JP2005261285A - 細胞観察チップおよび細胞観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
透明性部材により形成しながらも、走化性観察に必要となる十分な反射光を得ることができる細胞観察チップ及び細胞観察装置を提供すること
【解決手段】
本発明にかかる走化性観察用チップ１は、透明性部材により形成され、少なくとも細胞が通過する流路が形成された観察面と、当該観察面と反対側の非観察面とを有する走化性観察用チップであって、前記観察面よりも前記非観察面側に、前記観察面側から入射する光を反射する反射面１０を設けたものである。反射面１０は、パッキン４と固定治具３との間に設けてもよい。
【選択図】 図１

Description

本発明は、いわゆる細胞走化性を観察するための細胞観察チップおよび細胞観察装置に関する。

走化性とは、走化性因子と呼ばれる化学物質の濃度勾配に応じて細胞が移動する性質のことである。この細胞の走化性を利用して治療薬の開発に応用しようとする動きがある。特に、この走化性を利用することによって、各種の炎症やアレルギー、ガンに対する治療薬の開発に新しいアプローチが見出せるのではないかと考えられており、走化性研究の重要性は増している。この走化性を観察するために、細胞観察チップを用いて走化性因子の挙動を観察することが提案されている（例えば、特許文献１、非特許文献１を参照）。

この走化性を観察するための細胞観察チップ（以下、走化性観察用チップ）は、走化性因子を充填する第１のウエルと、走化性を有する細胞等を充填する第２のウエルを有する。そして、これらのウエル間は流路によって連通されており、当該流路内には障壁によって隔てられた微細な通路を多数設けている。

図８（ａ）は、従来の走化性観察用チップの構成を説明するため図である。図８（ａ）は断面図及び下面図、図８（ｂ）は一部拡大下面図である。図において、１は走化性観察用チップ、５Ａおよび５Ｂは細胞又は走化性因子を充填する領域であるウエル、６はウエル間を連通する流路、７は流路に設けられた障壁、８Ａ乃至８Ｄは細胞あるいは走化性因子等の試料を注入・採取するための貫通穴である。

図８（ｂ）は、図８（ａ）に示した下面図中における流路６周辺を拡大した図である。ここで９は障壁７によって隔てられた微細な通路である。通路９の大きさは細胞の通常の大きさより多少小さく作れられており、走化性因子の濃度勾配ができると細胞は通路９を通って濃度の高い方へ移動するため、走化性の観察ができる。

従来の走化性観察用チップは、主にシリコンウエハ（単結晶シリコン）を異方性ドライエッチング等のマイクロマシニング技術を用いて加工する方法（例えば特許文献２を参照）や、シリコンゴムの一種であるＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane ：ポリジメチルシロキサン）を成形する方法によって製作されていた。これらの方法では、走化性観察用チップの加工コストが高価となることや、加工に要する工程数が多いために製造に時間がかり量産に適さないといった課題があった。
特開２００２−１５９２８７号公報 特開２００３−２１５２１０号公報 日経バイオビジネス２００１年１１月号、ｐ．４８−５０

そこで、走化性観察用チップの安価な生産及び量産化に適した製作方法として、透明性を有する樹脂（以下、単に透明性樹脂とする）によって走化性観察用チップを形成することが考えられる。

しかし、透明性樹脂によって構成した走化性観察用チップを用いて走化性観察を行うと、観察面側から照明光を当てても反射光による十分な明るさが得られずに流路部分が暗くなってしまうため、観察面側から流路内を移動する細胞の像が見え難い。この原因は、走化性観察用チップを構成する透明性樹脂と流路内の等張液の主成分である水との屈折率が近いために、入射した照明光が走化性観察用チップ壁面と充填された等張液等との境界面で反射されずに、走化性観察用チップ壁面を透過してしまう点にある。

本発明は透明性部材によって構成した細胞観察チップを使用する際の上記の問題を解決するためになされたものであり、透明性部材により形成しながらも、走化性観察に必要となる十分な反射光を得ることができる細胞観察チップ、及び、細胞観察チップを備えた細胞観察装置を提供することを目的とする。

本発明にかかる細胞観察チップは、透明性部材により形成され、少なくとも細胞が通過する流路が形成された観察面と、当該観察面と反対側の非観察面とを有する細胞観察チップであって、前記観察面よりも前記非観察面側に、前記観察面側から入射する光を反射する反射面を設けたものである。これにより、透明性部材で形成した細胞観察チップでも反射光による充分な明るさが得られるため、流路内の細胞の像をはっきりと観察することができる。

特に、反射面は、非観察面上に設けられていることが望ましい。これにより、反射面を容易に製造することができる。

反射面を細胞観察チップの内部に設けるようにしてもよい。これにより、反射面の損傷を防止できる。

また、反射面は、前記流路の非観察面側に設けられ、流路以外の領域の非観察面側には反射面を形成しない領域を有するようにしてもよい。これにより、反射面の面積を減少させることができ、コスト削減をもたらすことができる。

本発明にかかる細胞観察装置は、透明性部材により形成され、少なくとも細胞が通過する流路が形成された観察面と当該観察面と反対側の非観察面とを有する細胞観察チップと、前記細胞観察チップの観察面と接する透明性基板と、前記細胞観察チップと前記透明性基板とを固定する固定手段とを備えた細胞観察装置であって、前記観察面よりも前記非観察面側に、前記観察面側から入射する光を反射する反射面を設けたものである。これにより、透明性部材で形成した細胞観察チップでも反射光による充分な明るさが得られるため、流路内の細胞の像をはっきりと観察することができる。

ここで、前記固定手段は、固定治具と、当該細胞観察チップと固定治具との間に設けられたパッキンにより構成され、前記反射面は、前記細胞観察チップと前記パッキンとの間に設けるようにしてもよい。これにより、反射面は細胞観察チップと、比較的柔らかいパッキンとの間に介持されることになるから、反射面の損傷を防止できる。

また、前記固定手段は、固定治具と、当該細胞観察チップと固定治具との間に設けられた透明性を有するパッキンにより構成され、前記反射面は、前記固定治具と前記パッキンの間に設けるようにしてもよい。このような構成によっても、透明性部材で形成した細胞観察チップでも反射光による充分な明るさが得られるため、流路内の細胞の像をはっきりと観察することができる。

また、前記固定手段は、反射性を有する固定治具と、当該細胞観察チップと固定治具との間に設けられた透明性を有するパッキンにより構成され、前記反射面は、前記固定治具の面によって構成するようにしてもよい。これにより、部品点数が少なくすることができ、製造コストを低減できる。

本発明により、透明性部材で構成しながらも、走化性の観察に必要となる十分な反射光を得て流路内の細胞の像をはっきりと観察することができる細胞観察チップ及び細胞観察装置を提供することができる。

発明の実施の形態１．
以下では、本発明にかかる細胞走化性の観察に使用する細胞観察チップ（以下、走化性観察用チップ）について説明する。発明の実施の形態１として、流路等の微細構造を有した観察面側の表面とは反対の走化性観察用チップ表面に反射面を形成した形態を示す。図１に発明の実施の形態１に係る走化性観察用チップの構成を示す。

走化性観察用チップ１は、略透明なポリエステルエラストマー、ポリオレフィンエラストマー等のエラストマー系材料により構成されることが好ましい。これらの材料を用いて、例えば射出成形により製作すれば、流路部分の微細な加工も可能である。樹脂の射出成形による製法は、金型を製作すれば安価に大量生産することができるため、従来のシリコンウエハをマイクロマシニング技術によって加工する製法やＰＤＭＳを成形する製法に比べて、低コストかつ短時間で製作でき、量産に適している。

走化性観察用チップ１には、ウエル５Ａ、５Ｂが設けられている。この例では、ウエル５Ａ、５Ｂは、走化性観察用チップ１の観察面上の窪みとして形成されている。ウエル５Ａ、５Ｂは、当該走化性観察用チップ１と透明性基板（図示せず）とが密着された状態において、それぞれ２つの空間を形成し、当該空間に細胞又は走化性因子が充填される。この例にかかるウエル５Ａ、５Ｂは、走化性観察用チップ１の一方の面から約１００μｍ窪んで形成されている。尚、ウエル５Ａ、５Ｂの容積に特別な制限は無く、細胞、走化性因子等の試料を充填する際の必要最小限の容積を持てば良い。例えば、深さは１００μｍ程度、幅・奥行きはそれぞれ１〜２．５ｍｍ程度で良い。

ウエル５Ａとウエル５Ｂとの間には、両者を連通する流路６が設けられている。この流路６は、ウエル５Ａ、５Ｂよりも浅く形成されている。この例にかかる流路６は、走化性観察用チップ１の一方の面より約５μｍ窪んで形成されている。

流路６には複数の障壁７が設けられている。障壁７の高さ及び障壁７に挟まれた流路６の幅は、測定対象とする細胞の大きさに合わせて高さや幅を決定する。障壁７の高さや流路６の幅は、測定対象である細胞の通常の大きさより若干小さくする必要があり、通常は、障壁の高さ５μｍ程度、流路の幅２〜１０μｍ程度である。

ウエル５Ａ、５Ｂの底部には、走化性観察用チップ１の観察面と反対側の面である非観察面とを貫通する貫通穴８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄが設けられている。これらの貫通穴８Ａ乃至８Ｄは細胞あるいは走化性因子等の試料を注入・採取するための穴として用いられる。図に示す例では、４つの貫通穴８Ａ乃至８Ｄが設けられているが、２以上の任意の数の貫通穴であればよい。貫通穴８Ａ乃至８Ｄの断面形状・大きさは特に限定されるものではない。例えば、直径０．５ｍｍのマイクロシリンジを用いて試料の注入が可能であれば良い。このため、貫通穴８Ａ乃至８Ｄの断面形状が円形であれば直径１ｍｍ程度、正方形であれば一辺の長さは１ｍｍ程度が典型的である。

図１（ｂ）は、図１（ａ）に示した下面図中における流路６周辺を拡大した図である。図に示されるように、障壁７によって隔てられた微細な通路９が形成されている。通路９の大きさは細胞の通常の大きさより多少小さく作れられており、走化性因子の濃度勾配ができると細胞は通路９を通って濃度の高い方へ移動するため、走化性の観察ができる。

本発明の実施の形態１においては、図１（ａ）に示されるように、流路等の微細構造を有した観察面側の表面とは反対のチップ表面に反射面１０が形成されている。反射面１０の厚さは、入射した照明光を反射するために十分な厚さ以上であれば良い。

反射面１０の材質は、反射性に優れた材料であれば良く、アルミニウム、プラチナ、銀等の金属が適している。チップ表面への反射面１０の形成は、例えば、アルミニウム箔等の金属箔をチップ表面に貼り付けることにより行うことができる。さらには、金属箔や金属薄膜等を走化性観察用チップ１の表面に密着させても良いし、走化性観察用チップ表面にプラチナ等の金属蒸着膜を形成する、走化性観察用チップ表面に金属粉体塗装を施す等の方法によって形成しても良い。また、金属以外の反射率の高い物質からなるフィルム材等を走化性観察用チップ表面に密着あるいは貼り付けて形成しても良い。

なお、走化性観察用チップ１の表面に蒸着膜を形成する方法の場合は、走化性観察用チップ１の材料である樹脂と金属蒸着膜の線膨張係数が異なるため、走化性観察用チップ１を後述するパッキンや固定治具で固定してパッケージする際に蒸着膜の剥がれやひび割れが生じやすい。剥がれやひび割れが生じると照明光が透過してしまうために観察し難くなる。これに対して、金属箔や金属薄膜等を走化性観察用チップ１の表面に密着させる方法であれば、線膨張係数の違いによる剥がれ、ひび割れは原理的に発生せず、剥がれやひび割れによる観察上の不具合は生じない。

次に本発明の実施の形態１にかかる走化性観察用チップを備えた細胞観察装置（以下、走化性観察用装置）の構成について図２を用いて説明する。図２に示されるように、透明性基板２上に走化性観察用チップ１がその流路６等の微細構造を持つ面が接するようにして載置される。透明性基板２は、通常厚さ１ｍｍ程度のガラス板が用いられるが、ガラスに替えてＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）等の合成樹脂による略透明な基板、即ち透明性を有する基板を使用しても良い。

走化性観察用チップ１の反射面１０を設けた側には、パッキン４を介して固定治具３が設けられている。このパッキン４は走化性観察用チップ１が透明性基板２に対して均一の圧力により接するために設けられている。固定治具３は、例えば、合成樹脂やＳＵＳ（アルミニウム鋼材）等の金属により構成される。パッキン４は、例えばＰＤＭＳ等の合成樹脂により構成される。尚、本発明の実施の形態においては、固定治具３、パッキン４の材質に透明性は必要ない。貫通穴８Ａ乃至８Ｄは、細胞あるいは走化性因子等の試料を注入・採取できるよう、固定治具３およびパッキン４にも設けられている。

続いて、走化性観察用装置を用いて細胞の走化性を観察する手順を説明する。あらかじめ水または水を主成分とする等張液等を走化性観察用チップ１と透明性基板２によって挟まれたウエル５Ａ、ウエル５Ｂ及び流路６内に充填しておく。次いで、ウエル５Ａ及びウエル５Ｂのいずれか一方に細胞を充填し、他方に走化性因子を注入する。細胞および走化性因子の注入は貫通穴８Ａ乃至８Ｄを通じて行われる。走化性因子の濃度勾配が発生すると、走化性を有する細胞は流路６を通って走化性因子が充填されたウエル側へ移動する。

この流路６内を移動する細胞の像を、透明性基板２を介して外側の観察面から検出することにより、走化性の観察が可能となる。具体的には、観察面に設置した顕微鏡やビデオカメラ等の検出器１１によって移動する細胞を検出することになるが、この際には、細胞の像が十分に確認できる程度の明るさが必要となる。このため、図２に示すように観察面側に光源を設置して照明光を流路６付近に照射している。

ここで、本発明の原理について図３を用いて詳しく説明する。図３（ａ）および（ｂ）は、走化性観察用チップ１と透明性基板２に挟まれた通路９の部分を示している。図中の実線矢印は、照明光の経路を概念的に現したものである。

図３（ａ）は反射面１０を設けていない従来の走化性観測用チップ１における光の挙動を示す。図３（ａ）に示すように、通路９内が水または水を主成分とする等張液等で満たされている場合、観察面側に設置した光源からの照明光は、透明性基板２及び通路９内を通過した後に、走化性観察用チップ１との境界面においてもほとんど反射されることなくチップ内へ透過してしまう。これは、水と走化性観察用チップを構成する樹脂との屈折率が近いことに起因する。このため、走化性を観察するのに十分な明るさが得られない。

図３（ｂ）は本発明の実施の形態にかかる走化性観測用チップ１における光の挙動を示すものであり、この走化性観察用チップ１の裏面には反射面１０が設けられている。この場合、観察面から入射した照明光は、通路９から走化性観察用チップ１に透過した後に反射面１０によって十分に反射され、再び走化性観察用チップ１、通路９、透明性基板２を通って観察面側へ透過していく。この結果、反射面１０での反射光によって通路９内を照らし出すことができ、観察面側から走化性の観察を行うことが可能となる。

尚、上述の例では、反射面１０を走化性観察用チップ１に設けるものとして説明したが、パッキン４の表面にプラチナ等の金属蒸着膜を形成する、パッキン４の表面に塗装を施す等の方法によって形成しても良い。

発明の実施の形態２．
発明の実施の形態１では、走化性観察用チップ１の表面に反射面１０を設ける形態について説明したが、本発明の効果を得るためには反射面１０を走化性観察用チップのウエル、流路等の微細構造を有する表面より上方部に設けてあればよい。

本発明の実施の形態２では、走化性観察用チップ１の内部に反射面１０を設けている。図４に本発明の実施の形態２にかかる走化性観察用チップ１の断面図を示す。この例では、反射面１０は、貫通穴８Ａ乃至８Ｄよりも内側の領域、即ち流路６の上方部のみに設けられている。このような構成によっても、反射面１０での反射光によって流路６内を照らし出すことができ、観察面側から走化性の観察を行うことが可能となる。

また、本発明の実施の形態２にかかる走化性観察用チップ１の構成によれば、反射面１０が走化性観察用チップ１の内部に設けられているため、パッキン４や固定治具３等の他の部材との接触による破損の可能性が低い。特に、走化性観察用チップ１単独で取引される場合には、この効果は大きい。

尚、図４に示す例では、反射面１０は、貫通穴８Ａ乃至８Ｄよりも内側の領域のみに設けられているが、これに限らず、全体に亘って設けられていてもよい。

発明の実施の形態３．
発明の実施の形態１では、走化性観察用チップ１の表面全体に反射面１０を形成したが、本発明の実施の形態３では貫通穴８Ａ乃至８Ｄよりも内側の領域、即ち流路６の上方部のみに反射面１０を形成している。図５に本発明の実施の形態３にかかる走化性観察用チップ１の断面図を示す。このような構成によっても、反射面１０での反射光によって流路６内を照らし出すことができ、観察面側から走化性の観察を行うことが可能となる。

本発明の実施の形態３によれば、特に反射面１０の面積が少なくて済むため、コスト低減を図ることができる。

発明の実施の形態４．
本発明の実施の形態４にかかる走化性観察用装置の構成について図６に示す。本発明の実施の形態では、パッキン４と固定治具３の間に反射面１０を形成している。

本発明の実施の形態でのパッキン４には光を透過する性質が必要であるため、例えばＰＤＭＳにより構成される。反射面１０の材質は、発明の実施の形態１および発明の実施の形態２と同様に反射性に優れた材料であれば良く、アルミニウム、プラチナ、銀等の金属が適している。反射面１０は、例えば、アルミニウム箔等の金属箔、金属薄膜等をパッキンと固定治具の間に挟み込むことによって形成できる。金属以外の反射率の高い物質からなるフィルム材等をパッキン４と固定治具３の間に挟み込んで形成しても良い。その他に、パッキン４の表面あるいは固定治具３の表面にプラチナ等の金属蒸着膜を形成する、塗装を施す等の方法によって形成しても良い。その他の装置各部の材質及び構造は、発明の実施の形態１と同様であるため説明を省略する。

本発明の実施の形態にかかる走化性観察用装置１００を走化性観察に使用する際は、走化性観察用チップ１を透明性基板２に密着させた上にパッキン４を載置し、パッキン４と固定治具３の間に反射面となる金属箔等を挟み込んでから固定治具３で固定する。

本発明の実施の形態４では、観察面から透明性基板２を通じて入射した照明光が走化性観察用チップ１を透過するものの、パッキン４まで透過した後にパッキン４上部に設けた反射面１０で反射されて再び観察面側まで透過して戻ることにより、流路６内が反射光によって十分に照らし出されて流路６内の細胞の動きを観察することができる。
発明の実施の形態５．

本発明の実施の形態５にかかる走化性観察用装置の構成について図７に示す。本発明の実施の形態では、図のように固定治具３と反射面１０を一体化して形成している。

固定治具３と反射面１０の一体化は、固定治具３の材質として反射性に優れた材料を用いることによって実現できる。即ち、固定治具３は反射体である。例えば、固定治具３の材質としてアルミニウム等の反射率の高い金属材料を用いればよい。本発明の実施の形態でのパッキン４には光を透過する性質が必要とされ、例えばＰＤＭＳにより構成される。その他の装置各部の材質及び構造は、発明の実施の形態１と同様であるため説明を省略する。

本発明の実施の形態５にかかる走化性観察用装置を走化性観察に使用する際は、走化性観察用チップ１を透明性基板２に密着させた上にパッキン４を載置し、反射面と一体化した固定治具３で固定する。

本発明の実施の形態５では、透明性基板２から入射した光が、走化性観察用チップ１を透過するものの、パッキン４まで透過した後に固定治具３の表面で反射されて再び観察面側まで透過して戻る。これにより、流路６内が反射光によって十分に照らし出されて流路６内の細胞の動きを観察することができる。

本発明の実施の形態５においては、反射面１０を形成する独立部材が不要であるため、部品点数を減らすことができ、作業工程の簡略化や材料費の低減により製造コストを低減することが可能となる。

その他の実施の形態．
本発明の効果を得ることができる実施の形態は、上述した実施の形態に限られず、様々な変更が可能である。例えば、走化性観察用装置１００では、パッキン４を省略して直接固定治具３で固定する構成をとることもできる。この場合には、発明の実施の形態１あるいは発明の実施の形態４に示す構成を変更して、走化性観察用チップ１と固定治具３の間に反射面を設ければよいし、発明の実施の形態５に示す構成を変更して、反射性に優れた材質で構成した固定治具３を用いて直接走化性観察用チップ１を固定すれば良い。このような形態でも本発明の効果を奏することは明らかである。

さらに、上述した実施の形態で説明した走化性観察用チップにおけるウエルと流路の構造は例として挙げたものであり、これら以外にも様々な工夫による変形が考えられるが、本発明による効果は特定のウエルおよび流路の構造に限定されるものでないことは言うまでもない。

また、１対のウエルとこれらの間を連通する流路、および貫通穴によって走化性観察用チップの１ユニットが構成されるが、走化性観察の効率向上等のため、複数個のユニットを集積して１つの走化性観察用チップとしても良く、このような走化性観察用チップに対しても本発明は有効である。

本発明にかかる走化性観察用チップの構成図であり、（ａ）の上図は断面図、（ａ）の下図は下面図、（ｂ）は流路部分の拡大図である。 発明の実施の形態１にかかる走化性観察用チップを備えた走化性観察用装置の構成図である。 本発明の効果を示す概念図である。 発明の実施の形態２にかかる走化性観察用チップの構成図である。 発明の実施の形態３にかかる走化性観察用チップの構成図である。 発明の実施の形態４にかかる走化性観察用装置の構成図である。 発明の実施の形態５にかかる走化性観察用装置の構成図である。 従来の走化性観察用チップの構成図であり、（ａ）の上図は断面図、（ａ）の下図は下面図、（ｂ）は流路部分の拡大図である。

符号の説明

１ 走化性観察用チップ
２ 透明性基板
３ 固定治具
４ パッキン
６ 流路
１０ 反射面

Claims (8)

1. 透明性部材により形成され、少なくとも細胞が通過する流路が形成された観察面と、当該観察面と反対側の非観察面とを有する細胞観察チップであって、
   前記観察面よりも前記非観察面側に、前記観察面側から入射する光を反射する反射面を設けた細胞観察チップ。
2. 前記反射面は、前記非観察面上に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞観察チップ。
3. 前記反射面は、前記細胞観察チップの内部に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞観察チップ。
4. 前記反射面は、前記流路の非観察面側に設けられ、流路以外の領域の非観察面側には反射面を形成しない領域を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞観察チップ。
5. 透明性部材により形成され、少なくとも細胞が通過する流路が形成された観察面と当該観察面と反対側の非観察面とを有する細胞観察チップと、前記細胞観察チップの観察面と接する透明性基板と、前記細胞観察チップと前記透明性基板とを固定する固定手段とを備えた細胞観察装置であって、
   前記観察面よりも前記非観察面側に、前記観察面側から入射する光を反射する反射面を設けた細胞観察装置。
6. 前記固定手段は、固定治具と、当該細胞観察チップと固定治具との間に設けられたパッキンにより構成され、
   前記反射面は、前記細胞観察チップと前記パッキンとの間に設けられたことを特徴とする請求項５に記載の細胞観察装置。
7. 前記固定手段は、固定治具と、当該細胞観察チップと固定治具との間に設けられた透明性を有するパッキンにより構成され、
   前記反射面は、前記固定治具と前記パッキンの間に設けられたことを特徴とする請求項５に記載の細胞観察装置。
8. 前記固定手段は、反射性を有する固定治具と、当該細胞観察チップと固定治具との間に設けられた透明性を有するパッキンにより構成され、
   前記反射面は、前記固定治具の面によって構成されていることを特徴とする請求項５に記載の細胞観察装置。
   
   

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