JP2011046722A5

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Publication number: JP2011046722A5
Application number: JP2010226505A
Authority: JP
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2011-04-21

Claims

ユビキチン様折り畳みモチーフを有する修飾ユビキチンタンパク質であって、
（i）前記修飾ユビキチンタンパク質は、下記条件（1）及び（2）を満たす置換を含み、
（1）前記置換は、βシート鎖に存在するアミノ酸の１５〜４０％を含む；
（2）前記置換は、前記修飾タンパク質の表面露出領域における５〜１０アミノ酸の隣接する領域に存在する；そして
（ii）前記修飾の結果として、
（1）前記修飾ユビキチンタンパク質は、予め定められた結合パートナーであって、未修飾ユビキチンタンパク質が結合しない結合パートナーに結合し、
（2）前記修飾ユビキチンタンパク質は、前記予め定められた結合パートナーに対して１０^-5Ｍから１０^-12ＭのＫ_Dで表される結合親和性を示し、
（3）前記修飾ユビキチンタンパク質は、少なくとも８０％以上が前記未修飾ユビキチンタンパク質と同一である、修飾ユビキチンタンパク質。
ユビキチン様折り畳みモチーフを有する修飾ユビキチンタンパク質であって、
（i）前記修飾ユビキチンタンパク質は、下記条件（1）及び（2）を満たす置換を含み、
（1）前記置換は、βシート鎖に存在するアミノ酸の１５〜４０％を含む；
（2）前記置換は、前記修飾タンパク質の表面露出領域における５〜１０アミノ酸の隣接する領域に存在する；そして、
（ii）前記修飾の結果として、
（1）前記修飾ユビキチンタンパク質は、予め定められた結合パートナーであって、未修飾ユビキチンタンパク質が結合しない結合パートナーに結合し、
（2）前記修飾ユビキチンタンパク質は、前記予め定められた結合パートナーに対して１０^-5Ｍから１０^-12ＭのＫ_Dで表される結合親和性を示し、
（3）前記修飾ユビキチンタンパク質は、少なくとも８０％以上が前記未修飾ユビキチンタンパク質と同一であり、
下記のステップを含む製造方法により得られうる、修飾ユビキチンタンパク質。
ａ）修飾されるユビキチンタンパク質を準備すること；
ｂ）結合パートナーを予め決定すること、ここで、前記予め決定したパートナーは、前記修飾されるタンパク質に結合しない；
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の表面露出領域におけるアミノ酸を選択すること；
ｄ）前記選択アミノ酸を、置換、挿入、欠失、化学修飾又はこれらの組み合わせにより、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持しながら修飾すること、ここで、前記修飾は前記タンパク質の表面の５〜１０アミノ酸の隣接する領域を形成し、さらに、前記修飾はβシート領域におけるβシート鎖に位置する１５％〜４０％のアミノ酸を含み、
ｅ）前記修飾タンパク質を、工程ｂで決定した結合パートナーと接触させること；
ｆ）前記修飾ユビキチンタンパク質が工程ｄに記載の要件を満たすこと、さらに、前記修飾ユビキチンタンパク質のＫ_Dで表される結合親和性が工程ｂにおいて予め定められた結合パートナーに対して１０^-5Ｍから１０^-12Ｍであることを確認すること；
ｇ）工程ｆで確認した前記修飾タンパク質は、少なくとも８０％以上が前記修飾前のユビキチンタンパク質と同一である。
前記タンパク質が、ヒトユビキチン又はその他の哺乳類のユビキチンである、請求項１又は２記載のタンパク質。
前記修飾が、前記タンパク質の表面の６から８アミノ酸の隣接する領域を含み、好ましくはその２から４アミノ酸が表面露出βシートにある、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質。
第１及び第４βシート鎖の表面露出アミノ酸が修飾され、必要に応じて、さらに、哺乳類ユビキチンの非βシート領域の第６２から６５番目の領域が修飾された、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質。
前記修飾が、一次配列で直接隣接した又は直接隣接していないアミノ酸を少なくとも１以上含み、好ましくは、一次配列において隣接していない修飾されたアミノ酸が、二次構造において隣接した結合パートナーに対する結合領域を形成する、請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質。
一次配列において直接隣接したアミノ酸の修飾、好ましくは、置換される数が、２から８の直接隣接したアミノ酸である、請求項１から６のいずれかに記載のタンパク質。
一次配列において互いに直接隣接した修飾されたアミノ酸の部分が、βシート鎖の開始又は終結部分であって、前記部分が、２、３又はそれ以上のアミノ酸長である、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質。
一次配列において互いに直接隣接する５以上のアミノ酸が置換され、そのうちの１、２、３又はそれ以上の直接隣接したアミノ酸が、βシート鎖領域の開始又は終結部分を形成する、請求項１から８のいずれかに記載のタンパク質。
前記ユビキチンのβ鎖に存在する少なくとも２５％のアミノ酸が修飾されている、請求項１から９のいずれかに記載のタンパク質。
さらに、前記タンパク質のループ領域のアミノ酸が修飾されている、請求項１から１０のいずれかに記載のタンパク質。
ヒトユビキチンであって、少なくとも８個のユビキチンの表面露出アミノ酸が置換されており、前記修飾アミノ酸が結合パートナーに対する結合親和性を有する領域を含む、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質。
前記８個の表面露出アミノ酸のうち少なくとも６個が、前記タンパク質のβシート領域に指定される領域内に存在する、請求項１２記載のタンパク質。
置換された少なくとも５個のアミノ酸が、一次配列において互いに直接隣接している、請求項１２又は１３に記載のタンパク質。
前記タンパク質のアミノ末端βシート鎖、若しくは、カルボキシ末端βシート鎖、又は両方位置するアミノ酸が修飾されている、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質。
さらに、カルボキシ末端βシート鎖に続くループに位置するアミノ酸が修飾されている、請求項１から１５のいずれかに記載のタンパク質。
前記修飾タンパク質が、第２、４、６、６２、６３、６４、６５若しくは６６番目、又はこれらの組み合わせの位置で、置換されたヒトユビキチンである、請求項１から１６のいずれかに記載のタンパク質。
修飾タンパク質が、合計して置換されたアミノ酸の少なくとも１０のアミノ酸、又は少なくとも１５のアミノ酸を含む、請求項１から１７のいずれかに記載のタンパク質。
置換によって、ヒトユビキチンが、第４４、４８、５４、７０、７２及び７５番目の位置の１以上においてアミノ酸が置換され、第７６番目のアミノ酸が欠失され、ユビキチンが、本質的に天然の結合パートナーとの相互作用を示さない、請求項１８記載のタンパク質。
前記タンパク質が、第４５番目の位置においてフェニルアラニンからトリプトファンへの置換を含むヒトユビキチンである、請求項１から１９のいずれかに記載のタンパク質。
選択されたアミノ酸のランダム置換が行われた、請求項１から２０のいずれかに記載のタンパク質。
前記結合パートナーが、抗原又はハプテンである、請求項１から２１のいずれかに記載のタンパク質。
前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により、同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合されており、それぞれ、二価又は二重特異的な結合特性を示す、請求項１から２２のいずれかに記載のタンパク質。