JP2011101638A - 細胞遊走測定用基板および細胞遊走試験法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、導電性領域と絶縁性領域とを有する基材、ならびに該導電性領域上および該絶縁性領域上にそれぞれ形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、導電性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っており、絶縁性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っている、前記細胞培養用基板に関する。
【選択図】図1
Description
(1)導電性領域と絶縁性領域とを有する基材、ならびに該導電性領域上に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域、および該絶縁性領域上に形成された細胞接着阻害性領域を備える細胞培養用基板であって、導電性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っている、前記細胞培養用基板。
(2)導電性領域と絶縁性領域とを有する基材、ならびに該導電性領域上および該絶縁性領域上にそれぞれ形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、導電性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っており、絶縁性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っている、(1)記載の細胞培養用基板。
(3)導電性領域上の細胞接着阻害性領域が、導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能である、(1)または(2)記載の細胞培養用基板。
(4)細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および/または分解処理を施して細胞接着性とした領域であり、細胞接着阻害性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されている、(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞培養用基板。
(5)導電性領域が、複数の櫛歯部と各櫛歯部を支持する基部とからなる櫛形にパターニングされている、(1)〜(4)のいずれかに記載の細胞培養用基板。
(6)細胞接着阻害性領域が櫛歯部に直交する細長形状の領域となるようパターニングされている、(5)記載の細胞培養用基板。
(7)導電性領域が形成する櫛歯部の幅が0.1〜500μmである、(5)または(6)記載の細胞培養用基板。
(8)導電性領域が形成する櫛歯部間の間隔が10〜1000μmである、(5)〜(7)のいずれかに記載の細胞培養用基板。
(9)炭素酸素結合を有する有機化合物がアルキレングリコールオリゴマーである、(4)記載の細胞培養用基板。
(10)導電性領域が、基材表面に酸化インジウム錫の膜が存在する領域である、(1)〜(9)のいずれかに記載の細胞培養用基板。
(i)(1)〜(10)のいずれかに記載の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)導電性領域に電圧を印加することによって導電性領域上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、および
(iii)導電性領域上の細胞接着性領域に接着している細胞の、工程(ii)で細胞接着性領域に改変した領域への移動を観察する工程
を含む、前記方法。
(12)導電性領域と絶縁性領域を有する基材の全面に、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成する工程、および
導電性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合うように、親水膜をパターン状に酸化処理および/または分解処理して細胞接着性に改変させる工程、
を含む、細胞培養用基材の製造方法。
(13)導電性領域が線状導電性領域を含み、
線状導電性領域の長さ方向に沿う両側には絶縁性領域が配置されており、
線状導電性領域の、1つ又は長さ方向位置が異なる2つ以上の位置に、線状導電性領域の各位置における部分を全部又は一部に含むように細胞接着性領域が形成されており、
前記線状導電性領域の各位置における部分が前記細胞接着性領域の一部である場合には、該細胞接着性領域には、該部分に隣接する絶縁性領域の部分が更に含まれ、
線状導電性領域、及び、線状導電性領域の長さ方向に沿う両側に配置される絶縁性領域のうち前記細胞接着性領域に含まれない部分は、細胞接着阻害性領域であり、
各細胞接着性領域の、線状導電性領域長さ方向の寸法を細胞接着性領域の長さ、該長さ方向に直交する方向の寸法を細胞接着性領域の幅と定義したとき、各細胞接着性領域の長さ及び幅が、それぞれ独立に、1〜500μmであり、
線状導電性領域のうち、細胞接着性領域に含まれない部分の線幅が0.1〜10μmであり、且つ、該線幅は、該部分と接続される細胞接着性領域の幅よりも小さい、
(1)〜(10)のいずれかに記載の細胞培養用基板。
(14)導電性領域の細胞接着阻害性領域が、導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能である、(13)記載の細胞培養用基板。
(15)線状導電性領域の、長さ方向位置が異なる2つ以上の位置に、細胞接着性領域が形成されている、(14)記載の細胞培養用基板。
(16)細胞を試験する方法であって、
(i)(14)記載の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)線状導電性領域に電圧を印加することによって線状導電性領域の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、および
(iii)細胞接着性領域に接着している細胞を観察する工程
を含む、前記方法。
(17)回路状の細胞構築物を形成する方法であって、
(i)(15)記載の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)線状導電性領域に電圧を印加することによって線状導電性領域の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、および
(iii)細胞を培養することによって、細胞接着性領域に接着している細胞に形態変化を生じさせ、工程(ii)で細胞接着性領域に改変した線状導電性領域を介して隣接する細胞間に該領域に沿った連絡部を形成させる工程
を含む、前記方法。
(18)工程(i)において、細胞接着性領域1つ当たり細胞を1つ接着させる(16)又は(17)記載の方法。
本発明の細胞培養用基板に用いられる基材としては、導電性領域と絶縁性領域とを形成可能な材料で形成されたものであれば特に制限されない。絶縁性材料からなる基材上に導電性領域を形成することにより、導電性領域と絶縁性領域とを形成することが好ましい。また、その表面に炭素酸素結合を有する有機化合物の被膜を形成することが可能な材料で形成されたものであることが好ましい。具体的には、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック(例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂)で代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状、ならびに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常0.1〜1000μm、好ましくは1〜500μm、より好ましくは10〜200μmである。
細胞接着阻害性領域は、好ましくは、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される親水性膜により形成される。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を有する有機化合物を主原料とする薄膜であり、酸化される前は細胞接着阻害性を有し、酸化および/または分解された後は細胞接着性を有しているものであれば特に限定されない。
なお、本発明において水接触角とは、23℃において測定される水接触角を指す。
本発明では、細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および/または分解処理を施して細胞接着性とした領域により形成される。
細胞接着性領域(結合層が存在する場合には結合層も含む)の炭素量は、細胞接着阻害性領域(結合層が存在する場合には結合層も含む)の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して20〜99%であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ(結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計)が10μm以下の場合に特に好適である。「炭素量(atomic concentration、%)」は下記に定義する通りである。
本発明の親水性薄膜(結合層が存在する場合には結合層も含む)の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、X線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはX線光電子分光測定(XPS/ESCA)である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度(atomic concentration、%)で算出される。以下、本発明におけるX線光電子分光分析方法を詳細に説明する。
本発明の細胞培養用基板では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。パターンの形状は、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織等によって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状(樹状)、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形等の図形の内部がすべて細胞接着性領域または細胞接着阻害性領域となっているパターンなどを形成することができる。
細胞培養用基板に播種する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。また遊走する性質を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝がん細胞、グリオーマ細胞、結腸癌細胞、腎がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、大腸がん細胞、乳癌細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞などのがん細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
上記のように、本発明の細胞培養用基板上に細胞を播種して培養し、細胞接着性領域に細胞を接着させた後、導電性領域に電圧を印加して、導電性領域上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させ、その後の細胞の移動を観察することにより、細胞遊走を試験することができる。
(i)本発明の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)導電性領域に電圧を印加することによって導電性領域上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、
(iii)導電性領域上の細胞接着性領域に接着している細胞の、工程(ii)で細胞接着性領域に改変した領域への移動を観察する工程
を含む。
図1の(1)〜(3)に本発明の細胞培養用基板の製造方法の一実施形態が示されている。まず、(1)に示すように、基材上に導電性領域(b)と絶縁性領域(a)を、導電性領域が、複数の櫛歯部(c)と各櫛歯部を支持する基部(d)とからなる櫛形にパターニングされるように形成する。続いて、(2)に示すように、基材の全面に、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成する。そして、(3)に示すように、親水膜をパターン状に(細胞接着阻害性領域が櫛歯部に直交する細長形状(ライン形)の領域となるように)酸化処理および/または分解処理して細胞接着性に改変させる。これにより、導電性領域上において細胞接着性領域(b)と細胞接着阻害性領域(b’)とが隣り合っており、絶縁性領域上において細胞接着性領域(a)と細胞接着阻害性領域(a’)とが隣り合っている、細胞培養用基板が得られる。
本発明の細胞培養用基板の他の好ましい実施形態について図3〜7を参照して説明する。この実施形態における、細胞培養用基板を製造するための材料及び方法、細胞培養用基板の形状、細胞培養の方法、細胞培養の条件や用いる試薬、培養される細胞、印加電圧、電圧印加の方法等の諸条件は、この節において特に規定していない限り、本発明の他の実施形態について述べた諸条件と同様である。
10cm角の無アルカリガラス上に酸化インジウム錫(ITO)を150nmにスパッタ製膜し、レジスト塗布、フォトマスクを介した露光、現像、エッチングを経て、線幅100μmの櫛型ITO電極基材を準備した(図1(1))。
(一段階目の反応)
トルエン39.0g及びエポキシシランTSL8350(GE東芝シリコーン製)750μlの混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。UV洗浄したITO基材を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、19時間室温で振盪した。その後、下地処理されたITO基材をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。
テトラエチレングリコール15gを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシシラン処理された基材を上記のテトラエチレングリコールに浸漬し、80℃で60分間反応させた。反応後、基材をよく水洗いし、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成された基板が得られた(図1(2))。
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、250μm角の開口部が500μmピッチで形成されたスクエアパターンで、且つ、周囲に幅約1.5cmの開口部を有する5インチサイズのものを用いた。あらかじめ露光機の照度を350nmの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は25mW/cm2であった。親水性薄膜が形成されたITO基板と上記触媒付き石英板を、親水性薄膜とフォトマスクの光触媒層が対向するように、且つITO基板の櫛型導電性領域の櫛歯部とフォトマスクのスクエアパターンが直交するように設置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。120秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、25mm角に切断した(図1(3))。
上記のように切断した基板をエチレンオキサイドガスで滅菌した。この基板に滅菌済みφ8mmのクローニングリングを設置し、その中に5x104個のマウス繊維芽細胞を播種した。10%血清を含むDMEM培地を用いて、37℃、5%CO2濃度のインキュベータ内で24時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、細胞は酸化処理された部分にのみコンフルエントの状態で接着していた(図1(3’))。
上記櫛型ITOを回路に接続し、+2Vの電圧を2分間印加した。正の電圧が印加された電極上のみで、時間経過とともに、それまでフォトマスクのスクエアパターン通りに接着していた細胞が、パターンを崩しながら遊走していく様が観察された。7.5時間後には、100μm幅の電極上を100μmほど遊走していることを確認できた(図1(4’)(5’)および図2)。
31:導電性領域
32:絶縁性領域
33:細胞接着性領域
40:細胞
41:細胞間の連絡部
50:櫛歯部(線状導電性領域)
51:基部
52:櫛形電極
53:櫛形電極
54:対向電極櫛歯部
55:絶縁性領域
60:導電性領域
61:絶縁性領域
62:細胞接着性領域
70:導電性領域
71:導電性領域の幅広部
72:絶縁性領域
73:細胞接着性領域
Claims (18)
- 導電性領域と絶縁性領域とを有する基材、ならびに該導電性領域に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域、および該絶縁性領域に形成された細胞接着阻害性領域を備える細胞培養用基板であって、導電性領域において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っている、前記細胞培養用基板。
- 導電性領域と絶縁性領域とを有する基材、ならびに該導電性領域および該絶縁性領域にそれぞれ形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、導電性領域において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っており、絶縁性領域において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っている、請求項1記載の細胞培養用基板。
- 導電性領域の細胞接着阻害性領域が、導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能である、請求項1または2記載の細胞培養用基板。
- 細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および/または分解処理を施して細胞接着性とした領域であり、細胞接着阻害性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されている、請求項1〜3のいずれか1項記載の細胞培養用基板。
- 導電性領域が、複数の櫛歯部と各櫛歯部を支持する基部とからなる櫛形にパターニングされている、請求項1〜4のいずれか1項記載の細胞培養用基板。
- 細胞接着阻害性領域が櫛歯部に直交する細長形状の領域となるようパターニングされている、請求項5記載の細胞培養用基板。
- 導電性領域が形成する櫛歯部の幅が0.1〜500μmである、請求項5または6記載の細胞培養用基板。
- 導電性領域が形成する櫛歯部間の間隔が10〜1000μmである、請求項5〜7のいずれか1項記載の細胞培養用基板。
- 炭素酸素結合を有する有機化合物がアルキレングリコールオリゴマーである、請求項4記載の細胞培養用基板。
- 導電性領域が、基材表面に酸化インジウム錫の膜が存在する領域である、請求項1〜9のいずれか1項記載の細胞培養用基板。
- 細胞遊走を試験する方法であって、
(i)請求項1〜10のいずれか1項記載の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)導電性領域に電圧を印加することによって導電性領域の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、および
(iii)導電性領域の細胞接着性領域に接着している細胞の、工程(ii)で細胞接着性領域に改変した領域への移動を観察する工程
を含む、前記方法。 - 導電性領域と絶縁性領域を有する基材の全面に、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成する工程、および
導電性領域において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合うように、親水膜をパターン状に酸化処理および/または分解処理して細胞接着性に改変させる工程、
を含む、細胞培養用基材の製造方法。 - 導電性領域が線状導電性領域を含み、
線状導電性領域の長さ方向に沿う両側には絶縁性領域が配置されており、
線状導電性領域の、1つ又は長さ方向位置が異なる2つ以上の位置に、線状導電性領域の各位置における部分を全部又は一部に含むように細胞接着性領域が形成されており、
前記線状導電性領域の各位置における部分が前記細胞接着性領域の一部である場合には、該細胞接着性領域には、該部分に隣接する絶縁性領域の部分が更に含まれ、
線状導電性領域、及び、線状導電性領域の長さ方向に沿う両側に配置される絶縁性領域のうち前記細胞接着性領域に含まれない部分は、細胞接着阻害性領域であり、
各細胞接着性領域の、線状導電性領域長さ方向の寸法を細胞接着性領域の長さ、該長さ方向に直交する方向の寸法を細胞接着性領域の幅と定義したとき、各細胞接着性領域の長さ及び幅が、それぞれ独立に、1〜500μmであり、
線状導電性領域のうち、細胞接着性領域に含まれない部分の線幅が0.1〜10μmであり、且つ、該線幅は、該部分と接続される細胞接着性領域の幅よりも小さい、
請求項1〜10のいずれか1項記載の細胞培養用基板。 - 導電性領域の細胞接着阻害性領域が、導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能である、請求項13記載の細胞培養用基板。
- 線状導電性領域の、長さ方向位置が異なる2つ以上の位置に、細胞接着性領域が形成されている、請求項14記載の細胞培養用基板。
- 細胞を試験する方法であって、
(i)請求項14記載の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)線状導電性領域に電圧を印加することによって線状導電性領域の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、および
(iii)細胞接着性領域に接着している細胞を観察する工程
を含む、前記方法。 - 回路状の細胞構築物を形成する方法であって、
(i)請求項15記載の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)線状導電性領域に電圧を印加することによって線状導電性領域の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、および
(iii)細胞を培養することによって、細胞接着性領域に接着している細胞に形態変化を生じさせ、工程(ii)で細胞接着性領域に改変した線状導電性領域を介して隣接する細胞間に該領域に沿った連絡部を形成させる工程
を含む、前記方法。 - 工程(i)において、細胞接着性領域1つ当たり細胞を1つ接着させる請求項16又は17記載の方法。
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