JP2008197053A

JP2008197053A - 生体試料用の流路形成チップ及び生体試料用の流路形成チップの製造方法

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Publication number: JP2008197053A
Application number: JP2007034987A
Authority: JP
Inventors: Hisaaki Oguchi; 寿明小口
Original assignee: NSK Ltd
Current assignee: NSK Ltd
Priority date: 2007-02-15
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2008-08-28

Abstract

【課題】放射温度計のように測定対象物に応じて放射効率を補正することがなく、また、熱電対や白金測温抵抗体等のように高周波及び高電圧の影響を受けることがなく、高精度で温度の測定が可能な生体試料用の流路形成チップ、及び当該流路形成チップの製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】生体試料を流動させるための流路が表面に設けられた板状の基板と、前記流路内の前記生体試料に接触可能な反射膜と、前記反射膜に装着された蛍光体と、前記蛍光体に励起光を照射する光源と、前記励起光による前記蛍光体の発光強度の減衰特性から前記生体試料の温度を測定する測温部と、前記蛍光体に前記光源及び前記測温部を連結する光ファイバと、を有する蛍光式温度測定部材と、を備え、前記蛍光体は、前記光ファイバの端部と前記反射膜との間に介在している流路形成チップ。
【選択図】図１（ａ）

Description

本発明は、生体試料の温度を測定するための手段を備える生体試料用の流路形成チップ、その流路形成チップの製造方法に関する。

近年、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞といった種々の生体試料等に対する生化学的な分析操作は、流路形成チップを利用している。この流路形成チップはガラス、ポリマーからなる薄板状基板からなり、半導体集積回路に用いられる微細加工技術等を利用して、その基板表面に微細な流路が形成されている。そして、生体試料等の測定対象物を測定、分離等するために、流路形成チップの流路の両端に高電圧を印加することで形成された電気浸透流が利用される（電気泳動法）（例えば、特許文献１参照。）。

生化学的な分析操作を高い精度で行うためには、生体試料の温度管理を高精度で行うことが重要である。従来より、流路形成チップに用いられる温度測定手段としては、被測定物が放射する赤外線を検出する放射温度計（例えば、特許文献２参照。）や、2種類の異なる金属で閉回路を形成し、2箇所の接合点で温度差により生じる起電力(電圧)に基づき温度を測定する熱電対や、温度の変化を抵抗値若しくは定電流信号として取り出し、信号変換器により温度に換算して利用する白金測温抵抗体などが知られている（例えば、特許文献３参照）。
特開２００５−２８３１７３特開２００３−０４９８３２特開平１０−３０７０６５

ここで、生体試料の測定、分離等を高精度で行うためには、生体試料、もしくはその周囲の環境の温度を正確に測定し制御することが必要である。
ところが、測定対象物の材質や表面状態により赤外線の放射量に差異が生じる放射温度計を流路形成チップに適用した場合には、測定対象物の放射率を考慮して（すなわち放射量を補正して）、測定対象物の温度を算出する必要があり、その放射率を得るには手間がかかる。さらに、測定対象物以外から放射される赤外線をも区別されることなく放射量として測定してしまい、正確な温度測定が困難である。また、赤外線の波長サイズによっては、非常に高い温度分解能が要求され、正確な温度測定をするにはコストが嵩む恐れがある。

また、熱電対や白金測温抵抗体などの温度測定手段を、流路形成チップに適用した場合には、電気浸透流を形成するために高周波の高電圧を印加する場合があるので、電気的な信号に基づいて温度を測定する温度測定手段では、信号ノイズが生じる場合があり、高い精度で温度を測定することが難しい。

そこで、本発明は、放射温度計のように測定対象物に応じて放射効率を補正することがなく、また、熱電対や白金測温抵抗体等のように高周波及び高電圧の影響を受けることがなく、高精度で温度の測定が可能な生体試料用の流路形成チップ、及び当該流路形成チップの製造方法を提供することを目的とする。

発明者等が鋭意検討した結果、蛍光体式測温手段は、高周波で高電圧の環境下で使用しても、信号ノイズの影響を受けることが相対的に小さいので、安定して高精度で温度測定ができるということを知得した。なお、蛍光式温度測定手段は、生体試料に接触した蛍光体を、パルス状の励起光を照射することにより発光させ、蛍光体の発光強度の時間に関する減衰曲線が温度に応じて変化するという物理的原理を応用したものである。

上記課題を解決するための本発明の流路形成チップの第１の態様は、生体試料を流動させるための流路が表面に設けられた板状の基板と、前記流路内の前記生体試料に接触可能な反射膜と、前記反射膜に装着された蛍光体と、前記蛍光体に励起光を照射する光源と、前記励起光による前記蛍光体の発光強度の減衰特性から前記生体試料の温度を測定する測温部と、前記蛍光体に前記光源及び前記測温部を連結する光ファイバと、を有する蛍光式温度測定部材と、を備え、前記蛍光体は、前記光ファイバの端部と前記反射膜との間に介在している。

また、本発明の流路形成チップの第２の態様によれば、反射膜は、熱伝導体である。
さらに、本発明の流路形成チップの第３の態様によれば、前記反射膜は、反射率が相対的に高い、金属膜もしくは誘電体多層膜である。

本発明の流路形成チップの第４の態様によれば、前記蛍光式温度測定部材が、複数配置されている。
本発明の流路形成チップの第５の態様によれば、前記光ファイバの一端部には、前記反射膜および前記蛍光体を覆うようにキャップが装着されている。

さらに、本発明の流路形成チップの第６の態様によれば、前記流路の一端部と他端部それぞれに、前記生体試料を流動させるための電極が形成されている。
本発明の流路形成チップの第７の態様によれば、前記流路内で移動可能に配された検出媒体を備え、前記流路の途中には、前記検出媒体の移動を拘束する検出部が設けられている。

上記課題を解決するための本発明の生体試料用の流路形成チップの製造方法の第１の態様は、板状の基材と、蛍光式温度測定部材に連結可能な光ファイバと、を用意し、前記基板の表面の所定位置に前記光ファイバを固定し、前記基板の前記光ファイバが固定された面に光感応性樹脂を積層し、所定の流路パターンを有するマスクを介して前記光感応性樹脂に紫外線を照射し、前記光感応性樹脂を現像し、前記所定の流路パターンを有する流路を形成し、前記光ファイバの一端部は、前記流路を移動する前記生体試料に接するように前記流路に面するように配置される。

さらに、本発明の生体試料用の流路形成チップの製造方法の第２の態様によれば、前記流路の一端部と他端部それぞれ前記光感応性樹脂はポジ型又はネガ型である。
また、本発明の生体試料用の流路形成チップの製造方法の第３の態様によれば、前記基板に固定される前記光ファイバは複数である。

本発明によれば、蛍光式温度測定手段を用い、生体試料に接触する蛍光体にパルス上の励起光を照射することによる蛍光物質の光強度の減衰曲線を測定することにより、生体試料を測定するので、放射温度計と異なり放射効率を補正する必要もない。また、蛍光式温度測定手段は、高周波で高電圧の影響が非常に小さい。結果として、生体試料の温度を高精度で測定できる生体試料用の流路形成チップ、及び当該流路形成チップの製造方法を提供することができる。

以下、本発明の生体試料用の流路形成チップを適用した実施形態について図面を参照しつつ説明する。各図面中、同一要素は同一符号で示してある。

（実施形態１）
本発明の実施形態１である流路形成チップについて、図１、２を参照しつつ説明する。図１(ａ)は、流路形成チップの斜視図である。図１（ｂ）は図１（ａ）の流路形成チップの平面図である。図２は、蛍光性温度測定手段の構成図である。図２は、蛍光式温度測定部材の構成を模式的に示す図である。尚、図１（ａ）、（ｂ）は、構成を理解を容易にするため光ファイバが露出した状態で示している。同様に、図１（ｂ）から後述のＣＣＤカメラ２３を割愛した。

本実施形態の生体試料を検査するための流路形成チップ１は、ＤＮＡや細胞等の生体試料２５を流動させるための流路５が表面に設けられた板状の基板３と、蛍光式温度測定部材１３と、を備える。なお、基板３には、流路５と交差する方向に延びる生体試料を導入するための生体試料導入流路３９を設けているが、本発明の必須構成要件ではない。

蛍光式温度測定部材１３は、流路５内の生体試料２５の温度を伝達可能な熱伝導体である反射膜３１と、反射膜３１に装着された蛍光体２７と、蛍光体２７に励起光を照射する光源９と、励起光による蛍光体２７の発光強度の減衰時間から生体試料の温度を測定する測温部１９と、反射膜３１と光源９及び測温部１９とを連結する光ファイバ７と、を有する。さらに、蛍光体２７は、光ファイバ７の一端部７ｂと反射膜３１との間に介在している。すなわち、蛍光体２７は、光ファイバ７の一端部７ｂと反射膜３１とに挟まれた構成である。なお、光源９としては、青色ＬＥＤ等の公知の発光手段を用いるこができる。

さらに、光ファイバ７の一端部７ｂには、反射膜３１および蛍光体２７を覆うように、断面が略Ｕ字状のキャップ３３が装着されている。キャップ３３は、流路５の一方の壁面５ａの一部を構成している。従って、生体試料２５の温度は、キャップ３３、反射膜３１を介して蛍光体２７に伝達される。

なお、反射膜３１及び蛍光体２７が生体試料に直接接すると、生体試料の種類によっては、反射膜、蛍光体、生体試料の変質等を起こす場合がある。キャップ３３は、このような好ましくない影響を防止するために使用している部材であり、本発明の必須構成要素ではない。また、キャップ３３は、生体試料２５に直接接する部材であるので、生体試料２５の温度変化を忠実に反映するような熱伝達率の高い部材を使用することが望ましい。

また、光ファイバ７の一端部７ｂの垂直方向上方には、基板３を向いたＣＣＤカメラである撮像装置２３が配置され、流路形成チップ１を使用する者が流路５を移動する生体試料２５を観察できる構成となっている。

さらに、図２を参照して蛍光式温度測定部材１３について説明する。本実施形態の蛍光式温度測定部材１３は、上記したように、反射膜３１、蛍光体２７、光源９、測温部１９、光ファイバ７に加え、ビームスプリッタ２９と、フィルタ３５とを備える。ビームスプリッタ２９は、光源９からの励起光を９０度反射させて光ファイバ７に導波し、また、光ファイバ７を出射した蛍光体２７からの光線５３を透過させる部材である。また、フィルタ３５は、蛍光体２７からの光線５３のうち、所定波長の光を透過させる部材である。

また、測温部１９は、光検出部１５と温度検出部１７とを有する。光検出部１５は、フィルタ３５を透過した光を電荷に変換する光電変換部材であり、温度検出部１７は、光検出部１５で得られた電荷に基づいて算定された蛍光体の発光強度の減衰特性と、予め格納されている蛍光輝度の減衰特性とを比較して、温度を測定する部材である。

上記構成の蛍光式温度測定部材１３において、光源９から照射される励起光５１は、図２中の上下方向上方に進行する。さらに、ビームスプリッタ２９により励起光５１を９０度反射させ光ファイバ７内の端部７ａへ導入する。光ファイバ７内を進行する励起光５１は、光ファイバ蛍光体２７に到達し蛍光体２７が発光する。蛍光体２７から放出される放出光５３は、直接光ファイバ７の端部７ａ側に進行する光線と、反射膜３１で反射し光ファイバ７内を端部７ａ側に進行する光線から構成される。放出光５３は、光ファイバ７の端部７ａから出射し、ビームスピリッタ２９、フィルタ３５を透過し測温部１９内に入射する。上述のように測温部１９において蛍光体の発光強度の減衰に基づき生体試料の温度が計測される。

次に、光ファイバに蛍光体及び反射膜を形成する工程について図３を参照して説明する。図３（ａ）〜（ｃ）は、測温部１９に連結される測温光ファイバ７を作製する工程を示す横断面図である。図３（ａ）に示されるように、最初に、光ファイバ７の端面７ｂに蛍光体２７を作製する。蛍光体の作製は、例えば、蛍光体（微粒子）を樹脂に混入した材料を成膜したり、蛍光フィルムを貼り付けることにより行われる。次に、蛍光体２７の端面に反射率の高い、金属膜（Ａｕ、Ｐｔ、Ａｌ、等）または誘電体多層膜（ＴｉＯ_２（ｎ＝２．４）／ＳｉＯ_２（ｎ＝１．４６）による多層膜等）などの反射膜３１を真空蒸着等により形成する（図３（ｂ）参照）。最後に、光ファイバ７の端面７ｂ、蛍光体２７、反射膜３１を覆うようにキャップ３３を装着する。
さらに、流路形成チップの作製方法について図４を参照しつつ説明する。図４（ａ）〜（ｄ）は、流路形成チップ１を作製する工程を示す横断面図である。

まず、板状のガラス基材３ａを用意する。次に、図４（ａ）に示されるようにガラス基材３ａの上面の所定位置に光ファイバ７（図３参照。）を接着剤等により固定する。さらに、ガラス基材３ａの上面に、光ファイバ７を覆い、かつ、流路の流路壁を構成する流路構成部材３ｂを所定厚さで積層する。流路構成部材３ｂの材料としては、PMMA（ポリメチルメタクリレート：poly(methylmethacrylate)）、PDMS（ポリディメチルシロキサン：poly(dimethylsiloxane)）、ポリカーボネート、レジスト類などを主とした感光剤を含む部材である。このように、基板３は、それぞれ材質の異なるガラス基材３ａと流路構成部材３ｂから構成したが、基材と流路構成部材とを同じ材料としてもよいことは言うまでもない。なお、図１においては、構成の明瞭化のため、基材と流路構成部材とを同一の部材である基板として説明した。

次に、流路構成部材が感光性材料から形成されている場合、流路パターンが形成されたマスク３７を介して、流路構成部材３ｂに紫外線を照射し露光を行う（図３（ｃ）参照）。次は、露光された部分（ポジ型）または露光されなかった部分（ネガ型）を現像除去することにより流路５が形成される。もちろん、第１実施形態同様にポジ型の光感応性樹脂を用いてもよいことは言うでもない。なお、流路構成部材に感光性材料を用いない場合には、流路パターンを有する鋳型に樹脂材料を流し込み、樹脂材料を固化させた後、鋳型より引き剥がして流路を有する流路構成部材を得る。

上記構成の流路形成チップの使用方法について説明する。流路５、生体試料導入路３９の全体に緩衝液を満たす。その後、生体試料導入路３９の両端に電圧を印加し、生体試料導入路３９の一端から生体試料であるＤＮＡを導入すると、ＤＮＡで生体試料導入路が均一にみたされる。次に、印加電圧を切り替え、流路５に電圧をかけると、流路５と試料導入路３９の交差部に存在する一定量のＤＮＡが流路５へと移送される。

その一定量のＤＮＡが流路５内を移動し、光ファイバ７のキャップ３３の近傍を通過する際、光源９からのパルス状の励起光５１を照射する。励起光５１に励起された蛍光体２７が発した放射光５３は、ビームスプリッタ２９、フィルタ３５を経由して測温部１９に到達する。そして、測温部１９により、ＤＮＡの温度が算出される。

このように、電界によって生体試料を移動させる場合のように、高電圧、高周波が負荷される環境であっても、生体試料の測温を高精度でかつ簡易な構成において行うことができる。

なお、上記説明において、測温対象物はDNAであるが、RNA、タンパク質、ミトコンドリア等の細胞内器官、単一の細胞等でも本発明の蛍光式温度測定部材を有する流路形成チップを利用できることは言うまでもない。

上記実施形態では、単一の蛍光式光ファイバを流路形成チップに設ける構成としたが、本発明はこの構成に限定されるものではない。例えば、流路５に沿って、光ファイバを複数設置する構成とすることができる。この構成によれば、流路内を移動する生体試料の温度分布を検出することが可能となる。

（実施形態２）
本発明の蛍光式温度測定部材を備える流路形成チップの第２の実施形態について図５、６を参照しつつ説明する。本実施形態の流路形成チップは、生体試料中の所定の検出物を捕集するために使用される例である。図５は、流路形成チップ１０１の平面図である。図６は、図５の線ＶＩ−ＶＩに沿った流路形成チップの断面図である。図７は、検出部の拡大図である。

流路形成チップ１０１は、略矩形状の板状部材であり、ガラス製の基材１１１の表面に、膜状電極１１６が積層され、さらに、膜状電極１１６の上に光感応性樹脂層１１２が積層される。

膜状電極１１６は、外部電極に接続され、流路形成チップ１０１に投入される生体試料を移動させるため電界が形成される。なお、図５中において、膜状電極１１６がハッチングで示されている。また、破線のハッチングは、光感応性樹脂層１１２の下側に延在することを示し、実線のハッチングは、露出していることを示す。

本実施形態では、膜状電極１１６として、上側にＰｔを、下側にＴｉを配置する２層構造とした。Tｉにより、基材１１１との密着性を向上させることができ、Pｔを用いることで、生体試料が接触することによる電解腐食を防止するためである。

なお、膜状電極１１６の露出する表面については、Ａｕ、Ａｇ等の相対的に標準電極電位が高い材料とすることが電解腐食の観点から望ましい。
光感応性樹脂層１１２の表面には、流路パターンを有するマスクを介して紫外光を照射し、現像液で未硬化部分を溶解、除去すること（ネガ型）で、所定深さの凹溝１０２が形成される。なお、凹溝１０２は、４つであり、それぞれ同一形状、同一寸法である。

凹溝１０２は、生体試料投入槽１３１、廃液槽１３２、及び流路１０５から構成されている。また、凹溝１０２は、図５において上下対称である。すなわち、一対の略三角形状の溝を連結した形状である。図中において上側の略三角形状の部分が、試料投入槽１３１となり、連結部が流路１０５となる。また、流路１０５の延在方向のほぼ中央部には、検出部１３４が形成されている。

試料投入槽１３１及び廃液槽１３２は、生体試料を投入又は回収するためのものである。膜状電極１１６が試料投入槽１３１及び廃液槽１３２に延在し、それぞれ外部からの陽極または陰極が接続されている。よって、陽極電極に電圧を印加すると、電気浸透流が発生し、流路１０５内を、生体試料が試料投入槽１３１から廃液槽１３２、もしくは廃液槽１３２から試料投入槽１３１へと流れる。

流路１０５のほぼ中央部には、検出部１３４及び検出媒体であるシリカビーズ１３５が配置されている。流路幅及び流路深さは、生体試料に含まれる検出対象物質及びシリカビーズ１３５が通過できるようにシリカビーズの直径より大きく寸法付けられ、検出部１３４の流路幅及び流路深さはシリカビーズ１３５の直径より小さく寸法付けられている。よって、シリカビーズ１３５は、検出部１３４に引っ掛かる構成である。なお、流路１０５の、検出部１３４を除いた部分においても、シリカビーズが２個同時に通過できないように寸法づけされている。

シリカビーズ１３５は、例えばＳｉＯ_２（シリカ）を主成分とする材料からなり、その表面に無数の細孔が設けられた球形状である。このシリカビーズ１３５の細孔に目的とする分子を吸着する。さらに、検出対象物を特定するために、タンパク分子等に反応する酵素等をプローブとして細孔に装着してもよい。

さらに、図３に示した光ファイバ７と同様の光ファイバ１０７の一端部が各検出部１３４の近傍で流路１０５に面して配置されている。なお、各流路１０５には、それぞれ光ファイバ１０７が設けられている。また、光ファイバ１０７の他端部は、流路形成チップ１０１の外部で蛍光式温度測定部材１１３の本体部１１４に連結されている。本体部１１４は、図２に示した構成と同様の、光検出部、温度検出部、光源、ビームスピリッタ、フィルタを備えている。

上記構成の蛍光式温度測定部材１１３を備える流路形成チップ１０１の動作は以下のようになされる。例えばＤＮＡ断片を試料投入槽１３１に投入する。膜状電極１１６の試料投入槽１３１側を陽極、廃液槽１３２側を陰極とし電圧を印加すると、試料投入槽１３１側から廃液槽１３２側への電気浸透流が形成される。ＤＮＡ断片が試料投入槽１３１から廃液槽１３２方向へ移動する。ＤＮＡ断片は検出部１３４を通過する際に所定のＤＮＡがシリカビーズ１３５に吸着される。

上記検出作業の温度管理は、以下のように行われ、光ファイバ１０７を介して光源から励起光を照射し、蛍光体に到達する。そして蛍光式温度測定部材１１３の本体１１４において蛍光体からの放射光の光強度の減衰曲線を検出して検出部１３４近傍の温度を計測することができる。このように、温度測定は、実施形態１の構成と同様の方法で行われ、検出作業における温度管理を高精度で行うことができる。

なお、電気浸透流の流れ方向を廃液槽１３２側から試料投入槽１３１側へとしてもよいことは言うまでもない。但し、その場合には、シリカビーズを検出部において廃液槽側で引っ掛かるように配置することが必要である。
蛍光式光ファイバを各流路に一つづつ配置したが、流路に沿って複数配置したり、試料投入槽や廃液槽に設けてもよいことは言うまでもない。

上記実施形態１、２では、表面に流路が露出した流路形成チップを用いたが、薄板状の部材を流路形成チップの流路が形成されている表面に貼付し、薄板状の部材に、生体試料を投入するための流路に連通する穴を設けた構成の部材としてもよいことは言うまでもない。

なお、上記実施形態１、２の流路形成チップにおいて、電気浸透流を用いて生体試料を流路で移動させる構成としたが、流路の両端に電圧をかけて、負電荷を帯びている生体試料を移動させる構成であってもよい。

この発明は、その本質的特性から逸脱することなく数多くの形式のものとして具体化することができる。よって、上述した実施形態は専ら説明上のものであり、本発明を制限するものではないことは言うまでもない。

流路形成チップの斜視図である。（ａ）の流路形成チップの平面図である。蛍光性温度測定部材の構成図である。（ａ）〜（ｃ）は、光ファイバを形成する工程を示す横断面図である。（ａ）〜（ｄ）は、流路形成チップを作製する工程を示す横断面図である。実施形態２に係る流路形成チップの平面図である。図５の線ＶＩ−ＶＩに沿った流路形成チップの縦方向断面図である。検出部の拡大図である。

符号の説明

１生体試料用の流路形成チップ
３基板
５流路
７光ファイバ
９光源
１３蛍光式温度測定手段
１４測温装置本体
１５光検出部
１７温度検出部
２３ＣＣＤカメラ
２５生体試料
２７蛍光体
３１反射膜

Claims

生体試料用の流路形成チップであって、
生体試料を流動させるための流路が表面に設けられた板状の基板と、
前記流路内の前記生体試料に接触可能な反射膜と、前記反射膜に装着された蛍光体と、前記蛍光体に励起光を照射する光源と、前記励起光による前記蛍光体の発光強度の減衰特性から前記生体試料の温度を測定する測温部と、前記蛍光体に前記光源及び前記測温部を連結する光ファイバと、を有する蛍光式温度測定部材と、を備え、
前記蛍光体は、前記光ファイバの端部と前記反射膜との間に介在している流路形成チップ。
反射膜は、熱伝導体である請求項１に記載の生体試料用の流路形成チップ。
前記反射膜は、反射率が相対的に高い、金属膜もしくは誘電体多層膜である請求項１又は２に記載の生体試料用の流路形成チップ。
前記蛍光式温度測定部材が、複数配置されている請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体試料用の流路形成チップ。
前記光ファイバの一端部には、前記反射膜および前記蛍光体を覆うようにキャップが装着されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体試料用の流路形成チップ。
前記流路の一端部と他端部それぞれに、前記生体試料を流動させるための電極が形成されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体試料用の流路形成チップ。
さらに、前記流路内で移動可能に配された検出媒体を備え、前記流路の途中には、前記検出媒体の移動を拘束する検出部が設けられている請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体試料用の流路形成チップ。
生体試料用の流路形成チップの製造方法であって、
板状の基材と、蛍光式温度測定部材に連結可能な光ファイバと、を用意し、
前記基板の表面の所定位置に前記光ファイバを固定し、
前記基板の前記光ファイバが固定された面に光感応性樹脂を積層し、
所定の流路パターンを有するマスクを介して前記光感応性樹脂に紫外線を照射し、
前記光感応性樹脂を現像し、前記所定の流路パターンを有する流路を形成し、
前記光ファイバの一端部は、前記流路を移動する前記生体試料に接するように前記流路に面するように配置される流路形成チップの製造方法。
前記光感応性樹脂はポジ型又はネガ型である請求項８に記載の流路形成チップの製造方法。
前記基板に固定される前記光ファイバは複数である請求項８又は９に記載の流路形成チップの製造方法。