CN116133685A - 包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc区变体 - Google Patents

包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc区变体 Download PDF

Info

Publication number
CN116133685A
CN116133685A CN202180059384.2A CN202180059384A CN116133685A CN 116133685 A CN116133685 A CN 116133685A CN 202180059384 A CN202180059384 A CN 202180059384A CN 116133685 A CN116133685 A CN 116133685A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutation
substitution
variant
mutations
phe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180059384.2A
Other languages
English (en)
Inventor
G·德斯贾丁斯
E·埃斯科巴-卡布雷拉
A·萨米奥塔基斯
G·C·琼斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yeast Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Yeast Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeast Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Yeast Biopharmaceutical Co ltd
Publication of CN116133685A publication Critical patent/CN116133685A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

描述了Fc变体，其包含一个或多个氨基酸突变，与不包含所述一个或多个氨基酸突变的亲本Fc相比，所述突变增加了所述Fc变体的稳定性，并且描述了包含Fc变体的多肽和编码Fc变体的多核苷酸。

Description

包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc区变体
技术领域
本公开涉及免疫球蛋白领域，特别是涉及包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc变体。
背景技术
基于免疫球蛋白的药物正在成为一种日益重要的治疗方法，在过去的25年中，单克隆抗体已被鉴定为各种疾病的主要治疗方式。
已有大量研究针对工程化免疫球蛋白以改善各种功能。例如，已经对抗体Fc区进行了修饰，以改善药代动力学、增强或降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性、增强或降低对特定Fcγ受体或FcRn受体的选择性或者改善双特异性抗体中异源二聚体Fc区的形成。然而，此类修饰可能对抗体的其他特性(包括热稳定性)产生不利影响。
改善工程化抗体的稳定性的工作包括引入提供新的二硫键的突变(Gong等人,2009,J Biol Chem,284(21):14203-14210；Jacobsen等人,2017,J Biol Chem,292(5):1865-1875)和引入点突变的组合(国际专利申请公开号WO 2012/032080)。还描述了用于通过向抗体Fc区的环区引入各种氨基酸取代来改善抗体Fc区的稳定性的方法(美国专利申请公开号2015/0210763)。
提供此背景信息的目的在于使申请人相信的已知信息成为与本公开可能相关的信息。不必承认，也不应理解为任何前述信息都构成针对要求保护的发明的现有技术。
发明内容
本文描述了包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc区变体。本公开的一个方面涉及一种Fc变体，其包含一个或多个稳定性增强氨基酸突变，所述突变选自：250位处的突变，其中所述突变是250位的氨基酸被Ala、Ile或Val取代；287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代；428位的突变，其中所述突变是428位的氨基酸被Phe取代；以及242位和336位的一对突变，其中两个突变都是用Cys进行的取代，其中所述Fc变体的CH2结构域解链温度(Tm)相比于不包含所述一个或多个稳定性增强氨基酸突变的亲本Fc增加。
本公开的另一个方面涉及一种Fc变体，其包含一至三个稳定性增强氨基酸突变，所述突变包括：(a)一个或多个突变，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；以及309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；或(b)两个或更多个突变，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代；或(c)三个或更多个突变，所述突变包括：242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代，其中所述Fc变体的CH2结构域解链温度(Tm)相比于不包含所述一个或多个稳定性增强氨基酸突变的亲本Fc增加。
本公开的另一方面涉及一种多肽，其包含如本文所述的Fc变体和一个或多个融合或共价连接至所述Fc变体的蛋白质部分。
本公开的另一方面涉及一种多核苷酸或多核苷酸组，所述多核苷酸编码如本文所述的Fc变体。
本公开的另一方面涉及一种多核苷酸或多核苷酸组，所述多核苷酸编码包含如本文所述的Fc变体和一个或多个融合或共价连接至所述Fc变体的蛋白质部分的多肽。
本公开的另一方面涉及一种载体或载体组，所述载体包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码如本文所述的Fc变体。
本公开的另一方面涉及一种载体或载体组，所述载体包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码包含如本文所述的Fc变体和一个或多个融合或共价连接至所述Fc变体的蛋白质部分的多肽。
本公开的另一方面涉及一种宿主细胞，其包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码如本文所述的Fc变体。
本公开的另一方面涉及一种宿主细胞，其包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码包含如本文所述的Fc变体和一个或多个融合或共价连接至所述Fc变体的蛋白质部分的多肽。
本公开的另一方面涉及一种制备如本文所述的Fc变体的方法，所述方法包括用一个或多个编码所述Fc变体的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适合表达所述Fc变体的条件下培养所述宿主细胞。
本公开的另一方面涉及一种制备包含如本文所述的Fc变体和一个或多个融合或共价连接至所述Fc变体的蛋白质部分的多肽的方法，所述方法包括用一个或多个编码所述多肽的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适合表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞。
本公开的另一方面涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的Fc变体。
本公开的另一方面涉及一种药物组合物，其包含有包含如本文所述的Fc变体和一个或多个融合或共价连接至所述Fc变体的蛋白质部分的多肽。
本公开的另一方面涉及一种增加Fc的CH2结构域解链温度(Tm)的方法，其包括将一个或多个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc中以提供CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加的Fc变体，所述突变选自：250位的突变，其中所述突变是250位的氨基酸被Ala、Ile或Val取代；287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代；428位的突变，其中所述突变是428位的氨基酸被Phe取代；以及242位和336位的一对突变，其中两个突变都是用Cys进行的取代。
本公开的另一方面涉及一种增加Fc的CH2结构域解链温度(Tm)的方法，其包括将一至三个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc中以提供CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加的Fc变体，所述突变包括：(a)一个或多个突变，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；以及309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；或(b)两个或更多个突变，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代；或(c)三个或更多个突变，所述突变包括：242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
附图说明
图1提供(A)IgG1 Fc区序列的序列[SEQ ID NO:1]，和(B)IgG1Fc区(PDB ID:4BSV)的结构图，其示出了示例性稳定性增强设计T250V、A287F和M428F的位置。
图2示出了CH2结构域解链温度(Tm)由于将示例性稳定性增强突变引入各种Fc支架而得到的改善，(A)支架3，其包含促进异源二聚体Fc形成的非对称突变；(B)支架6，其包含N297A突变；和(C)支架7，其包含S239D/I332E突变。支架1是同源二聚体IgG1 Fc。
图3示出了(A)IgA、IgD和IgG的CH2结构域与IgE和IgM的CH3结构域的序列比对，和(B)IgA、IgD和IgG的CH3结构域与IgE和IgM的CH4结构域的序列比对。与IgG1 T250、A287和M428等效的位置被框出。
图4示出了在40℃、酸性或中性条件下孵育2周诱导的聚集与具有和不具有稳定性增强突变T250V/A287F的抗体变体的CH2结构域的热稳定性之间的相关性，(A)标准刻度x轴，在弱酸性条件下孵育，(B)标准刻度x轴，在中性条件下孵育，和(C)对数刻度x轴，在弱酸性条件下孵育，以及(D)对数刻度x轴，在中性条件下孵育。在研究中示出聚集变化小或未示出负的聚集变化的变体被省略。亲本序列(未稳定化)由圆圈表示，稳定化变体由正方形表示，每个未稳定化变体和对应的稳定化变体由箭头连接。
具体实施方式
本文描述了Fc变体，其包含一个或多个氨基酸突变，与不包含一个或多个氨基酸突变的亲本Fc相比，所述突变增加了Fc变体的稳定性。这些突变在本文中称为“稳定性增强氨基酸突变”或“稳定性增强突变”。
在某些实施方案中，Fc变体所包含的一个或多个稳定性增强氨基酸突变选自：
250位的突变，其中所述突变是250位的氨基酸被Ala、Ile或Val取代；
287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；
308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；
309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代；
428位的突变，其中所述突变是428位的氨基酸被Phe取代；以及
242位的突变和336位的突变，其中两个突变都是用Cys进行的取代。
本公开的某些实施方案涉及多肽，其包含如本文所述的Fc变体。此类多肽的实例包括但不限于抗体、抗体片段和Fc融合蛋白。包含如本文所述的Fc变体的多肽可以用作治疗剂、诊断剂或研究工具。
本公开的某些实施方案涉及编码本文所述的Fc变体的多核苷酸和编码包含Fc变体的多肽的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的宿主细胞和使用所述多核苷酸和宿主细胞制备Fc变体或包含Fc变体的多肽的方法。
本公开的某些实施方案涉及通过将本文所述的一个或多个稳定性增强突变引入Fc来稳定Fc(亲本Fc)的方法。本公开的一些实施方案涉及通过将本文所述的一个或多个稳定性增强突变引入Fc来升高Fc(亲本Fc)的CH2结构域解链温度(Tm)的方法。亲本Fc可以是野生型Fc，或者它本身可以是已经包含一个或多个例如改善Fc区功能的氨基酸突变的变体Fc。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“约”是指自给定值大约+/-10％的变化。应当理解，无论是否特别提及，此类变化总是包括在本文提供的任何给定值中。
当在本文中与术语“包含”结合使用时，使用词“一个/种(a或an)”可以意指“一个/种(one)”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素和/或方法步骤。当在本文中与组合物、用途或方法结合使用时，术语“基本上由……组成”表示可以存在附加的要素和/或方法步骤，但是这些附加不会实质性影响所述的组合物、方法或用途起作用的方式。当在本文中与组合物、用途或方法结合使用时，术语“由......组成”排除了附加的要素和/或方法步骤的存在。本文描述为包含某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法，在某些实施方案中也可以基本上由那些要素和/或步骤组成，并且在其他实施方案中由那些要素和/或步骤组成，无论是否特别提及了这些实施方案。
如本文所用，关于材料的术语“分离的”意指材料从其初始环境(例如，如果它是天然存在的，则为自然环境)取出。例如，活体动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的一些或所有共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分，并且/或者此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是其自然环境的一部分。
如本文可互换使用的术语“Fc区”和“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区。例如，人IgG重链Fc区序列通常定义为从重链的239位延伸到C端。二聚体Fc的“Fc多肽”是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽中的一个，即包含能够稳定地自我缔合的免疫球蛋白重链的C端恒定区的多肽。Fc区通常包含CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，也可以认为Fc区涵盖铰链区。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常定义为从239位延伸到340位。“CH3结构域”通常定义为包含Fc区中CH2结构域C端的氨基酸残基，即从341位到447位。人IgG1的“铰链区”通常定义为从216位延伸到238位(Burton,1985,Molec.Immunol.,22:161-206)。通过对齐形成重链间二硫键的第一个和最后一个半胱氨酸残基，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列对齐。
除非本文另有说明，否则Fc区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述。
天然存在的氨基酸始终通过下表A中所示的常规三字母或单字母缩写来识别，如本领域普遍接受的并且由IUPAC-IUB委员会在生化命名法中所推荐。
表A：氨基酸代码
Figure BDA0004113659340000091
应理解的是，在一个实施方案中对特征的肯定陈述充当在另选的实施方案中排除所述特征的基础。特别地，在为给定实施方案或权利要求提出选项列表的情况下，应当理解，可以从所述列表中删除一个或多个选项，并且缩短的列表可以形成替代实施方案，无论是否特别提及此替代实施方案。
预期本文公开的任何关于Fc变体的实施方案可以关于本文公开的任何方法、用途或组合物来实施，并且反之亦然。
Fc变体
本公开的Fc变体包含一个或多个氨基酸突变(“稳定性增强突变”)，与亲本Fc相比，所述突变增加Fc变体的稳定性。增加的稳定性可以导致CH2结构域的热稳定性增加、聚集的可能性降低、血清半衰期增加、可制造性提高或其组合。在某些实施方案中，与亲本Fc相比，Fc变体所包含的一个或多个稳定性增强突变增加CH2结构域的热稳定性(Tm)。
在一些实施方案中，与亲本Fc相比，Fc变体所包含的一个或多个稳定性增强突变增加CH2结构域的热稳定性(Tm)并且还减少Fc区的聚集。在一些实施方案中，与亲本Fc相比，Fc变体所包含的一个或多个稳定性增强突变增加CH2结构域的热稳定性(Tm)并且减少低pH下Fc区的聚集。在此情境下，“低pH”是指约4.0与7.5之间的pH。
在一些实施方案中，与亲本Fc相比，Fc变体所包含的一个或多个稳定性增强突变增加CH2结构域的热稳定性(Tm)并且减少弱酸性条件下Fc区的聚集，其中弱酸性条件包括低于中性的pH。在一些实施方案中，弱酸性条件包括约4.0与7.0之间的pH。在一些实施方案中，弱酸性条件包括约4.0与6.5之间的pH。
Fc变体可以包含一个稳定性增强突变，或者它可以包含多于一个稳定性增强突变。在某些实施方案中，Fc变体包含一个与五个之间的稳定性增强突变。在一些实施方案中，Fc变体包含一个与四个之间的稳定性增强突变。在一些实施方案中，Fc变体包含一个与三个之间的稳定性增强突变。在一些实施方案中，Fc变体包含1、2或3个稳定性增强突变。
在某些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少0.5℃。在一些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少1.0℃、至少1.5℃、至少2.0℃、至少2.5℃或至少3.0℃。在一些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少5.0℃、至少5.5℃、至少6.0℃、至少6.5℃或至少7.0℃。
在某些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约0.5℃至约6.5℃。在一些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约0.5℃至约9.0℃。在一些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约1.0℃至约9.0℃、约2.0℃至约9.0℃或约3.0℃至约9.0℃。在一些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约2.0℃至约10.5℃或约3.0℃至约10.5℃。
在某些实施方案中，CH2结构域Tm通过DSC或DSF测量。
亲本Fc可以是野生型Fc，或者它本身可以是已经包含一个或多个例如改善Fc区功能的氨基酸突变的变体Fc。在一些实施方案中，亲本Fc可以是包含一个或多个功能上增强Fc区的氨基酸突变的Fc。在一些实施方案中，亲本Fc可以是包含一个或多个功能上增强Fc区但导致稳定性相比于野生型Fc降低的氨基酸突变的Fc。在一些实施方案中，亲本Fc可以包含一个或多个功能上增强Fc区但使CH2结构域的热稳定性相比于野生型Fc降低的氨基酸突变。
功能上增强Fc区但使CH2结构域的热稳定性相比于野生型Fc降低的氨基酸突变的实例包括但不限于：促进异源二聚体Fc形成的突变(诸如杵臼或静电转向突变，由Atwell等人,1997,J Biol Chem,270:26-35和Gunasekaran等人,2010,J Biol Chem,285(25):19637-19646描述)；产生糖基化Fc的突变(诸如N297A突变，描述于Lund等人.,1995,FASEB,9(1):115-119；Leabman等人.,2013,mAbs,5(6):896-903和Jacobsen等人,2017,JBC,292(5):1865-1875)；和改变FcγR选择性的突变(诸如增加对FcγRIIIa的亲和力的S239D/I332E或S239D/A330L/I332E突变，如Lazar等人,2006,PNAS,103(11):4005-4010和Oganesyan等人,2008,Molec Immunol,45(7):1872-1882中所述，或增加对FcγRIIb的选择性的E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变，如Mimoto等人,2013,ProteinEng.Des.Sel.,26:589-598中所述)。在功能上增强Fc区但使CH2结构域的热稳定性相比于野生型或亲本Fc降低的氨基酸突变的其他实例描述于本文实施例中。
引入稳定性增强突变的亲本Fc可以是IgG Fc、IgA Fc、IgD Fc、IgE Fc或IgM Fc。尽管本文使用的氨基酸编号涉及IgG Fc，但本领域技术人员可以通过使用本领域已知的多种序列比对工具之一的序列比对来容易地确定其他Ig Fc序列中突变的等效位置。因此，本文对Fc区中特定位置的稳定性增强突变的提及旨在涵盖IgG Fc中的指定位置，以及IgA、IgD、IgE或IgM Fc区中的对应位置。IgA、IgD和IgG的CH2结构域与IgE和IgM的CH3结构域的序列比对以及IgA、IgD和IgG的CH3结构域与IgE和IgM的CH4结构域的序列比对示于图3A和3B中。
在某些实施方案中，Fc变体基于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM Fc。在一些实施方案中，Fc变体基于人IgG、IgA、IgD、IgE或IgM Fc。在一些实施方案中，Fc变体基于IgG或IgA Fc。在一些实施方案中，Fc变体基于人IgG或IgA Fc。在一些实施方案中，Fc变体基于IgG Fc。在一些实施方案中，Fc变体基于人IgG Fc。
在某些实施方案中，Fc变体基于IgG Fc，其可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc。在一些实施方案中，Fc变体基于人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc。人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 CH2和CH3结构域的序列比对提供于图3A和3B中。在一些实施方案中，Fc变体基于IgG1 Fc。在一些实施方案中，Fc变体基于人IgG1 Fc。
稳定性增强突变
如本文所述，采用计算机模拟和生物信息学方法来鉴定Fc区内可以突变以提高Fc的稳定性的位置。这些方法将表1中示出的突变鉴定为稳定性增强突变。
表1：稳定性增强突变
位置(EU) 突变
250 T250A、T250I、T250V
287 A287F、A287H、A287M、A287W、A287Y
308 V308I
309 L309Q、L309T
428 M428F
240和332 V240C_I332C
242和336 L242C_I336C
特别地，计算机模拟方法将以下氨基酸突变鉴定为在呈单突变引入时增加Fc的稳定性的突变：
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；和
突变M428F，
并且生物信息学方法将以下氨基酸突变鉴定为在呈单突变引入时增加Fc的稳定性的突变：
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变；
突变V308I；和
选自L309Q和L309T的309位的突变。
此外，突变对L242C_I336C、V240C_I332C和V263C_V302C，其每一个都将其他二硫键引入Fc区，显示出在不存在任何其他稳定性增强突变的情况下增加Fc的稳定性。
表1中示出的稳定性增强突变的组合还显示出进一步增加了Fc变体的稳定性。
因此，在某些实施方案中，Fc变体包含一个或多个稳定性增强突变，其中至少一个突变选自表1中示出的突变。在相同的实施方案中，Fc变体包含一个或多个选自表1中示出的突变的稳定性增强突变。
在一些实施方案中，Fc变体包含一个或多个稳定性增强突变，其中至少一个突变选自：
287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；
308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；以及
309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代。
在某些实施方案中，Fc变体包含单个稳定性增强突变。在一些实施方案中，Fc变体包含选自以下的单个稳定性增强突变：
287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；
308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；以及
309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代。
在一些实施方案中，Fc变体所包含的287位的突变是287位的氨基酸被Phe取代。在一些实施方案中，Fc变体所包含的309位的突变是309位的氨基酸被Gln取代。
在某些实施方案中，Fc变体包含稳定性增强突变对，每个突变都引入半胱氨酸残基，从而允许在Fc区中形成新的二硫键。在一些实施方案中，稳定性增强突变对选自：242C_336C、240C_332C和263C_302C。在一些实施方案中，稳定性增强突变对是242C_336C或240C_332C。在一些实施方案中，稳定性增强突变对是242C_336C。
在某些实施方案中，Fc变体包含两个或更多个稳定性增强突变。在某些实施方案中，Fc变体包含选自以下的两个或更多个稳定性增强突变：
250位的突变，其中所述突变是250位的氨基酸被Ala、Ile或Val取代；
287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；
308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；
309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代；
428位的突变，其中所述突变是428位的氨基酸被Phe取代；以及
242位和336位的一对突变，其中每个突变都是用Cys进行的取代。
在某些实施方案中，Fc变体包含两个稳定性增强突变。在一些实施方案中，Fc变体包含：
选自以下的两个稳定性增强突变：250位的突变、287位的突变、308位的突变、309位的突变和428位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变是用Ile进行的取代；309位的突变是用Gln或Thr进行的取代；并且428位的突变是用Phe进行的取代；或
242位和336位的一对突变，其中每个突变都是用Cys进行的取代。
在一些实施方案中，Fc变体包含：
250位的突变和287位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代，并且287位的突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；
250位的突变和308位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代，并且308位的突变是用Ile进行的取代；
250位的突变和309位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代，并且309位的突变是用Gln或Thr进行的取代；
250位的突变和428位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代，并且428位的突变是用Phe进行的取代；
287位的突变和308位的突变，其中287位的突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代，并且308位的突变是用Ile进行的取代；
287位的突变和309位的突变，其中287位的突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代，并且309位的突变是用Gln或Thr进行的取代；
287位的突变和428位的突变，其中287位的突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代，并且428位的突变是用Phe进行的取代；
308位的突变和309位的突变，其中308位的突变是用Ile进行的取代，并且309位的突变是用Gln或Thr进行的取代；
308位的突变和428位的突变，其中308位的突变是用Ile进行的取代，并且428位的突变是用Phe进行的取代；
309位的突变和428位的突变，其中309位的突变是用Gln或Thr进行的取代，并且428位的突变是用Phe进行的取代；或
242位和336位的一对突变，其中每个突变都是用Cys进行的取代。
在一些实施方案中，Fc变体包含：
250位的突变和287位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代，并且287位的突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；
250位的突变和309位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代，并且309位的突变是用Gln或Thr进行的取代；
250位的突变和428位的突变，其中250位的突变是用Ala、Ile或Val进行的取代，并且428位的突变是用Phe进行的取代；
287位的突变和428位的突变，其中287位的突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代，并且428位的突变是用Phe进行的取代；或
242位和336位的一对突变，其中每个突变都是用Cys进行的取代。
在一些实施方案中，Fc变体所包含的250位的突变是用Val进行的取代。在一些实施方案中，Fc变体所包含的287位的突变是用Phe进行的取代。在一些实施方案中，Fc变体所包含的309位的突变是用Gln进行的取代。
在一些实施方案中，Fc变体包含稳定性增强突变250V/287F、250V/308I、250V/309Q、250V/428F、287F/308I、287F/309Q、287F/428F、308I/309Q、308I/428F、309Q/428F或242C/336C。
在一些实施方案中，Fc变体包含稳定性增强突变250V/287F、250V/309Q、250V/428F、287F/428F或242C_336C。
在一些实施方案中，Fc变体包含稳定性增强突变250V/287F、250V/309Q、250V/428F或287F/428F。
在一些实施方案中，Fc变体所包含的稳定性增强突变选自：250V、287F、308I、309Q、428F、242C_336C、287F/428F、250V/287F、250V/309Q、250V/428F和242C_336C/308I。
在一些实施方案中，Fc变体所包含的稳定性增强突变选自：287F、308I、309Q、242C_336C、287F/428F、250V/287F、250V/309Q、250V/428F和242C_336C/308I。
在某些实施方案中，Fc变体包含三个或更多个稳定性增强突变。在某些实施方案中，Fc变体包含选自以下的三个或更多个稳定性增强突变：
250位的突变，其是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，其是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，其是用Ile进行的取代；309位的突变，其是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，其是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，其都是用Cys进行的取代。
在一些实施方案中，Fc变体包含三个稳定性增强突变。在某些实施方案中，Fc变体包含选自以下的三个稳定性增强突变：
250位的突变，其是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，其是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，其是用Ile进行的取代；309位的突变，其是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，其是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，其都是用Cys进行的取代。
在一些实施方案中，Fc变体包含：
242位和336位的一对突变，其都是用Cys进行的取代；和
选自以下的突变：250位的突变，其是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，其是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，其是用Ile进行的取代；309位的突变，其是用Gln或Thr进行的取代；和428位的突变，其是用Phe进行的取代。
在某些实施方案中，Fc变体包含一个与三个之间的稳定性增强突变。在一些实施方案中，Fc变体包含：
一个或多个突变，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；以及309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；或
两个或更多个突变，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代；或
三个或更多个突变，所述突变包括：242位的突变和336位的突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
在某些实施方案中，Fc变体是IgG Fc变体。在某些实施方案中，IgG Fc变体包含一个或多个稳定性增强突变。在一些实施方案中，IgG Fc变体包含一个或多个稳定性增强突变，其中至少一个突变选自：
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；
突变V308I；和
选自L309Q和L309T的309位的突变。
在某些实施方案中，IgG Fc变体包含单个稳定性增强突变。在一些实施方案中，IgG Fc变体包含选自以下的单个稳定性增强突变：
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；
突变V308I；和
选自L309Q和L309T的309位的突变。
在一些实施方案中，IgG Fc变体所包含的287位的突变是A287F。在一些实施方案中，IgG Fc变体所包含的309位的突变是L309Q。
在某些实施方案中，Fc变体包含稳定性增强突变对，每个突变都引入半胱氨酸残基，从而允许向Fc区中形成新的二硫键。在一些实施方案中，稳定性增强突变对选自：L242C_I336C、V240C_I332C和V263C_V302C。在一些实施方案中，稳定性增强突变对是L242C_I336C或V240C_I332C。在一些实施方案中，稳定性增强突变对是L242C_I336C。
在某些实施方案中，IgG Fc变体包含两个或更多个稳定性增强突变。在一些实施方案中，IgG Fc变体包含选自以下的两个或更多个稳定性增强突变：
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变；
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；
突变V308I；
选自L309Q和L309T的309位的突变；
突变M428F，和
突变L242C和I336C。
在某些实施方案中，IgG Fc变体包含两个稳定性增强突变。在一些实施方案中，IgG Fc变体包含：
选自以下的两个稳定性增强突变：250位的突变、287位的突变、308位的突变、309位的突变和428位的突变，其中250位的突变选自T250A、T250I和T250V；287位的突变选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y；308位的突变为V308I；309位的突变选自L309Q和L309T；并且428位的突变是M428F，或
突变L242C和I336C。
在一些实施方案中，IgG Fc变体包含：
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变以及选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变以及突变V308I；
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变以及选自L309Q和L309T的309位的突变；
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变以及突变M428F；
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变以及突变V308I；
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变以及选自L309Q和L309T的309位的突变；
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变以及突变M428F；
突变V308I以及选自L309Q和L309T的309位的突变；
突变V308I以及突变M428F；
选自L309Q和L309T的309位的突变以及突变M428F；或
突变L242C和I336C。
在一些实施方案中，IgG Fc变体包含：
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变以及选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变以及选自L309Q和L309T的309位的突变；
选自T250A、T250I和T250V的250位的突变以及突变M428F；
选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变以及突变M428F；或
突变L242C和I336C。
在一些实施方案中，IgG Fc变体所包含的250位的突变是T250V。在一些实施方案中，IgG Fc变体所包含的287位的突变是A287F。在一些实施方案中，IgG Fc变体所包含的309位的突变是L309Q。
在一些实施方案中，IgG Fc变体包含稳定性增强突变T250V/A287F、T250V/V308I、T250V/L309Q、T250V/M428F、A287F/V308I、A287F/L309Q、A287F/M428F、V308I/L309Q、V308I/M428F、L309Q/M428F或L242C_I336C。
在一些实施方案中，IgG Fc变体包含稳定性增强突变T250V/A287F、T250V/L309Q、T250V/M428F、A287F/M428F或L242C_I336C。
在一些实施方案中，IgG Fc变体包含稳定性增强突变T250V/A287F、T250V/L309Q、T250V/M428F或A287F/M428F。
在一些实施方案中，Fc变体所包含的稳定性增强突变选自：T250V、A287F、V308I、L309Q、M428F、L242C_I336C、A287F/M428F、T250V/A287F、T250V/L309Q、T250V/M428F和L242C_I336C/V308I。
在一些实施方案中，Fc变体所包含的稳定性增强突变选自：A287F、V308I、L309Q、L242C_I336C、A287F/M428F、T250V/A287F、T250V/L309Q、T250V/M428F和L242C_I336C/V308I。
在某些实施方案中，IgG Fc变体包含三个或更多个稳定性增强突变。在一些实施方案中，IgG Fc变体包含选自以下的三个或更多个稳定性增强突变：
250位的突变，所述突变选自T250A、T250I和T250V；287位的突变，所述突变选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y；突变V308I；309位的突变，所述突变选自L309Q和L309T；突变M428F；以及突变L242C和I336C。
在一些实施方案中，IgG Fc变体包含三个稳定性增强突变。在某些实施方案中，IgG Fc变体包含选自以下的三个稳定性增强突变：
250位的突变，所述突变选自T250A、T250I和T250V；287位的突变，所述突变选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y；突变V308I；309位的突变，所述突变选自L309Q和L309T；突变M428F；以及突变L242C和I336C。
在一些实施方案中，IgG Fc变体包含突变L242C和I336C以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变选自T250A、T250I和T250V；287位的突变，所述突变选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y；突变V308I；309位的突变，所述突变选自L309Q和L309T；以及突变M428F。
在某些实施方案中，IgG Fc变体包含一个与三个之间的稳定性增强突变。在一些实施方案中，IgG Fc变体包含：
一个或多个突变，所述突变选自：选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；突变V308I；以及选自L309Q和L309T的309位的突变；或
两个或更多个突变，所述突变选自：选自T250A、T250I和T250V的250位的突变；选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；突变V308I；选自L309Q和L309T的309位的突变；突变M428F；以及突变L242C和I336C；或
三个或更多个突变，所述突变包括：突变L242C和I336C，和选自以下的突变：选自T250A、T250I和T250V的250位的突变；选自A287F、A287H、A287M、A287W和A287Y的287位的突变；突变V308I；选自L309Q和L309T的309位的突变；以及突变M428F。
某些稳定性增强突变在本领域中是已知的。例如，通过在Fc区中包含突变L242C_K334C、L240C_K334C、A287C_L306C、V259C_L306C、R292C_V302C或V323C_I332C来引入其他二硫键已显示增加稳定性(Gong等人,2009,J Biol Chem,284(21):14203-14210；Jacobsen等人,2017,J Boil Chem,292(5):1865-1875)。其他稳定性增强突变描述于美国专利申请公开号2015/0210763。本公开的某些实施方案考虑了Fc变体，其包含一个或多个本文公开的稳定性增强突变与一个或多个先前显示增加Fc区的稳定性的突变的组合。
方法
本公开的某些实施方案涉及通过将如本文所述的一个或多个稳定性增强突变引入亲本Fc以提供Fc变体来稳定Fc区(亲本Fc)的方法。
本公开的一些实施方案涉及通过将本文所述的一个或多个稳定性增强突变引入亲本Fc以提供CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少0.5℃的Fc变体来增加Fc区(亲本Fc)的CH2结构域解链温度(Tm)的方法。
本公开的一些实施方案涉及增加亲本Fc的CH2结构域Tm的方法，所述方法包括将如本文所述的一个或多个稳定性增强突变引入Fc以提供Fc变体，其中Fc变体的CH2结构域Tm比亲本Fc的CH2结构域Tm高至少0.5℃。
亲本Fc可以是野生型Fc，或者它本身可以是已经包含一个或多个例如改善Fc区功能的氨基酸突变的变体Fc。在一些实施方案中，亲本Fc可以包含一个或多个改善Fc区的功能但还降低CH2结构域Tm的氨基酸突变。
本公开的一些实施方案涉及升高CH2结构域Tm低于对应野生型Fc的亲本Fc的CH2结构域Tm的方法，所述方法包括将如本文所述的一个或多个稳定性增强突变引入Fc以提供Fc变体，其中Fc变体的CH2结构域Tm比亲本Fc的CH2结构域Tm高至少0.5℃。
在一些实施方案中，所述方法提供CH2结构域Tm比亲本Fc的CH2结构域Tm高至少1.0℃、至少2.0℃或至少3.0℃的Fc变体。
在一些实施方案中，所述方法提供CH2结构域Tm比亲本Fc的CH2结构域Tm高约0.5℃至约6.5℃的Fc变体。在一些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm比亲本Fc的CH2结构域Tm高约0.5℃至约9.0℃、约1.0℃至约9.0℃、约2.0℃至约9.0℃或约3.0℃至约9.0℃。在一些实施方案中，Fc变体的CH2结构域Tm比亲本Fc的CH2结构域Tm高约2.0℃至约10.5℃或约3.0℃至约10.5℃。
在某些实施方案中，所述方法还包括测量Fc变体的CH2结构域Tm。在一些实施方案中，所述方法还包括通过DSC或DSF来测量Fc变体的CH2结构域Tm。
在某些实施方案中，所述方法包括将如本文所述的一个与五个之间的稳定性增强突变引入亲本Fc。在一些实施方案中，所述方法包括将如本文所述的一个与四个之间的稳定性增强突变引入亲本Fc。在一些实施方案中，所述方法包括将如本文所述的一个与三个之间的稳定性增强突变引入亲本Fc。在一些实施方案中，所述方法包括将1、2或3个稳定性增强突变引入亲本Fc。
在一些实施方案中，所述方法包括将一个或多个选自以下的稳定性增强突变引入亲本Fc：
250位的突变，其中所述突变是250位的氨基酸被Ala、Ile或Val取代；
287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；
308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；
309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代；
428位的突变，其中所述突变是428位的氨基酸被Phe取代；以及
242位的突变和336位的突变，其中两个突变都是用Cys进行的取代。
在一些实施方案中，所述方法包括将选自以下的单个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代。
在一些实施方案中，所述方法包括将选自以下的两个或更多个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位的突变和336位的突变，所述突变都是用Cys进行的取代。
在一些实施方案中，所述方法包括将三个或更多个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc，所述突变包括：242位的突变和336位的突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
某些实施方案涉及增加Fc区(亲本Fc)的CH2结构域Tm的方法，所述方法包括将一个至三个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc以提供CH2结构域Tm相比于亲本Fc区增加的Fc变体，其中一个至三个稳定性增强突变包括：
(a)一个或多个突变，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；或
(b)两个或更多个突变，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的突变，所述突变都是用Cys进行的取代；或
(c)三个或更多个突变，所述突变包括：242位的突变和336位的突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
在一些实施方案中，所述方法包括将稳定性增强突变250V/287F、250V/308I、250V/309Q、250V/428F、287F/308I、287F/309Q、287F/428F、308I/309Q、308I/428F、309Q/428F或242C_336C引入亲本Fc。在一些实施方案中，所述方法包括将稳定性增强突变250V/287F、250V/309Q、250V/428F、287F/428F或242C_336C引入亲本Fc。在一些实施方案中，所述方法包括将稳定性增强突变250V/287F、250V/309Q、250V/428F或287F/428F引入亲本Fc。
在某些实施方案中，所述方法包括将选自以下的稳定性增强突变引入亲本Fc：250V、287F、308I、309Q、428F、242C_336C、287F/428F、250V/287F、250V/309Q、250V/428F和242C_336C/308I。在某些实施方案中，所述方法包括将选自以下的稳定性增强突变引入亲本Fc：287F、308I、309Q、242C_336C、287F/428F、250V/287F、250V/309Q、250V/428F和242C_336C/308I。
在某些实施方案中，亲本Fc是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM Fc，例如人IgG、IgA、IgD、IgE或IgM Fc。在一些实施方案中，亲本Fc是IgG或IgA Fc，例如人IgG或IgA Fc。在一些实施方案中，亲本Fc是IgG Fc，例如人IgG Fc。
在某些实施方案中，亲本Fc是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc。在一些实施方案中，亲本Fc是IgG1 Fc，例如人IgG1 Fc。
在某些实施方案中，所述方法提供了CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少0.5℃并且显示出Fc区聚集相比于亲本Fc减少的Fc变体。在一些实施方案中，所述方法产生的Fc变体CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少0.5℃并且显示出在低pH下的Fc区聚集相比于亲本Fc减少。在一些实施方案中，所述方法产生的Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少0.5℃并且显示出在弱酸性条件下的聚集相比于亲本Fc减少。
测定
与亲本Fc相比，本公开的Fc变体的稳定性增加。此增加的稳定性可以导致CH2结构域的热稳定性增加、聚集减少、血清半衰期增加、可制造性提高或其组合。
在某些实施方案中，如通过CH2结构域解链温度(Tm)所确定的，Fc变体的热稳定性相比于亲本Fc增加。Fc变体和亲本Fc的CH2结构域Tm可以使用标准技术通过例如圆二色谱(CD)、差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光法(DSF)来测量。在某些实施方案中，如通过CH2结构域Tm所确定的，Fc变体的稳定性相比于亲本Fc增加，其中CH2结构域Tm通过DSC或DSF测量。
在某些实施方案中，当呈单突变引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少0.5℃。在一些实施方案中，当呈单突变引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少1.0℃、至少1.5℃、至少2.0℃、至少2.5℃或至少3.0℃。在一些实施方案中，当呈单突变引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约0.5℃至约6.5℃。
在某些实施方案中，当呈两个或更多个突变的组合引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少0.5℃。在一些实施方案中，当呈两个或更多个突变的组合引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少1.0℃、至少1.5℃、至少2.0℃、至少2.5℃或至少3.0℃。在一些实施方案中，当呈两个或更多个突变的组合引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加至少5.0℃、至少5.5℃、至少6.0℃、至少6.5℃或至少7.0℃。在一些实施方案中，当呈两个或更多个突变的组合引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约0.5℃至约9.0℃。在一些实施方案中，当呈两个或更多个突变的组合引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约1.0℃至约9.0℃、约2.0℃至约9.0℃或约3.0℃至约9.0℃。在一些实施方案中，当呈两个或更多个突变的组合引入Fc时，稳定性增强突变导致Fc变体的CH2结构域Tm相比于亲本Fc增加约2.0℃至约10.5℃或约3.0℃至约10.5℃。
在某些实施方案中，Fc变体的稳定性增加导致Fc变体相比于亲本Fc聚集减少和/或血清半衰期增加。可以通过本领域已知的各种标准技术测量聚集和血清半衰期。例如，可以通过尺寸排阻色谱法(SEC)或动态光散射(DLS)评估Fc变体和亲本Fc的聚集。Fc变体和亲本Fc的血清半衰期可以例如通过模型动物中的药代动力学研究来评估。
在某些实施方案中，如通过CH2结构域解链温度(Tm)所确定的，Fc变体的热稳定性相比于亲本Fc增加，并且其还显示出聚集减少。在一些实施方案中，Fc变体的热稳定性(Tm)相比于亲本Fc增加并且其还显示出在低pH下的聚集减少。在一些实施方案中，Fc变体的热稳定性(Tm)相比于亲本Fc增加并且其还显示出在弱酸性条件下的聚集减少。
可以任选地使用标准技术进行其他测定以进一步表征Fc变体。例如，可以评估Fc变体的纯度、FcR结合、FcRn结合、聚集和/或C1q结合。例如，可以分别通过液相色谱-质谱法(LC-MS)和尺寸排阻色谱法(SEC)评估纯度和聚集。FcR和FcRn结合可以通过例如表面等离子共振(SPR)、SPR成像(SPRi)、生物膜干涉(BLI)、ELISA、动力学排除测定
Figure BDA0004113659340000301
或基于Meso Scale DiscoveryTM(MSDTM)的方法(参见，例如，Current Protocols inImmunology:Ligand-Receptor Interactions in the Immune System,J.Coligan等人编,2018&updates,Wiley Inc.,Hoboken,NJ；和Yang等人,2016,Analytical Biochem,508:78-96)来测量。C1q结合可以通过例如ELISA或SPR来评估。
在某些实施方案中，Fc变体是IgG Fc变体并且可以评估其FcγR结合和/或FcRn结合。通常，结合亲和力以Fc变体与FcγR或FcRn结合的解离常数(KD)表示。在Fc变体是IgGFc变体的一些实施方案中，Fc变体保留与亲本Fc基本上相同的与每个Fcγ受体的结合。在Fc变体是IgG Fc变体的一些实施方案中，Fc变体保留与亲本Fc基本上相同的与FcRn的结合。在此上下文中，“基本上相同的结合”是指与亲本Fc相比，KD变化3倍或更少。
多肽
本公开的某些实施方案涉及多肽，其包含如本文所述的Fc变体。通常，多肽包含一个或多个融合至Fc变体或共价连接至Fc变体(例如通过接头)的其他蛋白质部分。例如，多肽可以是Fc融合蛋白或抗体或抗体片段。可以融合或连接至Fc变体的蛋白质部分的实例包括但不限于抗原结合结构域、配体、受体、受体片段、细胞因子和抗原。
当多肽包含多于一个其他蛋白质部分时，这些部分可以相同或它们可以不同。一个或多个其他蛋白质部分可以融合在Fc多肽之一者或两者的N端、C端或N端和C端两者处。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个融合至Fc多肽之一者或两者的N端的其他蛋白质部分。在一些实施方案中，多肽包含一个融合至Fc多肽之一的N端的其他蛋白质部分。在一些实施方案中，多肽包含两个其他蛋白质部分，一个部分融合至第一Fc多肽的N端，并且另一个部分融合至第二Fc多肽的N端。在一些实施方案中，多肽所包含的两个其他蛋白质部分可以串联连接。
在一些实施方案中，多肽包含融合至一个或多个作为抗原结合结构域的蛋白质部分融合的Fc变体。在一些实施方案中，多肽包含Fc变体和一个或多个抗原结合结构域。在一些实施方案中，多肽包含Fc变体和两个或更多个抗原结合结构域，例如2、3、4、5、6、7或8个抗原结合结构域。当多肽包含Fc变体和两个或更多个抗原结合结构域时，抗原结合结构域可以结合相同的抗原或者它们可以结合不同的抗原。
在一些实施方案中，多肽包含融合至一个或多个作为抗原结合结构域的蛋白质部分和一个或多个其他蛋白质部分的Fc变体。在一些实施方案中，多肽包含融合至抗原结合结构域并且融合至一个或多个其他蛋白质部分的Fc变体。此上下文中其他蛋白质部分的实例包括但不限于受体、受体片段(诸如细胞外部分)、配体和细胞因子。
在一些实施方案中，多肽可以是抗体或抗体片段，其中的一个或多个蛋白质部分中的至少一个是抗原结合结构域。例如，抗原结合结构域可以是Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，多肽可以是单特异性抗体。在一些实施方案中，多肽可以是包含一个抗原结合结构域的单特异性抗体。在一些实施方案中，多肽可以是包含两个抗原结合结构域的单特异性抗体。在一些实施方案中，多肽可以是包含多于两个抗原结合结构域的单特异性抗体。在一些实施方案中，多肽可以是包含Fc变体和两个或更多个抗原结合结构域的双特异性或多特异性抗体，其中的两个或更多个抗原结合结构域结合至不同的抗原。
在一些实施方案中，多肽可以是治疗或诊断抗体或抗体片段，其中的一个或多个蛋白质部分中的至少一个是抗原结合结构域。
在一些实施方案中，多肽包含Fc变体和一个或多个结合至肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域。
Fc变体的制备
本文所述的Fc变体和包含如本文所述的Fc变体的多肽可以使用标准重组方法制备。Fc变体和多肽的重组产生通常涉及：合成一个或多个编码Fc变体或多肽的多核苷酸；将一个或多个多核苷酸克隆到一个或多个合适的载体中；以及将载体引入到合适的宿主细胞中以表达Fc变体或多肽。蛋白质的重组产生在本领域是众所周知的，并且可以使用标准方法实现，所述标准方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,(1987和更新),John Wiley&Sons,New York,NY；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1990)。
本公开的某些实施方案因此涉及编码如本文所述的Fc变体或编码包含如本文所述的Fc变体的多肽的分离多核苷酸或多核苷酸组。此上下文中的多核苷酸可以编码全部或部分Fc变体或多肽。
术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”可在本文互换使用，并且是指任何长度的核苷酸，脱氧核糖核苷酸、或核糖核苷酸、或其聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、分离DNA、分离RNA、核酸探针和引物。
“编码”给定多肽的多核苷酸是当置于适当调节序列的控制下时体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的多核苷酸。编码序列的边界通过在5'(氨基)端的起始密码子和在3'(羧基)端的翻译终止密码子确定。转录终止序列将可以位于编码序列的3'。
可以使用标准连接技术，直接或在一个或多个亚克隆步骤之后，将编码Fc变体或多肽的一个或多个多核苷酸插入到一个或多个合适的表达载体中。合适载体的实例包括但不限于质粒、噬粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒或DNA病毒。通常选择载体以在将使用的特定宿主细胞中发挥功能，即载体与宿主细胞机制相容，允许多核苷酸的扩增和/或表达。在这一点上，选择适当的载体和宿主细胞组合完全在本领域技术人员的普通技能范围内。
本公开的某些实施方案因此涉及载体(诸如表达载体)，其包含一个或多个编码Fc变体或包含Fc变体的多肽的多核苷酸。多核苷酸可以包含在单个载体中，或可以包含在多于一种载体中。在一些实施方案中，多核苷酸包含在多顺反子载体中。
通常，表达载体将含有一个或多个用于质粒维持和用于克隆和表达外源多核苷酸序列的调节元件。此类调节元件的实例包括启动子、增强子序列、复制起点、转录终止序列、供体和受体剪接位点、多肽分泌的前导序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的多核苷酸的多接头区和可选择标志物。
调节元件可能是同源的(即来自与宿主细胞同一物种和/或菌株)、异源的(即来自除宿主细胞物种或菌株之外的物种)、杂交的(即来自多于一个来源的调节元件的组合)或合成的。因此，调节元件的来源可以是任何原核或真核生物，前提是序列在使用的宿主细胞机制中起作用并且可以被使用的宿主细胞机制激活。
任选地，载体还可以含有“标签”编码序列。标签编码序列是位于编码异源肽序列的编码序列的5'或3'端的核酸序列，诸如polyHis(例如，6xHis)、
Figure BDA0004113659340000341
HA(血凝素流感病毒)、myc、金属亲和力、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或生物素标签。此标签通常保持与表达的多肽融合并且可以用作亲和纯化或检测多肽的手段。任选地，随后可以通过各种手段(诸如使用某些肽酶进行切割)从纯化的多肽中去除标签。
各种表达载体很容易从商业来源获得。替代地，当无法获得含有所有所需调节元件的商业载体时，可以使用商业可得的载体作为起始载体来构建表达载体。当一个或多个所需调节元件尚未存在于载体中时，可以单独获得它们并将它们连接到载体中。用于获得各种调节元件的方法和来源是本领域技术人员众所周知的。
在构建包含编码Fc变体或多肽的多核苷酸的表达载体之后，可以将载体插入合适的宿主细胞中以进行扩增和/或蛋白质表达。表达载体向选定宿主细胞中的转化可以通过众所周知的方法完成，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导的转染和其他已知技术。选择的方法将部分地随待使用的宿主细胞的类型而变化。这些方法和其他合适的方法是技术人员众所周知的(参见，例如，Sambrook等人，同上)。
当在适当条件下培养时，宿主细胞表达由载体编码的多肽，并且随后可以从培养基中收集多肽(如果宿主细胞分泌多肽)或直接从产生它的宿主细胞中收集多肽(如果多肽不被分泌)。宿主细胞可以是原核细胞(例如细菌细胞)或真核细胞(例如酵母、真菌、植物或哺乳动物细胞)。考虑到各种因素，诸如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的简便性，技术人员可以容易地选择适当的宿主细胞。
本公开的某些实施方案因此涉及宿主细胞，其包含编码Fc变体或包含Fc变体的多肽的多核苷酸或包含多核苷酸的一个或多个载体。在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。
例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母可以用作宿主细胞，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株(参见例如，Gerngross,(2004),Nat.Biotech.,22:1409-1414，和Li等人,(2006),Nat.Biotech.,24:210-215)。植物细胞也可以用作宿主细胞(参见，例如，描述PLANTIBODIESTM技术的美国专利号5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978和6,417,429)。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。各种哺乳动物细胞系可以用作宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系、人胚胎肾系293(例如，如Graham等人,(1977),J.Gen Virol.,36:59中描述的HEK293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(sertoli cell)(例如，如Mather,(1980),Biol.Reprod.,23:243-251中描述的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞(MDCK)、buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)、TRI细胞(例如，如Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68中描述)、MRC 5细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括如Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216中描述的DHFR-CHO细胞)以及骨髓瘤细胞系(诸如Y0、NS0和Sp2/0)。另参见，Yazaki和Wu,2003,Methods inMolecular Biology,第248卷,第255-268页(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.)。
本公开的某些实施方案涉及制备如本文所述的Fc变体或包含如本文所述的Fc变体的多肽的方法，其包括用一个或多个编码Fc变体或多肽的多核苷酸(例如以一个或多个包含多核苷酸的载体的形式)转染宿主细胞，以及在适合表达编码的Fc变体或多肽的条件下培养宿主细胞。
通常，在表达后，从宿主细胞分离Fc变体或多肽并且可以任选地对其进行纯化。用于分离和纯化表达的蛋白质的方法在本领域中是众所周知的。例如，标准纯化方法包括例如色谱技术，诸如离子交换色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、凝胶过滤色谱或反相色谱，其可以使用诸如FPLC、MPLC和HPLC的系统在大气压或在中压或在高压下进行。其他纯化方法包括电泳、免疫学、沉淀、渗析和色谱聚焦技术。与蛋白浓缩结合的超滤技术及渗滤技术也可能是有用的。
本领域已知多种天然蛋白质结合抗体的Fc区，因此这些蛋白质可以用于纯化含Fc的蛋白质。例如，细菌蛋白A和G结合至Fc区。纯化通常可以由如上所述的特定融合伴侣(fusion partner)或亲和标签来实现。例如，如果采用GST融合，可以使用谷胱甘肽树脂纯化抗体，如果采用His标签，可以使用Ni+2亲和色谱纯化抗体，或者如果使用FLAG标签，可以使用固定化抗flag抗体纯化抗体。有用的纯化技术的实例描述于Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(1990)，和Protein Purification:Principles and Practice,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY(1994)。
药物组合物
本公开的某些实施方案涉及Fc变体或包含Fc变体的多肽的治疗用途。对于治疗用途，Fc变体和多肽可以以包含Fc变体或多肽和药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物的形式提供。组合物可以使用众所周知且易于获得的成分通过已知程序制备，并且可以被配制用于通过例如口服(包括例如经颊或舌下)、局部、肠胃外、直肠或阴道途径，或通过吸入或喷雾施用于受试者。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、真皮内、关节内、静脉内、肌肉内、血管内、胸骨内、鞘内途径注射或输注。
组合物通常将配制成适于通过选择的途径(例如，作为糖浆剂、酏剂、片剂、糖锭剂、锭剂、硬胶囊或软胶囊、丸剂、栓剂、油性或水性悬浮液、可分散性粉剂或粒剂、乳液、注射剂或溶液)施用于受试者的形式。组合物可以作为单位剂量制剂提供。
药学上可接受的载剂通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。此类载剂的实例包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量(小于约10个氨基酸)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠离子；金属络合物，诸如Zn-蛋白质络合物；以及非离子型表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方案中，组合物可以是无菌可注射水性或油性溶液或悬浮液的形式。可以使用本领域已知的合适的分散剂或润湿剂和/或悬浮剂配制此类悬浮液。无菌注射溶液或悬浮液可以包含在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的Fc变体或多肽。可以采用的可接受的稀释剂和溶剂包括例如1,3-丁二醇、水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或等渗氯化钠溶液。此外，可以采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以采用各种温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸可用于制备注射剂。如本领域已知的佐剂诸如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂也可以包含在可注射溶液或悬浮液中。
其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域已知的，并且例如描述于“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(formerly“RemingtonsPharmaceutical Sciences”)；Gennaro,A.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2000)。
使用方法
本公开的某些实施方案涉及Fc变体或包含Fc变体的多肽作为治疗剂、诊断剂或研究工具的用途。一些实施方案涉及Fc变体和包含Fc变体的多肽的治疗用途。
包含如本文所述的Fc变体和一个或多个抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的多肽尤其可用作诊断剂和治疗剂。因此，一些实施方案涉及在诊断受试者的疾病或病症中使用包含Fc变体和一个或多个抗原结合结构域的多肽的方法。一些实施方案涉及在治疗有需要的受试者的疾病或病症中使用包含Fc变体和一个或多个抗原结合结构域的多肽的方法。
待诊断或治疗的疾病或病症将取决于抗原结合结构域所靶向的一种或多种抗原。可以诊断或治疗的疾病和病症的实例包括但不限于炎性疾病和病症、自身免疫疾病和病症以及增殖性疾病和病症，诸如各种癌症。
提供以下实施例是为了说明的目的而非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
一般方法
制备变体
使用标准方法通过定点诱变和/或限制/连接制备变体和对照。最终的DNA被亚克隆到载体pTT5中(参见美国专利号9,353,382)。用于制备变体的所有支架均基于IgG1 Fc。IgG1 Fc区的序列提供在图1A中。在某些克隆中，Fc序列中省略了C端赖氨酸残基。
使用了以下支架：
支架1：基于曲妥珠单抗(trastuzumab)的全尺寸抗体(full-size antibody，FSA)，其具有同源二聚体IgG1 Fc，SEQ ID NO:1。
支架2：包含曲妥珠单抗Fab和异源二聚体IgG1 Fc的单臂抗体(OAA)支架，其包含以下突变：
链A：T350V_L351Y_F405A_Y407V
链B：T350V_T366L_K392L_T394W
支架3：基于曲妥珠单抗的全尺寸抗体(FSA)，其包含与支架2相同的异源二聚体Fc。
支架4：基于4G7抗CD19抗体的全尺寸抗体(FSA)(Meeker等人,1984,Hybridoma,3:305-320；美国专利号8,524,867)，其包含与支架2相同的异源二聚体Fc。
支架5：基于CP-870,893抗CD40抗体的全尺寸抗体(FSA)(Gladue等人,2011,Cancer Immunol Immunother,60:1009-1017)，其包含与支架2相同的异源二聚体Fc。可变结构域序列获自国际专利申请公开号WO 2013/132044。
支架6：包含N297A突变的基于曲妥珠单抗的全尺寸抗体(FSA)(Leabman等人,2013,mAb,5(6):896-903)，这导致糖基化Fc以及与所有FcγRs的结合消除。
支架7：包含S239D和I332E突变的基于曲妥珠单抗的全尺寸抗体(FSA)(Lazar等人,2006,PNAS,103:4005-4010)，所述突变导致FcγRIIIa结合增加。
支架8：包含曲妥珠单抗Fab和异源二聚体IgG1 Fc的单臂抗体(OAA)支架，其包含以下突变，所述突变导致FcγRIIb选择性增加：
链A：CH2：G236N_G237A
CH3：T350V_L351Y_F405A_Y407V
链B：CH2：G236D_G237F_S239D_S267V_H268D_“模板1”
CH3：T350V_T366L_K392L_T394W
“模板1”表示将325-331位的氨基酸残基替换为以下序列：STWFDGGYAT[SEQ IDNO:2]。
支架9：包含曲妥珠单抗Fab和异源二聚体IgG1 Fc的单臂抗体(OAA)支架，其包含以下突变，所述突变导致FcγRIIb选择性增加：
链A：CH2：L234F_G236N_H268Q_A327G_A330K_P331S
CH3：T350V_L351Y_F405A_Y407V
链B：CH2：G236D_S239D_V266L_S267A_H268D
CH3：T350V_T366L_K392L_T394W
表达-方案1
表达在200mL CHO 3E7细胞中进行。CHO细胞在指数生长期(150至200万个细胞/mL)用水性1mg/mL 25kDa聚乙烯亚胺(PEIpro,Polyplus Transfection SA,Illkirch,France)以2.5:1的PEI:DNA比率(Delafosse等人,2016,J.Biotechnol.,227:103-111)转染。为了确定形成异源二聚体的最佳浓度范围，以允许异源二聚体形成的重链A(HC-A)、轻链(LC)和重链B(HC-B)的最佳DNA比率(例如，HC-A/HC-B/LC比率＝30:30:40％)转染DNA。当表达同源二聚体时，将比率50:50％用于HC:LC。5-6天后收获转染的细胞，在4000rpm下离心后收集培养基并使用0.45μm过滤器进行澄清。
将澄清的培养基加载到MabSelectTMSuReTM(GE Healthcare,Baie-d'Urfé,QC,Canada)蛋白A柱上，并用10柱体积pH 7.2的PBS缓冲液洗涤。将抗体用10柱体积pH 3.6的柠檬酸盐缓冲液洗脱，合并的级分含有用pH 11的TRIS中和的抗体。然后将样品在pH 7.4的PBS中进行缓冲液交换并在-80℃下储存。
表达-方案2
使用HEK 293-6E细胞(NRC,Canada)以小规模(1mL)或大规模(30mL或更大)进行表达。
对于1mL规模的表达，使用与阳离子脂质293FectinTM(Life Technologies,Paisley,U.K.)预复合的DNA以1μg DNA/mL细胞在指数生长期(150至200万个细胞/mL)转染HEK 293-6E细胞。重链和轻链DNA以47.5:52.5％的比率混合，并且DNA与293FectinTM复合，最终浓度为11.7μg/mL DNA、1.65％(体积/体积)293FectinTM，然后将其在环境温度下孵育30min，然后添加到细胞中。为了实现最佳的异源二聚体形成，转染混合物中HC-A和HC-BDNA的比率为50:50％，或其微小的变化。细胞在37℃和5％二氧化碳下在用透气密封件密封的96孔深孔板中在加湿摇床中培养5-6天。以1600x g离心后收集培养基。
对于大规模表达，使用与Gemini阳离子脂质(Camilleri等人,2000,Chem.Commun.,1253-1254)预复合的DNA以1μg DNA/mL细胞在指数生长期(150至200万个细胞/mL)转染HEK 293-6E细胞。重链和轻链DNA以50:50％的比率混合，并且DNA与Gemini复合，最终浓度为10μg/mL DNA、40μg/mL Gemini，然后将其在环境温度下孵育15-30min，然后添加到细胞中。转染混合物的HC-A和HC-BDNA比率如上所述。细胞在37℃和5％二氧化碳下在适当尺寸的锥形瓶或BioReactor管中在加湿摇床中培养多至10天。然后以2750x g离心后收集培养基，并使用0.22μm过滤器进行澄清。
将澄清的培养基加载到MabSelectTMSuReTM(GE Healthcare,Little Chalfont,U.K.)蛋白A柱上，用3-10柱体积pH 7.5的Tris-乙酸盐缓冲液洗涤，然后用2-5柱体积pH2.6的乙酸洗脱，洗脱级分用TRIS中和。通过尺寸排阻色谱法(使用PBS运行缓冲液的SuperdexTM200柱(GE Healthcare,Little Chalfont,U.K.))进行的进一步纯化和/或阳离子交换(ReSourceTMS柱(GE Healthcare,Little Chalfont,U.K.))被用于选定的样品。将蛋白A纯化的抗体缓冲液交换到PBS中。
制备Fcγ和FcRn受体
方案1
如前所述，FcγRIIaH、IIaR、IIb、IIIaF和IIIaV在HEK293-6E细胞中产生，而FcγRIa在CHO-3E7细胞中产生(Dorian-Thibaudeau等人,2014,J.Immunol.Methods,408:24-34)。人FcRn也在HEK293-6E细胞中通过含有比率为1:1的TEV可切割C端His标签与β2-微球蛋白的α亚基(p51)细胞外结构域的共转染来表达。在如Dorion-Thibaudeau等人(同上)中描述的纯化之后，通过TEV切割去除了C端His标签。
方案2
具有C端6xHis标签的可溶性FcγRI细胞外结构域购自R&D系统(目录号1257-Fc)。可溶性FcγRIIaH、IIaR、IIb、IIIaF和IIIaV细胞外结构域在具有C端10xHis标签的HEK293-6E细胞中产生。使用与Gemini阳离子脂质(Camilleri等人,2000,Chem.Commun.,1253-1254.)预复合的DNA以1μg DNA/mL细胞在指数生长期(150至200万个细胞/mL)转染细胞。细胞在37℃和5％二氧化碳下在适当尺寸的锥形瓶中在加湿摇床中培养多至7天。收获时间通过细胞活力降至低于50％的时间来确定。然后以2750x g离心后收集培养基，并使用0.22μm过滤器进行澄清。
通过渗析或切向流过滤将澄清的培养基缓冲液交换到含有25mM咪唑的pH 7.7的上样缓冲液中，并应用于Ni Sepharose 6柱(GE Healthcare,Little Chalfont,U.K.)，然后通过将缓冲液咪唑浓度增加至300mM来洗脱。洗脱的蛋白质通过渗析过滤被浓缩并缓冲液交换到PBS中，然后通过尺寸排阻色谱(
Figure BDA0004113659340000431
75柱(GE Healthcare,LittleChalfont,U.K.))进一步纯化。
可溶性人FcRn细胞外结构域通过共转染比率为1:1的含有C端6xHis标签的α亚基与β2微球蛋白来在HEK 293-6E细胞中表达，并且如以其他方式针对FcγR所描述的那样表达。用柠檬酸盐将澄清培养基的pH调节至pH 5.3，然后将其上样到IgG Sepharose柱(GEHealthcare,Little Chalfont,U.K.)上。用pH 7.7的HEPES缓冲液洗脱结合的蛋白质。洗脱的蛋白质通过渗析过滤被浓缩并缓冲液交换到PBS中，然后通过尺寸排阻色谱(
Figure BDA0004113659340000432
75柱(GE Healthcare,Little Chalfont,U.K.))进一步纯化。
Fcγ受体结合(表面等离子共振(SPR))
方案1
在25℃下使用ProteOnTMXPR36，用pH 7.4的含有150mM NaCl、3.4mM EDTA和0.05％Tween 20的PBS作为运行缓冲液，通过SPR测量FcγR对抗体Fc的亲和力。对于曲妥珠单抗变体，使用标准胺偶联，以BioRad胺偶联试剂盒，将重组HER2固定在GLM传感器芯片上。简而言之，用NHS/EDC激活GLM传感器芯片，然后注入在10mM NaOAc(pH 4.5)中的4.0μg/mL的HER2，直到固定大约3000个共振单位(RU)。然后用乙醇胺淬灭剩余的活性基团。通过以25μL/min在配体方向注入40μg/mL溶液纯化抗体240s来将野生型曲妥珠单抗变体间接地捕获到其SPR表面上，从而导致表面上大约有500RU。在注入缓冲液以在分析物方向建立稳定的基线后，分析物以50μL/min注入120s，解离相为180s，以获得一组结合传感图。除了FcγR1a的30nM外，还使用了FcγR的3倍稀释系列的5个浓度，所有受体的最高标称浓度为10μM，并且缓冲液被包括在内以用于双重参考。使用ProteOnTMManager v3.1.0中的Equilibrium Fit模型从对准和参考的传感图确定所得的Kd(亲和力)值，报告值为两次或三次独立运行的平均值。
方案2
在25℃下使用BiacoreTM4000(GE Healthcare,Little Chalfont,U.K.)，以PBSTE(含有0.05％ Tween-20和3.4mM EDTA的PBS)作为运行缓冲液，通过SPR测量FcγR对抗体Fc的亲和力。对于抗HER2抗体，使用胺偶联(EDC/NHS化学)，用重组HER2细胞外结构域(Merck,Darmstadt,Germany or ThermoFisher Scientific,Loughborough,U.K.)固定CM5芯片(GEHealthcare,Little Chalfont,U.K.)。简而言之，用NHS/EDC激活CM5传感器芯片，然后注入在10mM NaOAc(pH 4.5)中的10.0μg/mL的HER2。固定水平在1000-4000RU之间的范围内。然后用乙醇胺淬灭任何剩余的活性基团。抗体首先通过以10μl/min的流速，在点和流动池上以大约15μg/ml注入35s被捕获在芯片的固定化表面上，将点3留空以进行参考扣除。受体在PBSTE缓冲液中稀释至确定的浓度范围，所述浓度范围取决于其预期亲和力。每种分析物使用六个浓度，包括零。分析物接触时间根据所使用的受体及其预期动力学进行了优化。例如，对于FcγRIIB和FcγRIIaR，在30μl/min下的接触时间为18s。在每种分析物浓度注入87mM磷酸后，芯片表面都被再生。在测试之前，芯片是用3x18s的87mM磷酸注入制备的。进行双重参考扣除(参考点3和0受体浓度)，并且通过抗体捕获水平归一化结合反应。使用任一动力学和/或稳态(平衡)拟合模型分析样品。
FcRn结合(表面等离子共振(SPR))
方案1
在25℃下使用ProteOnTMXPR36，以pH 7.4或pH 6.0的HBS-EP+(10mM HEPES、150mMNaCl、0.003％ M EDTA和0.05％(体积/体积)表面活性剂P20(Teknova,Hollister,U.S.A.))作为运行缓冲液，通过SPR测量FcRn对抗体变体Fc的亲和力。使用标准胺偶联，以GE Healthcare偶联试剂盒，将蛋白L(ThermoScientific,Loughborough,UK)固定在GLM传感器芯片上。简而言之，用NHS/EDC激活GLM传感器芯片，然后注入在10mM NaOAc(pH 4.5)中的50μg/mL的蛋白L，直到固定大约3000个共振单位(RU)，然后用乙醇胺淬灭剩余的活性基团。通过以30μL/min在配体方向注入50μg/mL纯化抗体的溶液120s来将抗体变体间接地捕获到其SPR表面上。在注入缓冲液以在分析物方向建立稳定的基线后，分析物以40μL/min注入300s，解离相为600s，以获得一组结合传感图。使用了FcγR的4倍稀释系列的5个浓度，最高标称浓度为2048nM，并且缓冲液被包括在内以用于双重参考。使用ProteOnTMManagerv3.1.0中的Equilibrium Fit模型从对准和参考的传感图确定所得的Kd(亲和力)值。
方案2
在25℃下使用BiacoreTMT200(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)，以pH 7.4的HBS-EP+或pH 6.0的MES作为运行缓冲液，通过SPR测量FcRn对抗体变体Fc的亲和力。样品被捕获在固定化蛋白LCM5芯片(GE Healthcare)，但4G7抗CD19抗体未能被捕获。抗体首先通过以5μl/min的流速，在点和流动池上以大约15μg/ml注入60s被捕获在芯片的固定化表面上。受体在pH 7.4的HBS-EP+缓冲液或pH 6.0的MES缓冲液中稀释至确定的浓度范围。在pH7.4下，每种分析物使用三种浓度(4096、512和0nM)，并且在pH 6.0下，每种分析物使用四种浓度(512、64、8和0nM)。在每种分析物浓度注入pH1.5的10mM甘氨酸后，芯片表面被再生。使用BiacoreTMT200评估V2软件和1:1结合动力学模型分析结果。
方案3
在25℃下使用IBIS MX96(IBIS Technologies,Enschede,The Netherlands)，以pH 7.4的HBS-EP+或pH 6.0的MES作为运行缓冲液，通过SPR测量FcRn的亲和力。样品在pH4.5的乙酸盐缓冲液中稀释，然后使用连续流动微量点样器(Carterra,Salt Lake City,USA)将样品捕获到
Figure BDA0004113659340000462
G
Figure BDA0004113659340000461
传感器芯片(Carterra,Salt Lake City,USA)上。受体在pH7.4的HBS-EP+缓冲液或pH 6.0的MES缓冲液中稀释至确定的浓度范围。在pH 7.4下，每种分析物使用三种浓度(4096、512和0nM)，并且在pH 6.0下，每种分析物使用四种浓度(512、64、8和0nM)。在每种分析物浓度注入pH 2.0的10mM甘氨酸后，芯片表面被再生。使用Scrubber V2(BioLogic Software,Campbell,Australia)和动力学拟合模型分析结果。
方案4
使用BiacoreTMT200(GE Healthcare)表面等离子共振仪筛选抗体的FcRn结合。实验在25℃下使用pH 6的具有0.05％
Figure BDA0004113659340000463
20和3.4mM EDTA的含有PBS的运行缓冲液进行。将生物素化的FcRn(由上述方案1产生)捕获到CM-5传感器芯片上，所述芯片具有先前使用标准胺偶联被固定在空白和捕获表面上的中性抗生物素蛋白(Thermo Fisher，WalthamMA)。然后使抗体稀释液流过FcRn和对照表面。使用Biacore控制软件中的固定向导，将pH4.5的10mM乙酸钠缓冲液中的25ug/mL中性抗生物素蛋白添加到每个NHS/EDC激活表面直到达到2000RU。为了得到FcRn表面，将生物素化的FcRn在含有0.05％
Figure BDA0004113659340000471
20和3.4mMEDTA(pH 7.4)的PBS中稀释至2ug/mL，并且以25ug/mL的流速注入在捕获表面上110s直到捕获32RU。此FcRn表面用于所有抗体。使用单循环动力学一式两份地筛选抗体。使用在pH 6的运行缓冲液中的3倍稀释液，以25uL/min注入900与11.1nM之间的五种浓度，90s缔合以及180s解离。FcRn表面在以30uL/min注入pH 7.4的缓冲液30s后再生在不同的抗体变体之间。传感图双重参考空白对照表面，并使用亲和结合模型进行拟合以生成每个抗体-FcRn相互作用的KD值。
差示扫描量热法
方案1
每个抗体构建体在PBS中稀释至0.2mg/mL，并且总共使用400μL以VP-毛细管DSC(GE Healthcare)进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行五次缓冲液空白注入以稳定基线，并在每次抗体注入之前进行一次缓冲液注入以供参考。每个样品以60℃/h的速率从20℃至100℃进行扫描，具有低反馈，8s过滤，5min preTstat和70psi氮气压力。参考所得的热谱图并使用Origin 7软件(OriginLab Corporation,Northampton,MA)分析。
方案2
通过如针对方案1所述的相同方法评估抗体构建体，除了使用0.1–1.0mg/ml的抗体浓度，其中0.4mg/ml或更大的浓度为优选的。
差示扫描荧光法
方案1
将20μL纯化样品(在0.2与1.0mg/mL之间)添加到10μL
Figure BDA0004113659340000481
Orange(Invitrogen,Paisley,U.K.)中，用反渗透(RO)水从5000x原液稀释至20x，并且置于透明的96孔PCR板中。将样品在40℃下孵育5min，然后使用BioRad CFX ConnectTMRT-PCR机器(BioRad,Watford,U.K.)使用15℃/h的速率在40-95℃之间测量
Figure BDA0004113659340000482
Orange的荧光发射。使用Bio-Rad CFX ManagerTM3.1版分析各峰并得出蛋白质去折叠事件的温度，然后将其与蛋白质内已知结构域的去折叠相关联。
方案2
将10μL纯化样品(在0.2与1.0mg/mL之间)装入Prometheus NT.Plex nanoDSF标准级玻璃毛细管(PR-AC002,NanoTemper Technologies,London,U.K.)中并在PrometheusNT.Plex nanoDSF(NanoTemper Technologies,London,U.K.)中使用60℃/h的速率在20-95℃之间进行分析。使用PR.stability Analysis软件1.02版分析各峰并得出蛋白质去折叠事件的温度，然后将其与蛋白质内已知结构域的去折叠相关联。
尺寸排阻色谱法
使用Agilent 1100 HPLC系统(Agilent,Stockport,U.K.)，将10μL纯化样品(在0.2与2mg/mL之间的浓度范围内)注入到Supelco
Figure BDA0004113659340000483
G3000 SWXL尺寸排阻柱(Tosoh,Reading,U.K.)上，pH 6.8的400mM磷酸钠、200mM NaCl流动相以恒定1.0mL/分钟流动，每个样品运行时间为15分钟。二极管阵列检测器连接在柱后的流线中，并且记录了210和280nm处的UV/vis吸收。使用Chemstation软件(Agilent,Stockport,U.K.)整合所得迹线，并随后使用ChromViewTM软件进行分析。通过相比于分子量高于主峰的总峰面积％和分子量低于主峰的总峰面积％分类主峰面积％来记录样品纯度。
液相色谱质谱法
质谱用于确认样品的身份。为去除N-连接糖基化，在5％甘油中的10μl 80μg/ml的PNG酶F被添加到50μL抗体样品中(浓度范围在0.2与2mg/mL之间)并将混合物在30℃下孵育过夜。在MS分析之前，将5μL的0.5M DTT添加到每个样品。使用Agilent 1200HPLC系统(Agilent Technologies,Stockport,U.K.)，将3至5μg样品注入用0.1％甲酸盐、5％乙腈洗涤的反相保护柱，然后样品用0.1％甲酸盐和90％乙腈洗脱，流速为0.5ml/min。洗脱液被导向6224精确质量TOF LC/MS质谱仪(Agilent Technologies)，由PC运行MassHunter软件(Agilent Technologies)控制。样品质量通过使用MassHunter解卷积电荷封包(chargeenvelope)来确定。
C1q结合
通过ELISA评估抗体构建体与人C1q的结合。测试抗体构建体通过每孔添加100μl10μg/ml的在PBS中的测试抗体来涂覆在96孔平底Nunc
Figure BDA0004113659340000491
板(Invitrogen,Paisley,U.K.)的孔上。将板密封并在4℃下孵育16h。将板用300μl含有0.05％(体积/体积)
Figure BDA0004113659340000492
20的PBS洗涤3次。然后通过每孔添加200μl 1％(w/v)牛血清白蛋白封闭板表面。将板在环境温度下孵育1h，然后如前洗涤。将重组人C1q(C1740,Sigma Aldrich,Gillingham,U.K.)在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(C3041,Sigma Aldrich)中稀释至最终测定浓度，并且每孔加入100μl。将样品在环境温度下孵育2h，然后如前洗涤板。然后在每孔中加入100μl用PBS稀释至2μg/ml的绵羊抗人C1q-HRP(Ab46191,AbCam,Cambridge,UK)，样品在环境温度下孵育1h，然后如前洗涤板。为了检测，每孔添加100μl SureblueTMTMB(52-00-01,Seracare,Milford,U.S.A.)，并且样品在环境温度下搅拌孵育20min。通过向每个孔中添加100μl 1M HCl来停止反应。然后使用M5e
Figure BDA0004113659340000501
读板器(Molecular Devices,Wokingham,U.K.)在450nm处测量每个样品孔的吸光度。对于每种抗体变体，一式两份地测试了半对数步骤中2μg/ml至6ng/ml的7个C1q浓度加上无C1q对照。使用Prism(GraphPad,San Diego,U.S.A.)分析数据。使用吸光度和对数转换C1q浓度的4参数非线性回归模型拟合结合曲线。从拟合曲线内推结合超过阈值吸光度的C1q浓度。
实施例1：由计算机模拟预测工具鉴定的稳定性突变
使用与IgG1 Fc结合的FcγRIIb的三维结构，在CH2结构域内的每个位置以及CH2结构域的两个壳层内的CH3结构域中的特定位置计算机模拟进行单突变。第一壳层残基是与CH2结构域直接相互作用的残基，并且第二壳层残基是与至少一个第一壳层残基相互作用的残基。在每个位置用除脯氨酸或半胱氨酸之外的所有可能的氨基酸进行取代。鉴定的增强Fc热稳定性的突变称为稳定性增强突变。
最初在对FcγRIIb具有选择性的Fc变体的背景下研究了稳定性增强突变。由于FcγRIIb与IgG Fc的结合导致不对称复合物，因此仅选择计算机模拟提高Fc两条链的稳定性的突变用于测试，以确保稳定性突变与对FcγRIIb具有选择性的变体以及其他抗体疗法相容。
使用多种分子建模工具分析计算机模拟生成的所有模型，包括计算机模拟诱变和使用内部软件工具的包装建模。所有模型都基于许多因素进行评分和排名，包括基于知识和基于物理的折叠和复合物形成潜力，以及静电、溶剂筛选、Lennard-Jones和疏水相互作用的综合能量贡献。
进一步过滤结果以选择优选具有以下特征的最佳稳定性增强突变：
·没有暴露于溶剂(<30％溶剂可及表面积(SASA)是有利的，<50％可接受)
·远离FcγR界面
·不知道对FcRn结合产生负面影响
·不知道对C1q结合产生负面影响
·不影响N297位Fc的N-糖基化。
上述过程将突变A287F、T289W、A339W、A339Q、A378W和M428F鉴定为潜在的稳定性增强突变。如一般方法中所述构建了曲妥珠单抗(支架1)的六种变体，每一种都包含一种鉴定的突变。如一般方法中所述，评估每种变体的表达、聚集、热稳定性和对FcγRIIa、FcγRIIb和FcRn的结合亲和力。具体地，聚合通过分析SEC评估；热稳定性通过DSC(方案2)和DSF(方案1)评估；FcγRIIa和FcγRIIb结合通过Biacore结合(方案2)评估，并且FcRn结合通过方案1评估。结果示于表1.1和1.2中。
表1.1：计算机模拟预测工具鉴定的突变的特征
Figure BDA0004113659340000511
1相对SASA是基于两条链的平均溶剂可及体积和每个残留物的面积计算的。输出相对于完全暴露的残留物。
2ΔTm表明Tm突变-Tm野生型(v16588、WT曲妥珠单抗)之间的差异。
3变体19305的数据是在流速0.5ml/min而不是1.0ml/min下生成的。因此，与其他变体相比，保留时间在色谱柱保留方面非常一致。
表1.2：计算机模拟预测工具鉴定的突变的特征
Figure BDA0004113659340000521
1相对于野生型的变化，表示为FcγRIIb和FcγRIIa的KD wt/KD mut。
2NB＝无结合。
3ND＝未测定。
选择突变A287F和M428F以进行基于以下标准的进一步评估：
·对于单点突变，通过DSC的Tm增加>2℃
·在FcγRIIb和FcγRIIa结合方面，保留野生型样特性(WT值+30％)
·保留与FcRn的结合(相对于WT，<KD的2倍差异)
·通过分析SEC，单体含量>95％。
通过突变A287F的稳定在能量上是有利的，并且可能源于与W277位的堆叠P-P相互作用的产生以及W277和S304之间氢键的掩埋。因此，预测在这些位置用在芳香性和疏水性方面具有类似特性的氨基酸进行的替代突变会增加稳定性，并且因此是稳定性增强突变。这些包括突变A287Y、A287W和A287H，以及A287M。预测后一种突变会掩埋氢键，但由于Π-Π堆积相互作用的丧失，可能会提供较低的稳定性。
图1B示出了IgG Fc区中A287和M428位的位置。
实施例2：通过生物信息学分析鉴定的稳定性突变
来自多种生物体和IgG亚型的序列(从Uniprot提取的59个非冗余序列)与ClustalX对齐(Larkin等人,2007,Bioinformatics,23:2947-2948)以将对于折叠或功能是保守的残基与可以被取代的残基区分开。在所有IgG中具有一些序列同一性的非表面暴露位置与存在于其他物种或亚型中的替代常见残基一起被鉴定。包括基于选定位置的相对SASA的额外过滤以降低免疫原性风险。
过滤结果以选择优选具有以下特征的最佳稳定性增强突变：
·没有暴露于溶剂(<30％溶剂可及表面积(SASA)是有利的，<50％可接受)
·部分保守(所有CH2 IgG的序列同一性<85％是有利的，<95％可接受)
·远离FcγR界面
·不知道对FcRn结合产生负面影响
·不知道对C1q结合产生负面影响
·不影响N297位Fc的N-糖基化。
存在于小鼠IgG2a中的氨基酸取代比其他物种更有利，因为小鼠IgG2a中的CH2结构域Tm(Tm＝约80℃)比人IgG1中的CH2结构域Tm(Tm＝72℃)高。未考虑其他物种的CH2结构域的稳定性。
上述方法将突变L242I、T250V、F275I、V279I、V308I、Y319F、P247I、M252S、L309Q、L314M和K334R鉴定为潜在的稳定性增强突变。如一般方法中所述构建了曲妥珠单抗(支架1)的十一种变体，每一种都包含一种鉴定的突变。如实施例1中所述，评估每种变体在哺乳动物细胞中的表达、纯化后的聚集、热稳定性和对FcγRIIb、FcγRIIa和FcRn的结合亲和力。结果示于表2.1和2.2中。
表2.1：生物信息学分析鉴定的突变的特征
Figure BDA0004113659340000541
1相对SASA是基于两条链的平均溶剂可及体积和每个残留物的面积计算的。输出相对于完全暴露的残留物。
2ΔTm表明Tm突变-Tm野生型(v16588、WT曲妥珠单抗)之间的差异。
3ND＝未测定
表2.2：通过生物信息分析鉴定的突变的特征
Figure BDA0004113659340000551
1相对于野生型的变化，表示为FcγRIIb和FcγRIIa的KD wt/KD mut。
2NB＝无结合。
3ND＝未测定。
4由于抗体捕获不佳，无法获得v19315的可靠数据。
选择突变T250V、L309Q和V308I以进行基于以下标准的进一步评估：
·对于单点突变，通过DSC的Tm增加>2℃
·在FcγRIIb和FcγRIIa结合方面，保留野生型样特性(WT值±30％)
·保留与FcRn的结合(相对于WT，<KD的2倍差异)
·通过分析SEC，单体含量>95％。
由于在大小和疏水性方面类似的氨基酸特性，预测这些位置的替代突变(诸如T250I、T250A或L309T)也会增加稳定性。氨基酸大小(V与I或A)和侧链支化(Cβ支化与非支化残基)的微小差异可能会导致稳定效果的微小变化。
图1B示出了T250位在IgG Fc区中的位置。
实施例3：包含非天然二硫键的稳定性突变
使用与IgG1 Fc结合的FcγRIIb的三维结构，计算CH2结构域的所有Cα和Cβ原子对之间的距离并为Fc的两条链取平均值，以确定可以引入二硫键的位置。过滤基于Cα-Cα对的最大距离
Figure BDA0004113659340000561
和Cβ-Cβ对的最大距离
Figure BDA0004113659340000562
因为FcγRIIb与IgG Fc的结合导致不对称复合物，所以只有计算机模拟提高Fc两条链的稳定性的突变被选择用于测试。这种选择使稳定性突变偏向于与对FcγRIIb和未结合的Fc具有选择性的变体相容的突变。
为所有可能的人工二硫键创建了计算机模拟模型，并将所述模型能量最小化以确定具有最低能量的那些。基于两条链中半胱氨酸残基的相对溶剂可及表面积(SASA)、相对于野生型结构的主链和侧链均方根偏差(RMSD)、基于知识和物理的亲和力和稳定性潜力的改进、立体冲突和二硫化物应变能(DSE)分数对模型进行目视检查和评分(Katz和Kossiakoff,1986,J Biol Chem,261(33):15480-15485)。
过滤结果以选择优选具有以下特征的最佳稳定性增强突变：
·没有暴露于溶剂(<30％相对SASA是有利的，<50％可接受)
·远离FcγR界面
·不知道对FcRn结合产生负面影响
·不知道对C1q结合产生负面影响
·不影响N297位Fc的N-糖基化
·低主链和侧链RMSD(主链的
Figure BDA0004113659340000571
并且侧链的
Figure BDA0004113659340000572
)
·同等或提高的基于知识和物理的稳定性潜力
·低DSE分数(<30(DSE)是有利的，<50可接受)。
上述过程将突变对D249C-P257C、F275C-S304C、V263C-V302C、L242C-I336C、T289C-S304C、F243C-T260C、V266C-Y300C、V240C-I332C和W277C-V284C鉴定为潜在的稳定性增强突变。如一般方法中所述构建了曲妥珠单抗(支架1)的十三种变体，每一种都包含鉴定的突变对之一或文献中先前报道的突变对，以通过引入二硫键来提高稳定性(Jacobsen等人,2017,J Biol Chem,292(5):1865-1875；Gong等人,2009,J Biol Chem,284(21):14203-14210；Gong等人,2011,J Biol Chem,286(31):27288-27293)。如实施例1中所述，评估每种变体在哺乳动物细胞中的表达、聚集、热稳定性和对FcγRIIb、FcγRIIa和FcRn的结合亲和力。对FcRn受体的亲和力也在成功的变体子集中评估。结果示于表3.1和3.2中。
表3.1：引入非天然二硫键的突变的特征
Figure BDA0004113659340000573
Figure BDA0004113659340000581
1相对SASA是基于两条链的平均溶剂可及体积和每个残留物的面积计算的。输出相对于完全暴露的残留物。
2ΔTm表明Tm突变-Tm野生型(v16588、WT曲妥珠单抗)之间的差异。
3v19326的DSC曲线图不典型，并导致CH2结构域的Tm测定不明确。
表3.2：引入非天然二硫键的突变的特征
Figure BDA0004113659340000582
1相对于野生型的变化，表示为FcγRIIb和FcγRIIa的KD wt/KD mut。
2NB＝无结合。
3ND表示数据未测定。
4v19326的纯度曲线图不典型，并且导致KD测定不明确。
5LB＝低结合。
在鉴定的二硫键中，仅选择L242C-I336C以进行基于以下标准的进一步评估：
·对于单突变对，通过DSC的Tm增加>2℃
·在FcγRIIb和FcγRIIa结合方面，保留野生型样特性(WT值±30％)
·通过分析SEC，单体含量>95％。
本领域已知的突变对L242C-K334C、A287C-L306C和V259C-L306C符合以下标准:
·对于单突变对，通过DSC的Tm增加>2℃
·在FcγRIIb和FcγRIIa结合方面，保留野生型样特性(WT值±30％)
二硫键V240C-I332C提高了Tm，但部分消除了FcγR结合。预计此类二硫键仍然可用于结合的消除是需要的或者可以通过包含促进与一个或多个FcγR结合的其他突变来减轻的某些情况中。
实施例4：FcγRIIB选择性Fc变体的稳定
将如实施例1-3中所述的在曲妥珠单抗同源二聚体中鉴定的六个最佳个体突变(A287F、M428F、T250V、L309Q、L242C_I336C和V308I)移植到两种不同的异源二聚体曲妥珠单抗FcγRIIb选择性变体(支架8和支架9)中，以评估它们与其他CH2结构域突变的相容性。此外，测试了两个或三个稳定性增强突变(A287F/M428F、A287F/T250V、M428F/T250V、A287F/M428F/T250V、T250V/L309Q和L242C_I336C/V308I)的六种组合以评估是否可以通过相加或协同效应获得稳定增加。
如一般方法中所述构建了单臂抗体形式的二十四种曲妥珠单抗变体。每种变体包括两组FcγRIIb选择性增强突变(支架8或支架9；参见表4.1)之一以及表4.2至4.4中所示的稳定性增强突变。如实施例1中所述，评估每种变体的表达、聚集、热稳定性和对FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRI的结合亲和力。结果示于表4.2至4.4中。
表4.1：用于评估稳定性和选择性增强突变的相容性的亲本变体
Figure BDA0004113659340000601
*模板1表示将325-331位之间的序列替换为以下序列：STWFDGGYAT[SEQ ID NO:1]
基于分析SEC曲线图在纯化后应用第一层过滤。对存在的所有信号的色谱图曲线下面积进行积分，并转换为变体样品中存在的每个物种的百分比。在分析SEC曲线图中观察到的高分子量(HMW)物种的百分比表明了使用单一DNA比率进行表达时每种变体形成的全尺寸抗体的丰度。在以单一DNA比率表达时，HMW物种少于20％的变体被认为是成功的。只有3种变体具有多于20％的HMW物种(参见表4.2)并且未包括在进一步的表征中。低分子量(LMW)物种表明存在错配的Fc同源二聚体，这不会干扰Tm的测定或对任何FcγR的结合亲和力。
表4.2：稳定性和选择性增强突变的相容性：表达和聚合
Figure BDA0004113659340000602
Figure BDA0004113659340000611
1HMW百分比、异源二聚体百分比、LMW百分比和单体的保留时间全部都与分析SEC所观察到的每种变体的曲线图有关，并且表明了它们的相对丰度。HMW百分比对应于错配的全尺寸抗体，异源二聚体百分比对应于异源二聚体单臂抗体，并且LMW百分比对应于错配的同源二聚体Fc或半抗体。
2支架8
3支架9
表4.3：稳定性和选择性增强突变的相容性：热稳定性
Figure BDA0004113659340000612
Figure BDA0004113659340000621
1报告了通过DSF观察到的CH2结构域的转变
2ΔTm表明Tm突变-Tm亲本(v27923或v27924)之间的差异。
3理论ΔTm意指基于相应亲本变体中的点突变的加性稳定效应
4支架8
5支架9
6N/A表示数据由于样品纯度低而未被收集
表4.4：稳定性和选择性增强突变的相容性：对FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRI的结合亲和力
Figure BDA0004113659340000622
Figure BDA0004113659340000631
1支架8
2支架9
3N/A表示数据由于样品纯度低而未被收集
基于以下标准评估突变：
·对于单点突变，通过DSF的Tm增加>1℃，并且组合时的加性效应最小
·在FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRI结合方面，保留野生型样的特性(与亲本变体相比差异<2倍)
·通过分析SEC的异源二聚体含量>75％。
基于以上的最有效的单突变是A287F(+3.5-4℃)、T250V(+5.5℃)、L309Q(+2-2.5℃)和M428F(+2℃)。V308I作为单突变还提供了Tm的小幅增加(+0.5至1.0℃)。
具有加性或协同贡献的稳定性增强设计包括A287F/M428F(+6.5-7℃)、A287F/T250V(+9.0-9.5℃)、M428F/T250V(+8.5℃)和T250V/L309Q(+8.5-9.0℃)。A287F/M428F、M428/T250V和T250V/L309Q组合产生略高于加性效应的Tm增加，而A287F/T250V产生加性效应。组合L242C_I336C/V308I还提供了相比于单独L242C_I336C突变的Tm的小幅增加。
实施例5：其他全尺寸抗体测试系统的稳定
三种稳定性增强设计各自与三种FcγRIIb选择性增强设计组合，并转移到三种不同的全尺寸抗体系统中，以评估设计在抗体间的可转移性。如一般方法中所述将设计克隆到异源二聚体曲妥珠单抗、抗CD19和抗CD40抗体(支架3-5)中。三种FcγRIIb选择性增强设计如表5.1所示，并且三种选定的稳定性增强设计如表5.2-5.5所示。
表5.1：用于评估稳定性和选择性增强突变相容性的亲本变体
Figure BDA0004113659340000641
1“模板1.1”表示将325-331位的氨基酸残基替换为以下序列：STWFIGGYAT[SEQ IDNO:3]。
2“模板7.1”表示将325-331位的氨基酸残基替换为以下序列：GLDHRGKGYV[SEQ IDNO:4]。
如实施例1中所述评估每种变体在哺乳动物细胞中的表达、纯化后聚集和热稳定性。如实施例1中所述评估基于曲妥珠单抗的变体对FcγRI、FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRIIIa的结合亲和力。如一般方法中所述评估基于曲妥珠单抗的变体的C1q结合。热稳定性通过多种抗体中的DSF和基于曲妥珠单抗的变体的DSC来评估。结果示于表5.2至5.6中。
如一般方法中所述收集分析SEC曲线图，并对全尺寸抗体物种进行以下修改。对存在的所有信号的色谱图曲线下面积进行积分，并转换为每个物种的百分比。在aSEC曲线图中观察到的高分子量(HMW)物种的百分比表明在引入稳定性增强突变后每种变体形成的聚集体的量，并与每个抗体系统中的亲本变体进行比较。多种抗体中具有亲本样特性的变体(+/-5％的HMW物种)是优选的。较低分子量(LMW)物种表明存在错配的异源二聚体重链，这会导致半抗体，并且这是由于在表达过程中使用了未优化的DNA比率。结果示于表5.2。
如一般方法中所述评估通过LC-MS的纯度，以确认单体内含物主要是所需的异源二聚体物种。半体A和半体B的累积百分比表明了用于表达的给定DNA比率的每个样品中存在的错配同源二聚体的量。由于稳定性增强突变是对称的，所以CH2结构域Tm、FcRn和C1q结合不受错配物种存在的影响。然而，高含量的错配同源二聚体将影响通过SPR观察到的FcγRIIb选择性。大多数样品显示少于10％的错配同源二聚体。参见表5.3。
表5.2：异源二聚体纯度(分析SEC)
Figure BDA0004113659340000651
Figure BDA0004113659340000661
1HMW百分比、单体百分比、LMW百分比和单体的保留时间都与分析SEC观察到的每种变体的曲线图有关，并且表明了它们的相对丰度。HMW百分比对应于聚集体，单体百分比对应于异源二聚体和错配同源二聚体，并且LMW百分比对应于半体。
2异源二聚体曲妥珠单抗-支架3。
表5.3：异源二聚体纯度(LCMS)
Figure BDA0004113659340000662
Figure BDA0004113659340000671
1异源二聚体曲妥珠单抗-支架3。
表5.4：热稳定性
Figure BDA0004113659340000672
Figure BDA0004113659340000681
1ΔTm表示通过DSC或DSF评估的每个设计的Tm突变-Tm亲本(v29689、v29715或v29724)之间的差异。
2异源二聚体曲妥珠单抗-支架3。
3ND＝未测定
表5.5：基于曲妥珠单抗的变体1的FcγR结合
Figure BDA0004113659340000682
1没有变体显示通过SPR的与FcγRIIIaV和FcγRIIIaF的任何可检测的结合。
2相对于野生型的变化，表示为FcγRIIb和FcγRIIa的KD wt/KD mut。
3异源二聚体曲妥珠单抗-支架3。
4NB＝没有观察到结合。
表5.6：基于曲妥珠单抗的变体的C1q结合
Figure BDA0004113659340000691
1异源二聚体曲妥珠单抗-支架3。
2从结合信号超过0.5吸收的C1q浓度计算的C1q结合亲和力，如从曲线拟合内推。
3C1q结合亲和力，如从2μg/ml的测定吸光度计算。
2NB＝未检测到结合。
测试的所有三种稳定性增强设计(A287F/T250V、M428F/T250V和A287F/M428F)成功地将热稳定性增加了6-10℃，同时在评估的所有其他方面都保持了亲本样特性。具体来说，设计符合以下标准：
·所有3种抗体中，通过DSF的Tm增加>5℃。
·在FcγRI、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIa和C1q结合方面，保留野生型样特性(与亲本变体相比差异<2倍)。
·通过LC-MS的异源二聚体含量等同或优于亲本变体。
·单体含量类似于或优于通过aSEC得到的亲本变体。
实施例6：包含稳定性增强设计的全尺寸抗体的FcRn结合
如实施例5中所述，三种稳定性增强设计各自与三种FcγRIIb选择性增强设计组合，并转移到三种不同的全尺寸抗体系统(曲妥珠单抗、抗CD19抗体和抗CD40抗体；支架3-5)中。如一般方法(针对支架3/5的方案2和针对支架3-5的方案3)中所述评估所得变体的FcRn结合。结果示于表6.1。
表6.1：包含稳定性增强和FcγRIIb选择性增强设计的抗体的FcRn结合
Figure BDA0004113659340000701
Figure BDA0004113659340000711
1异源二聚体曲妥珠单抗–支架3。
2通过一般方法中的方案2确定的KD。相对于亲本变体的倍数变化，表示为KD wt/KDmut
3通过一般方法中的方案3确定的KD。相对于亲本变体的倍数变化，表示为KD wt/KDmut
4ND＝未测定，因为抗体未结合蛋白L。
5v29724在通过方案3(一般方法)评估时表现出非标准的形式。通过方案2(一般方法)评估的结合与其他变体相当。
对于测试的所有抗体，与相应的亲本变体相比，稳定性增强设计没有改变FcRn结合(KD<亲本变体的3倍)，表明设计在不同抗体间可转移。
实施例7：稳定性增强设计与其他导致稳定性损失的突变的相容性
为了进一步评估三种性能最佳的稳定性增强设计的可转移性和兼容性(A287F/T250V、M428F/T250V和A287F/M428F)，这些设计各自与以下三组CH2或CH3突变(支架3、6和7；参见一般方法)组合：
·支架3：CH3结构域中促进异源二聚体Fc形成的不对称突变。
·支架6：产生非糖基化抗体并消除抗体的效应功能的N297A突变。与野生型抗体相比，引入N297A突变将变体抗体的热稳定性降低了10℃。
·支架7：增加抗体对FcγRIIIa受体的亲和力的S239D/I332E突变。与野生型抗体相比，引入S239D/I332E突变将变体抗体的热稳定性降低了20℃。
如一般方法中所述，将相应的亲本变体和突变体克隆到曲妥珠单抗支架中。如一般方法中所述，评估每种变体在哺乳动物细胞中的表达(方案1)、热稳定性、对FcγRI、FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRIIIa的结合亲和力(方案1)和FcRn结合(方案4)。通过DSC评估热稳定性(方案1)。结果显示在表7.1至7.4和图2A至C中。
表7.1：稳定性增强突变对不同抗体支架中FcγRI和FcγRIII结合的影响
Figure BDA0004113659340000721
1相对于亲本变体的倍数变化，表示为KD wt/KD mut
2NB＝未检测到结合。
表7.2：稳定性增强突变在不同抗体支架中对FcγRII结合的影响
Figure BDA0004113659340000731
1相对于亲本变体的倍数变化，表示为KD wt/KD mut
2NB＝未检测到结合。
表7.3：稳定性增强突变在不同抗体支架中对FcRn结合的影响
Figure BDA0004113659340000732
1相对于亲本变体的倍数变化，表示为KD wt/KD mut
表7.3：稳定性增强突变在不同抗体支架中对热稳定性(Tm)的影响
Figure BDA0004113659340000741
1CH2转变与Fab和CH3转变重叠，并且无法准确测定
测试的所有三种稳定性增强设计(A287F/T250V、M428F/T250V和A287F/M428F)成功地将每个测试的支架的热稳定性提高了6-10℃，同时在评估的所有其他方面都保持了亲本样特性。具体来说，所有三个设计符合以下标准：
·所有3种支架中，通过DSC的Tm增加>5℃。
·在FcγRI、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcRn结合方面，保留野生型样特性(与亲本变体相比差异<2倍)。
因此，稳定性增强设计与改变抗体功能和生物学特性的CH2和CH3结构域中的突变相容并且能够稳定这些突变。
上述CH2或CH3突变组(以支架3、6和7为例)是目前临床评估的治疗性分子中包含的突变实例(Saxena等人,2016,Front Immunol,7:580)。其他影响抗体功能和稳定性的CH2和/或CH3突变，诸如杵臼结构(Ridgeway等人.,1996,Protein Eng.,9:617-621)、静电转向(Gunasekaran等人,2010,JBC,285,19637-19646)或本领域已知的其他突变，预计也与稳定性增强突变相容并由其稳定。
实施例8：稳定性增强设计与其他免疫球蛋白类别的相容性
评估对IgG、IgA、IgD、IgE和IgM恒定结构域的序列和拓扑结构，以确定上述鉴定的最有效的稳定性增强设计是否可以转移到其他免疫球蛋白(Ig)类别和/或亚型。
各种Ig类别具有不同的功能和生物活性，但具有共同的拓扑结构。IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全部都由重链和轻链构成。IgG、IgA和IgD恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域，它们共享共同的Ig折叠，这表明增加IgG稳定性的突变可以转移到IgA和IgD类别。IgE和IgM与其他Ig类别不同，并由CH1、CH2、CH3和CH4结构域构成。基于序列同一性，可以认为IgM和IgE的CH3和CH4结构域等同于其他Ig类别的CH2和CH3结构域(参见图3A和3B)。对从蛋白质数据库(PDB)获得的IgG、IgA和IgM Ig结构域(分别为PDB ID：2QEJ、2WAH和6KXS)的结构的回顾表明，从结构的角度来看，这些结构域具有类似的折叠，表明增加IgG稳定性的突变可以转移到IgM类以及IgE类。
进一步分析CH2和CH3结构域内T250V、A287F和M428F突变中每一个的特异性相互作用为稳定性增强突变应该可转移到其他Ig类别的提议提供了进一步支持。
残基T250位于靠近CH2结构域的FcRn结合位点的IgG1的螺旋区，并且空间上靠近CH3结构域。苏氨酸残基在此位置的所有IgG亚型中都是保守的，并被IgM中的相似极性残基(丝氨酸)和IgA、IgD和IgE中的带电荷的残基(天冬氨酸)取代(见图3A)。IgA、IgM和IgG中此区域的结构分析表明，与IgG1(PDBID：2WAH)相比，IgA和IgM中的螺旋被掩埋得更少(PDBID：2QEJ和6KXS)。因此，在其他Ig类别中相当于T250位置的带电荷或极性残基突变为较小的疏水残基可以改善第一个螺旋(246-254)针对第二个螺旋(309-316)的堆积和CH2-CH3结构域的连接，导致掩埋界面增加的更紧凑结构。这反过来又可以稳定CH2结构域以防止热变性。因此，预计稳定性增强突变T250V有效提高IgA、IgD和IgG抗体的CH2结构域以及IgE和IgM抗体的CH3结构域的稳定性。
残基A287位于IgG1的CH2结构域的Ig折叠外侧的暴露β链区域。丙氨酸残基在所有IgG亚型以及IgA中的287位是保守的，但在IgD、IgE和IgM中被残基(诸如缬氨酸、组氨酸和苏氨酸)取代。然而，不管此位置存在的不同的残基，局部环境和折叠在所有结构可用的Ig类别中都是类似的。如实施例1中所述，通过IgG1中的突变A287F的稳定在能量上是有利的，并且可能源于与W277位的堆叠Π-Π相互作用的产生以及W277位与S304位之间氢键的掩埋。残基W277在所有Ig类别中都是保守的，而残基S304在除IgM之外的所有Ig中都是保守的(参见图3A和图3B)。因此，还预计A287F突变有效提高IgA、IgD和IgG抗体的CH2结构域和IgE和IgM抗体的CH3结构域的稳定性。
残基M428位于IgG1的CH3结构域的暴露β链区域，并且在空间上位于与CH2结构域的交界面。428位的甲硫氨酸在所有IgG亚型中都是保守的，而其他Ig类别在此位置含有较小的残基，诸如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸或丝氨酸(参见图3A和3B)。在此位置引入较大的残基(诸如苯丙氨酸)可能会将疏水侧链掩埋在CH2结构域的螺旋上，所得在CH2-CH3结构域连接处的掩埋表面增加降低了CH2结构域的柔韧性并增加了其稳定性。IgA和IgM中的局部结构环境与此区域中的IgG类似，并且预期引入大的芳族残基(诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)与周围芳族形成额外的堆叠Π-Π相互作用。因此，还预测突变M428F会增加IgA、IgD和IgG抗体的CH2结构域以及IgE和IgM抗体的CH3结构域的稳定性。
如实施例4-7中所证明的，T250V、A287F和M428F稳定性增强突变成对相容并且可以组合以产生加性稳定效应。对于这些稳定性增强设计(A287F/T250V、M428F/T250V和A287F/M428F)，预计其他Ig类别也有类似的相容性。
实施例9：应力条件下稳定性突变对聚集倾向的影响
为了评估通过掺入稳定性增强突变实现的热稳定性增加是否可以减少抗体的聚集倾向，制备了十五种具有或不具有T250V/A287F稳定性增强设计的具有有一系列热稳定性的变体Fc区的抗体。然后将得到的抗体变体进行应力实验，其中在中性或弱酸性条件下，在40℃下孵育2周后评估它们的聚集体比例变化。
每个抗体变体均基于支架3，并包含如表9.1中所示的CH2结构域中的各种突变组合。如一般方法中所述，将相应的亲本变体和稳定性突变体克隆到支架3中。评估每种变体在哺乳动物细胞中的表达(方案2)、通过尺寸排阻色谱的聚集和通过DSF的热稳定性(方案2)。结果示于表9.1和9.2中。
随后，将每种变体归一化为10mg/ml，渗析到基于乙酸盐或磷酸盐的缓冲液中用于分别在弱酸性或中性条件下进行测试，并在4℃或40℃下孵育2周。然后通过尺寸排阻色谱法评估每种变体的聚集体、单体和片段比例，比较4℃和40℃的样品。结果示于表9.3和图4。
Figure BDA0004113659340000781
Figure BDA0004113659340000791
表9.2：亲本和稳定化变体的热稳定性
Figure BDA0004113659340000801
表9.3：中性和酸性条件下应激后亲本和稳定化变体聚集倾向的变化
Figure BDA0004113659340000802
1在40℃下在指定缓冲液中孵育2周后总HMW物种的变化
2ΔHMW物种[稳定化]-ΔHMW物种[未稳定化]
从表9.2可以看出，掺入T250V/A287F稳定性增强突变成功地将十五种变体的热稳定性增加了7.7℃至10.6℃。因此，这些稳定性增强突变能够增加CH2稳定性，而与抗体构建体的起始稳定性无关。
表9.3中的结果显示，在40℃、酸性条件下孵育2周后，CH2 Tm最低的三种变体(变体v31186、v32210和v32242)显示出通过分析SEC观察到的高水平聚集。当稳定性增强T250V/A287F突变被添加到这些变体中时，变体的Tm增加，并且在应激实验后检测到最少量的HMW物种。在图4中也可以看出CH2 Tm与这些变体在弱酸性条件下观察到的聚集之间的强且近似的指数的相关性。对于初始(未稳定化)CH2 Tm高于60℃的变体，观察到很小的高分子量物种的变化(<2％)。在中性条件下孵育后观察到的高分子量物种的微小变化似乎与CH2 Tm无关。
总体而言，这些结果表明稳定突变(并且具体的T250V/A287F)的掺入通常可以在弱酸性条件下降低聚集倾向。
本说明书中提及的所有专利、专利申请、出版物和数据库条目的公开内容特此明确地以引用的方式整体并入，其程度就如同明确且单独地指出每个这种单独的专利、专利申请、出版物和数据库条目以引用的方式并入一样。
意图将对于本领域技术人员而言将显而易见的本文所述的特定实施方案的修改包括在以下权利要求的范围内。

Claims (59)

1.一种Fc变体，其包含一个或多个选自以下的稳定性增强氨基酸突变：
250位的突变，其中所述突变是250位的氨基酸被Ala、Ile或Val取代；
287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；
308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；
309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代；
428位的突变，其中所述突变是428位的氨基酸被Phe取代；以及
242位和336位的一对突变，其中两个突变都是用Cys进行的取代，
其中所述Fc变体的CH2结构域解链温度(Tm)相比于不包含所述一个或多个稳定性增强氨基酸突变的亲本Fc增加，并且
其中氨基酸的编号根据EU索引。
2.根据权利要求1所述的Fc变体，其中所述Fc变体包含单个稳定性增强氨基酸突变，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；以及309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代。
3.根据权利要求1所述的Fc变体，其中所述Fc变体包含两个或更多个稳定性增强氨基酸突变，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代。
4.根据权利要求1所述的Fc变体，其中所述Fc变体包含三个或更多个稳定性增强氨基酸突变，所述突变包括：242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
5.一种Fc变体，其包含一至三个稳定性增强氨基酸突变，所述突变包括：
(a)一个或多个突变，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；以及309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；或
(b)两个或更多个突变，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代；或
(c)三个或更多个突变，所述突变包括：242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代，
其中所述Fc变体的CH2结构域解链温度(Tm)相比于不包含所述一个或多个稳定性增强氨基酸突变的亲本Fc增加，并且
其中氨基酸的编号根据EU索引。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的Fc变体，其包含287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代。
7.根据权利要求6所述的Fc变体，其中所述287位的突变是用Phe进行的取代。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的Fc变体，其包含308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的Fc变体，其包含309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代。
10.根据权利要求9所述的Fc变体，其中所述309位的突变是用Gln进行的取代。
11.根据权利要求1和3至5中任一项所述的Fc变体，其包含：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；和287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代。
12.根据权利要求11所述的Fc变体，其中所述250位的突变是用Val进行的取代。
13.根据权利要求11或12所述的Fc变体，其中所述287位的突变是用Phe进行的取代。
14.根据权利要求1和3至5中任一项所述的Fc变体，其包含：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；和309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代。
15.根据权利要求14所述的Fc变体，其中所述250位的突变是用Val进行的取代。
16.根据权利要求14或15所述的Fc变体，其中所述309位的突变是用Gln进行的取代。
17.根据权利要求1和3至5中任一项所述的Fc变体，其包含：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
18.根据权利要求17所述的Fc变体，其中所述250位的突变是用Val进行的取代。
19.根据权利要求1和3至5中任一项所述的Fc变体，其包含：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
20.根据权利要求19所述的Fc变体，其中所述287位的突变是用Phe进行的取代。
21.根据权利要求1和3至5中任一项所述的Fc变体，其包含242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代。
22.根据权利要求1、4或5中任一项所述的Fc变体，其包含：242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代；以及308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代。
23.根据权利要求1或5所述的Fc变体，其中所述Fc变体所包含的所述稳定性增强突变选自：250V、287F、308I、309Q、428F、242C_336C、287F/428F、250V/287F、250V/309Q、250V/428F和242C_336C/308I。
24.根据权利要求1或5所述的Fc变体，其中所述Fc变体所包含的所述稳定性增强突变选自：287F、308I、309Q、242C_336C、287F/428F、250V/287F、250V/309Q、250V/428F和242C_336C/308I。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体基于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM Fc。
26.根据权利要求25所述的Fc变体，其中所述Fc变体基于人IgG、IgA、IgD、IgE或IgMFc。
27.根据权利要求1至24中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体基于IgG Fc。
28.根据权利要求27所述的Fc变体，其中所述IgG Fc是IgG1Fc。
29.根据权利要求27或28所述的Fc变体，其中所述IgG Fc是人IgG Fc。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的Fc变体，其中所述亲本Fc包含一个或多个改善所述Fc区功能的氨基酸突变。
31.根据权利要求1至29中任一项所述的Fc变体，其中所述亲本Fc包含一个或多个改善所述Fc区功能并降低对应的野生型Fc的CH2结构域Tm的氨基酸突变。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加至少0.5℃。
33.根据权利要求32所述的Fc变体，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加至少1.0℃、至少2.0℃或至少3.0℃。
34.根据权利要求1至31中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加0.5℃至9.0℃。
35.根据权利要求1至31中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加2.0℃至10.5℃。
36.一种多肽，其包含根据权利要求1至35中任一项所述的Fc变体和一个或多个融合或共价连接至所述Fc变体的蛋白质部分。
37.根据权利要求36所述的多肽，其中所述一个或多个蛋白质部分包含抗原结合结构域、配体、受体、受体片段、细胞因子或抗原。
38.根据权利要求37所述的多肽，其中所述一个或多个蛋白质部分中的至少一个是抗原结合结构域。
39.根据权利要求37所述的多肽，其中所述抗原结合结构域是Fab或scFv。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的多肽，其中所述多肽是抗体或抗原结合抗体片段。
41.根据权利要求40所述的多肽，其中所述多肽是治疗性抗体或抗体片段。
42.一种多核苷酸或多核苷酸组，所述多核苷酸编码根据权利要求1至35中任一项所述的Fc变体。
43.一种多核苷酸或多核苷酸组，所述多核苷酸编码根据权利要求36至41中任一项所述的多肽。
44.一种载体或载体组，所述载体包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至35中任一项所述的Fc变体或根据权利要求36至41中任一项所述的多肽。
45.一种宿主细胞，其包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至35中任一项所述的Fc变体或根据权利要求36至41中任一项所述的多肽。
46.一种制备根据权利要求1至35中任一项所述的Fc变体的方法，其包括用一个或多个编码所述Fc变体的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适合表达所述Fc变体的条件下培养所述宿主细胞。
47.一种制备根据权利要求36至41中任一项所述的多肽的方法，其包括用一个或多个编码所述多肽的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适合表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞。
48.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至35中任一项所述的Fc变体或根据权利要求36至41中任一项所述的多肽。
49.一种增加Fc的CH2结构域解链温度(Tm)的方法，其包括将一个或多个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc中以提供CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加的Fc变体，所述突变选自：
250位的突变，其中所述突变是250位的氨基酸被Ala、Ile或Val取代；
287位的突变，其中所述突变是287位的氨基酸被Phe、His、Met、Trp或Tyr取代；
308位的突变，其中所述突变是308位的氨基酸被Ile取代；
309位的突变，其中所述突变是309位的氨基酸被Gln或Thr取代；
428位的突变，其中所述突变是428位的氨基酸被Phe取代；以及
242位和336位的一对突变，其中两个突变都是用Cys进行的取代，
其中氨基酸的编号根据EU索引。
50.根据权利要求49所述的方法，其包括将单个稳定性增强氨基酸突变引入所述亲本Fc，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代。
51.根据权利要求49所述的方法，其包括将两个或更多个稳定性增强氨基酸突变引入所述亲本Fc，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代。
52.根据权利要求49所述的方法，其包括将三个或更多个稳定性增强氨基酸突变引入所述亲本Fc，所述突变包括：242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代。
53.一种增加Fc的CH2结构域解链温度(Tm)的方法，其包括将一至三个稳定性增强氨基酸突变引入亲本Fc中以提供CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加的Fc变体，所述突变包括：
(a)一个或多个突变，所述突变选自：287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；以及309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；或
(b)两个或更多个突变，所述突变选自：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代；以及242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代；或
(c)三个或更多个突变，所述突变包括：242位和336位的一对突变，所述突变都是用Cys进行的取代，以及选自以下的突变：250位的突变，所述突变是用Ala、Ile或Val进行的取代；287位的突变，所述突变是用Phe、His、Met、Trp或Tyr进行的取代；308位的突变，所述突变是用Ile进行的取代；309位的突变，所述突变是用Gln或Thr进行的取代；以及428位的突变，所述突变是用Phe进行的取代，
其中氨基酸的编号根据EU索引。
54.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加至少0.5℃。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加至少1.0℃、至少2.0℃或至少3.0℃。
56.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加0.5℃至9.0℃。
57.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述Fc变体的CH2结构域Tm相比于所述亲本Fc增加2.0℃至10.5℃。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的方法，其中将所述稳定性增强氨基酸突变引入所述亲本Fc提供了Fc变体，所述Fc变体显示出与所述亲本Fc区相比在弱酸性条件下聚集减少。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述稳定性增强氨基酸突变包括250V和287F。
CN202180059384.2A 2020-05-20 2021-05-20 包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc区变体 Pending CN116133685A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063027569P 2020-05-20 2020-05-20
US63/027,569 2020-05-20
US202163163686P 2021-03-19 2021-03-19
US63/163,686 2021-03-19
PCT/CA2021/050691 WO2021232163A1 (en) 2020-05-20 2021-05-20 Immunoglobulin fc region variants comprising stability-enhancing mutations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116133685A true CN116133685A (zh) 2023-05-16

Family

ID=78708881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180059384.2A Pending CN116133685A (zh) 2020-05-20 2021-05-20 包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc区变体

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230303715A1 (zh)
EP (1) EP4153620A1 (zh)
JP (1) JP2023526114A (zh)
KR (1) KR20230043790A (zh)
CN (1) CN116133685A (zh)
AU (1) AU2021274316A1 (zh)
BR (1) BR112022023570A2 (zh)
CA (1) CA3144731A1 (zh)
MX (1) MX2022014454A (zh)
WO (1) WO2021232163A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024089609A1 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Ablynx N.V. Glycoengineered fc variant polypeptides with enhanced effector function

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005037867A1 (en) * 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. ALTERATION OF Fc-FUSION PROTEIN SERUM HALF-LIVES BY MUTAGENESIS OF POSITIONS 250, 314 AND/OR 428 OF THE HEAVY CHAIN CONSTANT REGION OF IG
US20060067930A1 (en) * 2004-08-19 2006-03-30 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2012515556A (ja) * 2009-01-23 2012-07-12 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 低下したエフェクタ機能を有する安定化Ｆｃポリペプチドおよび使用方法
WO2012032080A1 (en) * 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
EP2686345B1 (en) * 2011-03-16 2018-04-25 Amgen Inc. Fc variants

Also Published As

Publication number Publication date
CA3144731A1 (en) 2021-11-25
MX2022014454A (es) 2023-02-27
EP4153620A1 (en) 2023-03-29
AU2021274316A1 (en) 2023-02-02
BR112022023570A2 (pt) 2023-01-24
WO2021232163A1 (en) 2021-11-25
US20230303715A1 (en) 2023-09-28
JP2023526114A (ja) 2023-06-20
KR20230043790A (ko) 2023-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111601825B (zh) 全人源的抗b细胞成熟抗原(bcma)单链抗体及其应用
CN108283001B (zh) 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途
CN115028721A (zh) 抗-肌肉生长抑制因子抗体、包含变体fc区的多肽及使用方法
MX2011000071A (es) Inmunoterapeuticos de interleucina-6 (il6).
CN116133685A (zh) 包含稳定性增强突变的免疫球蛋白Fc区变体
US11965019B2 (en) Stabilized chimeric Fabs
JP2024528573A (ja) Ｈｇｆｒとｅｇｆｒに特異的に結合する抗原結合分子及びその医薬使用
KR20230030577A (ko) Fc 감마 RIIb에 대해 선택적인 이종이량체 Fc 변이체
WO2019184898A1 (zh) 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)的小型化抗体、其聚合物及应用
WO2024213046A1 (en) Anti-cd25 antibody and uses thereof
CA3231124A1 (en) Antibodies targeting ccr2
JP2024540196A (ja) Ｃｃｒ２を標的とする抗体
TW202334225A (zh) 抗ｉｃｏｓｌ抗體融合蛋白及用途
CN118119638A (zh) 具有高热稳定性和减弱的效应子功能的fc变体
JP2024517907A (ja) 抗原結合分子
TW202325743A (zh) 特異性結合ｃｄ３８、ｂｃｍａ和ｃｄ３的抗原結合分子及其醫藥用途
TW202246333A (zh) 特異性結合ｂｃｍａ和ｃｄ３的抗原結合分子及其醫藥用途
CN118076634A (zh) 抗TGFβ1、2、3抗体及其治疗用途
CN117916259A (zh) 特异性结合cgrp和pacap的抗原结合分子及其医药用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: British Columbia

Applicant after: Enzymatic British Columbia Ltd.

Address before: British Columbia

Applicant before: Yeast Biopharmaceutical Co.,Ltd.

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40092460

Country of ref document: HK