JP2011072246A - ヒト型Fcレセプター発現酵母、およびそれを用いたヒト型Fcレセプターの製造方法 - Google Patents
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【解決手段】 可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミド、前記プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIを発現可能な酵母、および前記酵母を用いたヒト型FcレセプターFcγRIの製造方法により、前記課題を解決することができた。
【選択図】 図8
Description
(1)可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIを発現可能な酵母。
(1)ヒト型FcレセプターFcγRIの細胞外領域(配列番号1の1番目のアミノ酸であるメチオニン(Met)から289番目のバリン(Val))のC末端側に6個のヒスチジン(以下6Hisと表記)を付加したFcγRIをコードするDNAをPCR(Polymerase Chain Reaction)法で増幅し取得した。なお、ヒト型FcγRIをコードするDNAの鋳型としてHuman cDNA clone TC119841プラスミドベクター(Origene社製)を用い、増幅用オリゴヌクレオチドとして配列番号2(3’末端側19塩基は配列番号1の1から19番目の塩基に相当)および配列番号3(3’末端側20塩基は配列番号1の848から867番目の塩基の相補鎖に相当)のオリゴヌクレオチドを用いた。また、PCR反応液の組成は表1に示す組成からなり、PCR反応は98℃・10秒、55℃・10秒、72℃・45秒を30サイクルで行なった。本実施例で増幅したポリヌクレオチドを以下hFcR−6Hisとする。
(3)50μg/mLの抗生物質(カルベシニリン)を添加したLBプレート培地(0.5% Yeast Extract、1% NaCl、1% Bacto Tryptone、2% アガロース)を用いて大腸菌JM109株の形質転換体を選択し、選択したうちの任意の形質転換体を50μg/mLの抗生物質(カルベシニリン)を含むLB液体培地(0.5% Yeast Extract、1% NaCl、1% Bacto Tryptone)を用いて37℃で一晩培養した。
(4)(3)の培養液をQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)を用いてプラスミドを抽出した。本実施例で取得した、ヒトFcγRIの細胞外領域をクローニングしたプラスミドを以下pAUR224−hFcRとする(図2)。
pAUR224プラスミドに挿入したhFcR−6Hisの塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくBig Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit(PEアプライドバイオシステム社製)を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動DNAシークエンサーABI Prism 310 DNA analyzer(PEアプライドバイオシステム社製)で解析した。なお、シークエンス用プライマーとして配列番号4および5に示すオリゴヌクレオチドを使用した。解析の結果、pAUR224プラスミドに挿入したhFcR−6Hisの塩基配列は設計通りであることを確認した。
(1)図2に示したpAUR224−hFcRを用いてFrozen−EZ Yeast Transformation II Kit(ZYMO Research社製)を用いた酢酸リチウム法でポンベ(Schizosaccharomyces pombe JY−745株)を形質転換後、0.5μg/mLのAureobasidin A(タカラバイオ社製)を含んだYPDプレート選択培地(1% Yeast Extract、2% D−Glucose、2% Bacto Peptone、2% アガロース)で選択した(30℃、3日)。
(2)(1)で選択した形質転換ポンベのうち、任意の4クローンを0.5μg/mLのAureobasidin A(タカラバイオ社製)を含んだYPD液体培地(1% Yeast Extract、2% D−Glucose、2% Bacto Peptone)にて30℃で振とうすることで前培養した。
(3)500mLのバッフルフラスコに1μg/mLのAureobasidin Aを含んだ200mLのYPD液体培地(1% Yeast Extract、2% D−Glucose、2% Bacto Peptone)にて30℃で振とうすることで本培養を行ない、増殖した形質転換ポンベを遠心分離により回収した。
(4)形質転換ポンベを50mM Tris−HCl緩衝液に懸濁後、ガラスビーズおよび/またはY−PER Plus(タカラバイオ社製)で破砕し内容物を抽出した。
(5)あらかじめ150mM NaClと10% グリセリンを含んだ20mM Tris−HCl緩衝液(以下、Buffer Aと表記)で平衡化したHis−Tagカラム(His−Bind Resin、Novagen社製)に、20mMとなるようにイミダゾールを加えた(4)の抽出物をアプライし、Buffer Aで洗浄を行なった。その後、500mM イミダゾールを含んだBuffer Aで溶出した。
(6)以下に示す方法で、ELISA(Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)法による検出を行なった。
(6−1)ヒトイムノグロブリン(以下ヒトIgGと表記)(化血研ガンマグロブリン、化学及血清療法研究所社製)を10μg/mLとなるよう、50mM Tris−HCl緩衝液で希釈後、96穴イムノプレート(マキシソープ、Nunc社製)に100μL/ウェルで添加し、4℃で一晩放置した。
(6−2)プレートウォッシャー(AMW−192、BioTec社製)を用いて、350μL/ウェルの洗浄液(150mM NaClを含んだ10mM Tris−HCl緩衝液)で4回洗浄後、Starting block(Thermo社製)を200μL/wellで添加し、30℃で2時間反応した。
(6−3)プレートウォッシャー(AMW−192、BioTec社製)を用いて、350μL/ウェルの洗浄液(150mM NaClと0.05% Tween 20を含んだ10mM Tris−HCl緩衝液(以下TBSTバッファーと表記))で4回洗浄後、(5)で精製したポンベ抽出物を100μL/ウェルで添加し、30℃で1時間インキュベートした。
(6−4)プレートウォッシャー(AMW−192、BioTec社製)を用いて、350μL/ウェルのTBSTバッファーで4回洗浄後、50mM Tris−HCl緩衝液に104倍希釈のAnti−6His−HRP抗体(BETHYL社製)を100μL/ウェルで添加し、30℃で1時間反応した。
(6−5)再度プレートウォッシャー(AMW−192、BioTec社製)を用いて、350μL/ウェルのTBSTバッファーで4回洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL社製)を50μL/ウェルで加え室温で数分放置後、1M リン酸溶液を50μL/ウェルで加え、吸光度(O.D.450nm)をプレートリーダー(Infinite M200、TECAN社製)で測定した。
図3に示したヒト型FcγRI活性が、ヒト型FcγRIとヒトIgGとの結合によるものであることを確認するために、前述したELISA法にてヒトIgGの希釈によるヒトIgGへの濃度依存的な結合を調べた。
実施例3で得られた形質転換ポンベにより得られたヒト型FcγRIのヒトIgGサブクラスに対する反応性を確認した。
ポンベ内で機能し、かつ異種タンパク発現の実績のあるP−factor前躯体、およびインベルターゼのシグナル配列をpAUR224−hFcRに組み込み、ヒト型FcγRIの発現量が向上するか検討した。
(1)配列番号6(GenBank No.NP_588038の1から57番目のアミノ酸に相当)に示すアミノ酸配列からなるP−factor前躯体シグナルをコードするDNAを、DNAWorks法(非特許文献8)により作製した。当該方法は、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、PCR(Polymerase Chain Reaction)法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。
(1−1)下記に示すオリゴヌクレオチド(配列番号14から21)を用いて表2の組成からなる反応液を調製し、PCR法(95℃・30秒、62℃・30秒、72℃・30秒を25サイクル)によりポリヌクレオチドを増幅した。
配列番号14:GenBank No.NM_001023030の1から38番
目の塩基に相当
配列番号15:GenBank No.NM_001023030の18から53
番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号16:GenBank No.NM_001023030の39から77
番目の塩基に相当
配列番号17:GenBank No.NM_001023030の62から98
番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号18:GenBank No.NM_001023030の78から11
6番目の塩基に相当
配列番号19:GenBank No.NM_001023030の99から13
7番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号20:GenBank No.NM_001023030の117から1
56番目の塩基に相当
配列番号21:GenBank No.NM_001023030の138から1
71番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号22:3’末端側14塩基がGenBank No.NM_001023
030の1から14番目の配列に相当
配列番号23:3’末端側20塩基がGenBank No.NM_001023
030の152から171番目の配列の相補鎖に相当
(2−1)配列番号8から11からなるオリゴヌクレオチドを用いて表4の組成からなる反応液を調製し、PCR法(95℃・30秒、62℃・30秒、72℃・30秒を25サイクル)によりポリヌクレオチドを増幅した。
(4)pAUR224−hFcR(図2)を制限酵素(XhoI/SalI、タカラバイオ社製)で消化し、PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製した。制限消化したプラスミドベクターはAlkaline Phosphatase(Calf intestine、タカラバイオ社製)で脱リン酸化処理(37℃で1時間)後、PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製した。
(5)(3)で調製したP−factor前躯体シグナル配列をコードするポリヌクレオチドまたはインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドと、(4)で調製したpAUR224−hFcRとをDNA Ligation kit Mighty mix(タカラバイオ社製)を用いてそれぞれライゲーションを行ない、ヒートショック法で大腸菌JM109株(ECOS Competent E.coli JM109、ニッポンジーン社製)を形質転換後、50μg/mLの抗生物質(カルベシニリン)を添加したLB寒天培地により大腸菌JM109株の形質転換体を選択した。
pAUR224−hFcRプラスミドに挿入したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの配列を、実施例2と同様な方法で解析した。解析の結果、pAUR224−hFcRプラスミドベクターに挿入したP−factor前躯体シグナルをコードするDNAおよびインベルターゼシグナル遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。
(1)pAUR224−P−hFcR(図6)またはpAUR224−I−hFcR(図7)を用いてFrozen−EZ Yeast Transformation II Kit(ZYMO Research社製)を用いた酢酸リチウム法でポンベ(JY−745株)を形質転換後、0.2μg/mLのAureobasidin A(タカラバイオ社製)を含んだYPDプレート選択培地(1% Yeast Extract、2% D−Glucose、2% Bacto Peptone、2%アガロース)で選択した。
(2)コロニーを形成した形質転換ポンベの任意のクローンを選択して、0.5μg/mLのAureobasidin Aを含んだ2mLのYPD液体培地(1% Yeast Extract、2% D−Glucose、2% Bacto Peptone)で前培養を行なった。
(3)100mLのバッフルフラスコに0.5μg/mLのAureobasidin Aを含んだYPD(1% Yeast Extract、2% D−Glucose、2% Bacto Peptone)液体培地20mLに植菌し、30℃で培養した。
(4)培養後、遠心分離により得た培養上清に20mMとなるようにイミダゾールを加え、あらかじめBuffer Aで平衡化しておいたHisTagカラム(His−Bind Resin、Novagen社製)に培養上清をアプライした。Buffer Aで洗浄後、500mM イミダゾールを含んだBuffer Aで溶出した。
Claims (6)
- 可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIを発現可能な酵母。
- 可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち1番目のメチオニン(Met)から289番目のバリン(Val)までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項1に記載の酵母。
- 発現プラスミドが、配列番号7に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項1または2に記載の酵母。
- 酵母がSchizosaccharomyces pombeである、請求項1から3のいずれかに記載の酵母。
- 請求項1から4のいずれかに記載の酵母を用いた、ヒト型FcレセプターFcγRIの製造方法。
- 可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチド、および配列番号7に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含んだ、ヒト型FcレセプターFcγRIを酵母で発現させるためのプラスミド。
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ANTJE PAETZ ET AL.: "Recombinant soluble human Fcγ receptor I with picomolar affinity for immunoglobulin G", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 338, JPN6014004693, 2005, pages 1811 - 1817, ISSN: 0002831084 * |
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