JP2011188866A - VEGFを標的とするiRNA物質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】RNA干渉(RNAi)の機構などによって、血管内皮増殖因子(VEGF)の発現を調節するのに有用な化合物、組成物および方法。該組成物はiRNA物質を含み、該iRNA物質は非修飾状態であってもよいし、化学的に修飾された状態であってもよい。また、VEGFの望ましくない発現と関係がある状態または障害、例えば加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症を治療するための、VEGF配列を標的とするsiRNAの使用。
【選択図】なし
Description
本願は、2004年3月12日に出願された米国仮出願第60/552,620号、2004年4月5日に出願された米国仮出願第60/559,824号、および2005年1月25日に出願された米国仮出願第60/647,191号の特典を主張するものである。3つの仮出願はいずれも、それらの全容を本願明細書に援用する。
VEGF(血管透過性因子、VPFとしても知られている)は、血管形成、上皮細胞の増殖、および内皮細胞の生存を刺激する多機能性サイトカインである。VEGFは広くさまざまな組織によって生成可能であり、その過剰発現または異常な発現は、加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの網膜障害、がん、喘息、および他の血管形成障害などのさまざまな障害をもたらす可能性がある。
本発明は、VEGF遺伝子の詳細な遺伝子歩行を行い、該分子を分解に対して安定化し、細胞への取り込みおよび標的化を増大させるために使用可能な修飾の詳細な構造分析を行うことによって、当分野の技術を進展させるものである。
好ましい実施形態では、アンチセンス配列および/またはセンス配列の5’端の最初のヌクレオチド間結合、かつ好ましくは最初の2つのヌクレオチド間結合が、好ましくはホスホロチオエートによって修飾される。好ましい実施形態では、センス配列および/またはアンチセンス配列の3’端の最初の、および好ましくは最初の2つ、3つ、または4つのヌクレオチド間結合が、好ましくはホスホロチオエートによって修飾される。センス配列とアンチセンス配列の両方の5’端、およびセンス配列とアンチセンス配列の両方の3’端を、記載したように修飾されることがより好ましい。
他の実施形態では、本発明は、iRNA物質の薬物動態を改善する1つまたは複数の化学修飾を含むiRNA物質を特徴とする。このような化学修飾には、結合体、例えば細胞受容体のリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンド由来のペプチドなど;タンパク質局在化配列;抗体;核酸アプタマー;ビタミンおよび他の補助因子、例えば葉酸、レチノイドおよびN−アセチルガラクトサミンなど;ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG、例えばPEG5およびPEG20)など;リン脂質;ポリアミン、例えばスペルミンまたはスペルミジンなど;およびその他があるが、これらだけには限られない。
1実施形態では、眼の脈絡膜領域内の1つまたは複数の細胞に、iRNA物質を送達することが可能である。1つの好ましい実施形態では、iRNA物質は、眼内の標的部位におけるVEGF遺伝子の発現を下方制御する。眼、例えば眼の脈絡膜細胞に送達されるiRNA物質は、非修飾iRNA物質であってよい。
他の実施形態では、例えばパッチまたは液体点眼剤によって、あるいはイオン導入法などによって、眼にiRNA物質が局所投与される。軟膏剤または滴下可能な液体は、アプリケータまたは点眼器など当分野で知られている眼内送達系によって送達することが可能である。
1実施形態では、iRNA物質は繰り返し投与される。iRNA物質の投与は、一定範囲の時間周期で行うことが可能である。iRNA物質は1時間毎、1日毎、数日毎に1回、1週間毎、あるいは1ヶ月毎に投与することが可能である。投与のタイミングは、患者の症状の重篤度などの要因に応じて、患者毎に変わる可能性がある。例えば、有効用量のiRNA物質を、1ヶ月に1回として無期限に、あるいは患者が治療をもはや必要としなくなるまで、患者に投与することが可能である。さらに、iRNA物質を含む徐放性組成物を使用して、標的VEGFヌクレオチド配列の領域において比較的一定な用量を保つことが可能である。
他の態様では、VEGF発現を阻害する方法が提供される。1つのこのような方法は、有効量の本発明のiRNA物質を投与することを含む。
1実施形態では、乾燥型の成人黄斑変性症(AMD)のヒトが診断され、他の実施形態では、湿潤型のAMDのヒトが診断されている。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
センス配列およびアンチセンス配列からなる単離iRNA物質であって、センス配列およびアンチセンス配列がRNA二重鎖を形成し、アンチセンス配列がVEGFのヌクレオチド配列の約19〜23ヌクレオチドの標的配列と十分相補的なヌクレオチド配列を含んでなり、前記標的配列は、配列番号1〜401からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下であることを特徴とするiRNA物質。
(項目2)
前記センス配列が、配列番号2〜401からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目1に記載のiRNA物質。
(項目3)
前記センス配列が、配列番号456、配列番号546、配列番号548、配列番号550、配列番号552、配列番号590、配列番号592、配列番号594、配列番号596、配列番号608、配列番号610、配列番号612、配列番号614、配列番号634、配列番号636、配列番号638、配列番号640、配列番号646、配列番号648、および配列番号650からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目1に記載のiRNA物質。
(項目4)
配列番号608との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下であることを特徴とする、項目3に記載のセンス鎖配列。
(項目5)
前記アンチセンス配列が、配列番号457、配列番号547、配列番号549、配列番号551、配列番号553、配列番号591、配列番号593、配列番号595、配列番号597、配列番号609、配列番号611、配列番号613、配列番号615、配列番号635、配列番号637、配列番号639、配列番号641、配列番号647、配列番号649、および配列番号651からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目1に記載のiRNA物質。
(項目6)
配列番号609との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下であることを特徴とする、項目5に記載のアンチセンス鎖配列。
(項目7)
非ヌクレオチド部分をさらに含むことを特徴とする、項目1に記載のiRNA物質。
(項目8)
センス配列およびアンチセンス配列が核酸分解に対して安定化されている、項目7に記載のiRNA。
(項目9)
1つの3’突出部分をさらに含み、前記3’突出部分が1〜6ヌクレオチドからなる、項目1に記載のiRNA物質。
(項目10)
第2の3’突出部分をさらに含み、前記第2の3’突出部分が1〜6ヌクレオチドからなる、項目9に記載のiRNA。
(項目11)
アンチセンス配列およびセンス配列の5’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。
(項目12)
アンチセンス配列およびセンス配列の3’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。
(項目13)
アンチセンス配列およびセンス配列の5’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートを、かつアンチセンス配列およびセンス配列の3’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。
(項目14)
2’修飾ヌクレオチドをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。
(項目15)
前記2’修飾ヌクレオチドが、2’−デオキシ、2’−デオキシ−2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)、2’−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)、および2’−O−N−メチルアセタミド(2’−O−NMA)からなる群から選択される修飾を含んでなる、項目14に記載のiRNA物質。
(項目16)
項目1乃至15のいずれか1項に記載のiRNA物質と細胞を接触させることからなる、対象の細胞中のVEGFのRNA量を減少させる方法。
(項目17)
項目1乃至15のいずれか1項に記載のiRNA物質を作製する方法であって、前記iRNA物質の合成からなり、センス鎖およびアンチセンス鎖が、核酸分解に対して該iRNA物質を安定化する修飾を少なくとも1つ含んでなることを特徴とする方法。
(項目18)
項目1に記載のiRNA物質と、薬剤として許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
(項目19)
有効量の項目1に記載のiRNA物質を投与することからなる、VEGFの発現を阻害する方法。
(項目20)
成人黄斑変性症(AMD)を有する、あるいは成人黄斑変性症のリスクを有すると診断されたヒトを治療する方法であって、治療上有効な量の項目1に記載のiRNA物質をそのような治療の必要がある対象に投与することからなる方法。
別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載した方法および材料と同等または均等な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することが可能であるが、有用な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することは目的としない。本発明の他の特徴および利点は、添付の図面および記載事項から、かつ特許請求の範囲から明らかとなろう。本願全体を通じて引用した全ての参照文献、係属中の特許出願および公開特許明細書の内容は、本願明細書に援用される。矛盾がある場合は、定義を含めて本明細書が優先される。
表1は、本発明の物質によって標的とされるVEGF遺伝子中の配列を提示する。これらの配列は、本発明のiRNA物質の一部のセンス鎖でもありうる。
表3は、ホスホロチオエートによる安定化を含むように修飾されたiRNA二重鎖、および実施例中に記載の活性データを提示する。
表5は、本発明の幾つかのiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA二重鎖の活性データを提示する。
表8AおよびBは、コレステロールまたはコラン酸結合体を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。
表10は、ビオチン結合体を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。
表12は、ポリエチレングリコール結合体を含むiRNA物質を提示する。
表14は、2’−アラフルオロ−2’−デオキシヌクレオシド修飾を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。
表16は、C−5アリルアミノ修飾を含むiRNA物質を提示する。
表17は、表中に示した様々な修飾および該修飾の組合せを含むiRNA物質を提示する。
(詳細な説明)
二本鎖(dsRNA)は、RNA干渉(RNAi)として知られるプロセスによって、mRNAの配列特異的な発現抑制(サイレンシング)を誘導する。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含めた多種多様な生物において起きる。
血管透過性因子としても知られているVEGFは、血管形成増殖因子である。VEGFは、少なくとも3つの異なるアイソフォームが存在するホモ2量体の45kDaの糖タンパク質である。VEGFのアイソフォームは内皮細胞中で発現される。VEGF遺伝子は、189アミノ酸のタンパク質アイソフォームを発現する8個のエクソンを含む。165アミノ酸のアイソフォームはエクソン6によってコードされる残基を欠き、一方121アミノ酸のアイソフォームは、エクソン6および7によってコードされる残基を欠く。VEGF145は、145個のアミノ酸を含みエクソン7を欠くと予測されるアイソフォームである。
本明細書で使用する「RNA物質」は、非修飾RNA、修飾RNA、またはヌクレオシド代用物である。好ましい例には、非修飾RNAよりもヌクレアーゼ分解に対して高い耐性を有するRNA物質がある。好ましい例には、2’糖修飾、1本鎖突出部分(好ましくは1本鎖の3’突出部分)の修飾、または特に1本鎖の場合、1つまたは複数のリン酸基あるいは1つまたは複数のリン酸基類似体を含む5’修飾を有するRNA物質がある。
1本鎖iRNA物質は、RISCに進入して標的mRNAのRISC仲介型切断に関与することができる程度に十分長くなければならない。1本鎖iRNA物質は少なくとも14、およびより好ましくは少なくとも15、20、25、29、35、40、または50ヌクレオチド長である。1本鎖iRNA物質は、200、100、または60ヌクレオチド長未満であることが好ましい。
iRNA物質は、両親媒性部分と複合体形成し得る。iRNA物質と共に使用するための代表的な両親媒性部分は、2004年3月8日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/07070に記載されている。
iRNAの設計
本発明は、細胞中のVEGF mRNAのレベルを低下させるために使用し得る活性iRNA物質を同定するための、VEGF遺伝子の遺伝子歩行に基づくものである。VEGF遺伝子中のiRNA物質の配列候補の全てに活性があるわけではなく、その多くは相当な標的外の影響も有している。本発明は、活性があり相当な標的外の影響は有していない配列を選択することによって、当分野の技術を進展させる。さらに、本発明のiRNA物質に関して選択した配列は多数の生物種間で保存されているため、動物試験および毒性試験に1つの物質を使用することが可能であると同時に、ヒトにおける治療目的でも同じものを使用することができる。
オリゴヌクレオチド(例えば、ある種の修飾オリゴヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドの部分)は、例えばカルーテルら(Caruthers et al)、Methods in Enzymology 211:3、1992;トンプソンら(Thompson et al)、国際公開第99/54459号パンフレット;ビンコットら(Wincott et al)、Nucleic Acids Res.23:2677、1995;ビンコットら(Wincott et al)、Methods Mol.Bio.74:59、1997;ブレンナンら(Brennan et al)、Biotechnol.Bioeng.61:33、1998;およびブレンナン(Brennan)、米国特許第6,001,311号明細書に記載されたのと同様の、当分野で知られているプロトコルを使用して合成することが可能である。これらの参照文献はいずれも、本願明細書に援用する。オリゴヌクレオチドの合成には、一般的な核酸保護基および結合基、例えば5’端にジメトキシトリチル、および3’端にホスホロアミダイトなどを使用する。
本明細書に記載するiRNA物質はいずれも、以下のように評価および修飾することが可能である。
(i)(a)候補のdsRNA、例えばiRNA物質と試験物質(例えば生物学的物質)を接触させることと、
(b)大きさに基づくアッセイ、例えばゲル電気泳動を使用して、iRNA物質が切断されるかどうかを判定すること。好ましい実施形態では、経時変化を測定し、様々な時間インキュベートした幾つかのサンプルを上記の大きさに基づくアッセイに供する。好ましい実施形態では、候補dsRNAを標識しない。この方法は「全染色」法であってよい。
(b)候補dsRNAと試験物質を接触させることと、
(c)大きさに基づくアッセイ、例えばゲル電気泳動を使用して、iRNA物質が切断されるかどうかを判定すること。好ましい実施形態では、経時変化を測定し、経時変化の測定においては幾つかのサンプルを様々な時間インキュベートし、大きさに基づくアッセイに供する。好ましい実施形態では、断片中に存在するヌクレオチドの数を測定することが可能である条件下において測定を行う。例えばインキュベートしたサンプルを、切断産物の長さの割り当てを可能にするマーカーを有するゲルで泳動する。ゲルが「ラダー型」消化物である標準品を含んでいてもよい。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを標識することが可能である。特定の実験では、1本の鎖のみを標識することが好ましい。5’端、3’端、あるいは内部の位置に標識を取り込ませることが可能である。断片の長さ(およびしたがって切断地点)は、ラダーに基づいた断片の大きさから、かつRNAseT1などの部位特異的エンドヌクレアーゼを使用するマッピングから決定することが可能である。
代表的な修飾は、本明細書に記載する修飾など、エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾を含む。特に好ましい修飾には、2’修飾、例えば2’−O−メチル化ヌクレオチドまたは2’−デオキシヌクレオチド(例えば2’デオキシ−シトジン)、または2’−フルオロ、ジフルオロトルイル、5−Me−2’−ピリミジン、5−アリルアミノ−ピリミジン、2’−O−メトキシエチル、2’−ヒドロキシ、または2’−アラ−フルオロヌクレオチド、またはロック型核酸(LNA)、拡張型核酸(ENA)、ヘキソース核酸(HNA)、またはシクロヘキセン核酸(CeNA)がある。1実施形態では、2’修飾は少なくとも1つの5’−ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、少なくとも1つの5’−ウリジン−グアニン−3’(5’−UG−3’)ジヌクレオチド、少なくとも1つの5’−ウリジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、または少なくとも1つの5’−ウリジン−シチジン−3’(5’−UC−3’)ジヌクレオチドのウリジン上、あるいは少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA−3’)ジヌクレオチド、少なくとも1つの5’−シチジン−シチジン−3’(5’−CC−3’)ジヌクレオチド、または少なくとも1つの5’−シチジン−ウリジン−3’(5’−CU−3’)ジヌクレオチドのシチジン上に存在する。2’修飾を、iRNA物質中の全てのピリミジンに施すことも可能である。1つの好ましい実施形態では、2’修飾はiRNA物質のセンス鎖上の2’OMe修飾である。より好ましい実施形態では、2’修飾は2’フルオロ修飾であり、2’フルオロはセンス鎖またはアンチセンス鎖、あるいは両方の鎖上に存在する。
1実施形態では、iRNA物質はL−糖を、好ましくはセンス鎖の5’または3’端に含む。
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾(塩基、糖および/またはリン酸)を備えた核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによる核酸分子の分解を妨げ、該分子の効能を高める可能性がある(例えば、エクシュタインら(Eckstein et al)、国際公開第92/07065号パンフレット;ペルラウルトら(Perrault et al)、Nature 344:565、1990;ピーケンら(Phieken et al)、Science 253:314、1991;ユースマンおよびセデルグレン(Usman and Cedergren)、Trends in Biochem.Sci.17:334、1992;ユースマンら(Usman et al)、国際公開第93/15187号パンフレット;およびロッシら(Rossi et al)、国際公開第91/03162号パンフレット;スプロート(Sproat)、米国特許第5,334,711号明細書;ゴールドら(Gold et al)、米国特許第6,300,074号明細書;およびブルジンら(Burgin et al)、上記を参照されたい;これらは全て本願明細書に援用する)。全ての前述の参照文献に、本明細書に記載の核酸分子の塩基、リン酸および/または糖部分に施すことが可能な種々の化学修飾が記載されている。細胞内でのそれらの有効性を高める修飾、ならびにオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し化学的要件を減らすための核酸分子からの塩基の除去が望まれる。
核酸分子のヌクレアーゼ安定性および有効性の有意な増大を伴って核酸分子に導入することができる糖、塩基およびリン酸修飾について報告する幾つかの例が当分野に存在している。例えば、オリゴヌクレオチドを修飾して安定性を増大させ、かつ/またはヌクレアーゼ耐性の基、例えば2’−アミノ、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−H、ヌクレオチド塩基修飾を用いた修飾によって生物学的活性を増大させる(総説に関しては、ユースマンおよびセデルグレン(Usman and Cedergren)、Trends in Biochem.Sci.17:34、1992;ユースマンら(Usman et al.)、Nucleic Acids Symp.Ser.31:163、1994;ブルジンら(Burgin et al.)、Biochemistry 35:14090、1996を参照)。核酸分子の糖修飾は、当分野において広く報告されている(エクシュタインら(Eckstein et al.)、国際公開第92/07065号パンフレット;ペルラウルトら(Perrault et al.)、Nature 344:565、1990;ピーケンら(Pieken et al.)、Science 253:314、1991;ユースマンおよびセデルグレン(Usman and Cedergren)、Trends in Biochem.Sci.17:334、1992;ユースマンら(Usman et al.)、国際公開第93/15187号パンフレット;スプロート(Sproat)、米国特許第5,334,711号明細書、およびビーグルマンら(Beigelman et al.)、J.Biol.Chem.270:25702、1995;ビーグルマンら(Beigelman et al.)、国際公開第97/26270号パンフレット;ビーグルマンら(Beigelman et al.)、米国特許第5,716,824号明細書;ユースマンら(Usman et al.)、米国特許第5,627,053号明細書;ウルフら(Woolf et al.)、国際公開第98/13526号パンフレット;カルペイスキーら(Karpeisky et al.)、Tetrahedron Lett.39:1131、1998;エアルンショーおよびゲイト(Earnshaw and Gait)、Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)48:39、1998;ベルマおよびエックシュタイン(Verma and Eckstein)、Annu.Rev.Biochem.67:99、1998;およびブルリーナら(Burlina et al.)、Bioorg.Med.Chem.5:1999、1997を参照;これらの参照文献は全て、その全容を本願明細書に援用する)。このような刊行物には、触媒反応を変化させずに核酸分子中への糖、塩基、および/またはリン酸修飾などの取り込み位置を決定するための一般的な方法および戦略が記載されており、これらの参照文献は本願明細書に援用する。このような教示を鑑みると、細胞内でRNAiを促進するiRNA物質の能力が著しく阻害されない限りは、本発明のiRNA核酸分子を修飾するために、類似の修飾を本明細書に記載したのと同様に使用することが可能である。
望ましくないVEGF発現を特徴とする障害を有すると診断された患者は、VEGFの悪影響を阻害することによって望ましくないVEGF遺伝子発現と関係がある症状を軽減するために、本明細書に記載するiRNA物質を投与することによって、治療することが可能である。例えばiRNA物質は、血管新生障害などの眼の疾患と関係がある症状を軽減することが可能である。他の例では、結腸がんまたは乳がんなどの腫瘍または転移性がん;喘息または気管支炎などの肺疾患;または関節リウマチまたは乾癬などの自己免疫疾患を有する患者を治療するために、iRNA物質を投与することが可能である。抗VEGF iRNA物質は、全身に、例えば経口で、または筋肉内注射によって、あるいは静脈内注射によって、投与経路に合った、薬剤として許容可能な担体と混合して投与することが可能である。iRNA物質は、対象に投与するためのリポソームなどの送達用ビヒクル、担体および希釈剤およびそれらの塩を含んでよく、かつ/あるいは薬剤として許容可能な調合物中に存在していてもよい。核酸分子を送達するための方法は、いずれも本願明細書に援用する、アクハターら(Akhtar et al.)、Trends in Cell Bio.2:139、1992;「Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics」、アクハター(Akhtar)編、1995;マウラーら(Maurer et al.)、Mol.Membr:Biol.、16:129、1999;ホフランドおよびフアング(Hofland and Huang)、Handb.Exp.Pharmacol.137:165、1999;およびリーら(Lee et al.)、ACS Symp.Ser.752:184、2000に記載されている。ベイゲルマンら(Beigelman et al)、米国特許第6,395,713号明細書、およびスリバンら(Sullivan et al)、国際公開第94/02595号パンフレットには、核酸分子を送達するための一般的な方法がさらに記載されている。核酸分子は、当業者に知られているさまざまな方法によって、例えば、リポソーム封入、イオン導入法、またはその他のビヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン(例えば、ゴンザレスら(Gonzalez et al.)、Bioconjugate Chem.10:1068、1999を参照)、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアへの組み込み、またはタンパク質様ベクター(オーハーレおよびノルマンド(O’Hare and Normand)、国際公開第00/53722号パンフレット)など(これらに限定はされない)によって、細胞に投与することが可能である。
適切な非経口投与経路には、血管内投与(例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管へのカテーテル注入);組織周囲および組織内への注射(例えば、眼内注射、網膜内注射、または網膜下注射);皮下への注射またはデポー、例えば皮下注入(浸透圧ポンプなどによる);血管新生部位またはその近辺の領域への直接施用、例えばカテーテルまたは他の配置式デバイス(例えば、多孔質、非多孔質、またはゼラチン材料を含んでなる網膜用ペレットまたはインプラント)による施用、がある。血管新生部位またはその近辺にiRNA物質を注射または注入することが好ましい。
本発明のiRNA物質は、単回用量または複数回用量として投与することが可能である。本発明のiRNA物質の投与が注入による場合、その注入は単回の徐放性投与であってもよいし、あるいは複数回の注入によって送達されてもよい。血管新生部位またはその近辺の組織に本発明の物質を直接注射することが好ましい。血管新生部位またはその近辺の組織に本発明の物質を複数回注射することも好ましい。
VEGF−A121 mRNA配列のエクソン1〜5内の400個の標的配列を同定し(表1参照、配列番号2〜401)、これらを標的とする、対応するsiRNAをバイオインフォマティクス・スクリーニングに供した。
少数のリード候補物を同定するために、これら400個の標的配列候補のうち、実験的スクリーニングによる分析用に80個を選択した。これら80個の標的配列114について、合計114個のsiRNA分子を設計した(表2)。
Expedite(商標)8909、ABI392およびABI394合成装置(ドイツ国64293、ダルムスタット、フランクフルターシュトラーセ(Frankfurter Str.)129b所在のアプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、アプレラ・ドイツランド・ゲーエムベーハー(Applera Deutschland GmbH))で、CPG固形支持体およびExpedite(商標)RNAホスホロアミダイト(いずれもプロリゴバイオケミー・ゲーエムベーハー(Proligo Biochemie GmbH)、ドイツ国ハンブルグ、ゲオルグハイケンシュトラーセ14(Georg−Hyken−Str.14)から入手)を使用して、1μmoleスケールでRNAを合成した。補助試薬は、マリンクロート・バーケル(Mallinckrodt Baker)(ドイツ国64347、グリーズハイム(Griesheim)、イムロイシュネルパルク4(Im Leuschnerpark4))から得た。ホスホロチオエート結合は、酸化ヨウ素溶液を、アセトニトリルに溶かしたBeaucage試薬(5%、重量/体積)の溶液で置換することによって導入した。
2つの有効性スクリーニングを使用して、VEGFのsiRNAを、リード候補物となるそれらの能力に関してスクリーニングした。表2は、幾つかのsiRNAについての、内在性VEGF遺伝子の発現を阻害する能力の相対的有効性を示している。この工程で、候補siRNAの数を選別した。ヒトHeLaまたはARPE−19(分化型の性質を有するヒト網膜色素上皮細胞株(ダンら(Dunn et al.)、Exp.Eye Res.62:155、1996)を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+10%ウシ胎児血清100μlに含めて、96ウェルプレート(17,000細胞/ウェル)で培養した。細胞が約90%コンフルエントに達したとき(約24時間後)、20nMで始めて3倍希釈系列としたsiRNAを用いて細胞をトランスフェクションした。1ウェルあたり0.4μlのトランスフェクション試薬Lipofectamine(商標)2000(米国カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad)所在のインビトロジェンコーポレーション(Invitrogen Corporation))を使用し、トランスフェクションは製造業者のプロトコルに従って行った。すなわち、siRNA:Lipofectamine(商標)2000複合体を、以下のように調製した。適量のsiRNAを無血清のOpti−MEM(登録商標)I低血清培地で希釈し、軽く混合した。Lipofectamine(商標)2000を使用前に軽く混合し、次いで96ウェルプレートの各ウェルについて0.4μlを、無血清のOpti−MEM(登録商標)I低血清培地25μlで希釈し、軽く混合し、室温で5分間インキュベートした。5分間のインキュベーション後、1μlの希釈siRNAを、希釈したLipofectamine(商標)2000と合わせた(合計体積は26.4μlである)。この複合体を軽く混合し、室温で20分間インキュベートしてsiRNA:Lipofectamine(商標)2000複合体を形成させた。次いで、10%ウシ胎児血清をDMEMに加えたもの100μlを、siRNA:Lipofectamine(商標)2000複合体のそれぞれに加え、プレートを前後に揺らすことによって軽く混合した。100μlの前述の混合物を、細胞の入った各ウェルに加え、このプレートを24時間CO2インキュベータ中で37℃にてインキュベートし、次いで培養培地を除去し、10%ウシ胎児血清を加えたDMEM100μlを加えた。培地交換後、馴化培地を24時間(HeLa細胞)または72時間(ARPE−19細胞)で回収し、DuoSet(登録商標)ヒトVEGF用ELISA開発キット(米国55413、ミネソタ州ミネアポリス所在のアール&ディー・システムズ・インコーポレイテッド(R&D Systems、Inc.))を使用してヒトVEGFのELISAを行った。このキットは、細胞培養上清および血清中の天然および組換えヒトVEGFを測定するための、サンドウィッチELISAの開発に必要な基本的要素を含む。
捕捉抗体:0.25mlのPBS(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8.1mMのNa2HPO4、1.5mMのKH2PO4、pH7.2〜7.4、0.2μm濾過)を用いて再構成した場合、576μg/mlの抗ヒトVEGFヤギ抗体。再構成後、60日間まで2〜8℃で保存するか、あるいは等分して6ヶ月まで霜取り手動式のフリーザーで−20℃〜−70℃にて保存した。担体タンパク質を含まないPBSで0.8μg/mlの作業濃度に希釈した。
対照は、siRNA無し、ヒトVEGFのsiRNA(Cand5、(a.k.a.、hVEGF5)ライヒら(Reich et al.)、Mol Vis.9:210、2003)、およびヒト、ラットおよびマウスのVEGF間で保存されている21nt配列に整合(マッチング)するsiRNA(hrmVEGF、フィレウアーら(Filleur et al.)、Cancer Res.63:3919〜3922、2003)とした。
ヒトHeLa細胞を、100μlの増殖培地(DMEM+10%FBS)に含めて細胞10,000個/ウェルとして96ウェルプレートで平板培養した。細胞接種の24時間後に細胞が約50%コンフルエントに達した時点で、30nMで始まるsiRNAの3倍希釈系列液を用いて細胞をトランスフェクションした。ウェル当たり0.2μlのLipofectamine(商標)2000トランスフェクション試薬(米国カリフォルニア州カールスバッド所在のインビトロジェンコーポレーション(Invitrogen Corporation))を使用し、トランスフェクションはインビトロジェン製品の挿入紙に記載されているように行った。対照は、siRNA無し、ヒトVEGFのsiRNA(ライヒら(Reich et al.)、Mol Vis.9:210、2003)、およびヒト、ラットおよびマウスのVEGF間で保存されている21nt配列に整合するsiRNA(hrmVEGF、フィレウアーら(Filleur et al.)、Cancer Res.63:3919〜3922、2003)とした。トランスフェクションはそれぞれのプレートにおいて2連で行った。さらに、プレートを2連としてトランスフェクションを行うことによって、トランスフェクション後24時間で増殖培地を交換し、1つのプレートを正常な酸素下増殖条件(37℃、5%CO2、20%酸素)に保ち、2つめのプレートは低酸素条件(37℃、1%酸素、窒素で平衡)に保つことが可能であるようにした。低酸素条件は、Pro−ox酸素濃度コントローラ(米国ニューヨーク州レッドフィールド所在のバイオスフェリクス社(BioSpherix、Ltd.))をPro−ox in vitro培養用チャンバと結合させて使用することによって維持した。培地交換後24時間、細胞を正常酸素条件または低酸素条件に保った。次いで馴化培養培地を両方のプレートから回収し、DuoSet VEGF ELISA(米国ミネソタ州ミネアポリス所在のR&D Systems)において分泌されたVEGFのレベルを試験した。アッセイは製造者のプロトコルに従い、かつ実施例2に記載したのと同様に行った。
AL−DP−4216
AL4094 MI s
5’−GCACAUUGGACAGUUGUGGUU−3’
AL4094 MI as
’3−GUCGUGUAACCUGUCAACACCAA−’5
AL−DP−4218
AL4094 M5 s
5’−GCACAUAGAAGUGACGCGCUU−3’
AL4094 M5 as
’3−GUCGUGUAUCUUCACUGCGCGAA−’5
AL−DP−3015
5’−GAACUGUGUGUGAGAGGUCCU−3’
’3−CGCUUGACACACACUCUCCAGGA−’5
Stains−All染色法(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ(Sigma))を行って、修飾siRNAの安定性を調べた。アッセイを行うために、siRNA二重鎖を90%ヒト血清中で37℃にてインキュベートした。反応混合物のサンプルをさまざまな時間地点(0、0.25、1、2、4、および24時間)で急冷し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。経時的なRNAの切断から、血清ヌクレアーゼによる分解に対するsiRNA二重鎖の感受性に関する情報が得られた。
1.組織ホモジェネートの調製
少なくとも3匹のラットから集めた眼全体、網膜、硝子液からの組織を切除し、液体窒素中で直ぐに凍結させた。この凍結組織を、ドライアイスで予め冷却した装置を使用して、ドライアイス上で粉砕した。1mlのRIPAバッファー(50mMのTris−HCl、pH8.0、150mMのNaCL、1mMのNa2EDTA、0.5%のデオキシコール酸Naデオキシコール酸、1%のIGEPAL CA−630、0.05%のSDS)を凍結組織粉末に加え、この混合物を完全に激しく混合した。このホモジェネートを4℃において5分間10,000×gで遠心分離し、ペレットを捨てた。上清の分割試料100μlを予め冷却した微量遠心分離チューブに移し、−70℃で保存するか、あるいは直ぐに安定性アッセイに使用した。
以下の試薬を使用した。
10×T4PNKバッファー(700mMのTris−HCl、100mMのMgCl2、50mMのジチオスレイトール(DTT)、pH7.6)
γ−32P−ATP(米国コネチカット州シェルトン(Shelton)所在のパーキンエルマー(PerkinElmer))250μCi、3000Ci/mmol(3.3μM)
H2Oで希釈した合成RNAオリゴの10μMストック
Microspin Sephadex(商標)G−25カラム(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences)
RNAseを含まない水および0.65ml微量遠心分離(1.5ml)チューブ。
2.5μl:10μMストックのセンスまたはアンチセンス(最終濃度1μM)由来
2.5μl:10×PNKバッファー(1×)
1.5μl:γ32−ATP(約0.2nM)
1.0μl:10ユニット/μlのT4PNK(10ユニット)
17.5μl:dH2O
反応混合物を37℃で1時間インキュベート(水浴)した後、Sephadex(商標)G−25スピンカラム(アマシャム(Amersham))によって標識siRNAを分画した。0.5μLを使用して、放射標識サンプル1mlの1分あたりのカウント数(cpm)/mlを決定した。
サイズマーカーのサンプルを作製するために、5’端がγ32P標識されたsiRNAの一部を、以下のようにアルカリ加水分解した:
5’端標識siRNA(センスまたはアンチセンス)を2.5μl、0.5MのNa2CO3/NaHCO3(pH9.5)を6.0μl、10mg/mlのtRNAを1.5μl、およびdH2Oを20.0μl含んだ30μlの加水分解反応物を、90℃で7.5分間インキュベートし、次いで氷上または4℃で冷却した。30μlの90%ホルムアミド、50mMのNa2EDTA、10mMのDTT、ならびにXC&BB(キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー)、このうち1μl+4μlのホルムアミド色素をゲル電気泳動分析に使用した。
センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが放射標識された種々のsiRNA二重鎖の1μMストック30μlを調製した。
5.siRNA二重鎖の品質管理:
siRNA二重鎖のサンプルを、トリス−ホウ酸、EDTA(TBE)中の15%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分析した。150Vで1時間電気泳動してからサンプルを泳動した。0.5〜1μlのsiRNA二重鎖または1本鎖siRNA、3〜3.5μlの0.5×TBE、1μlの5×非変性の色素液(合計体積=5μl)を混合することによって、サンプルを調製した。
2μlのsiRNA二重鎖を、PCRチューブ(0.2ml)中で18μlの血清または組織溶解物または対照用バッファーに加えた。siRNA二重鎖を加えた直後に、2μlを取り出して18μlの90%ホルムアミド、50mM EDTA、10mM DTTおよびキシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー(XC&BB)に加えることによって、ゼロ時間地点のサンプルを除去した。他のサンプルは、15分、30分、1時間、2時間、および4時間後に取り出し、同様に処理した。これらのサンプルは、96ウェルプレート中に保存した。幾つかの実験では、時間地点を8、24および48時間に延長した。バッファー(リン酸緩衝生理食塩水、PBS、1×作業用PBSであり、0.14Mの塩化ナトリウム、0.003Mの塩化カリウム、0.002Mのリン酸カリウム、0.01Mのリン酸ナトリウムを含む)についての経時サンプルは、実験のゼロ時間地点および最終時間地点で採取した。20%ポリアクリルアミドゲル(75Wで1時間のプレラン済み)による1×TBE(10×=890mM トリス、890mM ホウ酸、20mM EDTA、pH8.0)中の電気泳動によって、サンプルを分析した。ゲルをphosphorimager(登録商標)用カセットに移し、増感スクリーンで覆い、一晩露光させた後にスキャンした。
ヒト血清中でのインキュベーション後のStains−All染色法および放射標識技法によって(上記参照)、AL−DP−4094 siRNAの安定性を調べた。これらのアッセイから、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する感受性が明らかとなった。RP−HPLCを使用して、血清中インキュベーション後にsiRNAの断片プロファイルを調べた(図11)。
VEGFのmRNAを標的とするsiRNA二重鎖について8つの異なる主な化学修飾パターンを合成して評価した(表6)。使用したリボース糖修飾体は、2’−O−メチル(2’OMe)または2’−フルオロ(2’F)のいずれかとした。表6に示したように、ピリミジン(Py)とプリン(Pu)の両方を修飾することが可能であった。
パターンFでは、5’−PyPu−3’ジヌクレオチド、特にUA、CA、UG部位(両方の鎖)のみの、ピリミジンにだけ2’OMe修飾を有する二重鎖が含まれた。
パターン(H)は、5’−PyPu−3’ジヌクレオチド、UA、CA、UG部位(両方の鎖)のみに2’F修飾ピリミジンを有するアンチセンス鎖と、5’−PyPu−3’ジヌクレオチド、UA、CA、UG部位(両方の鎖)のみのピリミジンだけに2’OMe修飾を有するセンス鎖とを有するものとした。
4種の構成:偶数/奇数;奇数/偶数;偶数/偶数;奇数/奇数
E: 2’−OMeピリミジン(両方の鎖)
F: UA、CA、UG部位のみに2’−OMeピリミジン(両方の鎖)
G: 全てのピリミジンが2’−OMeピリミジン(センス)
全てのピリミジンが2’−Fピリミジン(アンチセンス)
H: UA、CA、UG部位のみに2’−OMeピリミジン(センス)
UA、CA、UG部位のみに2’−Fピリミジン(アンチセンス)
表2由来の17個の異なる親のVEGF二重鎖について試験した。
2μMのsiRNA二重鎖(最終濃度)を、90%のプールしたヒト血清中で37℃にてインキュベートした。30分、4時間、および24時間後にドライアイス上でサンプルを急冷した。それぞれのsiRNA配列について、同じ濃度のサンプルを血清の不在下(PBS中)で37℃において24時間インキュベートした。全てのサンプルを急冷した後、フェノール:クロロホルムを使用してRNAを抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。サンプルを風乾し、変性ローディングバッファー中に再懸濁させた。それぞれの時間地点の3分の1について、施用した20%アクリルアミド(19:1)、7M尿素、1×TBEのゲルで60℃にて泳動して分析した。Stains−All溶液で染色することによってRNAを視覚化した。それぞれの修飾siRNAの安定性の定性的評価は、それぞれの二重鎖のセットについて元の(親の)非修飾siRNAとの比較によって行った。PBS対照を、投入したsiRNAの品質のマーカーとして用いた。
4種のモジュール式化学修飾体、1)センス鎖とアンチセンス鎖の両方において全てのピリミジンを2’−O−メチル(2’OMe)で置換、2)センス鎖とアンチセンス鎖の両方においてUA、UG、CA対のピリミジンを2’OMeで置換、3)全てのピリミジンをセンス鎖においては2’OMeで、アンチセンス鎖においては2’−フルオロ(2’F)で置換、4)UA、UG、CA対のピリミジンをセンス鎖においては2’OMeで、アンチセンス鎖においては2’Fで置換、についてスクリーニングした。非修飾型である親の二重鎖および4種のモジュール式化学修飾体を含めて、合計85種のsiRNAをスクリーニングした。
二重鎖を、前に記載したHeLa細胞アッセイで活性に関して試験した。表6および図13〜29は、上述のそれぞれの修飾に関するHeLa細胞における二重鎖活性の概要およびグラフを提示している。
「即効型」脱保護モノマーを使用するRNA合成
1.RNA合成
AKTA10合成装置(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences))を使用して、固相上でのホスホロアミダイト技術を使用することによって、35〜60μmolの範囲のスケールでオリゴリボヌクレオチドを合成した。多孔質ガラス(CPG、
固相合成の後、該合成カラムに、40%のメチルアミン水溶液とメチルアミンエタノール溶液の3:1(v/v)混合物14mLを30分間かけて通過させることによって、支持体からRNAを切断した。コレステロール結合RNAについては、メチルアミン水溶液とメチルアミンエタノール溶液との比を1:13とした。溶出液を4つの15mLスクリューキャップ付きバイアルに分け、さらに30分間65℃に加熱した。この溶液を続いてスピードバック(登録商標)で減圧下において乾燥させた。それぞれのバイアル中の残渣を250μLのN−メチルピロリジン−2−オン(NMP)に溶解し、120μLのトリエチルアミン(TEA)および160μLのTEA・3HFを加えた。この混合物を2時間65℃にした。周囲温度に冷却した後、1.5mLのNMPおよび1mLのエトキシトリメチルシランを加えた。10分後、3mLのエーテルを加えることによってオリゴリボヌクレオチドを沈殿させた。ペレットを遠心分離によって回収し、上清は捨て、固形物を1mLのバッファー10mMリン酸ナトリウム中で再構成した。
Source(商標)RPC15で10cmの床高に詰め込んだ16/10HRカラム(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences))を使用して、AKTA Explorerシステム(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences))で、逆相HPLCによって粗製オリゴヌクレオチドを精製した。バッファーAは10mMのリン酸ナトリウムであり、バッファーBは65%アセトニトリルを含むバッファーAとした。6.5mL/分の流速を使用した。260、280、および290nmにおけるUV透過について記録した。DMTを有するオリゴリボヌクレオチドについては、カラム体積(CV)の10倍以内で7%B→45%Bの勾配を使用し、コレステロール結合RNAについては、14CV以内で5%B→100%Bの勾配を使用した。適切な画分を集め、減圧下で約10mLに濃縮した。DMTを有するオリゴヌクレオチドは、周囲温度において数時間、体積の3分の1の1M NaOAc、pH4.25で処理した。
コレステロール結合RNAを、CGEおよびLC/MSによって分析した。非結合RNAもIEX−HPLCによって分析した。CGE分析は、254nmの固定波長検出器を備えたベックマンコールター(Beckman Coulter)のPACE MDQ CE装置で行った。有効長20cmのeCap(商標)DNAキャピラリー(ベックマンコールター(Beckman Coulter)を使用した。全ての1本鎖RNAサンプルは、6Mの尿素を含む変性条件(eCap(商標)ssDNA100ゲルバッファーキット、ベックマンコールター(Beckman Coulter))で40℃にて分析した。サンプルは5〜8秒間10kVで動電学的に注入した。泳動時の電圧は15kVとした。
等モル濃度のRNA溶液を組み合わせることによって、相補鎖をアニーリングした。混合物を凍結乾燥し、適切な体積のアニーリングバッファー(100mMのNaCl、20mMのリン酸ナトリウム、pH6.8)で再構成して、所望の濃度とした。この溶液を95℃の湯浴中に置き、次いで3時間以内に周囲温度に冷却した。二重鎖形成の程度を、非変性条件の10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって調べ、バンドを「stains−all」試薬(シグマ(Sigma))で染色することによって視覚化した。
A.RNA/2’OMe(チオエート端)
2’−OMeヌクレオチドを有するキメラRNA分子を、ABIの394型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて合成した。固形支持体はCPG(500A)とした。モノマーは、標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイトまたは2’OMeRNAホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリル(CH3CN)中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−O−tブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−tブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトおよび5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトであり;2’OMeRNAホスホロアミダイトは、5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−O−メチル−アデノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−メチル−グアノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−メチル−シチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトおよび5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−ウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトとした。カップリング時間は全てのモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質:5−(エチルチオ)−1H−テトラゾール(0.25M);キャップA:5%無水酢酸/THF/ピリジン;キャップB:10%のN−メチルイミダゾール/THF。リン酸の酸化にはTHBP(10%、ACN中)10分間を、一方ホスホロチオエートの酸化には0.05MのEDITH試薬/アセトニトリルを使用した。脱トリチル化は3%TCA/ジクロロメタンを用いて行った。DMT保護基はサイクルの最終工程後に除去した。
ABIの394型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて、RNA分子を合成した。固形支持体はCPGとした(500A、TsT AG001はエーエムケミカルズエルエルシー(AM Chemicals LLC)から、ならびにrCおよびrUはプライムシンセシス(Prime Synthesis)からのものであった)。モノマーは、標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイトまたは2’Fホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリル(CH3CN)中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−O−tブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−tブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトおよび5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトであり;2’F RNAホスホロアミダイトは5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−フルオロ−2’−デオキシ−シチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトおよび5’−O−ジメトキシトリチル−2’−フルオロ−2’−デオキシ−ウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトであった。カップリング時間は全てのモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質:5−エチルチオテトラゾール(0.25M);キャップA:5%無水酢酸/THF/ピリジン;キャップB:10%N−メチルイミダゾール/THF;リン酸の酸化にはTHBP(10%、ACN中)で10分間、一方ホスホロチオエートの酸化には0.05MのEDITH試薬/アセトニトリルを使用した。脱トリチル化は3%のTCA/ジクロロメタンを用いて行った。DMT保護基はサイクルの最終工程後に除去した。
C.ホスホロチオエートRNAオリゴリボヌクレオチドの合成
ABIの394型機(ALN0208)で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し以下に記載したように数箇所の待機工程に変更を加えて、オリゴヌクレオチドを合成した。固形支持体は多孔質ガラス(CPG、2μmole rA CPG、520A、またはrU CPG、500A)とした。モノマーは、標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイトであり、別途記載のない限りはアセトニトリル(CH3CN)中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−O−tブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−tブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトおよび5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトであった。カップリング時間は10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質:5−エチルチオテトラゾール(0.25M);キャップA:5%無水酢酸/THF/ピリジン;キャップB:10%N−メチルイミダゾール/THF;PS酸化、0.05MのEDITH試薬/アセトニトリル。脱トリチル化は3%TCA/ジクロロメタンを用いて行った。
A.2’F用のCPGの合成
塩基が適切に保護された5’−O−DMTr−2’−デオキシ−2’−フルオロリボヌクレオシドのCPGを、スキームAに示すように合成した。5’−O−DMTr−2’−デオキシ−2’−フルオロ−NNBz−Aおよび5’−O−DMTr−2’−デオキシ−2’−フルオロ−NiBu−Gは、報告されたのと同様に合成した(カワサキら(Kawasaki et al.)、J.Med.Chem、1993年、36、831)。化合物1001を、二塩化エチレン中DMAPの存在下で無水コハク酸と反応させることによって、化合物1005が生成した。化合物1005を、アセトニトリル−二塩化エチレン中DMAPの存在下において、2,2’−ジチオビス(5−ニトロピリジン)(DTNP)およびトリフェニルホスフィンで処理し、その後lcaaCPGでクーマーら(Kumar et al.)(Nucleosides&Nucleotides、1996年、15、879)により報告されたのと同様に処理して、所望のCPG1009が生成した。CPGの負荷量は文献中に報告されたのと同様に測定した(プラカッシュら(Prakash et al.)、J.Org.Chem、2002年、67、357)。適切に保護された2’−デオキシ−2’−フルオロA、CおよびGのCPGは、上述と同様に得た(スキームA)。
前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表7および図30は、上述のそれぞれの修飾体についてのHeLa細胞における活性のグラフを提供する。
1.合成:
ABIの394型機(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems))にて、製造者により文書化された標準的な93工程のサイクルを使用し、以下に記載したように数箇所の待機工程に変更を加えてRNA分子を合成した。固形支持体は多孔質ガラス(CPG、1umole、500A)であり、モノマーは標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト(5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト)とした。全てのアミダイトはアセトニトリル(CH3CN)中に0.15Mの濃度で使用し、カップリング時間は非修飾および2’−O−Me修飾モノマーに関しては6分、修飾および結合型モノマーに関しては12分とした。5−エチルチオテトラゾール(0.25M)を活性化物質として使用した。PO酸化用にはヨウ素/水/ピリジン、およびPS酸化用にはビューケージ(Beaucage)試薬(2%)の無水アセトニトリル溶液を使用した。硫化時間は約6分であった。全ての合成は1umoleスケールで行った。
1. 非修飾のホスホジエステル骨格(PO)のみ
2. ホスホロチオエート(PS)のみ
3. 2’−O−Me、PS
4. 3’−ナプロキセン、2’F−5Me−U、PS
5. 5’−コレステロール、PS
6. 3’−コレステロール、PS
7. 2’F−5Me−U、PS
8. 3’−ビオチン、2’F−5Me−U、PS
9. 3’−コラン酸、2’F−5Me−U、PS
10.メチルホスホネート
11.C−5アリルアミノrU。
合成の終了後、多孔質ガラス(CPG)をスクリューキャップ付きバイアル、またはスクリューキャップ付きのRNaseを含まない微量遠心分離チューブに移した。55℃で15時間エタノールアンモニア混合物(アンモニア(28〜30%):エタノール(3:1))(1.0mL)を使用することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、同時に塩基およびリン酸の保護基を除去した。バイアルを氷上で短時間冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな微量遠心分離チューブに移した。CPGは少量の脱イオン水(2×0.1mL)で洗浄した。上清を1つにし、10分間ドライアイスで冷却し、次いでスピードバックで乾燥させた。
得られた白い残渣を、トリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド(TEA.3HF、約24%HF))および1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)の混合物(4:3:7)(400ul)に再懸濁し、65℃で90分間加熱して、2’位のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次いで反応をイソプロポキシトリメチルシラン(iPrOMe3Si、400ul)を用いて停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて10分間さらにインキュベートした(これによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる)。残留している反応停止試薬を、スピードバックで乾燥させることによって除去した。3%トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液(1.5ml)を加えた。この混合物を遠心分離した。RNAのペレットが形成された。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットはスピードバックで乾燥させた。微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として粗製RNAを得た。
サンプルを脱イオン水(1.0mL)に溶かし、以下のように定量した。ブランク測定は、水のみ(1mL)を用いて最初に行った。RNA溶液のサンプル(20u1)を水(980uL)で希釈し、微量遠心分離チューブ中で充分に混合させ、次いでキュベットに移し、260nmにおける吸光度の読み取り値を得た。粗製物を乾燥させ、−20℃で保存した。
LC−MSを使用して粗製サンプル(0.1OD)を分析した。
6.オリゴマーの精製
(a)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による精製 オール(Owl)の分離システム(米国ニューハンプシャー州ポーツマス(Portsmouth)所在)を使用して、垂直型スラブポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によってオリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動用のアクリルアミド(40%)、N,N’−メチレン−ビス(アクリルアミド)(BIS)、過硫酸アンモニウム(APS、N,N,N’N’−テトラメチレンジアミン(TEMED)、ブロモフェノールブルー(BPB)、キシレンシアノール(XC)、10×TBE(0.89Mのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸塩(pH8.3)、20mMのエチレンジアミンテトラ酢酸2ナトリウム)は、ナショナルダイアグノスティック(National Diagnostics)(米国ジョージア州アトランタ所在)から得た。12%の変性ゲルを、非修飾および修飾オリゴリボヌクレオチドの精製用に調製した。調製ゲルの厚さは1.5mmとした。ローディングバッファーは10×TBEに溶解した80%ホルムアミドとした。ガラスプレートを除去した後、ゲルをサランラップ(登録商標)で覆い、蛍光TLCプレート上に置いて手持ち式UVランプで照射して視覚化した。所望のバンドを切り出し、2mLの水または0.03M酢酸ナトリウム中で一晩振とうさせた。スピードバックで乾燥させることによって溶出液を除去した。
条件A:非修飾オリゴリボヌクレオチド、2’−O−Me/PSオリゴリボヌクレオチドの精製:
注入サンプルの量は約100ODである。
バッファーA:水
バッファーB:0.25MのTris.Cl pH8.0
バッファーC:0.375Mの過塩素酸ナトリウム
加熱:65℃
カラム:ダイオネクス PA−100 Semiprep
バッファーA:水
バッファーB:0.25MのTris.Cl pH8.0
バッファーC:0.8Mの過塩素酸ナトリウム
加熱:65℃
精製した乾燥オリゴマーを、次いでSephadex(登録商標)G−25Mを使用して脱塩した。カートリッジを10mLの脱イオン水を用いて3回調整した。最後に、2.5mLのRNAseを含まない水に完全に溶かした精製したオリゴマーを、非常にゆっくりと1滴ずつ溶出させながらカートリッジに装荷した。3.5mlの脱イオン水を用いて、塩を含まないオリゴマーをスクリューキャップ付きバイアル中に直接溶出させた。精製したRNA物質をスピードバックで乾燥させ、−20℃で保存した。
1.合成:
ABIの394型機(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems))にて、製造者により文書化された標準的な93工程のサイクルを使用し、以下に記載するように数箇所の待機工程に変更を加えてRNA分子を合成した。固形支持体は多孔質ガラス(CPG、1umole、500A)とし、モノマーは標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト(5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’O−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト)とした。修飾CPGおよびアミダイトは、周知の方法を使用して本明細書に記載したように合成した。全てのアミダイトはアセトニトリル(CH3CN)中0.15Mの濃度で使用し、カップリング時間は非修飾モノマーおよび2’−O−Meモノマーに関しては6分、修飾モノマーおよび結合型モノマーに関しては12分であった。5−エチルチオ−1H−テトラゾール(0.25M)を活性化物質として使用した。PO酸化用にはヨウ素/水/ピリジン、およびPS酸化用にはBeaucage試薬(2%)無水アセトニトリル溶液を使用した。硫化時間は約6分である。3’−ビオチン結合siRNAを合成するために、t−ブチル−過酸化水素を酸化剤として使用した(酸化時間10分)。
合成の終了後、多孔質ガラス(CPG)をスクリューキャップ付きバイアル、またはスクリューキャップ付きのRNaseを含まない微量遠心分離チューブに移した。55℃で15時間エタノールアンモニア混合物[アンモニア(28〜30%):エタノール(3:1)1.0mL]を用いて、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸の保護基を除去した。バイアルを氷上で短時間冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな微量遠心分離チューブに移した。CPGを少量の脱イオン水(2×0.1mL)で洗浄した。1つにした濾過物を次いで10分間ドライアイス上に置き、スピードバックで乾燥させた。
得られた白色の残渣を、トリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド(TEA.3HF、約24%HF)および1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)の混合物(4:3:7)(400ul)に再懸濁させ、65℃で90分間加熱して、2’位のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次いで反応をイソプロポキシトリメチルシラン(iPrOMe3Si、400ul)を用いて停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて10分間さらにインキュベートした(これによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる)。残留している反応停止試薬を、スピードバックで乾燥させることによって除去した。3%トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液(1.5ml)を加え、混合物を遠心分離にかけて、RNAのペレットを得た。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットをスピードバックで乾燥させた。微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として粗製RNAを得た。
サンプルを脱イオン水(1.0mL)に溶かし、以下のように定量した。ブランク測定は、水のみ(1mL)を用いて最初に行った。RNA溶液のサンプル(20u1)を水(980uL)で希釈し、微量遠心分離チューブ中で充分に混合し、次いでキュベットに移し、260nmにおける吸光度の読み取り値を得た。粗製物を乾燥させ、−20℃で保存した。
MSを使用してRNAサンプル(0.1OD)を分析した。
6.オリゴマーの精製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による精製
オール(Owl)の分離システム(米国ニューハンプシャー州ポーツマス(Portsmouth)所在)を使用して、垂直型スラブポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって、オリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動用のアクリルアミド(40%)、N,N’−メチレン−ビス(アクリルアミド)(BIS)、過硫酸アンモニウム(APS)、N,N,N’N’−テトラメチレンジアミン(TEMED)、ブロモフェノールブルー(BPB)、キシレンシアノール(XC)、10×TBE(0.89M トリスヒドロキシ−メチルアミノメタン、ホウ酸塩(pH8.3)、20mMのエチレンジアミンテトラ酢酸2ナトリウム)は、ナショナルダイアグノスティック(National Diagnostics)(米国ジョージア州アトランタ所在)から得た。12%の変性ゲルを、オリゴリボヌクレオチドの精製用に調製した。調製ゲルの厚さは1.5mmであった。ローディングバッファーは10×TBEに溶解した80%ホルムアミドとした。PAGEのガラスプレートを除去した後、ゲルをサランラップ(登録商標)で覆い、蛍光TLCプレート上に置いて手持ち式UVランプ(米国カリフォルニア州アップランド(Upland))で照射して視覚化した。所望のバンドを切り出し、水(2mL)または0.03Mの酢酸ナトリウム中で一晩振とうさせた。溶出液を取り出しスピードバックで乾燥させた。全てのビオチン結合配列をPAGEによって精製した。
精製した乾燥オリゴマーを、次いでSephadex(登録商標)G−25M(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences))を使用して脱塩した。カートリッジは脱イオン水を用いて3回調整した(それぞれ10mL)。最後に、2.5mLのRNAseを含まない水中に完全に溶かした精製オリゴマーを、非常にゆっくりと1滴ずつ溶出させながらカートリッジに装荷した。塩を含まないオリゴマーを、脱イオン水(3.5ml)を用いてスクリューキャップ付きバイアルに直接溶出させた。精製したRNA物質をスピードバックで乾燥させ、−20℃で保存した。
(a)キャピラリーゲル電気泳動(CGE)
(b)エレクトロスプレーLC/MS
オリゴマーのサンプル(約0.10OD)を水に溶かし(50ulと100ml、別々のチューブ中)、次いでCGE分析およびLC/MS分析用の専用バイアル中にピペットで注入した。
上述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表8、9、10および18、ならびに図31〜35は、上記の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
全トランスレチナールとオリゴヌクレオチド(RNA)の結合:
レチナールをオリゴヌクレオチドに結合させるためのホスホロアミダイト104を、スキームB中に示すようにして合成した。
モノベンジルペンタン−1,5−ジオール(15.70g、80.82mmol)、Ph3P(25.43g、96.84mmol)およびN−ヒドロキシフタルイミド(116.0g、98.08mmol)を、アルゴン雰囲気下において無水CH3CN(100ml)中に入れた。非希釈DIAD(20.0mL、103.25mmol)を、攪拌溶液に1滴ずつ20分間かけて加え、攪拌を24時間続けた。反応はTLCによって調べた。溶媒を真空中で除去し;ジエチルエーテルを用いて残渣を練和し、濾過した。残渣をエーテルで洗浄し、濾過し、濾液を合わせた。ヘキサンを濾液に1滴ずつ、濾液が濁度を生じるまで加え、その後この溶液にエーテルを加えることによって、同溶液を均質にした。均質溶液を24時間5℃で保存した。沈殿したPh3POを濾過除去し、エーテル−ヘキサン混合物(1:1)で洗浄した。合わせた濾液を蒸発乾固させ、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ(ヘキサン中10〜15%EtOAc)により精製して、粘性の淡黄色の油として24.5g(89.3%)の化合物102を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3,25℃):7.84〜7.82(m,2H);7.75〜7.73(m,2H);7.34〜7.33(m,4H);7.29〜7.26(m,1H);4.51(s,2H);4.22〜4.18(t,J(H,H)=6.71Hz,2H);3.52〜3.48(t,J(H,H)=6.4Hz,2H);2.04〜1.78(m,2H);1.73〜1.56(m,4H)。13C NMR(100MHz,CDCl3,25℃):163.9、138.8、134.6、129.2、128.6、127.8、127.7、123.7、78.6、73.1、70.3、29.6、28.2、22.5。
化合物102(23.5g、69.29mmol)を、100mlのEtOAc/メタノール(1:1)中に入れた。この混合物を脱気し、アルゴンでパージし、これに2.4gのPd−C(10%−デグサ社(Degusa)の湿潤型)を加えた。この混合物を次いで一晩水素添加し、焼結漏斗でセライト床を介して濾過した。その後残渣をシリカゲルのカラムに通し、40%EtOAcヘキサン溶液を使用して溶出させ、白色固体として化合物103(15.70g、90.9%)を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3,25℃)7.83〜7.81(bm.2H);7.75〜7.73(bm,2H);4.23〜4.19(t,J(H,H)=6.4Hz,2H);3.70〜3.66(t,J(H,H)=5.80Hz,2H);1.83〜1.79(m,2H);1.67〜1.60(m,4H)。13C NMR(100MHz,CDCl3,25℃) 163.9、134.7、129.1、123.7、78.6、62.7、32.4、28.0、22.0。
化合物103(5.4g、21.67mmol)およびトリエチルアミン(4ml、28.69mmol)を、アルゴン下において無水EtOAc(30ml)中に入れた。2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(5.00ml、21.97mmol)を、反応混合物に一滴ずつ加えた。Et3N.HClの白色の沈殿が試薬を加えた直後に形成され、この反応は10分以内に終了した(TLCによって調べた)。この沈殿を、焼結漏斗を介して濾過し、減圧下で溶媒を除去した。残渣を精製用のシリカゲルカラムに直接装荷した。ヘキサン/EtOAc(9:1)で溶出して、黄色い油、8.68g(89.13%)として化合物104を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3,25℃) 7.85〜7.81(m,2H);δ7.77〜7.72(m,2H);4.22〜4.19(t.J(H,H)=6.80Hz,2H);3.91〜3.76(m,2H);3.72〜3.53(m,4H)2.67〜2.63(t,J(H,H)=6.71Hz,2H);1.86〜1.78(m,2H);1.73〜1.66(m,2H);1.62〜1.56(m,2H);1.19〜1.16(m,12H)。31P NMR(162MHz,CDCl3,25℃)δ145.09。13C NMR(100MHz,CDCl3,25℃)δ163.9、134.7、129.2、123.7、117.9、78.6、64.0、63.4、58.7、58.5、43.2、43.1、31.1、31.0、28.1、24.9、24.8、24.7、22.3、20.6、20.5。
全トランスレチナールを、スキームC中に示したようにオリゴヌクレオチドと結合させた。標準的な固相オリゴヌクレオチド合成条件下において、化合物104を固体に結合したオリゴヌクレオチド105と結合させて、化合物106を得た。化合物106のフタルイミド保護基を、サロら(Salo et al.)(Bioconjugate Chem.1999年、第10巻、p.815)によって報告されたのと同様にヒドラジニウム水和物で処理することにより選択的に除去して、化合物107を得た。暗条件下において、全トランスレチナールで化合物107を処理することによって、文献(Bioconjugate Chem.1999、10、815)中で報告されたのと同様に化合物108を得た。暗条件下での標準的なRNAオリゴヌクレオチドの脱保護および精製によって、所望のオリゴヌクレオチド−レチナール結合体109を得た。化合物109は、スキームC中に示したように化合物110からも得た。化合物106の完全な脱保護および精製によって非結合状態の遊離オリゴヌクレオチド110を得て、続いてこれを全トランスレチナールと反応させて所望の化合物109を得た。
AL−3166以外の全てのオリゴヌクレオチドは、ABI490型DNA合成装置で合成した。市販の多孔質ガラス固形支持体(dT−CPGおよびU−CPG、
アミノオキシ−リンカーのカップリング後、ピリジンに溶解した0.5M酢酸ヒドラジニウム(0.16/4/2の無水ヒドラジン、ピリジン、酢酸)2.5mlで、デュアルシリンジ法を使用してCPGを処理した。5分毎にシリンジを前後に押して、CPG上に新たな溶液を送った。酢酸ヒドラジニウム処理の後、CPGを2×5mlのピリジン、次に3×5mlのアセトニトリルで洗浄した。乾燥アルゴンで30秒間洗浄し、次いでCPGを乾燥させた。
1−ピレン−カルボキシアルデヒドおよび全トランスレチナールはアルドリッヒ(Aldrich)から得たものであり、DMF中に0.5Mの濃度で使用した。4−ケト−レチノールはDMF中0.13Mの濃度で使用した。上述のCPGをアルデヒド溶液に加えた。結合は一晩(約16時間)室温で行った。反応が終了した後、CPGをDMF、次にアセトニトリルですすぎ、10〜15分間風乾した。AL−3213配列については、全トランスレチナールおよび1−ピレン−カルボキシアルデヒドのいずれとの結合もアセトニトリル中で行った。1−ピレン−カルボキシアルデヒドの場合、アルデヒドは0.5Mでは完全には溶解せず、溶解しなかったアルデヒドを除去するための濾過を行わずに溶液をそのまま使用した。
支持体上のレチナール結合オリゴヌクレオチドについては、支持体を5mlのチューブ(VWR)に移した。1mLの40%メチルアミン水溶液を用いて65℃で15分間処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基の脱保護を実施した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな15mlチューブに入れた。CPGを3×1mLのDMSOで洗浄した。
前述の混合物に、1.5mlのトリエチルアミントリヒドロフルオリド(TREAT−HF)を加え、60℃で15分間加熱して、2’位のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次いで反応を5.5mlの50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)を用いて停止させ、精製するまでフリーザー中に保存した。
アミノオキシ−リンカーオリゴヌクレオチドを脱保護した後での、アルデヒド(1−ピレン−カルボキシアルデヒドおよび全トランスレチナール)との結合も、代替結合方法として行った。
支持体を2mlのスクリューキャップ付きチューブに移した。65℃で15分間の0.5mLの40%メチルアミン水溶液処理により、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな15mlチューブに入れた。CPGを2×0.5mLの50%アセトニトリル/水で洗浄した。次いで混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバックで真空下において乾燥させた。
乾燥させた残渣を0.5mlのトリエチルアミントリヒドロフルオリド(TEA.3HF)に再懸濁させ、60℃で15分間加熱して、2’位のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次いで反応混合物を室温に冷却し、2mlの乾燥メタノールを用いてRNAを沈殿させ、スピードバックで真空下において乾燥させた。次いでサンプルを2mlの水に溶かし、さらに分析するまでフリーザー中に凍結保存した。
全てのサンプルに関して、1μl、10μlまたは30μlの分割試料を999μl、990μlまたは970μlのヌクレアーゼを含まない脱イオン水で希釈し(1.0mL)、260nmにおいて吸光度の読み取り値を得た。
(a)LC/MSによる粗分析
粗製オリゴマーを最初にLC/MSにより分析して、予想される最終産物の存在および量を調べた。
結合物のサンプルを、RPC−Source(商標)15カラム(21.5×1cm)で逆相HPLCによって精製した。バッファー系は:A=10%ACN中の20mM酢酸ナトリウム、pH8.5およびB=70%ACN中の20mM酢酸ナトリウム、pH8.5であり、流速5.0mL/分、ならびに波長を260および375とした。次いで、完全長オリゴヌクレオチドを含む画分を個々に脱塩した。
精製したオリゴヌクレオチド画分を、PD−10 Sephadex(登録商標)G−25カラムを使用して脱塩した。最初に、25〜30mlの水を用いてカラムを平衡化した。次いでサンプルを体積2.5mlとして装荷した。次いで、3.5mlの塩を含まない画分としてサンプルを溶出させた。脱塩した画分を1つに合せ、必要となるまで凍結保存した。
約0.3ODの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して300μlとし、次いでCGE、IEXおよびLC/MS分析用の専用バイアルにピペットで移した。
レチノイドの5’結合用のホスホロアミダイト116、およびレチノイドの3’結合用のCPG支持体115を、スキームDに示すように合成した。CPG支持体115は、レチノイドをオリゴヌクレオチドの3’に結合させるために使用した。
化合物111(120.0g、30.01mmol)を、無水ピリジン(100mL)に溶かしたイミダゾール(7.5g、110.16mmol)の存在下でTBDMS−Cl(5.43g、36.02mmol)と共に一晩攪拌した。ピリジンを除去した後、生成物を酢酸エチル(300mL)中に抽出し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで標準的な後処理を施した。得られた残渣を、1%メタノールをジクロロメタンに溶かしたものを溶出液として用いてフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィに供し、薄い白色の固体として化合物112を得た(24.4g、定量値。1HNMR(500MHz、[D6]DMSO、25℃): 7.33〜7.13(bm、15H、D2O交換後の14Hに相当);6.87〜6.82(bm、4H);5.01(s、0.2H、回転異性体少数);4.99(s、1.8H、回転異性体多数)、4.68〜4.64(m、0.72H、回転異性体多数);4.14〜4.07(bm、1H)、3.72(s、7H)、3.38〜3.36(m、0.6H、回転異性体少数);3.26〜3.21(m、1.4H、回転異性体多数);3.08〜3.07(m、0.3H、回転異性体、少数);2.99〜2.89(m、2.7H、回転異性体、多数);2.22〜2.12(m、2H)、2.04〜1.78(m、2H);1.48〜1.23(m、6H)、0.84、0.82(s、9H、回転異性体多数および少数);0.05(d、J(H,H)=1.5Hz、4.3H、回転異性体多数);0.03〜0.02(d、J(H,H)=5.5Hz、1.7H)。
化合物112(9.4g、14.54mmol)を15mLのβ−カプロラクトンに懸濁させ、懸濁液に10mLのTEAを加えた。この反応混合物を、55℃の浴温で24時間、アルゴン下において攪拌した。反応の終了はTLC分析によって調べた。真空中で反応混合物からTEAを除去し、150mLのジクロロメタン−ヘキサン(2:1混合物)を残渣に加えた。このようにして得た均質溶液を、シリカゲルのカラムに直接装荷し、ジクロロメタン−ヘキサン(2:1)、次に非希釈ジクロロメタンを用いて溶出した。ジクロロメタン中4%のメタノールを用いたシリカカラムの溶出によって、白色の固体として所望の化合物113を得た(8.73g、78.9%)。1HNMR(400MHz、[D6]DMSO、25℃)δ7.72〜7.68(bm、1H、D2Oと交換可能);7.33〜7.16(m、9H);6.88〜6.84(m、4H);4.68〜4.62(m、0.8H);4.57〜4.52(m、0.2H);4.34〜4.31(t、J(H,H)=5.18Hz、1H、D2Oと交換可能);4.14〜4.08(bm、1H);3.74〜3.67(m、7H);3.39〜3.32(m、3.3H);3.25〜3.21(m、1.7H);3.09〜2.88(m、4H)。
上述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表14および図38は、上記の各修飾物のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
PEG結合用のアミノリンカーオリゴヌクレオチド
概要
TSKゲル−SuperQ(商標)−5PW(東ソー)で、イオン交換分取クロマトグラフィを行った。イオン交換分析クロマトグラフィは、DNAPac(登録商標)Pa100(ダイオネクス(Dionex))で行った。電子スプレーイオン化質量スペクトルはアジレント(Agilent)1100MSD−SLを用いて記録した。
RNAをイオン交換クロマトグラフィ(カラム、DNAPac(登録商標)Pa100、4×250mm、分析用)により分析したが、条件を、30℃に加熱、流速1.5mL分−1、バッファーA=10%CH3CN中の0.020MのNa2HPO4(pH11);バッファーB=バッファーA+10%CH3CN中の1MのNaBr(pH11)、53分間で0→75%の直線勾配とした。LC/ESI−MSの条件は以下の通り、すなわち:カラムはXTerra(登録商標)C8(2.1×30mm、2.5μm)、2分間で5→35%、30.5分間で35→70%の直線勾配、流速0.200mL分−1、バッファーA=400mM HFIP/16.3mM TEA水溶液、バッファーB=100%メタノールとした。RNAをイオン交換クロマトグラフィ(5cmのインハウス充填カラム、TSKゲル−SuperQ−5PW、20μm)によって精製したが、条件を、75℃に加熱、流速50mL分−1、バッファーA=10%CH3CN中の0.020MのNa2HPO4(pH8.5);バッファーB=バッファーA+10%CH3CN中の1MのNaBr(pH8.5)、120分間で20→55%の直線勾配とした。
特注のインハウス支持体およびホスホロアミダイト化合物を使用して、100〜150μmolスケールで、AKTA OligoPilot(商標)100で保護RNAを構築した。ホスホロアミダイトは乾燥CH3CNに溶かした0.2molL−1溶液として使用し、カップリング時間を900秒とし、製造者の奨励する合成プロトコルを使用した。合成後、支持体に結合したRNAを45℃において90分間CH3NH2水溶液(40%)で処理し、冷却し、濾過し、DMSO(3×40mL)で洗浄した。次いで濾液を40℃において60分間、TEA.3HF(60mL)で処理し、NaOAc水溶液(0.05M、pH5.5、200mL)を用いて急冷した。合成後に続いて分析イオン交換HPLC、分取HPLCを実施し、次いでSephadex G−25で脱塩した。
一般的な結合手法をスキームEに示す。
全てのオリゴヌクレオチドを、AKTAoligopilot(商標)合成装置で合成した。市販の多孔質ガラス固形支持体(dT−CPG、
合成の終了後、支持体を100mlのガラス製容器に移した。40mLの40%メチルアミン水溶液を用いて45℃で90分間処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。容器を氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな500ml容器中に入れた。CPGを3×40mLのDMSOで洗浄した。次いで混合物をドライアイスで冷却した。
前述の混合物に60mlのトリエチルアミントリヒドロフルオリド(TREAT−HF)を加え、40℃で60分間加熱して、2’位のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次いで反応を50mMの酢酸ナトリウム(pH5.5)220mlを用いて停止させ、精製するまでフリーザー中に保存した。
全てのサンプルについて、10μlの分割試料を990μlのヌクレアーゼを含まない脱イオン水で希釈し(1.0mL)、260nmにおける吸光度の読み取り値を得た。
(a)HPLC精製
粗製オリゴマーは最初にHPLC(ダイオネクスPA100)により分析した。バッファー系は:A=20mMのリン酸、pH11、B=20mMのリン酸、1.8MのNaBr、pH11、流速1.0mL/分、および波長260〜280nmであった。それぞれのサンプルに関して5〜15μlを注入した。サンプルは、TSK−Gel SuperQ−5PW(20)カラム(17.3×5cm)でHPLCによって精製した。バッファー系は:A=10%ACN中の20mMのリン酸、pH8.5、およびB=10%ACN中の20mMのリン酸、1.0MのNaBr、pH8.5、流速50.0mL/分、ならびに波長260および294であった。完全長オリゴヌクレオチドを含む画分を次いで1つに集め、蒸発させ、脱イオン水で約100mlに再構成した。
精製したオリゴヌクレオチドは、Sephadex G−25カラムを使用してAKTA Explorer(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences))で脱塩した。最初に、水を用いて25ml/分の流速で20〜30分間カラムを洗浄した。次いでサンプルをのせて25ml画分とした。溶出させた塩を含まない画分を1つに組合せ、乾燥させ、50mlのRNaseを含まない水で再構成した。
約0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して150μlとし、次いでCGE分析およびLC/MS分析用の専用バイアルにピペットで移した。
A)最初の反応条件
精製および脱塩したRNAを凍結乾燥させた。RNA(1mg)をNaHCO3水溶液(0.1M、200μl、pH8.1)およびDMF(それぞれ200μL)に溶かした。5K(13当量、10mg)または20K(3.4当量、10mg)のPEGを反応バイアルに直接加え、完全に攪拌混合した。反応は4℃で一晩継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85%超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液(0.05M、pH5.5)を用いて反応を停止させた。
精製および脱塩したRNAを凍結乾燥させた。RNAのサンプル(1mg)をホウ酸ナトリウムバッファー(200μL、0.05M、pH10)に溶かした。5KPEG(3mg、4.5当量のSunbright(登録商標)ME−50HS、日本油脂)をCH3CN(200μL)に溶かした。RNA溶液をPEG溶液に加え、完全に攪拌混合した。反応は室温で1時間継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85%超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液(0.05M、pH5.5)を用いて反応を停止させた。
RNAのサンプル(1mg)をNaHCO3水溶液(0.1M、200μl、pH8.1)およびDMF(200μL)に溶かした。5KPEG(13.5当量、10mg、Sunbright ME−50HSまたはSunbright ME−50AS、日本油脂)を反応バイアルに直接加え、完全に攪拌混合した。反応は4℃で一晩継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85%超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液(0.05M、pH5.5)を用いて反応を停止させた。
精製および脱塩したRNAを凍結乾燥させた。RNAのサンプル(50mg)をNaHCO3水溶液(0.1M、2mL、pH8.1)およびDMF(1mL)に溶かした。20KPEG(約2.7当量、400〜520mgのSunbright ME−200HS、異なる配列に関してこの範囲内で異なる量)をCH3CN(2mL)に溶かした。RNA溶液をPEG溶液に加え、完全に攪拌混合した。H2O(250mL)を反応混合物に加えて、濁度を低下させた。反応は室温で1時間継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85%超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液(0.05M、pH5.5)を用いて反応を停止させた。
前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表12および図45は、上記の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
ABIの394型機にて、製造者により文書化された標準的なサイクルを使用し、数箇所の待機工程に変更を加えてRNA分子を合成した。固形支持体は500ÅのdT CPG(2umole)とした。モノマーはRNAホスホロアミダイトまたはリボ−ジフルオロトルイルアミダイトのいずれかとした。別途記載のない限り、全てのモノマーは標準的な保護基を有しており、アセトニトリル(CH3CN)中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、ホスホロアミダイトは、5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−O−tブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−tブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−ジフルオロトルイルO−tブチルジメチルシリル−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト(0.12M)であった。カップリング時間は全てのRNAモノマーに関して7分、DFTモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである:活性化物質:5−エチルチオ−1H−テトラゾール(0.25M);キャップA:5%無水酢酸/THF/ピリジン、キャップB:10%N−メチルイミダゾール/THF;リン酸の酸化には0.02MのI2/THF/H2Oを要した。脱トリチル化は3%TCA/ジクロロメタンを用いて行った。DMT保護基は、サイクルの最後の工程の後で除去した。
ABIの394型機にて、製造者により文書化された標準的なサイクルを使用し、数箇所の待機工程に変更を加えてキメラRNA分子を合成した。固形支持体は500ÅのdT CPG(2μmole)とした。モノマーはRNAホスホロアミダイトまたは2’−アラフルオロ−2’−デオキシ(2’アラF)ホスホロアミダイトのいずれかとした。別途記載のない限り、全てのモノマーは標準的な保護基を有しており、アセトニトリル(CH3CN)中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは、5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−O−tブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−(α−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−O−tブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−tブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトであり;2’アラFホスホロアミダイトは、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−ベンゾイル−2’−アラフルオロ−2’−デオキシシチジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−アラフルオロ−2’−デオキシウリジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−アラフルオロ−チミジン−3’−O−(β−シアノエチル−N,N’−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトであった。カップリング時間は全てのモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである:活性化物質:5−エチルチオ−1H−テトラゾール(0.25M);キャップA:5%無水酢酸/THF/ピリジン、キャップB:10%N−メチルイミダゾール/THF;リン酸の酸化には0.02MのI2/THF/H2Oを要した。脱トリチル化は3%TCA/ジクロロメタンを用いて行った。最終的なDMT保護基は、最終サイクルの後で除去した。
脱保護工程1:
合成の終了後、多孔質ガラス(CPG)をスクリューキャップ付きバイアルに移した。アセトニトリル/エタノール/NH4OH(45:45:10)からなる溶液(0.5ml)を支持体に加えた。バイアルを密閉し、室温で30分間放置した。エチレンジアミン(0.5mL)をバイアルに加え、室温でさらに6時間放置した。上清を傾瀉し、支持体を1:1のアセトニトリル/水(0.5mL)で2回洗浄した。上清を合わせて水(15mL)で希釈した。AcCN/H2O(1:9)中の6MのHClを用いて、pHを7.0に調整した。サンプルを、Seppak(登録商標)C18カートリッジを使用して脱塩し、次いでスピードバックで乾燥させた。
得られた白色の残渣をトリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド(TEA.3HF 約24%HF)および1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)の混合物(4:3:7)(400ul)に再懸濁させ、65℃で90分間加熱して、2’位のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次いでイソプロポキシトリメチルシラン(iPrOMe3Si、400ul)を用いて反応を停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて10分間さらにインキュベートした(これによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる)。残留している反応停止試薬は、スピードバックで乾燥させることによって除去した。3%トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液(1.5ml)を加え、混合物を遠心分離にかけて、RNAのペレットを得た。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットをスピードバックで乾燥させた。粗製RNAは、微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として得られた。
全てのメチルホスホネート修飾配列はPAGEによって精製した。
二重鎖の活性分析
前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表15および図48は、上記の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
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