KR20110105759A

KR20110105759A - 혈액 및 이상성 칼슘 포스페이트 세라믹 입자의 조합

Info

Publication number: KR20110105759A
Application number: KR1020117001526A
Authority: KR
Inventors: 티에리 발라게르; 나탈리 로쉐; 크리스토프 트로자니; 플로리안 부케츠바; 조르쥐 칼르
Original assignee: 쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스); 쌩뜨레 호스피탈리에르 유니베르시테르 드 나이스
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2011-09-27
Also published as: CN102123740B; EP2307060A1; ZA201100081B; WO2010007230A1; FR2932686B1; RU2011102373A; AU2009272594B2; US20110182950A1; AU2009272594A1; BRPI0914655A2; CA2728941A1; IL210181A0; IL210181A; KR101626630B1; ES2680623T3; RU2496524C2; JP5456031B2; CA2728941C; EP2307060B1; BRPI0914655A8

Abstract

본 발명은 응고 혈액 또는 응고 골수 흡인물 및 이상성 칼슘 포스페이트 세라믹 입자를 함유하는 생체재료, 이의 제조방법, 및 골 조직을 재생할 수 있는 이식재 생성용 상기 생체재료의 용도에 관한 것이다.

Description

혈액 및 이상성 칼슘 포스페이트 세라믹 입자의 조합{COMBINATION OF BLOOD AND OF BIPHASIC CALCIUM PHOSPHATE CERAMIC PARTICLES}

본 발명의 주요부는 응고 혈액 또는 응고 골수 흡인물, 및 이상성 칼슘 포스페이트 세라믹 입자를 함유하는 신규한 생체재료, 및 이의 제조 방법, 및 골 조직 재생이 가능한 이식재 제조용 이의 용도에 관한 것이다.

주로 외상에 기인하고, 보다 드물게는 종양 기원의, 뼈 성분 손실의 복원은 정형외과 의사가 마주치는 커다란 어려움 중 하나이다. "좁은(narrow)" 위관절(pseudarthrosis)(성분 손실이 가시적인 골절 병합의 결함)로부터 5-6cm의 뼈 손실에 이르는 작은 크기의 결함은 장골릉에서 제거된 피질-해면 골 조직 또는 해면의 자가조직 이식물의 가장 흔한 문제이다(골드 표준). 큰 크기의 결함(≥ 6cm)은 훨씬 더 성가신 절차, 혈관화 뼈 전달 또는 마스켈레(Masquelet) 기술을 필요로 한다. 그럼에도 불구하고, 활용가능한 자가조직 뼈의 양은 제한되고, 뼈 병합은 불확실하게 남아 있고, 이러한 다양한 기술들이 주로 이식물이 제거된 부위에서 수술-후 합병증을 일으킨다.

임상 실무에서 사용가능한 다양한 생체재료는 이론적으로는 자가조직 이식의 단점을 피할 수 있다. 불행하게도, 이들 중 어느 것도 골 이식 결과에 필적할 만한 것은 없고, 이들이 대량의 성분 손실을 복원할 수는 없다.

현재 연구되는 대부분의 뼈 대용품들은 선별 및 인 비트로 세포 배양 수 주일 후 골수로부터 얻어지는 중간엽 줄기세포와 생체재료를 결합한다. 이러한 접근법은 복잡하고 비싸서, 임상 사용을 제한한다.

L.　Okazaki et al., Clin. Oral Impl. Res., 16, 2005, 236-243은 응고된 혈액 또는 탈염된 골 분말을 함유하는 이식재를 기재한다. 여러 저자들이 합성 생체재료와 혈액의 조합을 연구하였다: J. Schmid et al., Clin. Oral Impl. Res. 1997:8:75-8은 탈염된 소의 뼈 분말과 혈액을 함유하는 이식재를 기재한다. A. Chevrier et al., Osteoarthritis and Cartilage (2007), 15, 316-327은 인 시츄에서 응고하는 혈액 및 글리세롤 포스페이트 완충액 내에 키토산을 함유하는 중합체 용액을 함유하는 이식재를 기재한다. B. Wallkamm et al., Clin. Oral Imp. Res., 14, 2003, 734-742은 혈액 및 폴리락트산 유도체를 함유하는 이식재를 기재한다(Polyfibre® 또는 Polyfoam®). Yilderim M. et al., Clin. Oral Impl. Res., 2000, 11, 217-219는 소 아파타이트 및 정맥혈을 함유하는 이식재를 기재한다. 문헌 US 제2008/0014279호는 골 결함이 충진될 부위에 주사기 또는 스파튤라를 사용하여 적용되는 페이스트를 형성하기 위하여, 임의의 액체, 특히 혈액과 혼합할 수 있고, 중합체 겔로 코팅된 과립 재료로 이루어지는 생체재료를 기재한다. 문헌 WO 제02/068010호는 골수 함유 복합 재료를 기재하고 있는데, 이 재료는 다공성, 생체적합성 이식 가능한 매트릭스, 및 골수, 혈액 또는 혈장의 응고물과 같은 응고된 재료를 포함한다.

그러나, 선행 기술에 기재된 이들 이식 가능한 재료 중 어느 것도 단점이 없지는 않다:

지지체(탈염된 뼈, 합성 중합체, 등)와 결합 전 골수 세포의 배양을 필요로하는 재료는, 사용하는 데 장시간이 걸리고, 이식재를 적용하기 수 주일 전 치료될 개체로부터 골수를 수집할 필요가 있는데, 이는 관련된 과정과 위험을 증가시킨다.

지지체 및 비응고 혈액을 함유하는 생체재료는 이식재가 구축될 수 있게 하지 못한다.

응고 혈액과 일부 지지체 재료의 조합이 제안되어 있지만, 특히 이 방법은 균질한 생체재료의 생산이 가능하지 않기 때문에, 얻어진 결과들이 항상 만족스러운 것은 아니다.

지지체 및 응고 또는 비응고 혈액의 조합에 기인한 이러한 재료들이, 골 병합의 문제가 덜 중요한 경우인 악골안면 수술에 현재까지 사용되어 왔지만, 이들 재료는 골간(diaphyseal) 뼈의 회복에 거의 또는 전혀 사용된 적이 없었다.

WO 제02/068010호의 경우에는, 이 방법은 응고된 재료, 바람직하기는 골수 유래인 응고 재료, 및 5mm 이상의 탈염된 피질 뼈 섬유와 결합된, 최소 크기가 1mm 이상인 과립 형태의 다공성 탈염된 뼈로 이루어진 지지체 재료를 사용하는 것으로 이루어진다고 개시한다. 제안된 모든 실시예들이 골수 세포를 포함한다.

본 발명은 신규한 생체재료, 및 이의 제조 방법, 및 골 조직 재생이 가능한 이식재 제조용 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 생체재료는, 응고 혈액과 실질적으로 균질하게 혼합된, 과립 형태의 하나 이상의 이상성 칼슘 포스페이트를 포함하는 페이스트 형태인 것이다.

이상성 칼슘 포스페이트, BCP는 많은 의학 및 치과학 적용에 사용된다. 이상성 칼슘 포스페이트는 Nery EB et al., J Periodontol. 1992, Sept., 63(9): 729-35에서 골 회복 재료로 처음 기재되었다. BCP는 하이드록시아파타이트(HA) Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ 및 베타-트리칼슘 포스페이트(Ca₃(PO₄)₂)(β-TCP)의 혼합물로 이루어진다. 그의 생활성 및 생체흡수성은 형성되는 β-TCP 및 하이드록시아파타이트의 비율을 통하여 조절될 수 있다.

BCP 함유 생체재료는, 다른 합성 생체재료와 비교하여, 골 생성을 촉진하는 장점을 가진다.

BCP는 많은 연구의 주제였다: Fellah B.H. et al., J. Mater. Sci.: Mater. Med. (2007), 18, 287-294는 20㎛ 미만의 입자 크기 선택이 조직의 염증 반응을 촉진하고, Malard O. et al., J.　Biomed. Mater. Res., 46(1), 1999, 103에 의하여 관찰된 바와 같이, 이 입자 크기가 특히 골 생성에 바람직하다는 사실을 설명할 수 있었다.

Mankani M.H. et al., Biotechnology and Bioengineering, 72(1), 2001, 96-107은, 대조적으로, 100 내지 250㎛ 범위의 크기를 가지는 보정된(calibrated) BCP 입자들이 배양된 골수 세포와 혼합될 때 가장 많은 뼈 복원을 일으키는 반면, 44㎛ 미만인 경우 뼈 형성이 관찰되지 않으며, 크기가 2mm 이하의 입자들에서는 우수한 결과들이 얻어진다는 것을 확인하였다.

Trojani　C. et al., Biomaterials, 27, 2006, 3256-3264는, 40 내지 80㎛로 보정된 BCP 입자와, 배양된 골수 세포가 첨가된 BCP/Si-하이드록시프로필메틸셀룰로오스 하이드로겔 복합 재료의 이식에 의하여 우수한 골 도입이 얻어질 수 있다는 것을 나타내었다.

그럼에도 불구하고, 후자의 두 방법은 골수 세포 및 이의 배양물을 수집하는 단계를 필요로 한다.

본 발명은 다음의 사실들에 기초한 것이다:

- BCP가 항응고성을 가지고 있다는 사실의 본 발명자들에 의한 발견,

- 응고 혈액과 결합된 선택된 입자 크기를 갖거나 또는 응고된 골수 흡인물(aspirate)과 함께 BCP가 매우 우수한 골 생성을 얻게 하고, 선행기술의 경우와 비교하여 매우 단순화된 방법 덕분에 매우 우수한 품질을 갖는 골 조직을 만든다는 본 발명자들의 발견.

따라서, 본 발명의 제1 주요부는 응고 혈액 또는 응고 골수 흡인물과 아래에 정의된 특정 BCP의 조합이다. 유리하기는, 이러한 조합이 가단성있는(malleable) 균질 페이스트의 형태인 것이다.

이 페이스트는, 그 삼차원 구조를 손상시키거나 파괴하는 과도한 압력이 이에 적용되지 않도록 주의하면서, 충진될 결함의 크기 및 형태에 적합하도록 조작될 수 있다.

본 발명에 사용되는 BCP는 40 내지 500㎛ 사이, 바람직하기는 40 내지 400㎛ 사이, 보다 더 바람직하기는 40 내지 300㎛ 사이, 그리고 유리하게는 80 내지 200㎛ 사이의 입경을 가진다.

본 발명에 사용되는 BCP는 선택된 직경을 갖는 과립으로서, 예를 들면 체질(sieving)에 의하여 분쇄되거나 보정되는 고온 소결로 이루어진다. 유리하기는, 본 발명에 사용되는 BCP는 5/95 내지 95/5 사이, 바람직하기는 30/70 내지 80/20 사이, 유리하기는 40/60 내지 60/40 사이의 HA/β-TCP 중량/중량 비의 하이드록시아파타이트 및 β-트리칼슘 포스페이트를 포함한다.

유리하게는, 이 BCP가 50nm 내지 150㎛ 범위, 바람직하게는 1㎛ 내지 50㎛ 범위의 공극 크기를 갖는 다공성 BCP인 것이다.

트리칼슘 포스페이트 및 하이드록시아파타이트의 과립 또는 분말은 Bouler et al., J Biomed Mater Res, 1996, 32, 603-609; Bouler et al., J Biomed Mater Res, 2000, 51, 680-684; Obadia et al., J Biomed Mater Res, 2006, 80(B), 32-42에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있다. 이들은 GRAFTYS SARL사로부터 상업적으로 얻을 수 있다.

선행기술의 방법이 BCP 과립에 적용된다면, 즉 만약 BCP가 예를 들어 혈액 샘플과 혼합된다면, BCP가 항응고 특성을 가지므로 혈액 응고물이 얻어지지 않는다. 본 발명의 방법에 따르면, BCP는 항응고제를 거쳐서 미리 수집되거나 항응고제 없이 수집된 혈액 샘플과 혼합되고, 생체재료의 수용자(recipient)와 화합가능한(compatible) 공여자(donor)에서 BCP와 즉시 접촉한 다음, 하나 이상의 응고제를 교반하면서 상기 혼합물에 첨가한다. 바람직하기는, 응고제가 칼슘 유도체인 것이다. 유리하기는, 칼슘-기반 응고제가 생체적합성 칼슘염, 예를 들면, CaCl₂, Ca(NO₃)₂, Ca(AcOEt)₂ 또는 CaSO₄이다.

본 발명을 실시하기 위하여 사용될 수 있는 다른 응고제 중, 트롬빈이 언급될 수 있다. BCP, 혈액, 또는 골수 흡인물, 및 응고제의 혼합은, 전체 응고 단계 동안 유지되고, BCP, 및 응고 혈액 또는 응고 골수의 과립이나 입자의 균질한 혼합의 형성, 그리고 특히 BCP 입자의 현탁 상태를 유지할 수 있기에 적합한 강도인 것이다. 교반이 과도하거나 충분히 강력하지 않을 경우, 균질한 혼합물 생성이 가능하지 않다. 당업계의 기술자는 균질한 혼합물의 형성을 가시적으로 조절할 수 있다.

BCP에 추가하여, 생체재료의 조성물은 중합체, 세라믹 입자, 약제학적 분자, 성장인자, 천연 또는 합성, 생체마커, 조영제, 조직 또는 세포 제제:와 같은 임의의 첨가제를 포함할 수 있고, 이들 재료를 사용하기 위한 조건은: 이들의 생체적합성, 생체재료 고정화 반응에 불리한 효과가 없는 것이다. 당업계의 기술자에게 공지된 이러한 첨가제는, 생체재료의 리올로지 또는 인 비보에서의 그의 성질(경도, 흡수성, 골생성도)을 수정하거나, 감염이나 염증 현상의 발생에 작용(항생, 항-감염, 항-염증성)하게 하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 생체재료에, 예를 들면 암 및 골다공증으로부터 선택되는 병리 증상을 예방하거나 치료하기 위한 분자와 같은 하나 이상의 치료용 분자와 같은 활성 성분을 도입하는 것을 고려할 수 있다.

또한, 본 발명의 생체재료에, 천연 또는 합성 성장 인자를 도입할 수 있다. 또한, 의학적 영상화에 의하여, 생체재료의 재흡수 및 몸체 내에서의 운명의 가시화를 촉진하는 생체마커 또는 조영제의 존재를 고려할 수도 있다.

본 발명의 생체재료에, 생체재료가 의도되는 환자에서 수집한 지방 조직 또는 임의의 다른 조직이나 세포 제제를 도입하는 것을 고려할 수 있는데, 이 지방 조직이나 이의 제제는 미리 혈액 또는 혈장 또는 생리적 염수에 현탁된 것이다. 이 조직 또는 세포 제제 중에는, 지방 조직, 혈소판, 골수 세포를 언급할 수 있다.

또한, 입자 크기를 조절하는 것이 골 조직의 더 나은 형성(더 빠르고 더 나은 품질) 및 우수한 재흡수를 허용하기 때문에, 다른 입자 크기를 갖는 BCP의 존재, 그러나 바람직하기는 소량인, 유리하기는 < 5% 중량/전체 중량 비인 BCP를 고려할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, BCP는 주사기의 내부 공동(cavity)과 같은 폐쇄된 멸균 용기의 공동에 배치된다. 수용자와 화합가능한 공여자로부터 미리 수집된 혈액 또는 골수 흡인물을 이 용기에 넣는다.

수집된 혈액 또는 골수 흡인물이 수 초 이상의 기간(5 내지 10초) 동안 보존되어야 한다면, 너무 이른 응고를 피하기 위하여, 이를 수집한 후 이와 항응고제를 즉시 혼합한다. 공여자의 혈액은, 예를 들면 항응고제의 적절한 양을 함유하는 튜브에서 직접 수집될 수 있다.

항응고제는 예를 들면, 구연산 나트륨과 같은 칼슘 이온의 킬레이트제, 및 예를 들면 헤파린일 수 있다.

BCP 및 혈액 또는 골수의 혼합물은 다음의 바람직한 비율로 제조된다:

g/ml로 혈액 (또는 골수) 부피에 대하여 10 내지 90중량%, 바람직하기는 50 내지 90중량%, 그리고 보다 더 바람직하기는 60 내지 80중량%의 BCP.

유리하기는, 이식재의 생체적합성을 가능한한 많이 보증할 수 있도록 혈액은 수용자 자신으로부터 수집된다. 본 발명의 한 변형예에 따르면, 혈액은 혈장과 같은 혈액 유래의 산물로 대체된다. 바람직하기는, 전체 혈액(전혈)이 사용되는 것이다. 청구항을 포함한 전체 명세서에서, 혈액이라는 용어가 사용될 때, 이는 그 정의 내에 혈장과 같은 혈액-유래 생성물을 포함한다.

바람직하기는, 본 발명의 실행에 있어서, 그의 수집이 수술 과정을 필요로 하지 않는, 혈액 또는 혈장이 사용된다.

본 발명의 한 변형예에 따르면, 주사기 몸체 내에 BCP 및 임의의 첨가제가 미리 들어 있는 주사기에 의하여 혈액이 수집될 수 있다.

BCP 및 혈액의 첫 번째 혼합 후, 이러한 장치가 사용되는 경우, 예를 들면 주사기에 의한 흡인으로, 응고제가 혼합물에 더 첨가된다.

균질한 재료의 형성이 가능하도록 BCP, 혈액, 및 응고제를 함유하는 폐쇄된 용기를 즉시 교반한다. 예를 들면, 혼합물이 튜브 또는 주사기 몸체 내에서 제조된다면, 응고가 일어나는 동안 BCP 입자가 현탁 상태로 남아 있도록, BCP의 입자 크기에 따라 속도가 정해지는 회전 교반기에 용기가 배치된다. 본 발명의 한 변형예에 따르면, 교반은 자기(magnetic) 교반기와 결합된 자기 비드에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 변형예에 따르면, BCP, 혈액, 및 응고제를 함유하는 폐쇄된 용기는, BCP가 침전하여 BCP로 포화된 이식재를 형성할 수 있도록 하기 위하여 혈액 응고 단계 동안 정치시킨다(stand).

이 단계의 끝에서, 혼합물은 조성물로 도입된 혈액 입자, 혈장 및 다른 분자를 포획한 피브린의 3차원 네트워크를 함유하는 균질한 가단성 페이스트 형태이다.

본 발명의 생체재료의 제조에 사용되었던 장치의 형태에 따라, 골 결함이 충진되어야만 하는 영역에 가장 잘 맞는 수단에 의하여 이것이 적용될 수 있다:

미리 말단부를 자른 다른 원통형 장치 또는 주사기에 의하여, 또는 이식재의 3차원 조직에 지장을 주지 않는 스파튤라와 같은 도구에 의하여, 본 발명의 생체재료의 리올로지에 적합한 개구를 형성할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 주요부는 생체재료를 제조하기 위한 방법이며, 이 방법은 최소한 다음의 단계를 포함하는 것이다:

(i)　혈액 또는 골수의 부피 당 BCP 10 내지 90중량% 범위의 비율로, 40 내지 500㎛ 사이의 크기를 가지는 과립 형태의 BCP를 혈액 또는 골수 흡인물과 혼합하고,

(ii)　(혈액 또는 골수의) 응고를 일으키기에 충분한 양으로 하나 이상의 응고제를 상기 단계 (i)의 혼합물에 첨가하고,

(iii)　응고가 일어나는 동안 BCP의 균질화를 촉진하는 조건 하에서 혼합하는 단계.

이미 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법에서, 단계 (i) 내지 (iii)은 말단이 폐쇄된 튜브 또는 주사기의 내부 공동에서 실시될 수 있다. 응고제는 앞서 나열되었던 것과 같은 칼슘 유도체 또는 예를 들면 트롬빈과 같은 다른 응고제로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 주요부는 또한 골 결함을 충진하는 방법으로서, 이 방법은 상기한 단계를 포함하고, 골 결함이 관찰된 공간에 단계 (iii)에서 얻어진 생체재료를 적용하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이 방법은 조직 절개 및 봉합 단계를 추가로 포함할 수 있다.

골 결함의 크기 및 형태에 따라, 본 발명의 생체재료에 의한 충진은, 골 복원이 본 발명의 생체재료의 이식 부위에서 진행되는 동안 요구되는 기계적 강도를 환부 조직에 부여할 수 있는 골접합술(골합성)과 연관될 수 있다.

본 발명자들이 관찰한 바와 같이, 본 발명의 생체재료의 이식은 단기간(수주일) 내 골 조직의 형성을 유도할 수 있고, 이 골 조직은 매우 풍부하게 혈관분포되어 있다.

대조적으로, 40㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 BCP를 가지고 동일한 방법에 의하여 얻어지는 생체재료의 이식은 만족스러운 기간 내에 충분한 품질의 골 조직 형성을 얻을 수 없다는 것이 관찰되었다. 500㎛ 보다 큰 입자 크기를 갖는 BCP를 가지고 동일한 방법에 의하여 얻어지는 생체재료의 이식은 흡수성이 낮은 이식재를 만든다.

본 발명의 다른 주요부는 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트로 이루어지고, 상기 키트는 40 내지 500㎛, 바람직하기는 40 내지 400㎛, 유리하기는 40 내지 300㎛, 그리고 보다 더 바람직하기는 80 내지 200㎛의 입자 크기를 가지는 BCP와 하나 이상의 응고제의 조합을 포함한다. 바람직하기는, 응고제가 칼슘 유래인 것이다. 유리하기는, 응고제가 CaCl₂이다.

응고제의 양은 수집된 혈액과 혼합되는 BCP 및 임의적인 항응고제의 항응고 효과를 보상하기 위하여 계산된다.

혈액과 BCP의 혼합물에서 응고제의 농도는, 특히 응고제가 칼슘 기반인 경우, 바람직하기는 1 내지 50mM, 보다 바람직하기는 3 내지 35mM이어야만 한다. 응고제는 바람직하기는 ml/g으로, BCP의 중량에 대해 응고제 용액이 2 부피배를 초과하지 않도록 수용액으로 첨가되어야만 한다.

바람직하기는 120mM 미만의 농도를 가지는 응고제 용액이 사용될 경우, 특히 응고제가 칼슘염일 경우, 응고제 용액의 농도는 이들 두 가지 제약을 존중하여 변경될 수 있다.

혈액이 항응고제를 거쳐 수집될 경우, 항응고제의 효과 및 생체재료의 효과는 보상되어야 한다.

예를 들면, (Greiner Bio-One 사에서 구입가능한 상표, Vacuette® 또는 Becton Dickinson 사에서 구입가능한 상표, Vacutainer®의) 통상적인 조건 하에서 구연산 나트륨을 거쳐 수집된 혈액에 대하여, BCP 50mg 및 혈액 100㎕ 비율로, 본 발명자들은 80mM의 칼슘 용액의 최종 부피의 1/5(즉, 20㎕)을 첨가한다(최종 농도 13.3mM). 용액의 농도는 최대 120mM까지 될 수 있다. 위에서, 과량의 칼슘이 있을 수 있는데, 이는 다시 응고를 억제한다.

혈액이 항응고제를 거쳐 수집되지 않을 경우, 혈액은 생체재료를 거쳐 직접 수집되고, 두 번째 경우 칼슘이 첨가된다. 이 경우, 약 12mM 내지 60mM 범위의 농도를 가지는 칼슘염 수용액의 혈액 부피의 1/5을 첨가할 수 있다.

이러한 조합은 다음을 포함하는 멸균 키트 형태일 수 있다:

(a) 내부에 BCP가 배치되는 멸균 내부 공동을 포함하는 장치,

(b) 응고제를 포함하는 멸균 저장소.

상기 저장소 (b)는 장치 (a)의 일부이거나, 응고제를 제거하여 장치 (a)의 내부 공동으로 전달할 수 있는 튜브 또는 병과 같이 분리된 개체, 또는 BCP가 배치된 공동으로, 응고제를 주입할 수 있는 주사기일 수 있다.

유리하기는, 장치 (a)가 내부 공동으로 혈액을 도입할 수 있는 수단: 예를 들면, 개체로부터 직접 또는 저장소로부터 혈액 샘플을 수집할 수 있는 수단, 또는 BCP와 혼합할 수 있도록 내부 공동으로 혈액 샘플의 주입이 가능한 수단을 포함한다. 수집된 혈액은 BCP를 포함하는 공동으로 직접 도입되거나, 항응고제가 배치된 저장소에 수집된 다음 전체가 BCP가 존재하는 공동으로 전달되는 것을 고려할 수 있다. 골수 흡인물이 사용될 경우, 골수의 흡인을 위한 수단을 위한 준비가 이루어진다.

장치 (a)의 내부 공동은, 본 발명의 생체재료, 및 혼합물의 나머지 성분들: 예를 들면, 응고제, 활성성분, 조직 또는 세포 제제를 생성하기 위하여 필요한 혈액 또는 골수의 양을 내부에 도입할 수 있는 크기를 가진다.

또한 유리하기는, 장치 (a)가 골 결함이 관찰된 영역 내의 생체재료의 적용을 허용하는 수단을 포함한다.

이러한 장치는 실험 부분에 설명된 바와 같이, 튜브 또는 주사기와 같은 원통형 장치로 이루어질 수 있다.

또한, 내부에 BCP가 저장되고, 내부로 혈액 및 응고제가 주입되며, 생체재료가 형성되면 생체재료를 방출하기 위한 피스톤이 맞춰지는 튜브를 포함하는 WO 제02/068010호에 개시된 장치와 같은 장치를 사용하는 것을 고려할 수 있다.

또한, Vacutainer® 형태의 장치, 즉 예정된 양의 혈액을 수집할 수 있는 주사기가 맞춰진 진공 하의 튜브를 사용하는 것을 고려할 수 있으며, 이들 튜브는 내부의 공동에 BCP를 갖도록 미리 조절된다.

본 발명의 다른 주요부는 혈액 단백질의 3차원 네트워크 또는 골수 단백질의 네트워크에서 실질적으로 균질하게 분산되고, 크기는 상기한 바와 같은 과립 형태의 BCP를 포함하는 이식가능한 생체재료로 이루어진다.

유리하기는, 이 생체재료가 가단성 페이스트의 외견을 갖는 실질적으로 균질한 혼합물 형태인 혈액 (또는 골수) 단백질의 응고물과 상기한 바와 같은 BCP를 포함한다.

가단성 페이스트라는 표현은 그 자체로는 액체와 같이 흐르지 않는 재료이지만, 그것의 기계적 강도가, 개체에 의하여, 특히 주사기의 피스톤 또는 스파튤라와 같은 기구에 의하여, 수동으로 부여된 압력의 효과 하에서 모양이 만들어질 수 있도록 충분히 낮은 것을 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 생체재료는 골절의 충진, 외상 또는 종양 기원의 성분 손실, 수술 과정 후의 결합을 포함하든 아니든, 골 이식재의 제조를 위하여, 또는 인공 삽입물의 맞춤을 돕기 위하여 사용될 수 있다.

생체재료는 골 결함이 충진될 필요가 있는 영역에 수술 과정에 의하여 실시예에 설명된 바와 같이 도입될 수 있다. 절개 후, 생체재료가 이식되고, 절개 부위는 다시 폐쇄된다.

본 발명의 생체재료는 골 조직에 의하여 결함이 있는 영역의 콜로니화(colonization)를 기다리는 동안 어셈블리의 안정화가 가능하도록, 더 큰 기계적 강도의 골접합술(골합성)과 결합될 수 있다.

인공 삽입물과 생체재료를 결합하는 것을 고려할 수 있다. 본 발명의 생체재료로 인공 삽입물을 코팅하는 것은 인공 삽입물 내부 또는 주변의 살아있는 골 조직의 이식을 촉진할 수 있다.

본 발명의 생체재료는 또한 골 조직 생성을 위한 지지체로서 인 비트로 또는 엑스 비보에서 사용될 수 있다:

사실, 이 생체재료 주위의 골 세포의 배양은 뒤따라 이식될 수 있는 골 조직을 생성할 수 있다.

본 발명의 다른 주요부는 골 이식재 생성용 상기한 생체재료의 인 비트로 또는 엑스 비보 용도이다.

본 발명에 따르면, 제조하기 원하는 이식재의 형태를 갖는 형틀 내에서 본 발명의 생체재료 상에서 골 세포를 배양하는 것이 가능하다. 이러한 조건 하에서 세포를 배양하는 것은 적절한 형태와 치수를 갖는 생체적합성 이식재를 얻을 수 있도록 한다.

본 발명은 선행기술의 단점을 극복할 수 있게 하고, 특히 본 발명은 일정하고 균질한 특성을 갖도록 생성하기 쉬운 합성 지지체, 및 배양 단계를 사용할 필요없는 응고 혈액으로부터 이식가능한 생체재료를 얻을 수 있으며, 이 재료는 골 조직의 빠른 복원을 허용하는 우수한 생체적합성을 가진다. 본 발명은 또한 강도(hardness) 및 혈관화(vascularization) 면에서 우수한 품질의 뼈를 생성할 수 있다. 또한, 이 생체재료를 제조하기 위한 방법은 간단하고, 실시하기 쉽고, 치료될 개체 상에 다수의 공정을 요구하지 않으며, 선행기술 방법에 비하여 저렴하다.

도 1: BCP 입자 주위의 응고 혈액의 이식재에 의한 골 조직의 형성.
피하(A 및 C) 및 근육 내(B 및 D) 부위에 이식 4주 후 헤마톡실린, 에리트로신, 사프론(HES)으로 염색된 이식재의 단면부.
스케일: A 및 B: 500㎛
C 및 D: 50㎛
백색 화살표: 조골 세포(osteoblast)
흑색 화살표: 골 세포(osteocyte)
흑색 화살촉부: 혈관
백색 화살촉부: 파골 세포(osteoclast)
도 2: 이식 4주 후 혈액/BCP 이식재 부분.
(A): 세포의 세포질에서 오스테오칼신의 갈색을 보여주는 면역 혈청과의 혼성화 (백색 화살표)
(B): 비면역 혈청과의 혼성화 - 스케일: 10㎛
(C): 골드너(Goldner) 염료 - 스케일: 50㎛
흑색 화살표: 혈관 및 골 세포.
도 3: 4주령 혈액/BCP 이식재의 주사 전자 현미경
(A) 과립 간 공간에서의 콜라겐 매트릭스 - 스케일: 10㎛
(B) (A)의 확대도 - 스케일: 1㎛
(C) 2 내지 3개의 가시적 핵을 갖는 과립에 부착된 두 파골세포 - 스케일: 10㎛
(D) 기능성 모세혈관 - 스케일: 10㎛
도 4: 이식재의 주사 전자 현미경
(A) BCP/응고 혈액
(B) BCP/응고 혈장
스케일: 1㎛
도 5: 이식 4주 후 BCP/혈장 이식재로부터 골 조직의 형성
피하 부위 (A, C)
근육내 부위 (B, D)
스케일: 500㎛ (A, B)
50㎛ (C, D)
도 6: 누드-타입 면역억제된 마우스에 피하 이식 후, BCP 미세입자(40-80㎛)와 혼합된 C57BL/6 마우스의 혈액 (A, B) 및 인간 혈액 (C, D)으로부터 제조된 생체재료의 골 생성 특성의 비교. 저배율(A, C) 및 고배율(B, D)에서의 관찰.
스케일: 100㎛.
도 7: 마우스에 피하 이식 후, 골 형성에 대한 BCP 미세입자 크기의 영향. 이식재를 80-200㎛의 입자와 혼합된 40㎛ 미만의 크기를 갖는 다량의 미세 가루(dust)의 형태(A); 40-80㎛의 입자 형태(B); 80-200㎛의 입자 형태(C, D); 200-500㎛의 입자 형태(E, F)의 BCP와 혼합된 C57BL/6 마우스 혈액으로부터 제조하였다. 도 7D 및 7F는 각각 이식재 C 및 E의 보다 더 고배율 시계에 대응된다. 스케일 100㎛.
도 8: 100㎕의 C57BL/6 마우스 혈액 및 BCP 40-80㎛의 미세입자의 증가된 양: (A) 10 mg, (B) 30 mg, (C) 50 mg 및 (D) 70　mg으로부터 제조된 이식재. 스케일: 100㎛.
도 9: 개의 x-선 - 보정된 BCP 미세입자 (80-200㎛) 주변의 응고된 전혈로부터 제조된 이식재: (A) 50%의 비를 갖는 BCP/혈액, 미세입자는 응고 단계 동안 혈액 내에서 현탁 상태로 유지됨(방법 1); (B) 혈액 내 최대 농도의 BCP, 미세입자는 응고 동안 침전됨(방법 2). 백색 화살표는 골간 단부와 이식재 사이의 방사선 투과성 라인의 존재를 나타낸다.
도 10: 비글(BEAGLE) 개 내의 이식. 수술 후 x-선. (A) 좌측에서, 이식재는 BCP 단독으로 이루어진 것이다. (B) 우측에서, 이는 이식재 제조의 방법 2에 따른 BCP의 최대 비율을 갖는 BCP/혈액 혼합물로 이루어진다.

실험 부분

1. 원리:

이는 수술실에서 실행되는 즉석 과정이다. 이는 폴리프로필렌 주사기 몸체에서, BCP 입자 및 칼슘 이온의 킬레이트제인 항응고제를 거쳐 수집된 자기 유래 전혈(50% w/v)의 혼합으로 이루어진다. CaCl₂ 첨가는 응고가 개시될 수 있게 한다. 그 다음 주사기를 상온에서 회전 믹서에 10분 동안 두어, 응고 과정 동안 혈액 내에서 BCP 입자가 현탁 상태로 유지될 수 있게 한다. 이에 따라 응고 혈액 내 입자들의 균질한 분포가 얻어진다. 그 다음 주사기 말단을 절개하고, 이식재를 피스톤에 의하여 주사기 밖으로 밀어내어 이식 부위에 둔다.

동물( C57BL /6 마우스)에서 얻어진 결과:

4주 후 매우 풍부하게 혈관화된 광물화 미성숙 골 조직에 의하여 완전하게 콜로니 형성된 이식재를 가지고, 전위 부위 (피하 및 근육내)에 생체재료를 이식하는 것은 그의 골-유도 특성을 증명한다.

2. 재료 및 방법

2.1. 이상성 칼슘 포스페이트의 입자:

이상성 칼슘 포스페이트(BCP) 생체재료는 60% 하이드록시아파타이트 (HA; Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) 및 40% 트리칼슘 포스페이트 (TCP; Ca₃(PO₄)₂)로 구성된다. 80 내지 200마이크론으로 보정된 BCP 입자를 GRAFTYS SARL (악상 프로방스, 프랑스) 사에서 공급받았다. 입자를 2시간 동안 180℃에서 가열하여 멸균하였다.

2.2.　이식재의 제조 및 수술 과정:

- 마우스에서의 피하 이식

동물 실험의 지역 윤리위원회(Comite Regional d'Ethique pour l'Experimentation Animale (CREEA))에 의하여 허가되고, 수의학 서비스 지침서(Direction des Services Veterinaires)의 규정에 따라 실험을 실시하였다. 마취된 10주령 C57BL/6 마우스로부터 심장내 천공에 의하여 구연산 나트륨(항응고제)를 거쳐 전혈을 수집하였다. 일부 실험에서는, 혈장이 15분 동안 1800 g에서 원심분리에 의하여 전혈로부터 제조되었다.

방법 1: 1ml 주사기에 50mg의 BCP 입자와 100㎕의 전혈 (또는 혈장)을 혼합하여 이식재를 제조하였다. 그 다음, 1% CaCl₂ 용액 20㎕를 추가하여 응고 활성을 얻었다. 응고 기간(5 내지 10분) 동안, 주사기를 New Brunswick 조직 배양 롤러 타입의 롤러(모델 TC-7 M1053-4005) 상에 두었다. 이는 주사기 그 자체의 회전 움직임과 응괴(clot)에서 BCP 입자가 현탁 상태를 유지할 수 있게 한다. 주사기 말단을 자른 다음, 피스톤에 의하여 이식재를 주사기 밖으로 밀어내고, C57BL/6 마우스에 피하로(SC) 또는 근육내로(IM) 이식하였다.

방법 2: 이식재를 최대 입자 농도 및 이에 따른 최대 BCP/혈액 비로 제조하였다. 이를 위하여, 미세입자가 자연적으로 혈액에 침전될 수 있도록, BCP/혈액/칼슘 혼합물을 응고 유지 동안 고정된 위치로 유지하였다. 응고 혈액에서 미세입자의 최대 농도가 얻어진다고 여겨진다.

피하 이식재를 등 부위의 피부 하에 배치하고, 근육내 이식재를 절개 후 근육 덩어리 사이의 각 대퇴부에 배치하였다. 상기한 부위(SC 및 IM) 각각에서, 이식 동안 출혈이 유도되지 않았음을 확인하였다.

각 이식 실험에서, C57BL/6 마우스를 4% 이소플루레인에 의하여 마취시켰다. 두 개의 SC 이식재 및 두 개의 IM 이식재를 각 마우스에 두었다. 일부 실시예에서, 각 마우스는 각 부위에 혈액/BCP 이식재 및 혈장/BCP 이식재를 받아들였다. 4 내지 8주 후, CO₂ 흡인에 의하여 동물을 희생시키고, 분석을 위하여 이식재를 제거하였다.

- 랫트의 골 부위에서의 이식

랫트에 적용한 프로토콜은 동물 실험을 위한 지역 윤리 위원회에 의하여 승인된 것이었다(NCA/2007/12-06). 이들 예비 실험은 약물의 Nice 단체의 중앙 동물 하우스(Animalerie Centrale)에서 실시되었다.

본 발명자들은 본 실험실에서 개발된 모델인, 플레이트-나사 골접합술과 결합된 임계적 크기(6mm)의 대퇴부 골간의, 중단된 체절의 골 성분의 손실 모델을 사용하였다. 본 발명자들은 랫트 당 하나의 대퇴부 상에서 조작하고, 본 발명의 생체재료, 자가 유래의 전혈/BCP(80-200㎛)로 성분 손실을 충진하였다. 랫트를 D0, D7, D15, D30, D45, D60 및 D90에서 사진에 의하여 방사선-논리적으로 그리고 임상적으로(통증 부재, 가벼운 운동, 전반적 상태) 관찰하였다. 3번째 달의 말에, 동물을 희생시키고, 대퇴부를 수집하고, 골접합 재료의 절제 후, 메틸 메타크릴레이트 수지에 삽입 및 조직학 연구를 하기 전 뼈를 포르말린에 고정시켰다.

첫 번째 과정 동안, 수술 전 동물에서 회수된 전혈 150㎕ 당 75mg의 BCP, 즉 50% 중량/부피 입자 비율을 갖는 골 결함의 크기로 이식재를 만들었다. 15㎕의 2% CaCl₂를 첨가하여 응고를 개시하고, 응고가 일어날 때까지 지속적인 회전으로 균질화시켜, 생체재료의 균질화를 보증하고 혈액 내에서 BCP 입자가 현탁 상태를 유지할 수 있게 하였다.

- 비글( BEAGLE) 개의 뼈 부위에 이식

이것은 Beagle 혈통의 성견에서 생성된 뒷쪽 대퇴부 관절구의 영역에서 임계적 크기의 보정된 원통형 공동의 골 성분 손실 모델이다. 각 개에서, 2개의 대퇴부 관절구를 끌어올렸다. 이 과정의 초반부에 동물의 경정맥 영역에 천공하여 전혈(3.5ml)을 회수하여 생체재료 제조에 사용하였다. 8×10mm의 원통형 뼈 손실을 각 외부의 대퇴부 관절구 영역에 생성하고, 뼈의 부골편을 생리적 염수로 세정 및 흡인하여 조심스럽게 제거하였다.

각 동물은 2개의 다른 조성의 이식재를 받아들였으나, 생성된 결함이 완전히 충진되도록 준비하였다. 즉:

한쪽에서, 시험될 생체재료는 50% 중량/부피 비를 갖는 BCP (80-200㎛) 및 혈액의 혼합물 또는 330mg의 BCP 및 660㎕의 전혈 혼합물로 이루어진다. 응고되는 동안 혼합물 제조에 제공되는 주사기의 회전에 의하여 BCP 입자를 현탁 상태로 유지하였다.

다른 한쪽에서는, BCP를 단독으로 이식하고, 상대편 이식재와 동일한 부피, 즉 660mg을 차지하도록, 생리적 염수에서 가습시켰다.

실험 기간은 8주였다.

ENVN에서 즉시, 그리고 실험 끝부분에 수술 후 x-선을 찍었다.

2.3. 조직 분석:

절개된 이식재를 10% 완충화 포르말린 용액에 24시간 동안 고정하였다. 그 다음 각 이식재를 상온에서 24시간 동안 10%(w/v) 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 용액에서 석회질을 제거하거나 하지 않은 세 조각으로 절단한 다음 파라핀에 삽입하였다. 4㎛ 절편을 제조하고, 파라핀을 제거하고, 가습하고, 헤마톡실린, 에리트로신, 사프론(HES)으로 염색하였다. 그 다음 이 절편들을 Zeiss Axioskop 현미경을 사용하여 광학 현미경에 의하여 조사하였다. AxioCam HRc 칼라 카메라(Zeiss, Le Pecq, France)로 사진을 찍었다. 한쪽은 섬유상 뼈가, 그리고 다른 한쪽은 BCP 입자가 차지하고 있는 표면 영역을 정량하기 위하여, 이식재의 각 이미지를 이식재의 중앙 축을 따라 0.6mm²과 동일한 표면 영역을 갖는 3 영역으로 나누었다. 이 세 영역 각각에서, AxioVision Rel.4.6 소프트웨어를 사용하여 섬유상 골 조직이 차지하는 영역을 측정하였다. 이 분석은 세 개의 SC 이식재 및 세 개의 IM 이식재에 대하여 실시하였다. 혈관과 파골 세포의 수는, 두 명의 다른 관찰자에 의하여 광 현미경(100X) 하에서 다중 핵 거대 세포 및 모세혈관 각각의 수를 계수하여 이들 동일한 영역에서 평가되었다. 파골 세포 및 혈관의 밀도는 평균±표준 편차의 형태로 mm² 당으로 표현되었다. 사용된 통계 검정은 스튜던트 T 검정이다. 유의수준은 0.05 미만의 p 값으로 정의되었다.

2.4. 골드너 ( Goldner ) 염색:

7㎛의 두께를 갖는 석회질 제거되지 않은 이식재의 절편을 골드너의 트리크롬 방법에 의하여 염색하여, 골 조직의 탈염을 평가하고, 탈염되지 않은 뼈 조직(레드)과 탈염된 조직(블루/그린)을 구별될 수 있게 하였다. 간단하게, 파라핀 제거된 절편을 다시 수화한 다음, 20분 동안 웨이거트(Weigert) 헤마토실린 존재 하에서 배양하고, 흐르는 물에 헹구고 1% 산 알코올 존재 하에서 분별시키고, 5분 동안 흐르는 물로 세정한 다음 증류수로 헹구었다. 그 다음 5분 동안 실리딘 폰소/산 푹신/아조플록신/아세트산의 용액에서 배양하여 절편을 염색하고, 1% 아세트산에서 헹구고, 20분 동안 포스프몰리브딘 산/오렌지 G의 존재 하에서 배양하고, 1% 아세트산에서 헹구고, 5분 동안 라이트 그린/아세트산의 존재 하에서 염색하고, 5분 동안 1% 아세트산에서 세정하고, 건조시켜 안텔란(Entellan) 봉입제(Merck, Darmstadt, Germany)에 고정시켰다.

2.5 쥣과 오스테오칼신의 면역 조직화학

본 발명자들은, 단백질의 N-말단 단부의 아미노산 1-20에 대응되는 합성 펩티드에 대항하는 마우스 오스테오칼신에 대한 면역정제된 폴리크로날 항체를 사용하였다. 간단하게, 파라핀 중의 7㎛ 절편을 파라핀 제거하고, 에탄올 중에서 재수화하고, PBS에서 세정하고, PBS 중의 0.3% H₂O₂ 존재 하에서 30분 동안 배양하였다. PBS에서 두 번 세정 후, 30분 동안 1.5% 염소 혈청(차단 완충액)의 존재 하에서 슬라이드를 배양하였다. PBS에서 세정 후, 퍼옥시다아제로 가시화하기 위한 과정 및 토끼 면역-글로불린에 대한 비오틴-표지화 항체의 존재 하에서, ABC 표지화 키트(sc-2118, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하여 배양을 실시하였다. 그 다음 절편들을 10분 동안 퍼옥시다아제 기질의 존재하에서 배양하고, 3분 동안 세포 핵을 헤마톡실린으로 염색하였다. 탈수 후, 엔텔란(Entellan) 고정액(Merck)에서 고정을 실시하였다. 차단 완충액의 존재하에서 슬라이드를 배양하여 대조군을 생성하였다.

2.6. 주사 전자 현미경

이식 4주 전 및 후에, 응고 혈액/BCP 또는 응고 혈장/BCP로 이루어지는 이식재를 완충화 글루타르알데히드 용액에 4℃에서 12시간 동안 고정하였다. 그 다음 샘플을 세정하고, 1시간 동안 30% 글리세롤의 존재 하에서 배양한 다음 액체 질소에서 동결시키고 골절시켰다. 증가된 농도의 에탄올 존재 하에서 탈수 후, 이들을 5분 동안 헥사메틸디실라잔(Sigma-Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France)에 함침시킨 다음 상온에서 건조시켰다. 그 다음 이들을 알루미늄 지지체 상에 고정한 다음 금-팔라듐 층(Polaron E5100, UK)으로 코팅하였다. 그 다음, JEOL 6700F 형태 (Japan)의 주사 전자 현미경을 사용하여 검사를 실시하였다.

3. 결과

3.1. 응고 혈액/ BCP 의 피하 및 근육내 이식재의 육안 및 현미경 분석.

BCP 입자의 부재에서 응고 혈액의 이식은 골 조직을 형성할 수 없었다. 4주 후, 단지 소량의 섬유 조직이 이식 부위에서 발견되었다.

4 내지 8주 후 BCP 입자 주위의 응고 혈액의 이식재의 절개 및 육안 검사는 이들의 단단한 경도(consistency) 및 이들 표면의 다수의 작은 혈관의 존재를 관찰할 수 있었다. 숙주 조직의 염증은 관찰되지 않았다.

이식 4주 후 혈액/BCP 이식재의 파라핀 절편의 조직학적 분석은 SC (도 1A) 및 IM (도 1B) 이식재 모두에 대하여 BCP와 가깝게 접촉하는 미성숙 골 조직에 의하여 전체 입자간 공간의 완전하고 재현가능한 콜로니화를 나타내었다. 더 높은 배율에서의 검사는 콜라겐 매트릭스가 SC 부위(도 1C)에서보다 IM 부위(도 1D)에서 더 성장한다는 것을 제시한다. 입자간 공간에서 발달된 섬유상 뼈의 양을 평가하기 위하여, 골 조직이 차지하는 영역과 BCP가 차지하는 영역 사이의 비를 재료 및 방법 하에 기재된 바와 같이 계산하였다. 이는 IM 이식재에서 골 조직의 49.63±5.08% 및 SC 이식재에서 42±8.33%(n = 9, p = 0.035)를 갖는 SC와 IM 부위 사이의 유의적인 차이를 나타낼 수 있었다. 이러한 모든 결과는 입자간 공간이 SC 및 IM 부위에서 완전하게 콜로니화되지만, 발달된 조직의 양이 IM 이식재에서 현저하게 더 많았다.

각 부위에서, 본 발명자들은 모든 이식재에 균질하게 분포된 콜라겐 매트릭스 내의 다수의 혈관의 존재를 관찰하였다(도 1의 C, D, 흑색 화살촉). 이들 수치는 각각 61.4±10.2 혈관/mm² 및 51.10±10/mm²의 평균값을 갖는 IM 및 SC 이식재 사이의 유의적인 차이(n = 9; p = 0.045)를 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 BCP 입자에 부착된 다수의 다중핵 거대 세포(백색 화살촉)를 관찰하였다. 이들 세포는 이전 작업에서 본 발명자들이 파골세포로 확인한 세포와 동일하다 (Trojani C. et al., Biomaterials, 27, 2006, 3256-3264). 이들 수치는 각각 평균이 IM 이식재에서는 88.51±14.60 파골 세포/mm² 및 SC 이식재에서는 93.13±14.40/mm²인 것으로 나타났고, 이는 통계적으로 유의적이지 않은 차이를 나타내었다. 낮고 이질적인 밀도를 갖는 분해 질감, 일부 BCP 입자 윤곽의 불규칙성에 의하여, 미세입자 및 세포질 내 분획화 결정의 존재에 의하여, 이들 세포의 고 흡수성이 강하게 제안된다. 최종적으로, 본 발명자들은 BCP 입자의 표면에 정렬된 입방형 조골세포(도 1C 및 삽입물, 도 5C, 백색 화살표) 및 콜라겐 매트릭스에 삽입된 골세포 형태의 다수 세포(도 1D, 2B, 3A, B, 흑색 화살표)의 존재를 관찰하였다. 이들 세포의 성장한 조골세포의 표현형은 오스테오칼신의 세포질내 면역 조직학적 검출로 입증되었다(도 2A). 또한, 모든 이식재들은 이식 4주 후 골드너 염색 후 양성이며, 이는 이러한 새로운 형태의(neoform) 조직이 광물화된다는 것을 나타낸다(도 2C).

주사 전자 현미경에 의한 4-주 IM 이식재의 분석은 BCP 입자의 미세-다공성, 입자간 공간을 채우는 콜라겐 매트릭스, 적혈구를 함유하는 기능성 모세혈관의 존재(도　3A, D, 백색 화살표) 및 BCP 과립에 부착된 파골세포(도 3C, 흑색 화살표)를 관찰할 수 있게 한다(도 3). 또한, 조골 세포 형태의 세포 주변 공간에 의하여 둘러싸이고, 콜라겐 매트릭스에 삽입된, 모든 방향으로 방출되는 다수의 연장을 가지는 골세포의 별-모양 세포의 존재를 확인하였다(도 3A 삽입물, 3B).

이식 8주 후 얻어진 결과들은 4주 이식재와 어떠한 유의적인 차이도 나타내지 않았다. 모든 SC 및 IM 이식재를 동일한 조직학적 특성을 나타내는 미성숙 뼈에 의하여 완전히 콜로니화하였다.

3.2. 응고 혈장/ BCP 의 SC 및 IM 이식재의 육안 및 현미경 분석:

뼈 신생(neoformation)에서 혈액 세포 및 혈장 각자의 역할을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 각 마우스에 대하여, 그리고 각 부위(SC 및 IM)에 응고 혈장/BCP의 이식재 및 응고 혈액/BCP의 이식재를 동시에 이식하였다.

두 가지 형태의 이식재인, 응고 혈액/BCP 및 응고 혈장/BCP의 피브린 네트워크의 구조를 주사 전자 현미경으로 분석하였다. 이는 응고 혈액으로 얻어진 피브린 메쉬가 응고 혈장으로 관찰된 것보다 더 크다는 것을 보여주었다(도 4A, B). 예상된 바와 같이, 적혈구 세포 및 혈소판은 응고 혈액/BCP의 이식재에서 관찰된 우세한 세포이다. 이들 형태와 구조의 보존은 우수한 생존력을 입증하는데(도 4A), 이는 혈액과 BCP 입자의 혼합물이 혈액 세포들에 대해 나쁜 영향이 없다는 것을 나타낸다.

4주와 8주 후 응고 혈장/BCP 이식재의 절개 및 육안 검사는 응고 혈액/BCP의 이식재의 경우와 유사한 특성, 즉 단단한 경도 및 다수의 가시적 표면 혈관(결과는 도시되지 않음)을 나타내었다. 4주 후 조직학적 분석은, SC 이식재가 신생 뼈에 의하여 약 80% 콜로니화되었다(도 5A)는 것을 보여주었다. IM 이식재의 분석은 75%의 케이스(도 5B)와 25%의 케이스에서 완전한 콜로니화, 더 섬유질화된 느슨한 조직의 작은 중앙 영역의 존재를 보여주었다(결과는 도시되지 않음). 각 부위에서, 신생의 섬유상 골 조직이 응고 혈액/BCP의 이식재에서 얻어진 조직의 경우와 동일한 특성을 나타내었다(도 5C, 5D). 결과적으로, 이들 결과는 전혈의 사용이 양쪽 부위에서 이식재의 완전한 콜로니화를 얻을 수 있게 한다는 것을 증명한다. 응고 혈장과 BCP 입자의 조합은 불완전한 콜로니를 생성한다.

3.3 면역 억제된 마우스의 피하 이식 후 응고된 인간 혈액 및 40-80㎛ BCP 입자로 구성된 이식재의 육안 및 현미경 분석.

본 발명자들은 누드-타입 면역 억제 마우스에 이식 후 40-80㎛ BCP 입자 주위의 응고된 인간 혈액으로부터 제조된 생체재료에 의하여 유도된 골 형성을 분석하였다. 동시에, 동일한 동물에서, 본 발명자들은 동일한 수용자 동물에서, 마우스 혈액에 의하여 유도되고, 인간 혈액에 의하여 생산된 골 형성을 비교하기 위하여, C57BL/6 마우스의 혈액으로부터 생체재료를 제조하였다. 이식 6주 후, 상기한 바와 같이 이식재를 회수하고, 고정하고, 조직학적 분석을 실시하였다.

조직학적 연구 전부터도, 본 발명자들은 마우스 혈액의 이식재는 보다 더 신축적인 경도를 가지는 반면, 인간 혈액에서 제조된 이식재의 매우 예외적인 강도를 관찰하였다.

쥣과 이식재의 조직학적 분석은 동질계에서 실시되는 이전의 실험 동안 발견되었던 것과 동등한 품질을 갖는 미성숙 골 조직을 확인하였다(C57BL/6 마우스에 C57BL/6 마우스 혈액의 이식). 본 발명자들은 내부에서 뼈 세포, 조골세포, 골세포 및 파골세포를 확인할 수 있는 고도로 혈관화된 콜라겐성 섬유상 조직을 관찰하였다(도 6A, 6B).

인간 이식재의 조직학적 분석은 성숙 골 조직에 의한 콜로니화를 갖는 매우 다른 결과를 주었다. 뼈 세포는 골 세포를 위하여, 더 적었다. 지지 조직은, 적혈구아세포(erythroblast) 및 지방조직과 같은 미성숙 조혈 세포의 존재에 특징이 있는 조혈 플레이트를 그 내부에 가지는, 더 잘 구조화되고, 배열되고 더 조밀한 콜라겐 섬유로 조직화를 나타내었다(도 6C, 6D). 이러한 이식재의 강도는 절단시, 이 조직이 고도로 광물화되었다는 것을 제시하였다. 따라서, 본 발명자들은 성숙한 층상 골 조직을 얻었다.

인간 및 쥣과 혈액의 이식 후 얻어지는 골 조직의 성숙도에서의 차이는 이들 두 종의 혈액의 다른 성질, 세포 조성 및/또는 단백질 조성, 성장 인자, 용해성 인자 및 피브린 네트워크와 연관된 성질에 기인한 것일 수 있다. 실험들은 포함되는 기작들을 이해하도록 노력하기 위하여 실시될 것이다.

문헌의 결과와 본 발명자들의 결과를 비교하면 본 발명자들이 인간 혈액에서 얻은 성숙 골 조직이, 선택되고, 증식되고, 엑스 비보에서 조골세포로 분화된 다음 BCP 분말과 혼합되고, 면역억제 마우스로 피하 이식된, 인간의 중간엽 기질 세포(MSC)의 이식 후 여러 그룹에 의하여 기재된 것과 매우 유사하다는 것을 보여주었다.

따라서, 이 모든 결과는 임상 적용에 매우 유망하다.

3.4 골 형성에 대한 BCP 입자 크기의 영향

본 발명자들은 4가지 형태의 BCP, 각각이 40 내지 80㎛, 80 내지 200　㎛, 200 내지 500㎛로 보정된 세 가지 미세 입자 형태, 및 미세 가루의 비율이 혼합물 전체 중량에 비하여 40중량%인, 80-200㎛의 입자와 크기가 40㎛보다 훨씬 작은 미세 가루의 혼합물을 시험하였다. C57BL/6 마우스 혈액 및 상기한 형태의 BCP 각각으로부터 상기한 조건 하에서 이식재를 제조하였다. 동질 유전자 개체인 C57BL/6 마우스에 피하 이식 8주일 후 골 형성이 분석되었다.

도 7의 결과들은 80-200㎛ 미세입자로 이루어지는 이식재가 이미 기재한 특성을 갖는 미성숙 골 조직에 의하여 최고의 콜로니화를 매우 재현성있게 생산한다는 것을 설명한다(도 7C, 7D). 80-200㎛ BCP 미세입자와 혼합된 BCP 가루(40㎛ 미만의 크기)의 존재는 도 7A에 나타난 바와 같이 골 형성에 매우 불리하다. 사실, 이식재의 콜로니화는 항상 주변 크라운으로 엄격하게 제한되어 남아 있는 것으로 관찰되었다. 40-80㎛ 알갱이로 이루어지는 이식재는 80-200㎛ 이식재 보다 우수하지만 재현성이 낮은 콜로니화를 생성한다. 사실, 설명하기 어렵게, 중앙 콜로니 결함은 도 7B에 도시된 바와 같이 종종 관찰된다. 최종적으로, 200-500㎛ 알갱이로 이루어지는 이식재는 항상 콜로니화되지만, 덜 만족스러운 품질의 더 섬유상이고 느슨한 조직으로 된다(도 7E, 7F).

이 결과는, 본 발명의 생체재료에서, 80-200㎛ 과립도가 전위 부위에서의 골 형성에 매우 바람직하다는 것을 입증한다.

3.5 뼈 복원을 위한 최적의 BCP /혈액 비율의 결정

동일한 부피의 혈액에 대하여 다양한 양의 BCP 미세입자를 본 발명의 생체재료로 첨가할 수 있다. 이상적인 비율의 결정은 개발 시 중요한 단계였다. 마우스의 피하 부위에 이식하기 위한 여러 실험 및 위스타(Wistar) 랫트 및 비글(Beagle) 개의 뼈 부위에서 실시된 예비 시험은 본 발명자가 최적 BCP/혈액 비율을 특정할 수 있게 하였다.

3.5.1. 마우스의 피하 전위 부위에 이식

본 발명자들은 정해진 양의 혈액 (100㎕), 정해진 양의 CaCl₂ (10㎕) 및 증가되는 양의 40-80㎛ BCP 미세입자: 10　mg, 30 mg, 50 mg 및 70 mg, 즉 10, 30, 50 및 70% 중량/부피의 BCP/혈액 비율로 이루어지는 이식재를 제조하였다. 롤러 상에서 회전시켜 응고 동안 혈액에서 BCP 입자를 현탁 상태로 유지시켰다 (방법 1). 이들 이식재는, 각 부피가 112, 116, 120 및 124㎕이고, 이식 시에 동등한 크기를 가졌다.

도 8에 도시된 바와 같이, 이식 4주 후, 본 발명자들은 모든 이식재가 동일한 입자 밀도를 가지고, 이식재의 최종 크기는 첨가된 BCP의 초기 중량에 비례한다는 것을 관찰하였다. 또한, BCP/혈액 비율에 상관없이 미성숙 골 조직에 의한 콜로니화가 동일하였다.

이들 결과는 응고 동안 주사기 회전에 의하여 얻어진 초기 이식재 내의 알갱이의 균질한 분산이 장시간 유지되지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로, 아마도 인 비보에서 피브린 겔의 자연적 분해와 관련되는 입자의 패킹(packing) 현상이 일어난다. 이러한 패킹은 초기 비율에 상관없이 주어진 부피에 대하여 동일한 농도의 알갱이를 만들기 때문에, 골 유도 현상이 동일하다는 것이 논리적일 것 같다.

뼈 부위에서 연속적으로 실시된 실험들은 이러한 결과를 확인하였다.

3.5.2. 랫트의 뼈 부위에 이식

본 발명자들은, 랫트 당 하나의 대퇴부에서, 성분 손실을 본 발명의 생체재료, 자가 유래의 전혈/BCP (80-200㎛)로 충진하도록 수술하였다. 랫트는 D0, D7, D15, D30, D45, D60 및 D90에서 사진으로 방사선-논리적으로 그리고 임상적으로(통증 부재, 가벼운 운동, 전반적 상태) 관찰되었다. 3번째 달의 말에, 동물을 희생시키고, 대퇴부를 수집하고, 골접합 재료의 절제 후, 메틸 메타크릴레이트 수지에 삽입 및 조직학 연구를 하기 전 뼈를 포르말린에 고정시켰다.

첫 번째 과정 동안, 50% 중량/부피 입자 비율, 즉 수술 전 동물에서 회수된 전혈 150㎕ 당 75mg의BCP를 갖는 골 결함의 크기로 이식재를 만들었다. 15㎕의 2% CaCl₂를 첨가하여 응고를 개시하고, 응고가 일어날 때까지 지속적인 회전으로 균질화시켜, 생체재료의 균질화를 보증하고 혈액 내에서 BCP 입자가 현탁 상태를 유지할 수 있게 하였다.

본 발명자들은, D7에서의 첫 번째 x-선 사진으로부터 매우 재현성 있게, 생체재료와 골간 절편 사이의 접합의 부재를 반영하는, 골 표면과 이식재 사이의 방사선 투과성 라인의 출현을 관찰하였다(도　9A). BCP가 혈액에서 최대 농도일 때, 응고 동안 미세입자의 침전(방법 2), 생체재료와 골간 절편 사이의 만족스러운 접합이 관찰된다(도 9B).

3.5.3. 이식재를 제조하기 위한 두 가지 방법으로 얻어진 결과의 비교

랫트(도 9B) 및 개(도 10A 및 10B)의 뼈 부위에서, x-선 분석은 이 새로운 프로토콜로, 앞의 x-선 상에 이식재의 수축 부재 및 옆의 x-선 상에 라인의 부재를 나타낸다. 마우스의 전위 부위에서, 본 발명자들은 뼈 형성의 결과에서 차이를 관찰하지 못하였다.

3.5.4. 토론:

침전된 생체재료의 뼈 이식의 경우(방법 2), 본 발명자들이 랫트와 개에서 찍은 x-선에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 이식재의 치수에는 감소가 없고, 뼈와 가까이 접촉하여 바르게 맞추어졌다면, 최적의 방식으로 골 유도 현상과 골 전도로부터 이익을 얻는다는 것을 관찰할 수 있다.

Claims

생체재료를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 적어도 다음의 단계를 포함하는 방법:
(i)　g/ml로, 혈액 또는 골수의 부피 당 BCP 10 내지 90중량% 범위의 비율로, 이상성 칼슘 포스페이트, 또는 40 내지 500㎛ 사이의 크기를 가지는 과립 형태의 BCP를 혈액 또는 골수 흡인물과 혼합하고,
(ii)　혈액 또는 골수의 응고를 일으키기에 충분한 양으로 하나 이상의 응고제를 상기 단계 (i)의 혼합물에 첨가하고,
(iii)　응고가 일어나는 동안 BCP의 균질화를 촉진하는 조건 하에서 혼합하는 단계.
제1항에 있어서, 칼슘 기반 응고제는 생체적합성 칼슘염, 바람직하기는 CaCl₂로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈액은 생체재료를 필요로 하는 수용자와 화합가능한 공여자로부터 미리 수집되었던 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈액은 생체재료를 필요로 하는 수용자로부터 미리 수집되었던 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, BCP가 침전되어 BCP로 포화된 이식재가 형성될 수 있도록 BCP, 혈액, 및 응고제를 함유하는 혼합물을 혈액 응고 단계 동안 정치시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (i) 내지 (iii)이 말단이 폐쇄된 튜브에서 또는 주사기의 내부 공동에서 실시되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, g/ml로 혈액의 부피에 대하여 BCP 50 내지 90중량%, 바람직하기는 60 내지 80중량%를 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
40 내지 500㎛ 사이의 크기를 가지는 과립 형태의 BCP 및 응고된 혈액 또는 응고된 골수를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 방법으로 얻을 수 있는 생체재료.
제8항에 있어서, 가단성있는(malleable) 균질 페이스트 형태인 생체재료.
제8항 또는 제9항에 있어서, BCP 과립은 80 내지 200㎛ 범위의 크기를 가지는 생체재료.
제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, BCP는 5/95 내지 95/5 사이의 하이드록시아파타이트(HA)/β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP) 중량/중량비로 HA 및 β-TCP를 함유하는 생체재료.
제8항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 중합체, 세라믹 입자, 약제학적 분자, 천연 또는 합성 성장인자, 생체마커, 조영제 및 조직 또는 세포 제제:로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 생체재료.
제8항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 골 결함을 충진하는 방법에서 이식재로 사용하기 위한 생체재료.
골접합술과 제8항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 생체재료의 조합.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 실시하기 위한 키트로서, 상기 키트는 40 내지 500㎛ 사이의 입자 크기를 가지는 BCP와 칼슘 유래의 응고제의 조합을 포함하는 키트.
제15항에 있어서, 상기 응고제는 CaCl₂인 키트.
제15항 또는 제16항에 있어서,
(a) 내부에 BCP가 배치되는 멸균 내부 공동을 포함하는 장치,
(b) 응고제를 포함하는 멸균 저장소:
를 포함하는 키트.
제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 장치(a)는 내부 공동으로 혈액을 도입할 수 있는 수단을 포함하는 키트.
제15항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 장치(a)는 생체재료가 골 결함이 확인된 영역에 적용되도록 하는 수단을 포함하는 것인 키트.
제15항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 장치(a)는 주사기로 이루어지는 것인 키트.
골 조직의 생성을 위한 지지체로서의, 제8항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 생체재료의 인 비트로 또는 엑스 비보 용도.
골 이식재 생성용, 제8항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 생체재료의 인 비트로 또는 엑스 비보 용도.