JP2011502524A5

JP2011502524A5 -

Info

Publication number: JP2011502524A5
Application number: JP2010533596A
Authority: JP
Filing date: 2008-11-14
Publication date: 2013-12-12
Anticipated expiration: 2028-11-14

Description

Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）中におけるフマル酸還元酵素の発現のために使用されたｐＧＢＴＯＰ−１１ベクターのマップである。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのミトコンドリアフマル酸還元酵素ｍ１（ＦＲＤｍ１）をコードするｐＧＢＳ４１４ＳＵＳ−０７のプラスミドマップである。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのグリコソームフマル酸還元酵素（ＦＲＤｇ）をコードするｐＧＢＳ４１４ＳＵＳ−０８のプラスミドマップである。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。ｐＤＥＬ−ＳＤＨＡのプラスミドマップである。Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）中におけるＦＲＤｍ１過剰発現のためのプラスミドｐＧＢＴＰＡｎ１のマップである。ｓｄｈＡの置換スキームである。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのミトコンドリアフマル酸還元酵素ｍ１（ＦＲＤｍ１）をコードするｐＧＢＳ４１６ＦＲＤ−１のプラスミドマップである。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのグリコソームフマル酸還元酵素（ＦＲＤｇ）をコードするｐＧＢＳ４１６ＦＲＥ−１のプラスミドマップである。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのアクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）からのＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫａ）を含有するｐＧＢＳ４１４ＰＰＫ−１のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＰＣＫａ−ＴＤＨ１ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１４にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのアクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）からのＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫａ）、およびトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのミトコンドリアフマル酸還元酵素ｍ１（ＦＲＤｍ１）を含有するｐＧＢＳ４１４ＰＰＫ−２のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＰＣＫａ−ＴＤＨ１ターミネーターおよびＴＤＨ３プロモーター−ＦＲＤｍ１−ＴＤＨ３ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１４にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのアクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）からのＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫａ）およびトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのグリコソームフマル酸還元酵素（ＦＲＤｇ）を含有するｐＧＢＳ４１４ＰＰＫ−３のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＰＣＫａ−ＴＤＨ１ターミネーターおよびＴＤＨ３プロモーター−ＦＲＤｇ−ＴＤＨ３ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１４にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのマンヘイミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）からのＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫｍ）を含有するｐＧＢＳ４１４ＰＥＫ−１のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＰＣＫｍ−ＴＤＨ１ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１４にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのマンヘイミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）からのＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫｍ）、およびトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのミトコンドリアフマル酸還元酵素ｍ１（ＦＲＤｍ１）を含有するｐＧＢＳ４１４ＰＥＫ−２のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＰＣＫｍ−ＴＤＨ１ターミネーターおよびＴＤＨ３プロモーター−ＦＲＤｍ１−ＴＤＨ３ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１４にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのマンヘイミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）からのＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫｍ）、およびトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのグリコソームフマル酸還元酵素（ＦＲＤｇ）を含有するｐＧＢＳ４１４ＰＥＫ−３のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＰＣＫｍ−ＴＤＨ１ターミネーターおよびＴＤＨ３プロモーター−ＦＲＤｇ−ＴＤＨ３ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１４にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）からのフマラーゼ（ＦＵＭＲ）、および最初の１２個のアミノ酸が切断されているサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの細胞質リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Δ１２ＮＭＤＨ２）を含有するｐＧＢＳ４１５ＦＵＭ−２のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＦＵＭＲ−ＴＤＨ１ターミネーターおよびＤＨ３プロモーター−ＭＤＨ３−ＴＤＨ３ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１５にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）からのフマラーゼ（ＦＵＭＲ）、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ３）を含有するｐＧＢＳ４１５ＦＵＭ−３のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ１プロモーター−ＦＵＭＲ−ＴＤＨ１ターミネーターおよびＴＤＨ３プロモーター−ＭＤＨ３−ＴＤＨ３ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１５にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。ＳＵＣ−１０１（白丸、空ベクター対照）、ＳＵＣ−１４８（黒四角、ＰＣＫａ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｍ１の過剰発現）、ＳＵＣ−１４９（白四角、ＰＣＫａ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ）、ＳＵＣ−１５０（黒菱形、ＰＣＫｍ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｍ１）、ＳＵＣ−１５１（白菱形、ＰＣＫｍ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ）、ＳＵＣ−１５２（●、ＰＣＫａ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ）、ＳＵＣ−１５４（Ｘ、ＰＣＫｍ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ）、およびＳＵＣ−１６９（▲、ＰＣＫｍ、Δ１２ＮＭＤＨ２、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｍ１）株中のコハク酸レベルである。全ての過剰発現された遺伝子は、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現についてコドンペア最適化された。全てのデータはＳＵＣ−１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、およびＳＵＣ−１６９の３つの独立した成長実験の平均値、およびＳＵＣ−１０１の６つの独立した成長実験の平均値を表す。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）からのリンゴ酸パーミアーゼ（ＳｐＭＡＥ１）を含有するｐＧＢＳ４１６ＭＡＥ−１のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＥｎｏ１プロモーター−ＭＡＥ１−Ｅｎｏ１ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１６にクローンされた。ＣＰＯは最適化されたコドンペアを示す。ＳＵＣ−１０１（白丸、空ベクター対照）、ＳＵＣ−１６９（▲、ＰＣＫｍ、Δ１２ＮＭＤＨ２、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｍ１）、およびＳＵＣ−１９４（黒四角、ＰＣＫｍ、Δ１２ＮＭＤＨ２、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｍ１、ＳｐＭＡＥ１）株中のコハク酸レベルである。全ての過剰発現された遺伝子は、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現についてコドンペア最適化された。全てのデータはＳＵＣ−１６９およびＳＵＣ−１９４の３つの独立した成長実験の平均値、およびＳＵＣ−１０１の６つの独立した成長実験の平均値を表す。ＳＵＣ−１０３（白丸、ａｄｈ１／２およびｇｐｄ１欠失変異体；空ベクター対照）、ＳＵＣ−２０１（白四角、ａｄｈ１／２およびｇｐｄ１欠失変異体；ＰＣＫａ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ）、およびＳＵＣ−２００（黒四角、ａｄｈ１／２、およびｇｐｄ１欠失変異体；ＰＣＫａ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ、ＳｐＭＡＥ１）株中のコハク酸レベルである。全ての過剰発現された遺伝子は、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現についてコドンペア最適化された。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのピルビン酸カルボキシラーゼを含有するｐＧＢＳ４２６ＰＹＣ−２のプラスミドマップである。ＰＹＣ２をコードするヌクレオチド配列は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ株からのゲノムＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲによって得られ、ＰＣＲ産物は発現ベクターｐ４２６ＧＰＤにクローンされた。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のためのトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）からのグリコソームフマル酸還元酵素（ＦＲＤｇ）をコードするｐＧＢＳ４１４ＦＲＥ−１のプラスミドマップである。合成遺伝子コンストラクトＴＤＨ３プロモーター−ＦＲＤｇ−ＴＤＨ３ターミネーターは、発現ベクターｐＲＳ４１４にクローンされた。ＳＵＣ−２２６（白四角、ＰＣＫａ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ）、ＳＵＣ−２２７（▲、ＰＹＣ２、ＰＣＫａ、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ）、ＳＵＣ−２２８（黒四角、ＰＹＣ２、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ）、およびＳＵＣ−２３０（白丸、ＭＤＨ３、ＦＵＭＲ、ＦＲＤｇ）株中のコハク酸レベルである。データは３つの独立した成長実験の平均値を表す。

Claims

フマル酸からコハク酸への変換を触媒するＮＡＤ（Ｈ）依存フマル酸還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、酵母および糸状菌からなる群から選択される、組み換え真核細胞であって、
ＮＡＤ（Ｈ）依存フマル酸還元酵素をコードするヌクレオチド配列の発現に際して、ＮＡＤ（Ｈ）依存フマル酸還元酵素が細胞質ゾル中で活性である、細胞。
細胞がコハク酸の形成を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列を発現し、ヌクレオチド配列がＮＡＤ（Ｈ）依存フマル酸還元酵素をコードして、配列番号３、および／または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の細胞。
ＮＡＤ（Ｈ）依存フマル酸還元酵素がトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種に由来する、請求項１または２に記載の細胞。
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を過剰発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
異種のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現に際して、細胞質ゾル中で活性であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
リンゴ酸のフマル酸への変換を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現に際して、細胞質ゾル中でリンゴ酸のフマル酸への変換を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
ジカルボン酸輸送体をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が機能性でない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が機能性でない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が機能性でない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の真核細胞を、コハク酸が調製される適切な発酵培地中で発酵させるステップを含む、コハク酸を調製する方法。
請求項１４に記載の方法によって得られる、コハク酸を含む発酵ブロス。