JP2013226070A - 細胞遊走試験用装置および細胞遊走試験方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 正負の走化性に対応することができ、かつ再現性、定量性および効率性に優れた細胞遊走試験用装置、およびこれを用いた細胞遊走試験方法を提供する。
【解決手段】本発明は、細胞遊走試験用装置１０であって、その表面に線状導電性領域ｂを有する基材ｃを備え、線状導電性領域ｂは、その両端を含む領域が第１の細胞接着阻害性領域１１であり、第１の細胞接着阻害性領域１１の間が第１の細胞接着性領域１３であり、線状導電性領域ｂの周囲が第２の細胞接着阻害性領域１２であり、線状導電性領域ｂは薬剤供給部１４に接触しており、薬剤供給部１４は、線状導電性領域ｂの両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であり、第１の細胞接着阻害性領域１４は、線状導電性領域ｂへの電圧印加によって、第２の細胞接着性領域に変化することが可能である、上記装置に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞遊走試験用装置および細胞遊走試験方法に関する。

細胞の遊走は免疫応答や受精後の胚形態形成、組織修復および再生等の様々な段階に関与している。また、癌やアテローム動脈硬化症、関節炎等の疾患の進行においても極めて重要な役割を持つ。具体的には、血管内皮を通しての細胞の遊走は、炎症、アテローム性動脈硬化症、癌の転移といった状態の病態生理における重要な現象である。特に、薬剤存在下での細胞遊走試験は、薬剤のスクリーニングの際に利用されている。細胞が適用した薬剤に対して正の走化性を有するか、負の走化性を有するか、またその移動速度等を解析することにより、その薬剤が細胞に対して促進剤として作用するか、または阻害剤として作用するか等の知見を得ることができる。そのため、インビトロでの細胞遊走を測定する方法は、長年に渡って開発されてきた。

例えば、一般に市販されている細胞遊走試験用装置としては、古典的なボイデンチャンバ、細胞培養インサート、ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ＨｉｔＫｉｔ（登録商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）がある。しかしながら、これらの装置では、細胞の遊走領域を制御できないという問題があった。

特定の領域に細胞を遊走させて観測するための基板は、（非特許文献１）に開示されている。この基板は、ウェル内に細胞を播種しコンフルエントに培養した後、ピンで細胞を引っ掻くことにより創傷パターンを作製し、その創傷パターンへ向かって周りから細胞が遊走する過程を観測するものである（スクラッチアッセイ）。このような基板を用いるスクラッチアッセイは、ピンで創傷パターンを形成することから、傷のサイズ（幅）に物理的制約があり、せいぜいミリオーダー程度までしか小さくすることができない。また、傷のエッヂが汚く、ウェル間での傷形状のばらつきが大きいという問題がある。また、創傷時、ピンと細胞との物理的接触により細胞が浮遊したり、細胞内容物が漏出するといった欠点もある。さらに、傷の面積が広く細胞が早く埋まる部分や遅く埋まる部分などのばらつきが大きく、定量的なアッセイが難しく経時的な観察が必要になるなどの問題もあった。

これに対し、本発明者らは、導電性領域と絶縁性領域とを有する基材、ならびにその導電性領域上に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備え、導電性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っている細胞遊走試験用装置を開発した（特許文献１）。この細胞遊走試験用装置に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させ、導電性領域に電圧を印加して導電性領域上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性に変化させることにより、細胞接着性領域に接着している細胞の、細胞接着性に変化した細胞接着阻害性領域への遊走を観察することができる。よって、特許文献１に記載の装置では、細胞を遊走させる前の細胞の配置、細胞の遊走方向、および遊走開始のタイミングを制御して、定量的に細胞遊走試験を行うことができる。しかしながら、特許文献１には、薬剤に対する正の走化性および負の走化性のいずれにも対応することができるような、装置の形状や細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域のパターン形状については記載されていない。

また、特許文献２には、液体試料を静止した状態で収納できるウェルの複数個が流路を介して互いに連通していること、流路には土手が設けられていること、ウェルはガラス基板と密着するように形成されていること、土手の上部には細胞の径またはその変形能に合わせた幅および／または深さの溝を１乃至複数本構成する障壁が設けられているか、または平面が設けられており、該平面はガラス基板との間で細胞の径またはその変形能に合わせた深さを形成するべく設けられていることを特徴とする細胞遊走試験用装置が記載されている。特許文献２には、本装置によれば、ウェルに入れた細胞が、走化開始前に流路の近傍に集まり、細胞の進行方向に向かって並ぶことが可能であるため、細胞の自力に基づく動きを正確に測定可能であることが記載されている。しかしながら、本装置では、ガラス基板表面は一様の細胞接着性をもつため、ウェルを通じて供給された細胞がピペットによって起こる液流により散らばって配置される可能性がある。また、本装置では細胞のランダムな運動を制御することが困難であり、解析結果の信頼性や再現性に劣る可能性がある。また、本装置は、細胞の遊走方向が一方向に制限されているため、正の走化性と負の走化性の両方に対応することは不可能である。

また、濃度勾配下で細胞遊走試験を行うことができる市販の装置としては、μ−Ｓｌｉｄｅ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ（ｉｂｉｄｉ社）およびＥＺ−ＴＡＸＩＳｃａｎ（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社）がある。しかしながら、前者は、ウェルの数が少ないためにハイスループットで効率的に遊走試験を行うことができず、また後者は、負の走化性については遊走速度の低下のみを観察することができるに過ぎない。また、上記のような既存の細胞遊走試験用装置は、遊走前の細胞の配置や細胞の遊走領域を厳密に制御することができないため、定量的に遊走解析を行うためには、細胞トラッキングソフトが必要となる。

特開２０１１−１０１６３８号公報 特開２００３−１８０３３６号公報

Justic C Yarrow, et al., A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods," BMC Biotechnology 2004, 4: 21

本発明は、正負の走化性に対応することができ、かつ再現性、定量性および効率性に優れた細胞遊走試験用装置、およびこれを用いた細胞遊走試験方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、細胞遊走試験用装置に、基材表面の特定の方向に濃度勾配を形成させることが可能な薬剤供給部を設け、また、線状導電性領域を備える基材表面に細胞接着性領域および細胞接着阻害性領域を特定のパターン形状に形成して、電圧印加により細胞接着性に変化した細胞接着阻害性領域へ細胞を遊走させることにより、正負の走化性について、再現性、定量性および効率性の高い細胞遊走試験を行うことが可能であることを見出した。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）細胞遊走試験用装置であって、
その表面に線状導電性領域を有する基材を備え、
線状導電性領域は、その両端を含む領域が第１の細胞接着阻害性領域であり、第１の細胞接着阻害性領域の間が第１の細胞接着性領域であり、線状導電性領域の周囲が第２の細胞接着阻害性領域であり、
線状導電性領域は薬剤供給部に接触しており、
薬剤供給部は、線状導電性領域の両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であり、
第１の細胞接着阻害性領域は、線状導電性領域への電圧印加によって、第２の細胞接着性領域に変化することが可能である、上記装置。

（２）薬剤供給部が第１の薬剤供給部と第２の薬剤供給部とを備え、
線状導電性領域が、第１の薬剤供給部および第２の薬剤供給部に接触しており、
第１の薬剤供給部と第２の薬剤供給部が、線状導電性領域上の第１の細胞接着性領域を挟んで対向して配置されている、上記（１）に記載の装置。
（３）複数の線状導電性領域が、各線状導電性領域に接続する基部とともに櫛形である、上記（１）または（２）に記載の装置。

（４）細胞遊走試験方法であって、
（ａ）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞遊走試験用装置の基材上に細胞を播種して、第１の細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
（ｂ）線状導電性領域に電圧を印加することによって第１の細胞接着阻害性領域を第２の細胞接着性領域に改変する工程、
（ｃ）薬剤供給部に薬剤を供給して、基材表面に薬剤の濃度勾配を形成する工程、および
（ｄ）第１の細胞接着性領域に接着した細胞の第２の細胞接着性領域における遊走を観察する工程
を含む、上記方法。
（５）一定時間経過後、第２の細胞接着性領域における細胞の遊走距離を測定する工程をさらに含む、上記（４）に記載の方法。

本発明によれば、正負の走化性について、再現性、定量性および効率性の高い細胞遊走試験を行うことができる。

図１は、本発明の第一の実施形態を示す図である。 図２は、本発明の第二の実施形態を示す図である。 図３は、本発明の一実施形態を示す図である。 図４は、本発明の一実施形態を示す図である。 図５は、本発明の一実施形態を示す図である。

以下、本発明の細胞遊走試験用装置（以下、「本発明の装置」という）の一実施形態について説明する。

第一の実施形態は、図１に示すように、その表面に線状導電性領域ｂを有する基材ｃを備え、
線状導電性領域ｂは、その両端を含む領域が第１の細胞接着阻害性領域１１であり、第１の細胞接着阻害性領域１１の間が第１の細胞接着性領域１３であり、線状導電性領域ｂの周囲が第２の細胞接着阻害性領域１２であり、
線状導電性領域ｂは薬剤供給部１４に接触しており、
薬剤供給部１４は、線状導電性領域ｂの両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であり、
第１の細胞接着阻害性領域１１は、線状導電性領域ｂへの電圧印加によって、第２の細胞接着性領域に変化することが可能である形態である。

第二の実施形態は、図２に示すように、その表面に線状導電性領域ｂを有する基材ｃを備え、
線状導電性領域ｂは、その両端を含む領域が第１の細胞接着阻害性領域２１であり、第１の細胞接着阻害性領域２１の間が第１の細胞接着性領域２３であり、線状導電性領域ｂの周囲が第２の細胞接着阻害性領域２２であり、
線状導電性領域ｂは第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’に接触しており、
第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’は、線状導電性領域ｂの両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であり、
第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’は、線状導電性領域ｂ上の第１の細胞接着性領域２３を挟んで対向して配置されており、
第１の細胞接着阻害性領域２１は、線状導電性領域ｂへの電圧印加によって、第２の細胞接着性領域に変化することが可能である形態である。

（細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域）
本発明において、第１の細胞接着性領域と第２の細胞接着性領域を単に細胞接着性領域と称する場合がある。

本発明において、細胞接着性とは、細胞が接着すること、または細胞が接着しやすいことを意味する。細胞接着阻害性とは、細胞が接着しにくいことまたは細胞が接着しないことを意味する。従って、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域が形成されている基材表面に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しない。

細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性とは、ある種の細胞に対して細胞接着性であることを意味する。従って、細胞遊走試験用装置上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性領域が２水準以上存在する場合もある。

（導電性領域および基材）
本発明の装置は導電性領域をその表面に形成させるための基材を含む。
本発明の装置に用いられる基材としては、導電性領域を形成可能な材料で形成されたものであれば特に制限されない。基材は絶縁性材料を含むものであることが好ましい。具体的には、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。基材は透明性の材料を含むものであることが好ましい。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、ならびに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。

基材上に導電性領域を形成する場合、公知のパターニング技術を利用できる。公知のパターニング技術としては、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法およびコンタクトプリンティング法等の各種印刷法による方法、各種リソグラフィー法を用いる方法、ならびにインクジェット法による方法、他に微細な溝を彫刻等する立体整形の手法等が挙げられる。具体的には、基材、例えばガラス基材に、導電性材料、例えば金属膜または金属酸化物膜を成膜し、これをフォトリソグラフィー技術等の公知の技術を用いてパターニングすることにより、導電性領域を形成することができる。

基材上への導電性材料の成膜は、公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法等が挙げられる。成膜は、塗布により実施してもよい。スピンコートや各種の印刷方式も使用できる。

導電性領域を構成する導電性材料の膜として、金属膜または金属酸化物膜、金属微粒子や金属ナノファイバーが絶縁体に分散された膜、導電性の有機材料からなる膜等が挙げられる。金属酸化物としては、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）、ＩＺＯ（酸化インジウム亜鉛）等が挙げられ、金属微粒子としては、銀、金、銅等の微粒子、金属ナノファイバーとしてはカーボンナノチューブ、導電性の有機材料としては、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）等が挙げられる。

導電性材料の膜としては特に制限されないが、透明な膜であることが好ましく、例えば、ＩＴＯ膜、ＩＺＯ膜、導電性高分子のポリエチレンジオキシチオフェン膜等が挙げられる。また、電圧印加後も透明な膜であることが好ましい。本発明においては、ＩＴＯ膜をスパッタリング法により成膜して、その後パターニングすることにより、導電性領域を形成することが好ましい。透明な膜は、細胞の観察において有利である。

導電性材料の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。

本発明の装置が備える基材は、その表面に線状導電性領域を有する。そして、線状導電性領域には、第１の細胞接着阻害性領域および第１の細胞接着性領域が形成され、線状導電性領域の周囲には第２の細胞接着阻害性領域が形成されている。本発明の装置は、線状導電性領域への電圧印加によって、第１の細胞接着阻害性領域が第２の細胞接着性領域に変化するため、基材表面の線状導電性領域部分が細胞の遊走路となる。よって、導電性領域が線状であることにより、第１の細胞接着阻害性領域に接着させた細胞が遊走する方向を制御することができ、定量的に細胞遊走試験を行うことができる。

線状導電性領域は複数存在することが好ましく、その本数は、特に制限されないが、通常２〜１５３６本、好ましくは４〜３８４本、より好ましくは１２〜９６本である。このような本数とすることにより、ハイスループットスクリーニングで一般的に用いられている９６、３８４、１５３６マイクロプレートと同等の検体数の評価が可能であり、データの相関が取りやすい。線状導電性領域は、直線状で互いに略平行であることが細胞遊走を定量的に観察する観点から好ましいが、これに限定されず、曲線でもよい。これら複数の線状導電性領域は電気的に接続して、１つの導電性領域を形成していることが好ましい。それにより、複数の線状導電性領域に一度にかつ同時に電圧を印加でき、簡便かつ正確な定量的観察が可能になる。

上記のような導電性領域のパターニングは、具体的には、成膜した金属膜または金属酸化物膜に、レジスト塗布、フォトマスクを介した露光、現像およびエッチングを行って実施することができる。

（細胞接着阻害性領域）
細胞接着阻害性領域は、好ましくは、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される親水性膜により形成される。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を有する有機化合物を主原料とする薄膜であり、酸化される前は細胞接着阻害性を有し、酸化および／または分解された後は細胞接着性を有しているものであれば特に限定されない。また、細胞接着阻害性領域は、細胞非接着性あり、かつ表面に親水性膜が形成されないレジスト部により形成されていてもよい。このようなレジスト部の材料としては、例えばＳＵ−８（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を挙げることができる。レジスト部の形成方法は、特に制限されないが、例えば、スピンコートや各種印刷技術による塗布成膜により形成することができる。また、レジスト部の厚さは特に制限されないが、１〜１００μｍであることが好ましい。

本発明において炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。

主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、これらが相互に物理的または化学的に架橋し、基材または導電性領域と物理的または化学的に結合することにより親水性薄膜となる。

具体的な水溶性高分子材料としては、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその誘導体、ポリメタクリル酸およびその誘導体、ポリアクリルアミドおよびその誘導体、ポリビニルアルコールおよびその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類、等を挙げることができる。分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体、デキストラン、およびヘパリンが挙げられるがこれらには限定されない。

具体的な水溶性オリゴマー材料や水溶性低分子化合物としては、アルキレングリコールオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、メタクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、アクリルアミドオリゴマーおよびその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーの鹸化物およびその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸およびその誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、アクリルアミドおよびその誘導体、双性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物等を挙げることができる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、２−〔メトキシ（ポリエチレンオキシ）−プロピルトリメトキシシラン、およびトリエチレングリコール−ターミネーティッド−チオールが挙げられるがこれらには限定されない。

親水性膜は、処理前は高い細胞接着阻害性を有し、酸化処理および／または分解処理後は細胞接着性を示すものであることが望ましい。

親水性膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、細胞の接着において、基材の表面の親水性薄膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。

基材または導電性領域表面への親水性膜の形成方法としては、基材または導電性領域へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、基材または導電性領域へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材または導電性領域へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材または導電性領域への密着性を高めるために多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、基材または導電性領域との密着性を高めるために基材または導電性領域上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基材または導電性領域表面に重合開始点を形成し、次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。

上記成膜方法のうち特に好ましい方法としては、多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、ならびに、基材または導電性領域との密着性を高めるために基材または導電性領域上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。これらの方法を用いると、親水性有機化合物の基材または導電性領域への密着性を高めることが容易だからである。本明細書では「結合層」という用語を用いる。結合層とは、多段階式に親水性有機化合物の薄膜を形成する場合には最表面の親水性薄膜層と基材との間に存在する層を意味し、基材または導電性領域表面に下地層を設け当該下地層の上に親水性薄膜層を形成する場合には当該下地層を意味する。結合層は、結合部分（リンカー）を有する材料を含む層であることが好ましい。リンカーとリンカーに結合させる材料の末端の官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれがリンカーであってもよい。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、基材または導電性領域上にリンカーを有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を例にとると、エポキシシランを付加した基材の表面の水接触角が典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上であれば、次に酸触媒存在下エチレングリコール系材料等を付加することによって十分な細胞接着阻害性を有する基材を作ることができる。なお、本発明において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角を指す。

（親水性膜の酸化処理および／または分解処理による第１の細胞接着性領域の形成）
本発明では、第１の細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした領域により形成される。

本発明において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。

本発明において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解等が挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。

紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水等）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。

以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理および／または分解処理」という用語を使用する。

酸化処理および／または分解処理の方法としては、親水性膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法等が挙げられる。本発明では、導電性領域上に第１の細胞接着性領域を形成することから、親水性膜をパターン状に部分的に酸化処理および／または分解処理する。部分的に酸化処理および／または分解処理する場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりするとよい。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。

紫外線照射処理の場合は、波長１８５ｎｍや２５４ｎｍの紫外線を出す水銀ランプや波長１７２ｎｍの紫外線を出すエキシマランプ等のＶＵＶ領域からＵＶ−Ｃ領域の紫外線を出すランプを光源として用いることが好ましい。光触媒処理する場合は、波長３６５ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることが好ましく、波長２５４ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることがより好ましい。光触媒としては、酸化チタン光触媒、金属イオンや金属コロイドで活性化された酸化チタン光触媒を用いるのが好ましい。酸化剤としては、有機酸や無機酸を特に制限なく用いることができるが、高濃度の酸は取り扱いが難しいので、１０％以下の濃度に希釈して用いるとよい。最適な紫外線処理時間、光触媒処理時間、酸化剤処理時間は、用いる光源の紫外線強度、光触媒の活性、酸化剤の酸化力や濃度等の諸条件に応じて適宜決定することができる。

第１の細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜により形成されていてもよい。この態様では、第１の細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とは、ともに炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されている。２つの領域は前記有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。第１の細胞接着性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。一方、細胞接着阻害性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できない程度に高い。

親水性有機化合物の密度を制御する方法としては、親水性有機化合物の薄膜と基材または導電性領域表面との間に結合層を設け、当該結合層の親水性有機化合物との結合力を調整する方法が挙げられる。ここで「結合層」とは上記で定義した通りであり、上記で説明した好ましい材料から構成され得る。結合層の結合力は、結合層におけるリンカーを有する材料の密度が高いほど強くなり、同密度が低いほど弱くなる。結合層におけるリンカーを有する材料の密度は、上述の通り、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。

本発明のこの態様では、第１の細胞接着性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は低い。第１の細胞接着性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°である。このような結合層を形成する方法としては、リンカーを有する材料の被膜（結合層）を基材または導電性領域表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理および／または分解処理する方法が挙げられる。結合層表面を酸化処理および／または分解処理する方法としては、結合層表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法等が挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理および／または分解処理してもよいし、部分的に処理してもよい。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いることにより行うことができる。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。諸条件等についても、親水性膜の酸化処理および／または分解処理により第１の細胞接着性領域を形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、第１の細胞接着性領域が形成できる。

本発明のこの態様では、細胞接着阻害性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は高い。細胞接着阻害性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、リンカーを有する材料の被膜を基材または導電性領域表面に形成することにより得られる。結合層表面を部分的に酸化処理および／または分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着阻害性領域が形成できる。

（細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域との比較）
細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。

また、細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。

（親水性薄膜の評価方法）
本発明の親水性薄膜（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法等を用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）で算出される。以下、本発明におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。

本発明において親水性薄膜の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本発明において親水性薄膜の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。具体的な測定は、特開２００７−３１２７３６に記載されるとおりに実施できる。

（本発明の装置の製造方法）
本発明の装置は、例えば、基材表面に線状導電性領域を形成する工程、基材表面に炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成する工程、および線状導電性領域上に第１の細胞接着性領域が形成されるように、親水性膜を酸化処理および／または分解処理して細胞接着性に改変させる工程を含む方法により製造できる。

（導電性領域への電圧印加による第２の細胞接着性領域の形成）
本発明では、第２の細胞接着性領域は、導電性領域に電圧を印加して細胞接着阻害性領域に形成された親水性膜を分解し、剥離して細胞接着性とすることにより形成される。ここで、分解とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。本発明では、導電性領域に電圧を印加することにより、例えば結合層に存在する結合部分（リンカー）が切断され、親水性膜を構成する有機化合物の少なくとも一部が分解または除去されるものと考えられる。

本発明の装置によれば、導電性領域への電圧印加により第１の細胞接着性領域に接着した細胞の遊走を開始するタイミングを制御することができるため、定量的に細胞遊走試験を行うことができる。また従来のスクラッチアッセイと比較して、より再現性の高い細胞遊走試験を行うことができる。

導電性領域に印加する電圧は、正電圧であることが好ましい。正電圧を印加することにより、細胞接着阻害性領域を効果的に細胞接着性領域に改変できるとともに、特に導電性領域がＩＴＯ膜からなる場合に黒変するのを防止することができ、細胞遊走の観察を良好に実施できる。

印加する電圧は、当業者であれば適宜決定することができるが、通常１〜１０Ｖ、好ましくは２〜５Ｖであり、印加する時間は、通常０．５〜６０分間、好ましくは１〜１０分間である。

印加する電圧は、電極が接している溶媒の種類や、電極の材質、電極の形状によって、適切な値が変わるが、通常、細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変可能な電圧以上で、細胞に悪影響を与えない程度に低い電圧を加えるのがよい。

電圧は、基材平面内の導電性領域間（例えば、ＩＴＯとＩＴＯ間）に印加してもよいし、基材平面内に、Ｐｔ等の対抗電極を設けて導電性領域と対向電極の間（例えば、ＩＴＯとＰｔ間）に印加してもよい。また、電圧を精密に制御するため、基材平面内にＡｇ／ＡｇＣｌ等の参照電極を設けてもよい。上記の対抗電極や参照電極は、基材平面内でなくてもよい（培養液に電極を浸漬する形態でもよい）。

第２の細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して得られる第１の細胞接着性領域とは、詳細な表面性状が異なる場合がある。

（パターンの形状と薬剤供給部）
本発明の装置が備える基材は、その表面に線状導電性領域とを有し、線状導電性領域には、その両端を含む領域に第１の細胞接着阻害性領域が形成されており、第１の細胞接着阻害性領域の間に第１の細胞接着性領域が形成され、線状導電性領域の周囲には第２の細胞接着阻害性領域が形成されている。そして、線状導電性領域は薬剤供給部に接触しており、該薬剤供給部は、線状導電性領域の両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であるように配置されている。ここで、線状導電性領域が薬剤供給部に接触するとは、電圧印加後に線状導電性領域上に形成される細胞遊走路に薬剤供給部の薬剤が拡散可能であることを意味する。上記のようなパターン形状および薬剤供給部を設けることにより、薬剤の一部が第１の細胞接着性領域に接着した細胞に到達するように薬剤の濃度勾配が基材表面に形成され、第１の細胞接着阻害性領域に接着された細胞は、薬剤の濃度勾配を感知して細胞遊走路（第２の細胞接着性領域）上を正負のいずれの方向にも遊走することが可能となる。具体的には、図３に示すような第１の細胞接着性領域３２に接着した細胞Ａの薬剤供給部３１に供給された薬剤に対する正の走化性、すなわち薬剤の濃度が高くなる方向への遊走と、図４に示すような第１の細胞接着性領域４２に接着した細胞Ａの薬剤供給部４１に供給された薬剤に対する負の走化性、すなわち薬剤の濃度が低くなる方向への遊走との両方について試験することが可能となる。また、図５に示すように、第１の薬剤供給部５１と第２の薬剤供給部５１’が存在する場合には、第１の薬剤供給部５１と第２の薬剤供給部５１’の一方に高濃度の薬剤を導入し、他方に低濃度の薬剤または水を供給して基材表面に濃度勾配を形成させて、正負の走化性について試験を行うことができる。細胞遊走路全体で濃度勾配を形成させることにより、予期することができない、細胞の逆方向への遊走を防ぐことができるようになるため、再現性および定量性の向上が期待できる。また、第１の薬剤供給部５１と第２の薬剤供給部５１’に異なる薬剤を導入することにより、薬剤の促進剤または阻害剤としての強弱を判断することができる。

本発明の装置を用いて細胞遊走試験を行う際、薬剤供給部から細胞を含む試料を導入してもよい。

（細胞）
本発明の装置に播種する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。また遊走する性質を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝がん細胞、グリオーマ細胞、結腸癌細胞、腎がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、大腸がん細胞、乳癌細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞などのがん細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。

目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理などを行っておくことが好ましい。

本発明の装置への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養などの通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器などの支持体表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件などは、通常の単層培養法などに準じて行う。細胞が接着して増殖する支持体表面の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲンおよびゼラチン等の細胞の接着や増殖が良好に行われる材料を選択したり、ガラスシャーレ、プラスチックシャーレ、スライドガラス、カバーガラス、プラスチックシートおよびプラスチックフィルム等の支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。

予備培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収できる。支持体表面に接着した生細胞の回収には、ＥＤＴＡ−トリプシン処理などの手段が適用できる。

上記のように予備培養した細胞を、培養液中の本発明の装置上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞遊走試験用装置上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。通常、培養液１ｍｌ当り１０⁴〜１０⁶個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。

本発明の装置に播種した細胞を培養液中で培養することにより、細胞を第１の細胞接着性領域に接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。

細胞を培養する時間は、培養時の細胞操作の有無などに左右されるが、通常６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間である。培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ₂細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ₂濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、本発明の装置を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、第１の細胞接着性領域にのみ細胞を接着させることができる。

（薬剤）
本発明の細胞遊走試験用装置を用いて、様々な薬剤に対する細胞の遊走を解析することができる。本発明において試験の対象となる薬剤は特に制限されず、例えば、天然または人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素又は抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはデコイオリゴなど）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）など）、有機化合物、無機化合物、低分子化合物、およびその他の高分子化合物などが挙げられる。具体的には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ Ｂ、サイトカラシンなどが挙げられる。

また、薬剤と細胞の組み合わせとしては、例えば、マウス線維芽細胞（ＳＷＩＳＳ−３Ｔ３）と線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ウシ血管内皮細胞とＦＢＳ、ウシ血管内皮細胞とＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎＢ、イヌ腎臓由来上皮細胞（ＭＤＣＫ）と上皮細胞増殖因子、ＨｅＬａ細胞とＦＢＳなどが挙げられる。

（細胞遊走試験）
本発明の細胞遊走試験方法は、
（ａ）本発明の装置の基材上に細胞を播種して、第１の細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
（ｂ）線状導電性領域に電圧を印加することによって第１の細胞接着阻害性領域を第２の細胞接着性領域に改変する工程、
（ｃ）薬剤供給部に薬剤を供給して、基材表面に薬剤の濃度勾配を形成する工程、および
（ｄ）第１の細胞接着性領域に接着した細胞の第２の細胞接着性領域における遊走を観察する工程
を含む。

工程（ａ）において、上記したように、細胞を基材上に細胞を播種した後培養を行ってもよい。特にその場合には、工程（ａ）の後、目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理を行うことができる。例えば、電圧印加後に基材表面を洗浄することにより、目的の細胞以外の細胞等や接着していない細胞を洗い流し、目的の細胞や接着した細胞のみを基材上に残すことが好ましい。このような分離処理により、細胞の遊走に影響を与えうる物質を除去することができ、よって、より定量的に細胞遊走解析試験を行うことができる。

上記工程（ｂ）および（ｃ）は、いずれを先に行ってもよい。すなわち、薬剤を供給してから電圧を印加し、線状導電性領域上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変して、形成された細胞遊走路への細胞遊走を開始させてもよいし、電圧印加により細胞遊走路を形成してから薬剤を供給してもよい。好ましくは電圧印加後に薬剤供給を実施する。電圧印加後に薬剤供給を実施することにより、薬剤が電荷を持っている分子である場合に薬剤分子が基材表面に吸着して濃度勾配の再現性が下がるのを回避できる。また、浮遊した細胞接着阻害性物質が薬剤と反応して薬剤の性能が落ちるのを回避できる。そのため、電圧印加後に細胞接着阻害性物質が浮遊した培地を取り除き、培地交換を行った後、薬剤を添加することが望ましい。一方、薬剤供給後に電圧印加を実施した場合、遊走開始のタイミングを正確に制御できるという点で有利である。

工程（ｄ）について、細胞の移動の観察には、細胞が移動する速度の計測、ならびに遊走方向、遊走時の細胞形態、および細胞同士のコネクション等の観察が含まれる。
以下、本発明の実施形態について、図を参照することにより説明する。

第一の実施形態
図１に本発明の装置の第一の実施形態が示されている。

第一の実施形態に係る装置１０は、その表面に線状導電性領域ｂを有する基材ｃを備え、
線状導電性領域ｂは、その両端を含む領域が第１の細胞接着阻害性領域１１であり、第１の細胞接着阻害性領域１１の間が第１の細胞接着性領域１３であり、線状導電性領域ｂの周囲が第２の細胞接着阻害性領域１２であり、
線状導電性領域ｂは薬剤供給部１４に接触しており、
薬剤供給部１４は、線状導電性領域ｂの両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であり、
第１の細胞接着阻害性領域１１は、線状導電性領域ｂへの電圧印加によって、第２の細胞接着性領域に変化することが可能である。

ここで、第１の細胞接着阻害性領域１１は線状導電性領域ｂ上の親水性膜ａが形成されている領域に対応し、第１の細胞接着性領域１３は導電性領域ｂが表面に表出している領域に対応し、第２の細胞接着阻害性領域１２は基材ｃ上の親水性膜ａが形成されている領域に対応する。また、第２の細胞接着性領域は電圧印加前の第１の細胞接着阻害性領域１１に対応する。

本実施形態において、導電性領域は、複数の線状導電性領域ｂ（櫛歯部）と各線状導電性領域ｂを支持する基部ｂ’とからなる櫛形にパターニングされていることが好ましい（図１ａ参照）。その場合、導電性領域が形成する櫛歯部の幅（基部から櫛歯部が延びる方向（櫛歯部の長さ方向）と直交する側の幅ｗ）は、好ましくは０．１〜５００μｍであり、細胞遊走を観察するためには、好ましくは５〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。櫛歯部の幅が狭すぎると、櫛歯部の長さ方向の電気抵抗が高くなり、一定の電圧をかけた際に櫛歯部の長さ方向に電圧降下が生じやすく、電位の制御が困難になる。電圧降下の程度は、用いる導電性材料の導電率により変わるため、櫛歯部の幅の下限も導電性材料の導電率に応じて適宜決められるが、一般的には５μｍ以上が好ましい。基材上の導電性領域の幅を５μｍ以下のように狭くする場合には、基材上に幅の広い電極を設け、該電極の表面の一部を絶縁膜で被覆し、５μｍ以下の所望の幅の領域だけを露出させて、該領域を導電性領域とすることにより、抵抗値が高く電圧降下を起こす問題を解決することができる。また、櫛歯部の幅が測定対象の細胞の大きさよりも狭いと、櫛歯部上に細胞が接着しにくくなる。従って、細胞遊走を観察する際の櫛歯部の幅は、測定対象の細胞の大きさによって適宜決められるが、一般的には１０μｍ以上が好ましい。櫛歯部の幅が広いと、顕微鏡で観察する際に視野に入る櫛歯部の本数が少なくなり、統計的な処理をする際に不利になる。一般的には、顕微鏡の視野は数ｍｍ以下であるため、視野内に少なくとも１本の櫛歯部が入るためには、櫛歯部の幅は５００μｍ以下が好ましい。また、櫛歯部の幅が適度に狭いと、測定対象の細胞の遊走方向が制限されるため、一定時間経過後の遊走距離が長くなり測定に有利になる効果もある。櫛歯部間の間隔は、好ましくは１０〜１０００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍである。櫛歯部間の間隔が狭すぎると、櫛歯部間の絶縁性領域上の細胞接着阻害性領域を乗り越えて、隣り合った櫛歯部間で細胞が遊走しやすくなるため、細胞の遊走方向を制限しにくくなる。従って、一般的には１０μｍ以上、より好ましくは５０μｍ以上の櫛歯部間の間隔だと好ましい。櫛歯部間の間隔が広すぎると、顕微鏡で観察する際に視野に入る櫛歯部の本数が少なくなり、統計的な処理をする際に不利になる。一般的には、顕微鏡の視野は数ｍｍ以下であるため、櫛歯部の幅は１０００μｍ以下が好ましい。櫛歯部と櫛歯部が互いにかみあった２つの櫛形のパターンが特に好ましい（図６ａ）。そのようなパターンは、細胞遊走試験において電圧を印加した場合に、電流が効果的に流れるため好ましい。

本実施形態の装置１０は、薬剤供給部１４から細胞を含む試料を導入してもよいが、細胞を含む試料を導入するための細胞導入部１５を備えることが好ましい。薬剤供給部１４または細胞導入部１５から導入された細胞は、細胞接着阻害性領域１１および１２には接着することなく、一定期間経過後に第１の細胞接着性領域１３に誘導され、接着する。このことは、細胞導入時に細胞が細胞接着阻害性領域１１および１２に散らばったとしても、最終的に所定のパターンに細胞を配置することが可能である点で有利である。よって、基材表面上の細胞接着性領域および細胞接着阻害性領域のパターン形状に対する細胞導入部１５の配置は特に制限されないが、効率よく短時間で細胞を第１の細胞接着性領域１３に接着させるために、第１の細胞接着性領域１３の上部に細胞導入部１５を設けることが好ましい（図１ｂ参照）。

本実施形態において、第１の細胞接着性領域１３は、線状導電性領域ｂの中央に形成されており、かつ薬剤供給部１４は線状導電性領域の端部に近い位置に配置されていることが好ましい。これにより、薬剤スクリーニングにおいて、薬剤が促進剤であるか、または阻害剤であるかが未知である場合等、細胞の正負の走化性について同等に細胞遊走試験を行うことができる。

本実施形態の装置１０は、蓋部材ｄを備えていてもよく、薬剤供給部１４および細胞導入部１５が該蓋部材ｄに形成されていてもよい。その場合、蓋部材ｄと基材表面との間に形成される細胞が遊走する空間（以下、細胞遊走空間１６という）と薬剤供給部１４および細胞導入部１５とは一体となって流路を形成している。

蓋部材ｄの材料は、細胞遊走空間１６に濃度勾配を形成することが可能な材料から構成されるものであれば特に制限されないが、観察しやすい点で、透明性のものが好ましい。このような材料としては、例えば、ガラスやポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＰＭＭＡ等の樹脂が好ましく、これらに細胞非接着の処理を施したものが特に好ましい。

薬剤供給部１４から薬剤を供給することにより細胞遊走空間１６において濃度勾配を形成した後、一定の濃度勾配を長時間維持するために、薬剤供給部１４の供給口および細胞導入部１５の導入口は流路を密閉することが可能な構造を有することが好ましい。

細胞遊走空間１６は、細胞遊走路である線状導電性領域ｂ上に形成されており、複数の線状導電性領域ｂ上に一体に形成されていてもよいし（図１ｃ）、各線状導電性領域ｂを含むように複数形成されていてもよい（図１ｄ）。細胞遊走空間１６が複数形成されている場合、各細胞遊走空間１６が、１個の供給口を備える薬剤供給部１４と一体となって流路を形成していてもよく、あるいは、薬剤供給部１４が複数の供給口を備えている場合には（図示せず）、薬剤供給部の各供給口とそれぞれ一体となって複数の流路を形成していてもよい。前者の場合、複数の細胞遊走空間１６に１回の薬剤供給で同一の濃度勾配を形成させることができるため、簡便、かつより定量的に遊走試験を解析することができる。後者の場合、１個の装置で異なる薬剤について試験を行うことができ、特に図１に示すように線状導電性領域ｂが電気的に導通されている場合には、電圧印加により同時に細胞遊走を開始させることができるため、異なる薬剤について、リアルタイムで細胞遊走の速度を比較することができる。
細胞遊走空間１６の形状は、直方体、正方形等が挙げられる。

本実施形態において、基材ｃや蓋部材ｄの寸法は特に制限されないが、例えば、基材ｃの寸法は、図１ｅのＸ方向が２０〜３０ｍｍ、Ｙ方向が２５〜７５ｍｍとすることができる。蓋部材ｄの寸法は、Ｘ方向が１８〜２８ｍｍ、Ｙ方向が２３〜７３ｍｍ、Ｚ方向が１０〜３０ｍｍとすることができる。また細胞遊走空間１６の寸法は、図１ｃのように複数の線状導電性領域ｂ上に一体に形成されている場合、Ｘ方向が１６〜２６ｍｍ、Ｙ方向が２１〜７１ｍｍ、Ｚ方向が０．０５〜２ｍｍとすることができ、図１ｄのように各線状導電性領域ｂを含むように複数形成されている場合、Ｘ方向が１６〜２６ｍｍ、Ｙ方向が１．２μｍ〜０．２ｍｍ（線状導電性領域よりやや広い幅）、Ｚ方向が０．０５〜２ｍｍとすることができる。

本実施形態において、基材表面に形成させる濃度勾配は、より定量的に解析を行う観点から、線状導電性領域ｂに沿って直線的な勾配であることが好ましい。

基材表面おける濃度勾配の方向は、線状導電性領域ｂの両端において濃度が異なるように基材表面に提供される限り特に制限されないが、より簡便かつ定量的に解析を行う観点から、細胞遊走路である線状導電性領域ｂに平行（図１ｄのＸ方向）に形成され、かつ線状導電性領域ｂに垂直な方向（図１ｄのＹ方向）には濃度勾配がないことが好ましい。

図２に本発明の装置の第二の実施形態が示されている。この実施形態における、装置の形状等の諸条件は、この節において特に規定していない限り、上記実施形態について述べた諸条件と同様である。

第二の実施形態に係る装置２０は、その表面に線状導電性領域ｂを有する基材ｃを備え、
線状導電性領域ｂは、その両端を含む領域が第１の細胞接着阻害性領域２１であり、第１の細胞接着阻害性領域２１の間が第１の細胞接着性領域２３であり、線状導電性領域ｂの周囲が第２の細胞接着阻害性領域２２であり、
線状導電性領域ｂは第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’に接触しており、
第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’は、線状導電性領域ｂの両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であり、
第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’は、線状導電性領域ｂ上の第１の第１の細胞接着性領域２３を挟んで対向して配置されており、
第１の細胞接着阻害性領域２１は、線状導電性領域ｂへの電圧印加によって、第２の細胞接着性領域に変化することが可能である。

本実施形態によれば、第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’の一方に高濃度の薬剤を導入し、他方に低濃度の薬剤または水を供給して基材表面に濃度勾配を形成させて、正負の走化性について試験を行うことができる。さらに、本実施形態によれば、第１の薬剤供給部２４および第２の薬剤供給部２４’に異なる薬剤を供給し、基材表面にそれぞれの濃度勾配を形成させて、正負の走化性について試験を行うことができる。例えば、両薬剤が促進剤である場合、第１の薬剤供給部２４から供給した薬剤のほうが促進剤としての作用が強い場合には、細胞は細胞遊走路上を第１の薬剤供給部２４が配置される方向に遊走し、第２の薬剤供給部２４’に供給した薬剤のほうが促進剤としての作用が強い場合には、細胞は細胞遊走路上を第２の薬剤供給部２４’が配置される方向に遊走する。このように、２種の薬剤が同時に存在する条件下での当該薬剤の促進剤または阻害剤としての作用の強弱を比較解析することができる。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。

［ＩＴＯの成膜］
ガラス基板（コーニング社製）を用意し、スパッタリングによりガラス基材上に１５００Åの厚さにＩＴＯ（酸化インジウム錫）を成膜した。フォトリソグラフィにより、幅１０μｍ、長さ５ｍｍの遊走路がピッチ３０μｍで９０本並ぶようにパターニングした。

［ＰＥＧコーティング］
パターニングされたＩＴＯ成膜ガラス基材上にあらかじめ加水分解されたエポキシシラン（ＧＥ東芝シリコーン製）をスピンコーティングで塗布した後、８０℃で１５分加熱し、純水で洗浄することによりシラン化合物を成膜した。このとき、ＩＴＯ成膜ガラス基材の接触角は、４０〜５５°であった。同基材上に触媒量の硫酸を添加したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としてＰＥＧ４００（シグマ・アルドリッチ）を浸漬法にて塗布し、１００℃で１時間加熱し、純水で洗浄することによりＰＥＧをコーティングした。この基材の接触角は２７〜３５°程度であった。

［フォトリソグラフィ条件］
ＰＥＧがコーティングされた基材上に、幅１０００μｍのライン状の開口部を有するパターンが形成されているフォトマスクを、ライン状の開口部が遊走路と直行するように配置し、プロキシミティ露光によりＶＵＶ（波長１７２ｎｍ）を照射してライン状の開口部にあたるＰＥＧを分解した。

［ディッシュ化条件］
上記のように作製した基材と、底面に１８ｍｍφの穴が空いている３５ｍｍφのポリスチレン製ディッシュとを接着剤にて接合させ、１日以上放置することで出ガスを抜き、ディッシュ化した。以上のようにしてディッシュを５つ作製した。

［培養条件］
作製されたディッシュそれぞれに２．０×１０⁵細胞／ｃｍ²となるようにマウス線維芽細胞を播種し、ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ溶液中で２４時間培養した。

［電圧印加条件］
細胞がライン状のパターンに接着していることを確認した後、導電性領域を正極、それに対向する側の導電性領域を負極につなぎ、２．０Ｖで１分間電圧を印加し、ＰＥＧを脱離した。

［薬剤添加条件］
電圧印加後、各ディッシュの培地を取り除き、薬剤としてＦＢＳの濃度が培地中０％、０．１％、１％、１０％、２０％のものを調整し、ディッシュごとに各濃度の培地に交換した。

［遊走観察］
ＣＣＤカメラにて５分間に一度細胞を撮影し、遊走路上における細胞の遊走方向の観察及び進行距離の定量化をした。電圧印加２４時間後に撮影した。

ａ：親水性膜
ｂ：線状導電性領域
ｂ’導電性基部
ｃ：基材
ｄ：蓋部材
ｅ:対向電極
１０、２０：細胞遊走試験用装置
１１、２１：第１の細胞接着阻害性領域
１２、２２：第２の細胞接着阻害性領域
１３、２３：第１の細胞接着性領域
１４：薬剤供給部
１５、２５：細胞導入部
１６、２６：細胞遊走空間
２４：第１の薬剤供給部
２４’：第２の薬剤供給部
３１、４１：薬剤供給部
３２、４２、５２：細胞接着性領域
５１：第１の薬剤供給部
５１’：第２の薬剤供給部
Ａ：細胞

Claims (5)

1. 細胞遊走試験用装置であって、
   その表面に線状導電性領域を有する基材を備え、
   線状導電性領域は、その両端を含む領域が第１の細胞接着阻害性領域であり、第１の細胞接着阻害性領域の間が第１の細胞接着性領域であり、線状導電性領域の周囲が第２の細胞接着阻害性領域であり、
   線状導電性領域は薬剤供給部に接触しており、
   薬剤供給部は、線状導電性領域の両端において濃度が異なるように基材表面に薬剤の濃度勾配を提供することが可能であり、
   第１の細胞接着阻害性領域は、線状導電性領域への電圧印加によって、第２の細胞接着性領域に変化することが可能である、上記装置。
2. 薬剤供給部が第１の薬剤供給部と第２の薬剤供給部とを備え、
   線状導電性領域が、第１の薬剤供給部および第２の薬剤供給部に接触しており、
   第１の薬剤供給部と第２の薬剤供給部が、線状導電性領域上の第１の細胞接着性領域を挟んで対向して配置されている、請求項１に記載の装置。
3. 複数の線状導電性領域が、各線状導電性領域に接続する基部とともに櫛形である、請求項１または２に記載の装置。
4. 細胞遊走試験方法であって、
   （ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞遊走試験用装置の基材上に細胞を播種して、第１の細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
   （ｂ）線状導電性領域に電圧を印加することによって第１の細胞接着阻害性領域を第２の細胞接着性領域に改変する工程、
   （ｃ）薬剤供給部に薬剤を供給して、基材表面に薬剤の濃度勾配を形成する工程、および
   （ｄ）第１の細胞接着性領域に接着した細胞の第２の細胞接着性領域における遊走を観察する工程
   を含む、上記方法。
5. 一定時間経過後、第２の細胞接着性領域における細胞の遊走距離を測定する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。

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