CN102123740B - 血液与双相磷酸钙陶瓷颗粒的组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物材料，其含有凝结的血液或凝结的骨髓抽取物以及双相磷酸钙陶瓷颗粒，还涉及该生物材料的制备方法及其用于制备能够使骨组织再生的植入物的用途。

Description

血液与双相磷酸钙陶瓷颗粒的组合
发明领域
本发明的主题是含有凝结的血液或凝结的骨髓抽取物以及双相磷酸钙陶瓷颗粒的新颖的生物材料，以及其制备方法和其在制造允许骨组织再生的植入物中的用途。
背景技术
主要源于外伤以及较少地源于肿瘤的骨物质损失的重建是整形外科医生遇到的巨大困难之一。对于小尺寸缺损，从“窄的”假关节(骨折愈合的缺陷，此处的骨物质损失是存在的)到5-6cm的骨损失，是从髂嵴除去海绵状或皮质海绵状骨组织的自体移植的最常见的主题(黄金标准)。对于大尺寸缺陷(≥6cm)，则需要复杂得多的操作、血管化的骨转移或Masquelet技术。然而，可用的自体骨骼的质量有限，骨骼愈合仍然不确定，并且这些不同的技术主要导致在移除移植物的位置出现手术后并发症。
临床实践中可用的各种生物材料理论上可以避开自体移植的缺点。不幸的是，它们均不能与骨移植的结果竞争，并且它们均不能允许大尺寸物质损失的重建。
目前研究的大部分骨替代物将生物材料与经过数周的筛选和体外细胞培养后由骨髓获得的骨髓间质干细胞组合。该方法既复杂又昂贵，这限制了临床的益处。
L.Okazaki et al.，Clin.Oral Impl.Res.，16，2005，236-243描述了含有去矿物质骨粉末或凝结的血液的植入物。若干作者已研究了血液与合成生物材料的组合：J.Schmid et al.，Clin.Oral Impl.Res.1997：8：75-8描述了含有去矿物质牛骨粉末和血液的植入物。A.Chevrier et al.，Osteoarthritis and Cartilage(骨关节炎和软骨)(2007)，15，316-327描述了含有含壳聚糖的聚合物在磷酸甘油酯缓冲液中的溶液以及原位凝结的血液的植入物。B.Wallkamm et al.，Clin.OralImp.Res.，14，2003，734-742描述了含有血液和聚乳酸衍生物(Polyfibre或Polyfoam)的植入物。Yildérim M.et al.，Clin.Oral Impl.Res.，2000，11，217-219描述了含有牛磷灰石和静脉血的植入物。文献US 2008/0014279描述了由涂敷有聚合物凝胶的颗粒状物质组成的生物材料，其可以与任何种类的液体、尤其是血液混合，以形成糊，使用抹刀(spatula)或注射器将其施用在必须填充骨缺损之处。文献WO 02/068010描述了含有骨髓的复合材料，该材料包含生物可相容的多孔可植入基质以及凝结的物质，如骨髓、血液、血浆的凝结物。
然而，现有技术中描述的这些可植入材料均有缺点：
在与支持物(去矿物质骨或合成聚合物等)结合之前需要培养骨髓细胞的材料需要很长时间来使用并且需要在与植入物匹配之前数周从待治疗的个体采集骨髓，这使得操作和与之相关的风险倍增。
与支持物和非凝结的血液组合的生物材料不允许构建植入物。
尽管已提出了某些支持材料与凝结的血液的组合，得到的结果并不总是令人满意的，尤其是因为该方法不能制造出均质的生物材料。
到目前为止，源自支持物与凝结的或非凝结的血液的组合的这种材料已被用于骨愈合问题不太严重的上颌面外科手术中，但它们几乎没有或者根本没有被用于骨干骨骼的修复中。
在WO 02/068010中，所教导的方法在于使用由最小尺寸为至少1mm的颗粒形式的多孔去矿物质骨组成的支持材料，其与至少5mm的去矿物质皮质骨纤维组合，并与优选源自骨髓的凝结的物质组合。提出的所有实例包含骨髓细胞。
本发明克服了现有技术的缺点，尤其使能够由合成支持物(因此可以很容易地被制备成具有恒定的和均一的性质)以及凝结的血液获得可植入生物材料，而不需使用培养步骤，该材料具有优异的生物相容性，允许快速重建骨组织。本发明还允许制备在硬度和血管化方面具有优异性能的骨骼。此外，用于制备该生物材料的方法简单，容易进行，不需要对待治疗的个体进行多步操作，比现有技术的方法更廉价。
发明内容
本发明的生物材料为糊状，其至少包含颗粒形式的且与凝结的血液基本均匀地混合的双相磷酸钙。
双相磷酸钙BCP被用于多种医疗和牙科应用中。双相磷酸钙首先被NeryEB et al.，J.Periodontol.1992 Sept.，63(9)：729-35描述为骨修复材料。BCP由羟磷灰石(HA)Ca10(PO4)6(OH)2与β-磷酸三钙(Ca3(PO4)2)(β-TCP)的混合物组成。其生物活性及其生物可再吸收性可以通过其组分羟磷灰石和β-TCP的比例来控制。
与其它合成生物材料相比，含有BCP的生物材料具有促进骨生成的优点。
BCP已经是很多研究的主题：Fellah B.H.et al.，J.Mater.Sci.：Mater.Med.(2007)，18，287-294已经显示选择小于20μm的粒径能够促进组织的免疫响应，这可以解释该粒径对骨生成尤其有利的事实，如Malard O.et al.，J.Biomed.Mater.Res.，46(1)，1999，103所观察到的那样。
与之相反，Mankani M.H.et al.，Biotechnology and Bioengineering，72(1)，2001，96-107已经显示粒径为100至250μm的校准(calibrated)BCP颗粒当与培养过的骨髓细胞组合时引起最多的骨重建，而在小于44μm时未观察到骨形成，且粒径高至2mm的颗粒获得良好的结果。
Trojani C.et al.，Biomaterials，27，2006，3256-3264已经显示，通过植入加入了培养过的骨髓细胞的Si-羟丙基甲基纤维素复合材料的BCP/水凝胶可以获得良好的成骨诱导性，其中校准BCP颗粒为40至80μm。
然而，后两种方法需要采集骨髓细胞并对其进行培养的步骤。
本发明是基于下列事实：
-本发明人观察到BCP具有抗凝结性质，
-相同的发明人观察到，与凝结的血液或者凝结的骨髓抽取物组合的具有所选粒径的BCP使能够借助比现有技术的方法更简单的方法，获得非常好的骨生成并导致具有令人非常满意的性质的骨组织。
因此，本发明的第一主题是下文定义的具体BCP与凝结的血液或者与凝结的骨髓抽取物的组合。有利地，该组合是可延展的、均质的糊状。
可以处理该糊，使其适应待填充的缺损的尺寸和形状，同时注意不要对其施加过大的压力，这会损坏或破坏其三维结构。
本发明所用的BCP的粒径为40至500μm，优选为40至400μm，更优选为40至300μm，并且有利地为80至200μm。
本发明所用的BCP由被研磨并通过例如筛分而校准的具有所选直径的颗粒形式的高温烧结物组成。有利地，本发明所用的BCP包含羟磷灰石和β-磷酸三钙，其中HA/β-TCP重量比为5/95至95/5，优选为30/70至80/20，有利地为40/60至60/40。
有利地，其为多孔性BCP，孔径为50nm至150μm，优选为1μm至50μm。
可以按照Bouler et al.，J Biomed Mater Res，1996，32，603-609；Bouler et al.，J Biomed Mater Res，2000，51，680-684；Obadia et al.，J Biomed Mater Res，2006，80(B)，32-42所描述的方法获得磷酸三钙和羟磷灰石的颗粒或粉末。它们可商购自GRAFTYS SARL公司。
如果将现有技术方法应用于BCP颗粒，也就是说，如果将BCP与例如血液样品混合，则不能获得血液凝结，因为BCP具有抗凝结性质。根据本发明的方法，将BCP与血液样品混合，该血液样品是在使用抗凝结剂的情况下预先采集的，或者是在不使用抗凝结剂的情况下采集并且使其在与生物材料接受者相容的供体中立即与BCP接触的，然后在搅拌下向混合物中加入至少一种凝结剂。优选地，凝结剂是钙衍生物。有利地，从诸如CaCl2、Ca(NO3)2、Ca(AcOEt)2、CaSO4的生物相容性钙盐中选择基于钙的凝结剂。
在能够用于实施本发明的其它凝结剂中，可以提及凝血酶。在整个凝结步骤中，BCP、血液或骨髓抽取物和凝结剂的混合持续进行，并且其强度适于允许形成BCP颗粒或微粒与凝结的血液或者凝结的骨髓的均质混合物，尤其是保持BCP颗粒悬浮。如果该搅拌过度或者不够剧烈，则其不允许形成均质的混合物。本领域技术人员能够可视地控制均质混合物的形成。
除了BCP之外，生物材料的组成可以包含任选的添加剂，例如：聚合物、陶瓷颗粒、药物分子，使用这些物质的条件为：它们的生物相容性，对生物材料的凝结反应(setting reaction)不存在负面影响。本领域技术人员公知的这样的添加剂旨在调节生物材料的流变学、其体内行为(硬度、再吸收、骨生成)或者作用于感染或炎症现象的出现(抗生素、抗感染药、抗炎剂)。
还可以设想向本发明的生物材料中引入活性成分，例如治疗性分子，例如旨在预防或治疗选自例如癌症、骨质疏松的病症的分子。
还可以向本发明的生物材料中引入天然或合成的生长因子。还可以设想生物标记物或造影剂的存在，其通过医学显影来促进生物材料的再吸收以及其在身体内的结局的可视化。
可以设想向本发明的生物材料中引入采集自待施用该生物材料的患者的脂肪组织或任何其它组织制品或细胞制品，该组织或该制剂被预先悬浮在血液或血浆或生理盐水中。在组织制品和细胞制品中，可以提及脂肪组织、血小板、骨髓细胞。
还可以设想存在不同粒径的BCP，但优选其以很小的量存在，有利地为BCP总重量的＜5重量％，因为已观察到，控制粒径允许更好地形成骨组织(更快、更好的质量)以及很好的再吸收。
根据本发明的方法，将BCP置于封闭和无菌的容器的空腔中，例如注射器的内腔中。将预先采集自与接受者相容的供体的血液或骨髓抽取物引入到该容器中。
如果采集的血液或骨髓抽取物必须被保存超过数秒(5至10秒)的时间，则在其采集后立即将其与抗凝结剂混合，以避免其早期凝结(pre-maturecoagulation)。来自供体的血液可以例如直接采集在含有适当量的抗凝结剂的管中。
抗凝结剂可以是钙离子的螯合剂，例如柠檬酸钠，以及例如肝素。
以下列优选的比例制备BCP与血液或骨髓的混合物：
相对于血液(或骨髓)体积，10％至90％重量的BCP，优选为50％至90％，并且更优选为60％至80％，以g/ml表示。
有利地，从接受者本身采集血液，从而尽量确保植入物的生物相容性。根据本发明的一个变型，用衍生自血液的产品，例如血浆，来代替血液。优选地，使用全血。在包括权利要求在内的整个申请中，当使用血液的措辞时，其定义中包括衍生自血液的产品，例如血浆。
优选地，在本发明的实施方式中，使用的血液或血浆为其采集不需要外科手术操作的血液或血浆。
根据本发明的一个变型，可以借助注射器采集血液，在注射器体内预先放置有BCP和任选的添加剂。
在BCP与血液的第一次混合之后，将凝结剂添加到混合物中，例如若使用注射器，则通过借助注射器的抽吸进行添加。
立即对含有BCP、血液和凝结剂的封闭容器进行搅拌，以形成均质的物质。例如，如果在管中或在注射器体内制备混合物，则将容器置于旋转振荡器中，根据BCP的粒径设定旋转振荡器的速度，使得在发生凝结的同时，BCP颗粒保持悬浮。根据本发明的一个变型，可以通过与磁力搅拌器组合的磁珠来产生搅拌。
根据本发明的优选变型，在血液凝结阶段，将含有BCP、血液和凝结剂的混合物的封闭容器静置，以允许BCP沉淀，并形成经BCP饱和的植入物。
该步骤结束时，混合物是均质的、可延展的糊形式，其含有纤维蛋白的三维网络，该网络俘获有血液颗粒、血浆和被引入到组合物中的其它分子。
根据用于制备本发明的生物材料的装置的类型，随后可以借助最适于待填充的骨缺损位置的方式来施用本发明的生物材料：
借助于诸如抹刀的工具，而不扰乱植入物的三维组织，或者借助于注射器或其它圆柱状装置，该圆柱状装置的端口被预先切割以形成适应于本发明的生物材料的流变学的开口。
因此，本发明的另一主题是用于制备生物材料的方法，该方法至少包含下列步骤：
(i)将粒径为40至500μm的颗粒形式的BCP与血液或与骨髓抽取物混合，其比例为每体积的血液或骨髓为10％至90％重量的BCP，
(ii)向步骤(i)的混合物中加入其量足以引起(血液或骨髓的)凝结的至少一种凝结剂，
(iii)在促进BCP的均质化并同时发生凝结的条件下进行混合。
如上面所描述的，在本发明的方法中，步骤(i)至(iii)可以在注射器的内腔或者在端口封闭的管内进行。凝结剂可以选自钙衍生物，例如上文列出的那些，或者选自其它凝结剂，例如凝血酶。
本发明的另一主题是填充骨缺损的方法，该方法包含上文列出的步骤，且另外还包含在观察到骨缺损的空间中施用步骤(iii)中获得的生物材料的步骤。该方法还可以另外包含组织切开和缝合的步骤。
取决于骨缺损的大小和形状，通过本发明的生物材料进行的填充可以与骨缝合术(或接骨术)结合，这样能够在本发明的生物材料的植入位置进行骨重建的同时，赋予受影响的组织所需的机械强度。
本发明人观察到，植入本发明的生物材料使能够在短时期(数周)内诱导骨组织的形成，该骨组织被相当充分地血管化。
与之相反，观察到使用粒径小于40μm的BCP，通过相同方法获得的生物材料的植入不能在令人满意的时间段内形成质量足够高的骨组织。使用粒径大于500μm的BCP，通过相同方法获得的生物材料的植入会降低植入物的再吸收性。
本发明的另一主题是实施本发明的方法的试剂盒，该试剂盒包含BCP与至少一种凝结剂的组合，所述BCP的粒径为40至500μm，优选为40至400μm，有利地为40至300μm，并且更优选为80至200μm。优选地，凝结剂衍生自钙。有利地，凝结剂是CaCl2。
计算凝结剂的量，以补偿BCP以及任选地与所采集的血液组合的抗凝结剂的抗凝结作用。
凝结剂在血液和BCP的混合物中的浓度应当优选为1至50mM，更优选为3至35mM，尤其是在凝结剂是基于钙的情况下。凝结剂应当优选地以水溶液的形式加入，使相对于BCP的重量(以ml/g表示)不超过2倍体积的凝结剂溶液。
为了遵守这两个限制，并且当优选地使用浓度低于120mM的凝结剂溶液时，尤其是当凝结剂是钙盐时，凝结剂溶液的浓度可以变化。
如果是在使用抗凝结剂的情况下采集血液，抗凝结剂的作用和生物材料的作用应当被补偿。
例如，对于在常规条件下(商标为Vacuette得自Greiner Bio-One公司，或者商标为Vacutainer得自Becton Dickinson公司)使用柠檬酸钠并且以50mg的BCP和100μl的血液的比例采集的血液，向其加入为最终体积五分之一(即20μl)的80mM的钙溶液(最终浓度为13.3mM)。溶液的浓度可以高至120mM。上面所述的，可以存在过量的钙，其同样地抑制凝结。
如果血液不是在使用抗凝结剂的情况下采集的，则直接使用生物材料采集血液并且随后加入钙。在这种情况下，可以加入血液体积五分之一的浓度为约12mM至60mM的钙盐水溶液。
这样的组合可以是无菌试剂盒的形式，其包含：
(a)包含无菌内腔的装置，在该无菌内腔中放置有BCP，
(b)含有凝结剂的无菌储库(reservoir)。
储库(b)可以是装置(a)的一部分，或者可以是单独的个体，例如管或瓶，可以从其中移走凝结剂并将其转移至装置(a)的内腔，或者是注射器，其允许将凝结剂注射入放置有BCP的内腔中。
有利地，装置(a)包含允许将血液引入到内腔中的工具(means)：例如允许直接从个体或者从储库采集血液样品的工具，或者允许将血液样品注射入内腔从而允许其与BCP混合的工具。可以设想将所采集的血液直接引入到包含BCP的空腔中，或者将其采集在放置有抗凝结剂的储库中然后整体转移到存在BCP的空腔中。在使用骨髓抽取物的情况下，提供了用于抽吸骨髓的工具。
装置(a)的内腔的大小为允许在其中引入所需用于制备本发明的生物材料的血液或骨髓的量，以及诸如凝结剂、活性成分、组织制品或细胞制品的其它混合物组分。
另外，有利地，装置(a)包含允许在观察到骨缺损的区域施用生物材料的工具。
这样的装置可以由诸如管或注射器的圆柱状装置组成，如实验部分所例示的。
还可以设想使用如WO 02/068010中所述的包含管的装置，在该管中储存有BCP，向其中注入血液和凝结剂，并且可以在其上安装活塞，使一旦形成生物材料能够将其释放。
还可以设想使用Vacutainer类型的装置，即安装有注射器的真空下的管，它可以采集预定量的血液，将这些管用其内腔中的BCP预处理(preconditioned)。
本发明的另一主题是可植入的生物材料，其包含基本均匀地分散在血液蛋白的三维网络中或者骨髓蛋白的网络中的尺寸如上文所定义的颗粒形式的BCP。
有利地，该生物材料包含如上文所定义的BCP以及血液(或骨髓)蛋白的凝结物，且该生物材料的形式为基本均质的混合物，其外观为可延展的糊。
措辞可延展的糊理解为意指如下描述的物质：其本身不像液体般流动，但其机械强度足够低，以至于在由个体手动施加的压力作用下，尤其是在借助于诸如抹刀或者注射器活塞的器具的情况下，其能够被模塑(molded)。
这样的生物材料可以被用于制备骨植入物，无论这涉及填充骨折、源自外伤或肿瘤的骨物质损失、外科手术操作后的缺损，或是利于匹配假肢。
如实施例中所例示的，可以通过外科手术操作将生物材料引入到需要填充骨缺损的区域。切开后，将生物材料植入并将切口再次闭合。
本发明的生物材料可以与具有更高机械强度的骨缝合术组合，从而在等待骨组织在缺损区域定殖(colonization)的同时使组合体(assembly)具有稳定性。
可以设想将其与假肢组合。用本发明的生物材料涂覆假肢可以促进假肢中或假肢附近活体骨组织的植入。
本发明的生物材料还可以在体外(in vitro)或离体(ex vivo)用作生成骨组织的支持物：
实际上，在该生物材料周围培养骨细胞能够使制备随后被植入的骨组织。
本发明的另一主题是上文所述的生物材料在体外或离体用于制备骨植入物的用途。
根据本发明，可以在具有期望制造的植入物的形状的模具中在本发明的生物材料上培养骨细胞。在这些条件下培养细胞可以获得具有适当形状和尺寸的生物相容性的植入物。
实验部分
附图
图1：通过凝结的血液植入物在BCP颗粒周围形成骨组织。
在皮下位点(A和C)以及肌肉内位点(B和D)植入4周后用HES染色的植入物的横截面。
比例尺：A和B：500μm
C和D：50μm
白色箭头：成骨细胞
黑色箭头：骨细胞
黑色箭尖：血管
白色箭尖：破骨细胞
图2：植入4周后血液/BCP植入物段。
(A)：与免疫血清的杂交，显示细胞的细胞质中骨钙素(osteocalcin)的棕色(白色箭头)
(B)：与非免疫血清的杂交-比例尺：10μm
(C)：Goldner染色-比例尺：50μm
黑色箭头：血管和骨细胞。
图3：4周龄血液/BCP植入物的扫描电子显微镜检查
(A)颗粒间空间的胶原蛋白基质(collagen matrix)-比例尺：10μm
(B)(A)的放大图-比例尺：1μm
(C)与颗粒连接的具有2至3个可见的细胞核的两个破骨细胞-比例尺：10μm
(D)功能性毛细血管-比例尺：10μm
图4：植入物的扫描电子显微镜检查
(A)BCP/凝结的血液
(B)BCP/凝结的血浆
比例尺：1μm
图5：植入4周后从BCP/血浆植入物形成骨组织
皮下位点(A、C)
肌肉内位点(B、D)
比例尺：500μm(A、B)
50μm(C、D)
图6：从与BCP微粒(40-80μm)组合的C57BL/6小鼠的血液(A、B)和人血(C、D)制备的生物材料，在裸型免疫抑制小鼠中进行皮下植入后，其成骨性质的比较。在低放大倍率(A、C)和高放大倍率(B、D)下观察。
比例尺：100μm。
图7：BCP微粒的粒径在小鼠进行皮下植入后对骨形成的影响。从与BCP组合的C57BL/6小鼠的血液制备植入物，BCP的形式为：(A)尺寸为小于40μm且与80-200μm的颗粒混合的大量微细粉尘；(B)40-80μm的颗粒；(C、D)80-200μm的颗粒；(E、F)200-500μm的颗粒。图D和F分别对应于植入物C和E的更高放大倍率视图。比例尺：100μm。
图8：从100μl的C57BL/6小鼠血液和其量如下增加的40-80μm的BCP微粒制备的植入物：(A)10mg，(B)30mg，(C)50mg和(D)70mg。比例尺：100μm。
图9：犬的X光片-从校准BCP微粒(80-200μm)周围的凝结的全血制备的植入物：(A)比率为50％的BCP/血液，微粒在凝结阶段保持悬浮在血液中(方法1)；(B)血液中最大浓度下的BCP，微粒在凝结过程中沉淀(方法2)。白色箭头指示骨干末端(diaphyseal ends)和植入物之间X射线可透线(radiotransparentline)的存在。
图10：在小猎犬(BEAGLE dogs)中进行植入。手术后x光片。(A)左侧，植入物仅由BCP组成。(B)右侧，其由根据制备植入物的方法2的具有最大BCP比率的BCP/血液混合物组成。
1.原理：
这是即时操作，在操作室中进行。其包括在聚丙烯注射器的体内将BCP颗粒和在使用抗凝结剂的情况下采集的自体全血(50％w/v)混合，所述抗凝结剂是钙离子的螯合剂。CaCl2的加入可以引发凝结。然后于室温下将注射器置于旋转混合器上10分钟，这可以使BCP颗粒在凝结期间保持悬浮在血液中。这样能够使颗粒在凝结的血液中均匀分布。然后切除注射器的端口并且借助活塞将植入物推出注射器并置于植入位点。
在动物中获得的结果(C57BL/6小鼠)：
生物材料在异位位点(皮下和肌肉内)的植入证明了其成骨诱导性质，其中4周后植入物通过血管化极其充分的矿物化的未成熟骨组织完全定殖。
2.材料和方法
2.1.双相磷酸钙颗粒：
双相磷酸钙(BCP)生物材料由60％羟磷灰石(HA；Ca10(PO4)6(OH)2)和40％磷酸三钙(TCP；Ca3(PO4)2)组成。80至200微米的校准BCP颗粒由GRAFTYSSARL公司(Aix-en-Provence，France)提供。通过在180℃下加热2小时使颗粒灭菌。
2.2.植入物的制备和外科手术操作：
-在小鼠中的皮下植入
依照兽医服务管理局(Direction des Services Vétérinaires)的规程进行实验并通过区域动物实验伦理委员会(ComitéRégional d′Ethique pourl′Expérimentation Animale(CREEA))批准。使用柠檬酸钠(抗凝结剂)，通过心脏内穿刺术从麻醉的十周龄C57BL/6小鼠采集全血。对于某些实验，在1800g下离心15分钟从全血制备血浆。
方法1：通过在1ml注射器中将100μl全血(或血浆)与50mg的BCP颗粒混合制备植入物。然后通过加入20μl的1％CaCl2溶液激活凝结。在凝结期间(5至10分钟)，将注射器置于New Brunswick组织培养滚动式滚筒(型号TC-7M1053-4005)上。这允许注射器自身的旋转移动并保持BCP颗粒悬浮在凝块中。切除注射器端口后，通过活塞将植入物推出注射器并经皮下(SC)或肌肉内(IM)植入到C57BL/6小鼠中。
方法2：用最大浓度的颗粒，因而最大的BCP/血液比率来制备植入物。为此，在凝结期间BCP/血液/钙混合物被保持在固定的位置使微粒能够在血液中自然沉淀。认为这样能够获得微粒在凝结的血液中的最大浓度。
将皮下植入物置于背部位置的皮下，并且将肌肉内植入物置于每一大腿中的切开后的肌肉块之间。在每一位点(SC和IM)，检查在植入期间没有诱发流血。
在每一植入实验中，通过吸入4％异氟烷将C57BL/6小鼠麻醉。对每一小鼠放置两个SC植入物和两个IM植入物。在某些实验中，每一小鼠在每一位点接受血液/BCP植入物和血浆/BCP植入物。4至8周后，通过吸入CO2将动物处死并将植入物取出进行分析。
-在大鼠的骨位点进行植入
施用于大鼠的方案得到区域动物实验伦理委员会的批准(NCA/2007/12-06)。在尼斯医学院的中心动物屋(Animalerie Centrale)进行这些初步实验。
发明人使用其实验室开发的模型，即股骨干的中断性的、分段性的严重大小(6mm)的骨物质损失与钢板-螺钉骨缝合术组合的模型。在每一大鼠的单一股骨上操作，用本发明的生物材料、自体全血/BCP(80-200μm)填充骨物质损失。对大鼠进行临床监测(无痛、轻运动、通常条件)并且在第0、7、15、30、45、60和90天通过照相进行放射学监测。在第三个月结束时，将动物处死，采集股骨并且在切除骨缝合术材料后将骨骼固定在福尔马林中，然后包埋在甲基丙烯酸甲酯树脂中并进行组织性研究。
在第一次操作中，将植入物制成骨缺损的尺寸，其颗粒比例为50％重量/体积，即相对于每150μl手术前采集自动物的全血为75mg的BCP。通过加入15μl的2％CaCl2来引发凝结，并且通过持续旋转直至获得凝结来产生均质化，从而使BCP颗粒保持悬浮在血液中，并确保生物材料的均质性。
-在小猎犬的骨位点进行植入
这是在小猎犬品种的成年犬上产生的在侧股骨骨节区域中的严重大小的校准圆柱形空腔骨物质损失的模型。对于每一犬，处理(tackled)2个股骨骨节。在操作开始时通过在动物的颈静脉区域进行穿刺来采集全血(3.5ml)，并将其用于制备生物材料。在每一外侧股骨骨节区域中产生8×10mm的圆柱形骨损失，并且通过用生理盐水洗涤并抽吸而小心除去坏骨片。
每一动物接受两个组成不同的植入物，该植入物被制备成完全填充所产生的缺损的植入物，也就是说：
一方面，待测试的生物材料由比例为50％重量/体积的BCP(80-200μm)和血液的混合物或者330mg的BCP和660μl的全血的混合物组成。通过用于制备混合物的注射器的旋转使BCP颗粒在凝结期间保持悬浮。
另一方面，植入单独的BCP，用生理盐水润湿，其为660mg，与对侧的植入物(controlateral implant)占相同的体积。
实验持续8周。
实验结束时立即于ENVN照手术后X光。
2.3.组织学分析：
将切开的植入物在10％缓冲的福尔马林溶液中固定24小时。然后将每一植入物切成三片，将其在10％(w/v)亚乙基二胺四乙酸(EDTA)溶液中室温脱钙24小时或不进行脱钙，然后包埋在石蜡中。制备4μm的段，脱蜡，润湿并用苏木精、赤藓红、藏红花(HES)染色。使用Zeiss Axioskop显微镜通过光学显微法检查这些段。用AxioCam HRc彩色照相机(Zeiss，LePecq，France)拍摄照片。一方面为了量化纤维状骨所占的表面积，另一方面为了量化BCP颗粒所占的表面积，将植入物的每一图像沿植入物的中轴细分成表面积等于0.6mm2的三个区域。在这三个区域的每一个中，使用AxioVision Rel.4.6软件测量纤维状骨组织所占的面积。对三个SC植入物和三个IM植入物进行该分析。通过由两个不同的观察者在光学显微镜(100X)下分别计数毛细血管和多核巨细胞来求取这些相同区域中的血管和破骨细胞的数目。破骨细胞和血管的密度以每mm2表示，其形式为平均值±标准偏差。所用的统计学检验是Student′s T检验。显著性被定义为p值低于0.05。
2.4.Goldner染色：
用Goldner三色法将厚度为7μm的未脱钙的植入物段染色，这可以评价骨组织的矿物化并区分矿物化组织(以蓝色/绿色表示)与未矿物化骨样组织(以红色表示)。简单地说，将脱蜡的段再水化，然后在Weigert苏木精的存在下温育(incubated)20分钟，用流动的水冲洗并在1％酸醇的存在下进行区分，用流动的水洗涤5分钟然后用蒸馏水冲洗。然后通过在丽春红/酸性品红/偶氮焰红染料/乙酸的溶液中温育5分钟而将这些段染色，用1％乙酸冲洗，在磷钼酸/橙黄G的存在下温育20分钟，用1％乙酸冲洗，在淡绿/乙酸的存在下染色5分钟，用1％乙酸洗涤5分钟，干燥并封装在Entellan封片剂(Merck，Darmstadt，Germany)中。
2.5鼠骨钙素的免疫组织化学
本发明使用小鼠骨钙素的免疫纯化的多克隆抗体，对抗对应于蛋白质N末端的氨基酸1-20的合成肽(Alexis Biochemicals，Lausanne，Switzerland)。简单地说，将石蜡中的7μm段脱蜡，在乙醇中再水化，在PBS中洗涤，并在0.3％H2O2的PBS溶液的存在下温育30分钟。在PBS中洗涤两次后，将载玻片在1.5％山羊血清(封闭缓冲液)的存在下温育30分钟。在PBS中洗涤后，在生物素标记的兔免疫球蛋白的抗体存在下温育并使用ABC标记试剂盒(sc-2118，Santa Cruz，CA，USA)用过氧化物酶进行可视化操作。然后将段在过氧化物酶基质的存在下温育10分钟并用苏木精将细胞核染色3分钟。脱水后，在Entellan封片液(Merck)中进行封装。通过将载玻片在封闭缓冲液的存在下温育而产生对照。
2.6扫描电子显微镜检查
由凝结的血液/BCP或凝结的血浆/BCP组成的植入物在植入之前和植入四周后于4℃下在缓冲的戊二醛溶液中固定12小时。然后将样品洗涤并在30％甘油的存在下温育1h，然后在液氮中冷冻并使其断裂。在浓度渐增的乙醇存在下脱水后，将其浸渍在六甲基二硅氮烷(Sigma-Aldrich，L′isle d′AbeauChesnes，France)中5分钟，然后在室温下干燥。然后将其固定在铝支持物上，然后涂以一金-钯(Polaron E5100，UK)层。然后使用JEOL 6700F型扫描电子显微镜(Japan)进行检查。
3.结果
3.1.凝结的血液/BCP皮下和肌肉内植入物的宏观和微观分析。
在没有BCP颗粒存在下植入凝结的血液不会形成骨组织。4周后，在植入位点仅观察到少量的纤维组织。
4周和8周后对BCP颗粒周围的凝结的血液植入物的解剖和宏观检查可以观察它们的牢固坚实度(firm consistency)以及在它们表面处大量小血管的存在。没有观察到宿主组织的炎症。
植入4周后对血液/BCP植入物的石蜡段的组织学分析对于SC(图1A)和IM(图1B)植入物均显示整个颗粒间空间被与BCP紧密接触的未成熟骨组织完全地和可重现地定殖。在更高放大倍率下的检查表明，胶原蛋白基质在IM位点(图1D)比在SC位点(图1C)更加成熟。为了评价颗粒间空间中形成的纤维状骨的量，如材料和方法部分所述计算了骨组织所占表面积与BCP所占表面积之间的比率。这可以显示SC和IM位点之间的显著性差异，其中在IM植入物中，骨组织为49.63±5.08％，并且在SC植入物中为42±8.33％(n＝9，p＝0.035)。所有这些结果显示，颗粒间空间在SC和IM位点均被完全定殖，但在IM植入物中形成的组织的量要大得多。
在每一位点观察到均匀分布在所有植入物中的胶原蛋白基质内存在大量血管(图1C、D，黑色箭尖)。对它们的计数显示IM和SC植入物之间的显著性差异，其平均值分别为61.4±10.2血管/mm2和51.10±10/mm2(n＝9；p＝0.045)。还观察到与BCP颗粒连接的大量多核巨细胞(白色箭尖)。这些细胞与发明人先前工作中识别为破骨细胞的那些细胞相同(Trojani C.et al.，Biomaterials，27，2006，3256-3264)。对它们的计数显示，IM植入物中的平均值为88.51±14.60破骨细胞/mm2以及SC植入物中的93.13±14.40/mm2，此差异不是统计学显著的。通过微粒和细胞质内碎片晶体的存在，通过某些BCP颗粒外形的不规则性，以及其具有更低和不均匀密度的降解结构(degradation texture)，强烈地表明这些细胞具有高再吸收能力。最后，我们观察到排列在BCP颗粒表面的立方形成骨细胞(图1C和插入图，图5C，白色箭头)和包埋在胶原蛋白基质中的大量骨细胞型细胞(图1D、2B、3A，B，黑色箭头)的存在。通过骨钙素的细胞质间免疫组织学检测证明了这些细胞的成熟的成骨细胞显型(图2A)。此外，植入4周后经Goldner染色后，所有植入物均为阳性，表明该新生组织是矿物化的(图2C)。
通过扫描电子显微镜对4周IM植入物进行分析，可以观察到(图3)BCP颗粒的多微孔性、填充颗粒间空间的胶原蛋白基质、含有红细胞的功能性毛细血管的存在(图3A、D，白色箭头)以及与BCP颗粒连接的破骨细胞(图3C，黑色箭头)。此外，它证实了骨细胞型星形细胞的存在，其具有大量向所有方向放射的延伸，包埋在胶原蛋白基质中，并且被骨母细胞型的细胞周空间包围(图3A插入图，3B)。
植入8周后获得的结果未显示与4周植入物的任何显著性差异。所有SC和IM植入物均被显示相同组织学特征的未成熟骨完全定殖。
3.2.凝结的血浆/BCP的SC和IM植入物的宏观和微观分析：
为了分析血浆和血液细胞各自在骨新生作用中的作用，对于每一小鼠和在每一位点(SC和IM)，平行植入了凝结的血液/BCP的植入物和凝结的血浆/BCP的植入物。
通过扫描电子显微镜检查分析了凝结的血液/BCP和凝结的血浆/BCP这两类植入物的纤维蛋白网络的结构。这显示了用凝结的血液获得的纤维蛋白网孔(fibrin mesh)比用凝结的血浆所观察到的更大(图4A、B)。如同所预期的，红血细胞和血小板是凝结的血液/BCP的植入物中所观察到的主要细胞。它们的形状和结构的保持证明了好的存活能力(图4A)，这表明血液和BCP颗粒的混合物对血细胞没有有害作用。
4周和8周后对凝结的血浆/BCP的植入物的解剖和宏观检查显示其具有与凝结的血液/BCP的植入物类似的特征，即牢固坚实度和大量可见的表面血管(结果未示出)。4周后的组织学分析显示，SC植入物总共约80％被新生骨定殖(图5A)。IM植入物的分析显示，被完全定殖(图5B)的情况有75％，而存在更纤维状和松散的组织的小中心区域(结果未示出)的情况有25％。在每一位点，新生纤维状骨组织显示出与凝结的血液/BCP的植入物中获得的组织相同的特征(图5C、5D)。综上所述，这些结果证明使用全血可以获得植入物在两个位点的完全定殖。凝结的血浆与BCP颗粒的组合产生不完全的定殖。
3.3在免疫抑制小鼠中皮下植入后，由凝结的人血和40-80μm BCP颗粒组成的植入物的宏观和微观分析。
对由围绕40-80μm BCP颗粒的凝结的人血制备的生物材料植入在裸型免疫抑制小鼠中之后诱导的骨形成进行了分析。平行地，在相同动物中植入了由来自C57BL/6小鼠的血液制备的生物材料，从而比较在相同的接受者动物中由小鼠血液诱导的骨形成和由人血产生的骨形成。植入6周后，采集植入物，将其固定，并如前文所述对其进行组织学分析。
甚至在组织学研究之前，我们观察到由人血制备的植入物的相当异常的硬度，而小鼠血液的植入物则具有更有弹性的坚实度。
鼠植入物的组织学分析显示未成熟骨组织与在同系体系(在C57BL/6小鼠中植入C57BL/6小鼠血液)中进行的在先实验中所观察到的具有相同质量。还观察到高度血管化的胶原纤维状组织，能够从中识别骨骼细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞(图6A、6B)。
人植入物的组织学分析对于被成熟骨组织定殖给出的结果非常不同。骨骼细胞更少，主要为骨细胞。支持组织显示组成具有更好的结构、排列和更致密的胶原蛋白纤维，其内具有造血板(hematopoiesis plates)，其特征是诸如成血红细胞和脂肪细胞的未成熟造血细胞的存在(图6C、6D)。这些植入物于切割时呈现的硬度表明该组织是高度矿物化的。因此我们获得了成熟的板状骨组织。
植入人血和鼠血后获得的骨组织的成熟度差异可归因于这两个物种的血液性质不同，与细胞组成和/或蛋白质组成、生长因子、可溶性因子以及纤维蛋白网络相关的性质不同。将进行实验以试图理解所涉及的机理。
将本发明的结果与文献的结果相比较，显示本发明从人血所获得的成熟骨组织非常类似于数个小组所描述的，其中植入所选的人间充质基质细胞(MSC)，并在离体扩充和分化为成骨细胞，然后与BCP粉末组合并皮下植入到免疫抑制小鼠中。
因此，所有这些对于临床应用是很有前途的。
3.4 BCP的粒径对骨形成的影响
对4种类型的BCP进行了测试，分别校准为40至80μm、80至200μm和200至500μm的三种微粒类型，以及80-200μm的颗粒与尺寸远小于40μm的微细粉尘的混合物，微细粉尘的比例为相对于混合物总重量的40重量％。在已描述的条件下从C57BL/6小鼠血液和每一种这些类型的BCP制备植入物。皮下植入8周后在同系C57BL/6小鼠中分析骨形成。
图7的结果例示了由80-200μm微粒组成的植入物通过具有已描述特征的未成熟骨组织以非常高的可重现性产生最佳定殖(图7C、7D)。与80-200μmBCP微粒混合的BCP粉尘(尺寸小于40μm)的存在对骨形成极其有害，如图7A所示。实际上，观察到植入物的定殖，其通常保持严格限制在外周冠。由40-80μm颗粒组成的植入物产生良好的定殖，但其可重现性比80-200μm植入物的差。实际上，难以理解，有时会观察到中心定殖缺陷，如图7B所示。最后，由200-500μm颗粒组成的植入物通常被定殖，但其是被质量稍不太令人满意的更纤维状的和松散的组织定殖(图7E、7F)。
这些结果证明了在我们的生物材料中80-200μm颗粒度对于异位位点的骨形成更有利。
3.5确定骨重建的最佳BCP/血液比率
可以向本发明的生物材料中并入相同体积的血液而不同量的BCP微粒。确定理想比率是其开发中的重要步骤。在小鼠的皮下位点进行植入的数个实验以及在Wistar大鼠和小猎犬的骨位点进行的初步实验使能够确定最佳的BCP/血液比率。
3.5.1.在小鼠的皮下异位位点进行植入
制备了由如下物质组成的植入物：固定量的血液(100μl)、固定量的CaCl2(10μl)和增加量的40-80μm BCP微粒：10mg、30mg、50mg和70mg，即BCP/血液比率为10％、30％、50％和70％重量/体积。通过在滚筒上旋转而使BCP颗粒在凝结过程中保持悬浮在血液中(方法1)。这些植入物在植入时具有等同的尺寸，各自的体积为：112、116、120和124μl。
如图8所示，植入4周后，观察到植入物的最终大小与所并入的BCP的初始重量成比例，并且所有的植入物具有相同的颗粒密度。此外，通过未成熟骨组织进行的定殖是相同的，与BCP/血液比率无关。
这些结果显示，凝结期间通过注射器的旋转获得颗粒在初始植入物中的均匀分散不随时间保持。相反，发生颗粒聚集的现象，这可能与纤维蛋白凝胶在体内的自然降解有关。由于该聚集对于给定的体积给出相同的颗粒浓度，而与初始比率无关，则具有相同成骨诱导现象似乎是合乎逻辑的。
随后在骨位点进行的实验证实了这些结果。
3.5.2.在大鼠骨位点进行植入
在每一大鼠的单一股骨上操作，用本发明的生物材料、自体全血/BCP(80-200μm)填充骨物质损失。对大鼠进行临床监测(无痛、轻运动、通常条件)并且在第0、7、15、30、45、60和90天通过照相进行放射学监测。在第三个月结束时，将动物处死，采集股骨并且在切除骨缝合术材料后将骨骼固定在福尔马林中，然后包埋在甲基丙烯酸甲酯树脂中并进行组织性研究。
在第一次操作中，将植入物制成骨缺损的尺寸，其颗粒比例为50％重量/体积，即相对于每150μl手术前采集自动物的全血为75mg的BCP。通过加入15μl的2％CaCl2来引发凝结，并且通过持续旋转直至获得凝结来产生均质化，从而使BCP颗粒保持悬浮在血液中，并确保生物材料的均质性。
观察到可重现性非常高，其中从第7天的第一张x光片中观察到骨表面与植入物之间出现X射线可透线(图9A)，这表明在生物材料和骨干段之间不存在粘连。当BCP在血液中为最大浓度时，微粒在凝结期间沉淀(方法2)，在生物材料和骨干段之间观察到令人满意的粘连(图9B)。
3.5.3.用两种制备植入物的方法获得的结果的比较
在大鼠(图9B)和犬(图10A和10B)的骨位点处，x射线分析显示，用这种新方案，在正面的x射线检查中不存在植入物的收缩并且在侧面的x射线检查中不存在线。在小鼠的异位位点处，没有观察到骨形成结果的差异。
3.5.4.讨论：
在沉淀的生物材料的骨植入的情况中(方法2)，能够从对大鼠和犬的x光片中观察到植入物尺寸没有减小，并且如果将其正确匹配，与骨紧密接触，其以最佳的方式受益于成骨传导和成骨诱导现象。

Claims (24)

1.制备生物材料的方法，所述生物材料包含基本均匀地分散在血液蛋白的三维网络中或者骨髓蛋白的网络中的颗粒形式的BCP，所述方法至少包含下列步骤：
(i)将粒径为40至500μm的颗粒形式的双相磷酸钙即BCP与血液或与骨髓抽取物混合，比例为每体积的血液或骨髓为10％至90％重量的BCP，以g/ml表示，
(ii)向步骤(i)的混合物中加入其量足以引起血液或骨髓凝结的至少一种凝结剂，
(iii)在促进BCP均质化并同时发生凝结的条件下进行混合。
2.如权利要求1所述的方法，其中基于钙的所述凝结剂选自生物相容性钙盐。
3.如权利要求2所述的方法，其中基于钙的所述凝结剂是CaCl2。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述血液预先采集自与待使用所述生物材料的接受者相容的供体。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述血液预先采集自待使用所述生物材料的接受者。
6.如权利要求1所述的方法，其中含有所述BCP、所述血液和所述凝结剂的所述混合物在血液凝结阶段被静置，从而使所述BCP沉淀并形成经BCP饱和的植入物。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(i)至(iii)在注射器的内腔或者在端口封闭的管内进行。
8.如权利要求1所述的方法，其包括混合相对于血液体积50％至90％重量的BCP，以g/ml表示。
9.如权利要求8所述的方法，其包括混合相对于血液体积60％至80％重量的BCP，以g/ml表示。
10.通过权利要求1所述的方法获得的生物材料，其包含粒径为40至500μm的颗粒形式的BCP以及凝结的血液或凝结的骨髓。
11.如权利要求10所述的生物材料，其为可延展的、均质的糊状。
12.如权利要求10所述的生物材料，其中所述BCP颗粒的粒径为80至200μm。
13.如权利要求10所述的生物材料，其中所述BCP含有羟磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)，且HA/β-TCP的重量比为5/95至95/5。
14.如权利要求10所述的生物材料，其进一步包含至少一种添加剂，所述添加剂选自聚合物、陶瓷颗粒、药物分子、天然或合成的生长因子、生物标记物、造影剂、组织制品或细胞制品。
15.如权利要求10所述的生物材料，其在填充骨缺损的方法中用作植入物。
16.权利要求10所述的生物材料与骨缝合术材料的组合。
17.用于进行权利要求1至9中任一权利要求所述的方法的试剂盒，该试剂盒包含粒径为40至500μm的BCP与衍生自钙的凝结剂的组合。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述凝结剂是CaCl2。
19.如权利要求17所述的试剂盒，其包含：
(a)包含无菌内腔的装置，在该无菌内腔中放置有所述BCP，
(b)含有所述凝结剂的无菌储库。
20.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述装置(a)包含使血液引入到所述内腔中的工具。
21.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述装置(a)包含在观察到骨缺损的区域施用所述生物材料的工具。
22.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述装置(a)由注射器组成。
23.权利要求10至16中任一权利要求所述的生物材料在体外或离体用作生成骨组织的支持物的用途。
24.权利要求10至16中任一权利要求所述的生物材料在体外或离体用于制备骨植入物的用途。
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