósea por Nery EB y col., J. Periodontol. 1992 Sept., 63 (9): 729-35. El BCP está constituido por una mezcla de hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4)6(OH)2 y fosfato tricálcico beta (Ca3(PO4)2) (p-TCP). Su bioactividad y su biorreabsorción pueden ser controladas por la proporción de hidroxiapatita y p-TCP que la constituyen.

Los biomateriales a base de BCP tienen la ventaja, en comparación con otros biomateriales sintéticos, de favorecer la osteogénesis.

La BCP ha sido objeto de numerosos estudios: Fellah B.H. y col., J. Mater. Sci.: Mater. Med. (2007), 18, 287-294, mostraron que la elección de una granulometría inferior a 20 pm favorecía la respuesta inflamatoria de los tejidos, lo que podría explicar el hecho de que este tamaño de partículas sea particularmente favorable a la osteogénesis, como observaron Mallard O. y col., J. Biomed. Mater. Res., 46(1), 1999, 103.

Mankani M.H. y col., Biotechnology and Bioengineering, 72(1), 2001, 96-107 mostraron, por el contrario, que las partículas de BCP calibradas de un tamaño que varía de 100 a 250 pm fueron las que dieron lugar a la reconstrucción ósea más significativa cuando se asocian a células de médula ósea cultivadas, mientras que no se observó ninguna formación ósea por debajo de 44 pm, y se obtuvieron buenos resultados con partículas de un tamaño que varía hasta 2 mm.

Trojani C. y col., Biomaterials, 27, 2006, 3256-3264, mostraron que la buena osteoinducción podría obtenerse implantando un material compuesto BCP/hidrogel de Si-hidroxipropilmetilcelulosa a la que se agregaron células de médula ósea cultivadas, con partículas de BCP calibradas de 40 a 80 pm.

Sin embargo, estos dos últimos procedimientos requieren una etapa de extracción de células de médula ósea, así como su cultivo.

La presente invención se basa en los siguientes hechos:

- la observación de los autores de la invención de que el BCP estaba dotado de propiedades anticoagulantes,

- la observación por los mismos autores de la invención de que un BCP con una granulometría seleccionada asociada con la sangre coagulada, o un aspirado de médula ósea coagulada, permite obtener una muy buena osteogénesis y lleva a un tejido óseo de calidad muy satisfactoria, utilizando un procedimiento de una sencillez muy grande en relación con los de la técnica anterior.

El primer objetivo de la invención, por consiguiente, es la asociación de un BCP particular definido a continuación con sangre coagulada o con un aspirado de médula ósea coagulada. De forma ventajosa, esta asociación está en forma de una pasta homogénea maleable.

Esta pasta se puede manipular para adaptarse al tamaño y a la forma del defecto a rellenar, asegurándose de no aplicar presiones excesivas que dañen o destruyan su estructura tridimensional.

El BCP utilizado en la presente invención tiene una granulometría comprendida entre 40 y 500 pm, preferentemente entre 40 y 400 pm, aún más preferentemente entre 40 y 300 pm, y de forma ventajosa entre 80 y 200 pm.

El BCP utilizado en la invención consiste en un sinterizado a alta temperatura, triturado y calibrado, por ejemplo, tamizando, en granulados de diámetro seleccionado. De forma ventajosa, el BCP utilizado en la invención contiene hidroxiapatita y fosfato tricálcico p en una relación peso/peso HA/p-TCP comprendida entre 5/95 y 95/5, preferentemente entre 30/70 y 80/20, de forma ventajosa entre 40/60 y 60/40.

De forma ventajosa, se trata de un BCP poroso, con tamaños del poro que varían de 50 nm a 150 pm, preferentemente de 1 pm a 50 pm.

Los gránulos o el polvo de fosfato tricálcico y de hidroxiapatita pueden obtenerse según los procedimientos descritos por Bouler y col., J Biomed Mater Res, 1996, 32, 603-609; Bouler y col., J Biomed Mater Res, 2000, 51, 680-684; Obadia y col., J Biomed Mater Res, 2006, 80(B), 32-42. Están disponibles comercialmente de la empresa GRAFTYS SARL.

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Si se aplican los procedimientos de la técnica anterior al granulado de BCP, es decir, si se mezcla el BCP con una muestra de sangre, por ejemplo, no se obtiene la coagulación sanguínea porque el BCP tiene propiedades anticoagulantes. Según el procedimiento de la invención, el BCP se mezcla con una muestra de sangre extraída previamente con anticoagulante o extraída sin anticoagulante y puesta inmediatamente en contacto con BCP en un donante compatible con el receptor del biomaterial, después se añade al menos un agente coagulante a la mezcla con agitación. Preferentemente, el agente coagulante es un derivado del calcio. De forma ventajosa, el agente coagulante basado en calcio se selecciona entre las sales biocompatibles como CaCl2, Ca(NO3)2, Ca(AcOEt)2 y CaSO4.

Entre otros coagulantes que se pueden utilizar en la implementación de la invención se puede citar la trombina. La mezcla de BCP, sangre, o aspirado de la médula, y agente coagulante continúa durante toda la etapa de coagulación y es de una intensidad adaptada para permitir la formación de una mezcla homogénea de granulados o de partículas BCP y sangre coagulada, o médula coagulada, y en particular el mantenimiento en suspensión de las partículas de BCP. Si esta agitación es demasiado fuerte o no lo suficientemente fuerte, no permite obtener una mezcla homogénea. La persona experta en la materia puede supervisar visualmente la formación de una mezcla homogénea.

Además del BCP, la composición del biomaterial puede comprender posibles aditivos tales como: polímeros, partículas cerámicas, moléculas farmacéuticas, siendo las condiciones para el uso de estos materiales: su biocompatibilidad, la ausencia de efecto negativo sobre la reacción de toma del biomaterial. Tales aditivos bien conocidos de la persona experta en la materia se destinan a modificar la reología del biomaterial, su comportamiento in vivo (dureza, resorción y osteogénesis) o actuar sobre la aparición de infecciones o fenómenos inflamatorios (antibióticos, agentes antiinfecciosos y agentes antiinflamatorios).

También es posible prever la introducción, en el biomaterial de la invención, de principios activos tales como moléculas terapéuticas como las moléculas destinadas a prevenir o tratar una patología seleccionada por ejemplo entre: cáncer y osteoporosis.

También es posible introducir factores de crecimiento naturales o sintéticos en el biomaterial de la invención. También es posible prever la presencia de biomarcadores o agentes de contraste que favorecen la visualización mediante imágenes médicas de la resorción del biomaterial y su transformación en el organismo.

Se puede prever introducir tejido adiposo en el biomaterial de la invención, o cualquier otra preparación de tejido o células, extraídas del paciente a quien se destina el biomaterial, habiendo sido este tejido o esta preparación previamente suspendido en sangre o en plasma o en suero fisiológico. Entre las preparaciones tisulares o celulares se incluyen tejido adiposo, plaquetas y células de la médula ósea.

También es posible prever la presencia de BCP de diferente granulometría, pero preferentemente en pequeña cantidad, de forma ventajosa < 5 % en peso/peso total de BCP, ya que se ha observado que el control de la granulometría permitía una mejor formación de tejido óseo (más rápida, de mejor calidad), y buena resorción.

Según el procedimiento de la invención, el BCP se coloca en una cavidad de un recipiente cerrado y estéril como la cavidad interna de una jeringuilla. La sangre o el aspirado de médula ósea, previamente extraída de un donante compatible con el receptor, se introduce en este recipiente.

Si la sangre o el aspirado de la médula ósea extraída debe almacenarse durante un período superior a algunos segundos (5 a 10 segundos), se mezcla inmediatamente después de extraerla con un anticoagulante para evitar su coagulación prematura. La sangre del donante puede, por ejemplo, extraerse directamente en un tubo que contenga la cantidad apropiada de agente anticoagulante.

El anticoagulante puede ser un quelado de iones calcio como, por ejemplo, citrato de sodio, pero también heparina, por ejemplo.

La mezcla de BCP y sangre o médula ósea se realiza en las siguientes proporciones preferentes:

de 10 a 90 % en peso de BCP en relación con el volumen de sangre (o de la médula ósea), preferentemente de 50 a 90 %, y aún más preferentemente de 60 a 80 %, en g/ml.

De una manera ventajosa, la sangre se extrae del propio receptor para garantizar en el mejor de los casos la biocompatibilidad del implante. Según una variante de la invención, la sangre es substituida por un producto derivado de la sangre tal como el plasma. Preferentemente, se utiliza sangre entera. En toda la demanda incluida en las reivindicaciones, cuando se utiliza la palabra sangre, se incluyen en su definición los productos derivados de la sangre tales como el plasma.

De manera preferente, en la aplicación de la invención, se utiliza sangre o plasma, cuya extracción no requiere una

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intervención quirúrgica.

Según una variante de la invención, la sangre puede ser extraída de una jeringuilla en el cuerpo de la cual se colocó previamente el BCP y posiblemente aditivos.

Después de una primera mezcla de BCP y sangre, el agente coagulante también se añade a la mezcla, por ejemplo, por aspiración utilizando la jeringuilla si se ha utilizado dicho dispositivo.

El recipiente cerrado que contiene BCP, sangre y agente coagulante se agita inmediatamente para permitir la formación de un material homogéneo. Por ejemplo, si se efectúa la mezcla en un tubo o en el cuerpo de una jeringuilla, el recipiente se coloca en un agitador rotativo cuya velocidad se regula dependiendo de la granulometría del BCP, de manera que las partículas de BCP permanecen en suspensión mientras que se produce la coagulación. Según una variante de la invención, la agitación se puede producir por microesferas magnetizadas asociadas a un agitador magnético.

Según una variante preferida de la invención, el recipiente cerrado que contiene la mezcla de BCP, sangre y agente coagulante se deja en reposo durante la fase de coagulación sanguínea para dejar que el BCP se asiente y forme un implante saturado en BCP.

Al final de esta etapa, la mezcla está en forma de una pasta maleable y homogénea, que incluye una red tridimensional de fibrina atrapando partículas sanguíneas, plasma y otras moléculas que se han introducido en la composición.

Según el tipo de dispositivo utilizado para la preparación del biomaterial de la invención, a continuación, puede aplicarse utilizando medios más adecuados para el lugar donde se va a rellenar un defecto óseo:

Utilizando una herramienta como una espátula sin alterar, no obstante, la organización tridimensional del implante, o utilizando la jeringuilla u otro dispositivo cilíndrico, cuyo extremo se ha cortado previamente para formar una abertura adecuada a la reología del biomaterial de la invención.

Así, otro objetivo de la invención es un procedimiento para la fabricación de un biomaterial, incluyendo este procedimiento al menos las siguientes etapas:

(i) mezcla de un BCP en forma de gránulos de tamaño comprendido entre 40 y 500 pm con sangre, o con un aspirado de médula ósea, en proporciones que varían de l0 a 90 % en peso de BCP por volumen de sangre o de médula,

(ii) adición a la mezcla de la etapa (i) de al menos un agente coagulante en cantidad suficiente para provocar la coagulación (de sangre o de médula),

(iii) mezcla en condiciones que favorecen la homogeneización del BCP mientras se produce la coagulación.

Como ya se ha mencionado, en el procedimiento de la invención, las etapas (i) a (III) pueden aplicarse en la cavidad interna de una jeringuilla o en un tubo cerrado en sus extremos. El agente coagulante se puede seleccionar de derivados de calcio, como los mencionados anteriormente, o entre otros agentes coagulantes como trombina, por ejemplo.

La invención todavía tiene como objeto un procedimiento de rellenar un defecto óseo, incluyendo este procedimiento las etapas enumeradas anteriormente e incluyendo además una etapa de aplicación del biomaterial obtenido en la etapa (III) en el espacio donde se observaba un defecto óseo. Este procedimiento puede comprender además las etapas de incisión del tejido y sutura.

Según el tamaño y la configuración del defecto óseo, el relleno por el biomaterial de la invención puede estar asociado a una osteosíntesis que permita al tejido lograr la resistencia mecánica necesaria mientras se produce la reconstrucción ósea en el sitio de implantación del biomaterial de la invención.

Como los autores de la invención han observado, la implantación del biomaterial de la invención ha permitido inducir la formación de tejido óseo dentro de plazos cortos (algunas semanas), estando el tejido óseo muy vascularizado.

Por el contrario, se ha observado que la implantación de un biomaterial obtenido por el mismo procedimiento con un BCP de granulometría inferior de 40 pm de tamaño no permitía obtener la formación de un tejido óseo de calidad satisfactoria y dentro de plazos satisfactorios. Y la implantación de un biomaterial obtenido por el mismo procedimiento con un BCP de granulometría superior a 500 pm conduce a un implante cuya capacidad de absorción es menos buena.

Otro objeto de la invención está constituido por un kit para la implementación del procedimiento de la invención, incluyendo este kit la asociación de un BCP de granulometría comprendida entre 40 y 500 pm, preferentemente entre 40 y 400 pm, ventajosamente entre 40 y 300 pm y aún más preferentemente de 80 a 200 pm, con al menos un

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agente coagulante. Preferentemente el agente coagulante es un derivado de calcio. De forma ventajosa, el agente coagulante es CaCh.

La cantidad de agente coagulante se calcula para compensar el efecto anticoagulante del BCP y posiblemente el agente anticoagulante que está asociado a la sangre extraída.

La concentración de agente coagulante en la mezcla de sangre y BCP debe estar, preferentemente, comprendida entre 1 y 50 mM, aún más preferentemente entre 3 y 35 mM, en particular en el caso de que el agente coagulante esté basado en calcio. El agente coagulante debe agregarse, preferentemente, a la solución acuosa de agente coagulante de manera que no sobrepase 2 volúmenes de solución de agente coagulante con respecto al peso de BCP en ml/g.

La concentración de la solución del agente coagulante puede variar para respetar estos dos requisitos, y que utiliza, preferentemente, una solución de agente coagulante de concentración inferior a 120 mM, especialmente cuando el agente coagulante es una sal del calcio.

Si la sangre se extrae con anticoagulante, debe compensarse el efecto del agente anticoagulante y el efecto del biomaterial.

Por ejemplo, para la sangre extraída en citrato sódico en las condiciones convencionales (marca Vacuette®, disponibles de la empresa Greiner Bio-One, o marca Vacutainer®, disponibles de la empresa Becton Dickinson) y en las proporciones de 50 mg de BCP y 100 pl de sangre, añadimos 1/5 del volumen final (supongamos, 20 pl) de una solución de calcio a 80 mM (concentración final de 13,3 mM). La concentración de la solución puede ser de hasta 120 mM. Más allá de eso, puede haber un exceso de calcio, lo que inhibe de nuevo la coagulación.

Si la sangre no es extraída con anticoagulante, la sangre se extrae directamente con el biomaterial, y el calcio se agrega de forma secundaria. En este caso, se puede añadir 1/5 del volumen de sangre de una solución acuosa de sal de calcio de concentración que varía de 12 mM a aproximadamente 60 mM.

Tal asociación puede estar en forma de un kit estéril que incluye:

(a) un dispositivo que incluye una cavidad interna estéril en la que se coloca el BCP,

(b) un depósito estéril que contiene el agente coagulante.

El depósito (b) puede formar parte del dispositivo (a) o ser una entidad distinta tal como un tubo o frasco en el que se puede extraer el agente coagulante puede ser tomado para transferirlo a la cavidad interna del dispositivo (a), o una jeringuilla que permite la inyección del agente coagulante en la cavidad donde se coloca el BCP.

Ventajosamente, el dispositivo (a) incluye medios que permiten la introducción de sangre en la cavidad interna: por ejemplo, los medios que permiten la extracción de una muestra de sangre, bien directamente de un individuo, o de un depósito, o medios que permiten la inyección de una muestra de sangre en la cavidad interna para permitir la mezcla con el BCP. Se puede prever que la sangre extraída sea introducida directamente en la cavidad que comprende el BCP o que sea extraída en el depósito donde se coloca el anticoagulante después de que el conjunto sea transferido a la cavidad donde se encuentra el BCP. En el caso donde se utiliza un aspirado de médula ósea, se prevé un medio de aspiración de la médula ósea.

La cavidad interna del dispositivo (a) es de un tamaño que permite introducir la cantidad de sangre o de médula necesaria para producir el biomaterial de la invención, así como los otros constituyentes de la mezcla tales como: agente coagulante, principios activos y preparaciones tisulares o celulares.

De forma ventajosa, también el dispositivo (a) incluye medios que permiten la aplicación del biomaterial en la zona donde se ha observado un defecto óseo.

Tal dispositivo puede estar constituido por un dispositivo cilíndrico tal como un tubo o una jeringuilla como la que se ilustra en la parte experimental.

También puede preverse la utilización de un dispositivo como el descrito en el documento WO 02/068010 que incluye un tubo dentro del cual el BCP es conservado, en el que se inyectan la sangre y el agente coagulante, y que puede equiparse con un émbolo para restituir el biomaterial una vez que se ha formado.

Todavía puede contemplarse la utilización de un dispositivo del tipo Vacutainer®, es decir, tubos de vacío a los que se adapta una jeringuilla que permite hacer una extracción de una cantidad predeterminada de sangre, estando estos tubos previamente acondicionados con BCP en su cavidad interna.

Otro objeto de la invención está constituido por un biomaterial implantable que incluye un BCP en forma de gránulos, cuyo tamaño se ha definido anteriormente, dispersado de manera sustancialmente homogénea en una red

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tridimensional de proteínas sanguíneas o en una red de proteínas de la médula ósea.

De forma ventajosa, este biomaterial incluye un BCP como se ha definido anteriormente y un coágulo de proteínas sanguíneas (o de la médula) en forma de una mezcla sensiblemente homogénea que tiene la apariencia de una pasta maleable.

Por pasta maleable se entiende un material que no fluye por sí mismo, como lo haría un líquido, pero cuya resistencia mecánica es suficientemente baja para poder ser modelada bajo el efecto de una presión ejercida manualmente por un individuo, posiblemente utilizando un instrumento tal como una espátula o el émbolo de una jeringuilla.

Dicho biomaterial puede utilizarse para la fabricación de un implante óseo, con el que se trate de rellenar una fractura, una pérdida de sustancia de origen traumático o tumoral, un defecto resultante de una intervención quirúrgica o que ayude a colocar una prótesis.

El biomaterial se puede introducir, como se ilustra en los ejemplos, por una intervención quirúrgica en la zona en que debe rellenarse un defecto óseo. Después de la incisión, se implanta el biomaterial y se cierra la incisión.

El biomaterial de la invención puede asociarse a una osteosíntesis de mayor resistencia mecánica, para permitir la estabilidad del montaje pendiente de la colonización de la zona deficiente de tejidos óseos.

Se puede esperar que se asocie con una prótesis. Un recubrimiento de la prótesis por el biomaterial de la invención permite favorecer la implantación de tejido óseo vivo en o alrededor de la prótesis.

El biomaterial de la invención puede aún ser utilizado in vitro o ex-vivo como soporte para la producción de tejido óseo:

De hecho, el cultivo de células óseas alrededor de este biomaterial permite producir un tejido óseo posteriormente implantable.

Otro objeto de la invención es el uso in vitro o ex-vivo de un biomaterial como se ha descrito anteriormente para producir un implante óseo.

Según la invención, pueden cultivarse células óseas sobre el biomaterial de la invención en un molde que tiene la forma del implante que se desea fabricar. El cultivo de células en estas condiciones permite obtener un implante biocompatible de forma y dimensiones apropiadas.

PARTE EXPERIMENTAL

Figuras

Figura 1: Formación de tejido óseo para un implante de sangre coagulada alrededor de las partículas de BCP.

Cortes transversales de implantes teñidos con HES después de 4 semanas de implantación en un sitio subcutáneo (A y C) e intramuscular (B y D).

Escala: A y B: 500 pm

C y D: 50 pm

Flechas blancas: osteoblastos

Flechas negras: osteocitos

Puntas de flecha negras: vasos sanguíneos

Puntas de flecha blanca: osteoclastos

Figura 2: Corte de implantes de sangre/BCP después de 4 semanas de implantación.

(A) : hibridación por suero inmunológico que muestra la coloración parda de la osteocalcina en el citoplasma de las células (flechas blancas)

(B) : hibridación por suero no inmunológico - Escala: 10 pm

(C) : Coloración Goldner - Escala: 50 pm Flechas negras: vasos y osteocitos.

Figura 3: Microscopía electrónica de barrido de implantas de sangre/BCP de 4 semanas

(A) matriz de colágeno en el espacio intergranular - Escala: 10 pm

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(B) aumento de (A) - Escala: 1 |jm

(C) dos osteoclastos unidos a los gránulos con 2 a 3 núcleos visibles - Escala: 10 jm

(D) capilar funcional - Escala: 10 jm

Figura 4: Microscopía electrónica de barrido de implantes

(A) BCP/sangre coagulada

(B) BCP/plasma coagulado Escala: 1 jm

Figura 5: Formación de tejido óseo a partir de implantes de BCP/plasma después de 4 semanas de implantación Sitios subcutáneos (A, C)

Sitios intramusculares (B, D)

Escala: 500 jm (A, B)

50 jm (C, D)

Figura 6: Comparación de las propiedades osteogénicas del biomaterial preparado a partir de la sangre de ratones C57BL/6 (A,B) y de sangre humana (C,D) asociadas a micropartículas de BCP (40-80 jm), después de la implantación subcutánea en ratones inmunodeprimidos sin sistema inmunitario. Observación de poco (A,C) y mucho (B,D) aumento.

Escalas: 100 jm.

Figura 7: influencia del tamaño de las micropartículas BCP sobre la formación ósea después de la implantación subcutánea en ratones. Los implantes se prepararon a partir de sangre de ratones C57BL/6 asociada con BCP en la forma (A) de una gran cantidad de polvo fino de tamaño inferior a 40 jm mezclado con partículas de 80-200 jm; (B) partículas de 40-80 jm; (C,D) partículas de 80-200 jm; (E,F) partículas de 200-500 jm. Las figuras D y F corresponden a vistas de mayor aumento de los implantes C y E respectivamente.

Escalas 100 jm.

Figura 8: implantes preparados a partir de 100 ml de sangre de ratones C57BL/6 y cantidades cada vez mayores de micropartículas de BCP 40-80 jm: (A) 10 mg, (B) 30 mg, (C) 50 mg y (D) 70 mg. Escala: 100 jm.

Figura 9: radiografías en perros - implantes preparados a partir de sangre entera coagulada alrededor de micropartículas de BCP calibradas (80-200 jm): (A) BCP/sangre con una relación de 50 %, estando las micropartículas mantenidas en suspensión en la sangre durante la fase de la coagulación (procedimiento n.° 1); (B) BCP a concentración máxima en sangre, micropartículas que sedimentan durante la coagulación (procedimiento n.° 2). Las flechas blancas indican la presencia de un borde radiotransparente entre los extremos diafisarios y el implante.

Figura 10: implantación en perro BEAGLE. Radiografías postoperatorias. (A) a la izquierda el implante está constituido por BCP solo. (B) a la derecha está constituido por la mezcla BCP/sangre con una relación máxima de BCP según el procedimiento 2 de preparación de los implantes.

1. Principio:

Se trata de un procedimiento extemporáneo, llevado a cabo en la sala de operaciones. Consiste en mezclar en el cuerpo de una jeringuilla de polipropileno partículas de BCP y sangre entera autóloga (50 % p/v) extraída con un anticoagulante quelador de iones de calcio. La adición de CaCl2 se usa para desencadenar la coagulación. A continuación, la jeringuilla se coloca durante 10 minutos a temperatura ambiente en un mezclador giratorio, lo cual permite mantener las partículas de BCP en suspensión en la sangre a medida que ocurre la coagulación. Se obtiene así una distribución homogénea de las partículas en el seno de la sangre coagulada. El extremo de la jeringuilla se corta, entonces, y el implante es expulsado de la jeringuilla utilizando el émbolo para que se coloque en el sitio de implante.

Resultados obtenidos en animales (ratones C57BL/6):

La implantación del biomaterial en un sitio ectópico (subcutáneo e intramuscular) muestra sus propiedades osteoinductoras, con implantes completamente colonizados por un tejido óseo inmaduro mineralizado muy bien vascularizados después de 4 semanas.

2. Materiales y Procedimientos

2.1. Partículas de fosfato de calcio bifásico:

El biomaterial del fosfato de calcio bifásico (BCP) se compone de 60 % de hidroxiapatita (HA; Ca10(PO4)6(OH)2) y 40 % de fosfato tricálcico (TCP; Ca3(PO4)2). Las partículas BCP calibradas entre 80 y 200 micrómetros fueron suministradas por la empresa GRAFTYS SARL (Aix-en-Provence, Francia). Las partículas fueron esterilizadas calentando a 180 °C durante dos horas.

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2.2. Preparación de implantes y procedimiento quirúrgico:

- Implantación subcutánea en ratones

Los experimentos se realizaron según el reglamento de la Dirección de Servicios Veterinarios y se obtuvo la autorización del Comité Regional de Ética para Experimentos con Animales (CREEA). La sangre entera se extrae con citrato del sodio (anticoagulación) por punción intracardiaca a partir de ratones C57BL/6 de diez semanas de edad anestesiados. Para algunos experimentos, el plasma se preparó a partir de sangre entera por centrifugación a 1.800 g durante 15 minutos.

Procedimiento 1: Los implantes se preparan mezclando 100 pl de sangre entera (o plasma) con 50 mg de partículas de BCP en una jeringuilla de 1 ml. La activación de la coagulación se obtiene luego añadiendo 20 pl de una solución al 1 % de CaCl2. Durante el período de coagulación (5 a 10 minutos), la jeringuilla se coloca en una rueda de tipo New Brunswick "rodillo de cultivo de tejido, modelo TC-7 M1053-4005). Esto permite un movimiento de rotación de la jeringuilla sobre sí misma y mantiene las partículas de BCP en suspensión en el coágulo. Después de la sección del extremo de la jeringuilla, los implantes son expulsados de la jeringuilla con el émbolo e implantados de forma subcutánea (SC) o intramuscular (IM) en los ratones C57BL/6.

Procedimiento 2: Los implantes se preparan con una concentración máxima de partículas y, por lo tanto, una relación máxima de BCP/sangre. Para ello, la mezcla BCP/sangre/calcio se mantiene en una posición fija durante la duración de la coagulación para permitir que las micropartículas se sedimenten de forma natural en la sangre. Se considera que se obtiene así una concentración máxima de micropartículas en la sangre coagulada.

Los implantes subcutáneos se colocaron bajo la piel en posición dorsal y los implantes intramusculares se colocaron en cada muslo entre las masas musculares después de la disección. En cada sitio (SC e IM), se garantiza que ningún sangrado se ha inducido en el transcurso de la implantación.

En cada experimento de implante, los ratones C57BL/6 se anestesiaron por inhalación del isoflurano al 4 %. Se colocan dos implantes SC y dos implantes IM en cada ratón. En algunos experimentos, cada ratón recibió un implante de sangre/BCP y un implante de plasma/BCP en cada sitio. Después de 4 a 8 semanas, los animales se sacrificaron con inhalación de CO2 y los implantes se extrajeron para análisis.

- Implantación en sitio óseo en ratas

El protocolo que se ha aplicado en ratas estaba aprobado por el comité de ética regional para la experimentación con animales (NCA/2007/12-06). Estos experimentos preliminares se realizaron en la Central de Animales de la Facultad de Medicina de Niza.

Se utilizó un modelo de pérdida de sustancia ósea, segmentaria, de interrupción, diafisaria femoral de tamaño crítico (6 mm) asociada a una osteosíntesis de placa-tornillo, modelo desarrollado en laboratorio propio. Se operó un solo fémur por cada rata, la pérdida de sustancia se rellenó con el biomaterial de la invención, sangre entera autóloga/BCP (80-200 pm). El seguimiento de las ratas es clínico (ausencia de dolor, deambulación y estado general) y radiológico por las imágenes J0, J7, J15, J30, J45, J60 y J90. Al final del tercer mes, los animales fueron sacrificados, los fémures son extraídos y, después de la ablación del material de osteosíntesis, los huesos son fijados en formol antes de la inclusión en resina del metil metacrilato y el estudio histológico.

En las primeras intervenciones, los implantes se realizaron a la medida del defecto óseo, con una proporción de partículas de 50 % peso/volumen, es decir, 75 mg de BCP para 150 pl de sangre entera extraída del animal en el preoperatorio. La coagulación se desencadena con la adición de 15 pl de CaCl2 al 2 % y la homogeneización se garantiza por rotación continua hasta la coagulación con el fin de mantener las partículas BCP en suspensión en la sangre y garantizar la homogeneidad del biomaterial.

- Implantación en sitio óseo en perros BEAGLE

Se trata de un modelo de pérdida de sustancia ósea de la cavidad cilíndrica calibrada de tamaño crítico a nivel de los cóndilos laterales femorales, realizado en perros adultos de raza Beagle. Para cada perro se abordaron los 2 cóndilos femorales. La sangre entera (3,5 ml) se extrae al principio de la intervención por punción a nivel de la vena yugular del animal y se utiliza para preparar el biomaterial. La pérdida ósea cilíndrica de 8 x 10 mm se realiza al nivel de cada cóndilo femoral externo y los fragmentos óseos secuestrados se eliminan cuidadosamente lavándose con suero fisiológico y aspiración.

Cada animal recibió dos implantes de composición diferente, pero preparados para rellenar en su totalidad el defecto generado, es decir:

Por un lado, el biomaterial a ensayar constituido por una mezcla de BCP (80-200 pm) y sangre con una

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relación de 50 % peso/volumen, es decir, 330 mg de BCP y 660 pl de sangre entera. Las partículas BCP se mantienen en suspensión durante la coagulación girando la jeringuilla utilizada para preparar la mezcla.

Por otro lado, se implanta el BCP solo, hidratado en suero fisiológico, es decir, 660 mg, que ocupa el mismo volumen que el implante contralateral.

La duración del experimento es de 8 semanas.

Las radiografías se llevaron a cabo en el postoperatorio inmediato y al final del experimento en el ENVN.

2.3. Análisis histológico:

Los implantes diseccionados se fijan durante 24 horas en una solución de formalina tamponada al 10 %. A continuación, cada implante se seccionó en tres rebanadas que son descalcificadas o no en una solución al 10 % (p/v) de ácido etilendiaminotetraacético (AEDT) durante 24 horas a temperatura ambiente e insertadas después en parafina. Las secciones de 4 pm son realizadas, desparafinadas, hidratadas y teñidas con Hematoxilina, Eritrosina y Azafrán (HES). Los cortes se observan a continuación por microscopía óptica utilizando un microscopio Zeiss Axioskop. Las fotos se realizan con una cámara de color AxioCam HRc (Zeiss, le Pecq, Francia). Para cuantificar las superficies ocupadas por el hueso fibrilar por un lado y por las partículas BCP por otro lado, cada imagen de implante se subdividió en tres zonas de superficie igual a 0,6 mm2 según el eje medio del implante. En cada una de estas tres zonas, el área ocupada por el tejido óseo fibrilar se midió utilizando el software AxioVision Rel.4.6. Este análisis se efectuó para tres implantes SC y tres implantes IM. El número de vasos y osteoclastos se evaluó en estas mismas zonas teniendo en cuenta, respectivamente, los capilares y las células gigantes multinucleadas con microscopio óptico (100X) por dos observadores diferentes. La densidad en osteoclastos y vasos se expresó en mm2 en forma de media + desviación estándar. La prueba estadística utilizada es la prueba de la T de Student. La relevancia se ha definido por un valor de p menor que 0,05.

2.4. Coloración Goldner:

Los cortes de implantes no descalcificados de 7 pm de espesor se tiñeron por el procedimiento Tricromo de Goldner que permite evaluar la mineralización del tejido óseo y distinguir el tejido mineralizado (en azul/verde) del tejido osteoide no mineralizado (en rojo). En resumen, las secciones desparafinadas son rehidratadas, después incubadas en presencia de hematoxilina Weigert durante 20 min, enjuagadas con agua corriente y diferenciadas en presencia de alcohol ácido al 1 %, lavadas en agua corriente durante 5 min y luego enjuagadas con agua destilada. Las secciones se tiñen a continuación por incubación en una solución de Ponceau de xilidina/ácido fúcsico/azofloxina/ácido acético durante 5 min, enjuagadas con ácido acético al 1 %, incubadas en presencia de ácido fosfomolíbdico/naranja G durante 20 min, enjuagadas en ácido acético al 1 %, teñidas en presencia de verde luz/ácido acético durante 5 minutos, lavadas en ácido acético al 1 % durante 5 minutos, secadas y montadas en medio de montaje Entellan (Merck, Damstadt, Alemania).

2.5. Inmunohistoquímica de la osteocalcina murina

Se ha utilizado un anticuerpo policlonal inmunopurificado anti-osteocalcina de ratón, dirigido contra un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 1-20 del extremo N-terminal de la proteína (Alexis Biochemicals, Lausana, Suiza). En resumen, los cortes en parafina de 7 pm fueron desparafinados, rehidratados en etanol, lavados en PBS e incubados 30 minutos en presencia de H2O2 al 0,3 % en PBS. Después de dos lavados en PBS, las placas se incubaron en presencia de 1,5 % de suero de cabra (solución amortiguadora de bloqueo) durante 30 min. Después de lavado en PBS, la incubación en presencia de un anticuerpo anti-inmunoglobulina de conejo marcado con biotina y el procedimiento de revelación con la peroxidasa se realizaron utilizando el kit de marcado ABC (sc- 2118, Santa Cruz, CA, EE.UU.). Las secciones se incubaron a continuación en presencia del sustrato de la peroxidasa durante 10 min y los núcleos celulares se tiñeron con hematoxilina durante 3 min. Después de la deshidratación, el ensamblaje se realiza en el líquido de montaje Entellan (Merck). Los controles se realizan incubando las placas en presencia de solución amortiguadora de bloqueo.

2.6. Microscopía electrónica de barrido

Los implantes constituidos por sangre coagulada/BCP o plasma coagulado/BCP, antes y después de cuatro semanas de implantación, se fijaron durante 12 horas a 4 °C en una solución de glutaraldehído tamponada. Las muestras se lavaron e incubaron, a continuación, en presencia de glicerol al 30 % durante 1 h y luego se congelaron en nitrógeno líquido y se fracturaron. Después de la deshidratación en presencia de concentraciones crecientes de etanol, se sumergieron en hexametildisilazano (Sigma-Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, Francia) durante 5 min y luego se secaron a temperatura ambiente. A continuación, se fijaron sobre soportes de aluminio y se cubrieron después con una capa del oro-paladio (Polaron E5100, Reino Unido). La observación se realizó, a continuación, mediante un microscopio electrónico de barrido de tipo JEOL 6700F (Japón).

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3. Resultados

3.1. Análisis macroscópico y microscópico de implantes subcutáneos e intramusculares de sangre coagulada / BCP.

La implantación de sangre coagulada en ausencia de partículas BCP no permitió la formación de tejido óseo. Después de cuatro semanas, se observó solamente una pequeña cantidad de tejido fibroso en el sitio del implante.

La disección y el examen macroscópico de los implantes de sangre coagulada alrededor de las partículas de BCP después de 4 y 8 semanas revelaron su consistencia firme, así como la presencia de numerosos pequeños vasos en su superficie. No se observó ninguna inflamación del tejido anfitrión.

El análisis histológico de los cortes parafinados de los implantes de sangre/BCP después de 4 semanas de implantación reveló la colonización completa y reproducible de todo el espacio entre partículas por el tejido óseo inmaduro en estrecho contacto con el BCP, a la vez para los implantes Sc (Fig. 1A) e IM (Fig. 1B). Una mayor observación de aumento sugiere que la matriz de colágeno es más madura en el sitio IM (Fig. 1D) que en el sitio SC (Fig. 1C). Para evaluar la cantidad de hueso fibrilar desarrollado en el espacio entre partículas, la proporción entre las áreas ocupadas por el tejido óseo y las áreas ocupadas por el BCP se calculó como se describe en materiales y procedimientos. Esto permitió mostrar una diferencia significativa entre los sitios SC e IM con 49,63 + 5,08 % de tejido óseo en los implantes IM y 42 + 8,33 % en los implantes SC (n = 9, p = 0,035). El conjunto de estos resultados indica que el espacio entre partículas está completamente colonizado en los dos sitios SC e IM, pero que la cantidad de tejido desarrollado es significativamente mayor en los implantes de IM.

En cada uno de los sitios, se ha observado la presencia de muchos vasos dentro de la matriz colágena, distribuidos de manera homogénea en todos los implantes (Fig. 1C, D, puntas de flecha negras). Su recuento reveló una diferencia significativa entre los implantes IM y SC con una media de 61,4 + 10,2 vasos/mm2 y 51,10 ± 10/mm2, respectivamente (n = 9; p = 0,045). También se han observado muchas gigantes multinucleadas unidas a las partículas de BCP (puntas de flecha blancas). Estas células son idénticas a las que se han identificado como osteoclastos en trabajos anteriores (Trojani C. y col., Biomaterials, 27, 2006, 3256-3264). Su recuento reveló una media de 88,51 + 14,60 osteoclastos/mm2 en implantes IM y 93,13 + 14,40/mm2 en implantes SC, diferencia no estadísticamente significativa. La alta capacidad de resorción de estas células es fuertemente sugerida por la presencia de micropartículas y cristales de fragmentación intercitoplásmicos, por la irregularidad del contorno de algunas partículas de BCP, su textura de degradación con una densidad más baja y heterogénea. Finalmente, se ha observado la presencia de osteoblastos cúbicos alineados con la superficie de las partículas de BCP (Fig. 1C e inserto, Fig. 5C, flechas blancas) y muchas células de tipo osteocito insertadas en la matriz de colágeno (Fig. 1D, 2B, 3A, B flechas negras). El fenotipo de osteoblasto maduro de estas células se demostró por la detección inmunohistológica intracitoplásmica de la osteocalcina (Fig. 2A). Además, todos los implantes fueron positivos después de la tinción de Goldner después de 4 semanas de implantación, lo que indica que este tejido neoformado está mineralizado (Fig. 2C).

El análisis de los implantes de IM de 4 semanas mediante microscopía electrónica de barrido permitió observar (Fig. 3) la microporosidad de las partículas de BCP, rellenando la matriz de colágeno los espacios entre partículas, la presencia de capilares funcionales que contienen eritrocitos (Fig. 3A, D, flecha blanca) y osteoclastos unidos a los gránulos de BCP (Fig. 3C, flechas negras). Además, se confirmó la presencia de células de tipo osteocito, de tipo estrellado, que poseen muchas prolongaciones irradiando en todas las direcciones, insertadas en la matriz de colágeno y rodeadas por un espacio pericelular de tipo osteoplasto (Fig. 3A inserto, 3B).

Los resultados obtenidos después de 8 semanas de implantación no revelaron ninguna diferencia significativa con los implantes de 4 semanas. Todos los implantes SC e IM están completamente colonizados por hueso inmaduro con las mismas características histológicas.

3.2. Análisis macroscópico y microscópico de implantes SC e IM y de plasma coagulado/BCP:

Para analizar la respectiva función del plasma y de las células sanguíneas en la neoformación ósea se ha implantado en paralelo para cada ratón y en cada sitio (SC e IM) un implante de sangre coagulado/BCP y un implante de plasma coagulado/BCP.

La estructura de la red de fibrina de los dos tipos de implantes, sangre coagulada/BCP y plasma coagulado/BCP, se analizó mediante microscopía electrónica de barrido. Esto demostró que la malla de fibrina obtenida con sangre coagulada era más ancha que la observada con el plasma coagulado (Fig. 4A, B). Como se espera, los glóbulos rojos y las plaquetas son las células predominantes observadas en los implantes de sangre coagulada/BCP. La conservación de su forma y de su estructura muestra una buena viabilidad (Fig. 4A), indicando que la mezcla de sangre y partículas de BCP no tiene efectos nocivos sobre las células sanguíneas.

La disección y el examen macroscópico de los implantes de plasma coagulado/BCP después de 4 y 8 semanas reveló características similares a las de los implantes de sangre coagulada/BCP, es decir, una consistencia firme y muchos vasos de superficies visibles (resultados no mostrados). El análisis histológico después de 4 semanas

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mostró que los implantes SC fueron colonizados en aproximadamente un 80 % (Fig. 5A) por el hueso neoformado. El análisis de los implantes IM reveló la colonización total en el 75 % de los casos (Fig. 5B) y en el 25 % de los casos, la presencia de una pequeña zona central de tejido más fibroso y flojo (resultado no mostrado). En cada uno de los sitios, el tejido óseo fibrilar neoformado tenía las mismas características que las del tejido obtenido en los implantes de sangre coagulada/BCP (Fig. 5C, 5D). En conclusión, estos resultados muestran que la utilización de sangre entera permite obtener una colonización completa de implantes en los dos sitios. La asociación de plasma coagulado y partículas de BCP genera una colonización incompleta.

3.3. Análisis macroscópico y microscópico de implantes compuestos de sangre humana coagulada y partículas de BCP de 40-80 um. después de la implantación subcutáneo en ratones inmunodeprimidos.

Se ha analizado la formación ósea inducida por el biomaterial preparado de sangre humana coagulada alrededor de las partículas de BCP de 40-80 pm, después de la implantación en ratones inmunodeprimidos sin sistema inmunitario. Paralelamente, en los mismos animales, se ha implantado el biomaterial preparado a partir de la sangre de ratones C57BL/6 para comparar, en el mismo animal receptor, la formación ósea inducida por la sangre de ratones y la generada por la sangre humana. Después de 6 semanas de implantación, se extrajeron los implantes, se fijaron y se realizó el análisis histológico como se describió anteriormente.

Incluso antes del estudio histológico, se observó una dureza muy inusual de los implantes preparados a partir de la sangre humana mientras que los implantes de la sangre de ratones tenían una consistencia más elástica.

El análisis histológico de los implantes murinos reveló un tejido óseo inmaduro de calidad equivalente a la observada en experimentos anteriores realizados en sistema singenético (implantación de sangre de ratones C57BL/6 en ratones C57BL/6). Se observó un tejido fibrilar colagénico muy vascularizado en el que se pueden identificar células óseas, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos (Fig. 6A, 6B).

El análisis histológico de los implantes humanos ofreció resultados muy diversos con la colonización por un tejido óseo maduro. Las células óseas son menos numerosas, en beneficio de los osteocitos. El tejido de sustrato presenta una organización en fibras de colágeno mejor estructuradas, alineadas y más densas, en el seno de los intervalos hematopoyéticos caracterizados por la presencia de células hematopoyéticas inmaduras como los eritroblastos, así como los adipocitos (Fig. 6C, 6D). La dureza de estos implantes en el corte sugirió que este tejido estaba muy mineralizado. En consecuencia, se ha obtenido un tejido óseo lamelar maduro.

La diferencia de madurez de los tejidos óseos obtenidos después de la implantación de sangre humana y de murino podría derivarse de las diferentes propiedades de la sangre de estas dos especies, propiedades relacionadas con la composición celular y/o con la composición proteica, con los factores de crecimiento, con los factores ores solubles y con la red de fibrina. Se realizarán experimentos para tratar de comprender los mecanismos involucrados.

La comparación de nuestros resultados con los de la bibliografía mostró que el tejido óseo maduro que se obtuvo de sangre humana era muy similar al que varios grupos han descrito después de la implantación de células estromales mesenquimatosas (MSC) humanas seleccionadas, amplificadas, diferenciadas ex vivo en osteoblastos y después asociadas a BCP en polvo e implantadas de forma subcutánea en ratones inmunodeprimidos.

Todos estos resultados son, por lo tanto, muy prometedores para la aplicación clínica.

3.4. Influencia de la granulometría del BCP en la formación ósea

Se han probado 4 formas de BCP, tres formas de micropartículas calibradas, respectivamente, entre 40 y 80 pm, 80 y 200 pm, y 200 y 500 pm, así como una mezcla de partículas de 80-200 pm de un polvo fino de tamaño mucho menor que 40 pm, siendo la proporción de polvo fino del 40 % en peso respecto al peso total de la mezcla. Los implantes se prepararon en las condiciones ya descritas, utilizando sangre de ratón C57BL/6 y cada una de estas formas de bCp. La formación ósea se analizó después de 8 semanas de implantación subcutánea en ratones singénicos C57BL/6.

Los resultados de la figura 7 ilustran que los implantes constituidos por micropartículas de 80-200 pm generan de forma muy reproducible la mejor colonización por un tejido óseo inmaduro que tiene las características ya descritas (Fig. 7c, 7D). La presencia de polvo de BCP (de tamaño inferior a 40 pm) mezclado con las micropartículas de BCP de 80-200 pm es extremadamente perjudicial para la formación ósea como se observa en la figura 7A. De hecho, se observa una colonización, de los implantes que siempre quedan, estrictamente limitada a una corona periférica. Los implantes constituidos por granos de 40-80 pm generan una buena colonización, pero menos reproducible que los implantes de 80-200 pm. De hecho, de manera inexplicable, se observa a veces un defecto central de la colonización como se observa en la figura 7B. Finalmente, los implantes constituidos por granos de 200-500 pm son siempre colonizados, pero por un tejido más fibroso y flojo de calidad menos satisfactoria (Fig. 7E, 7F).

Estos resultados demuestran que, en nuestro biomaterial, la granulosidad de 80-200 pm es la más favorable a la formación ósea en sitio ectópico.

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3.5. Determinación de la relación óptima de BCP/sangre para la reconstrucción ósea

Se pueden incorporar en el biomaterial de la presente invención cantidades variables de micropartículas de BCP para un mismo volumen de sangre. La determinación de la relación ideal era una etapa importante en su desarrollo. Varios experimentos de implantación en un sitio subcutáneo en ratones, así como experimentos preliminares en sitio óseo en rata WISTAR y en perro BEAGLE, han permitido precisar las mejores relaciones de BCP/sangre.

3.5.1. Implantación en sitio ectópico subcutáneo en ratones

Se han preparado implantes constituidos por una cantidad fija de sangre (100 pl), una cantidad fija de CaCl2 (10 pl) y una cantidad cada vez mayor de micropartículas de BCP de 40-80 pm: 10 mg, 30 mg, 50 mg y 70 mg, es decir, relaciones BCP/sangre de 10, 30, 50 y 70 % peso/volumen. Las partículas BCP se mantuvieron en suspensión en sangre durante la coagulación por rotación en una rueda (procedimiento 1). Estos implantes poseen tamaños equivalentes en el momento de la implantación, con volúmenes respectivos de: 112, 116, 120 y 124 pl.

Como se puede ver en la figura 8, después de 4 semanas de la implantación, se ha comprobado que el tamaño final de los implantes era proporcional al peso inicial del BCP incorporado, y que todos los implantes tienen densidad de partículas equivalente. Además, la colonización por tejido óseo inmaduro era la misma independientemente de la relación BCP/sangre.

Estos resultados indican que la dispersión homogénea de los granos en el implante inicial, obtenida por rotación de las jeringuillas durante la coagulación, no se mantiene en el transcurso del tiempo. Por el contrario, surge un fenómeno de disminución de las partículas, probablemente ligado a la degradación natural del gel de fibrina in vivo. Esta disminución conduce a la misma concentración de granos para un volumen dado, independientemente de la relación inicial, parece lógico que el fenómeno de osteoinducción sea el mismo.

Los experimentos realizados, posteriormente, en el sitio óseo confirmaron estos resultados.

3.5.2. Implantación en sitio óseo en rata

Se operó un solo fémur por rata, la pérdida de sustancia es rellenada por el presente biomaterial, sangre entera autóloga/BCP (80-200 pm). El seguimiento de las ratas es clínico (ausencia de dolor, deambulación y estado general) y radiológico mediante las imágenes J0, J7, J15, J30, J45, J60, y J90. Al final del tercer mes, los animales se sacrificaron, los fémures se extrajeron y, después de la ablación del material de osteosíntesis, los huesos se fijaron en formol antes de la integración en la resina del metil metacrilato y el estudio histológico.

En las primeras intervenciones, los implantes se realizaron a la medida del defecto óseo, con una proporción de partículas de 50 % peso/volumen, es decir, 75 mg de BCP para 150 pl de sangre entera extraída del animal en preoperatorio. La coagulación se desencadena mediante la adición de 15 pl de CaCl2 al 2 % y la homogeneización se garantiza por rotación continua hasta la coagulación con el fin de mantener las partículas de BCP en suspensión en la sangre y garantizar la homogeneidad del biomaterial.

Se observó de manera muy reproducible y a partir de las primeras imágenes radiológicas de J7, la aparición de un borde transparente de la radiografía entre los bancos óseos y el implante (fig. 9A), que refleja una ausencia de cohesión entre el biomaterial y las secciones diafisarias. Cuando el BCP está a máxima concentración en la sangre, las micropartículas se sedimentan durante la coagulación (procedimiento 2), se observa una cohesión satisfactoria entre el biomaterial y las secciones diafisarias (figura 9B).

3.5.3. Comparación de los resultados obtenidos con los dos procedimientos de preparación de los implantes.

En hueso de rata (Fig. 9B) y de perro (Fig. 10A y 10b), los análisis radiológicos mostraron, con este nuevo protocolo, la ausencia de encogimiento de los implantes en las radiografías de frente, así como la ausencia de bordes en las radiografías de perfil. En ratones, en sitio ectópico, no se observó ninguna diferencia en los resultados de la formación ósea.

3.5.4. Discusión:

En el caso de una implantación ósea de un biomaterial sedimentado (procedimiento 2), no existe una disminución de las dimensiones del implante, como observamos en las radiografías efectuadas en ratas y perros, y si se ha puesto correctamente en su lugar, en estrecho contacto con el hueso, favorece los fenómenos de osteoconducción y de osteoinducción de una manera óptima.

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la fabricación de un biomaterial, incluyendo este procedimiento al menos las siguientes etapas:

   (i) mezcla de un fosfato cálcico bifásico, o BCP, en forma de gránulos de tamaño comprendido entre 40 y 500 pm con sangre, o con un aspirado de médula ósea, en proporciones que varían del 10 al 90 % en peso de BCP por volumen de sangre o médula, en g/ml,

   (ii) adición a la mezcla de la etapa (i) de al menos un agente coagulante en cantidad suficiente para provocar la coagulación de la sangre o de la médula,

   (iii) mezcla en condiciones que favorecen la homogeneización del BCP mientras se produce la coagulación.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente coagulante basado en calcio se escoge de: sales de calcio biocompatibles y preferentemente CaCl2.
3. 3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sangre se tomó previamente de un donante compatible con el receptor al cual se destina el biomaterial.
4. 4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sangre se extrajo previamente del receptor al cual se destina el biomaterial.
5. 5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla que contiene BCP, sangre y agente coagulante se deja en reposo durante la fase de coagulación sanguínea para permitir que el BCP se sedimente y forme un implante saturado en BCP.
6. 6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas (i) a (III) se aplican en la cavidad interna de una jeringuilla o en un tubo cerrado en sus extremos.
7. 7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye la mezcla de 50 a 90 % en peso de BCP respecto al volumen de sangre en g/ml, preferentemente de 60 a 80 %.
8. 8. Biomaterial que puede obtenerse por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende un BCP en forma de gránulos de tamaño comprendido entre 40 y 500 pm, ventajosamente de 80 a 200 pm, y de sangre coagulada o de la médula coagulada.
9. 9. Biomaterial según la reivindicación 8 en forma de una pasta homogénea maleable.
10. 10. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9 en el que el BCP incluye hidroxiapatita (HA) y fosfato tricálcico p (p-TCP) en una relación peso/peso de HA/p-TCP comprendido entre 5/95 y 95/5.
11. 11. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 y que comprende, además, al menos un aditivo seleccionado de: polímeros, partículas cerámicas, moléculas farmacéuticas, factores de crecimiento, naturales o sintéticos, biomarcadores, agentes de contraste, preparaciones tisulares o celulares.
12. 12. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para su utilización como implante en un procedimiento de rellenado de un defecto óseo.
13. 13. Asociación de un biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 con una osteosíntesis.
14. 14. Kit para la aplicación del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo este kit la asociación de un BCP de granulometría comprendida entre 40 y 500 pm con un agente coagulante derivado del calcio.
15. 15. Kit según la reivindicación 14 en el que el agente coagulante es CaCl2.
16. 16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15 que incluye:

    (a) un dispositivo que incluye una cavidad interna estéril en la que se coloca el BCP,

    (b) un depósito estéril que contiene el agente coagulante.
17. 17. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en el que el dispositivo (a) contiene medios que permiten la introducción de sangre en la cavidad interna.
18. 18. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 en el que el dispositivo (a) contiene medios que permiten la aplicación del biomaterial en la zona donde se ha observado un defecto óseo.
19. 19. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 en el que el dispositivo (a) está constituido por una jeringuilla.

    5 20. Utilización de un biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 in vitro o ex-vivo como soporte

    para la producción de tejido óseo, o para producir un implante óseo.