JP2009539097A - 循環腫瘍細胞アッセイ - Google Patents

Abstract

インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を発現する循環腫瘍細胞を検出、計数、および分析する方法を開示する。これらの方法は、癌のスクリーニングおよびステージ判定、治療レジメンの開発、ならびに治療効果または癌再発などのモニタリングに有用である。そのような循環腫瘍細胞の検出、計数、および分析を容易にする試験キットも提供する。
【図１】

Description

本発明は、腫瘍学および診断検査の分野、より詳細には、癌スクリーニングの方法、ならびに化学療法治療効果または癌再発などを予測およびモニタリングする方法に関する。

インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）は、高濃度で血しょう中を循環している７．５ｋＤポリペプチドであり、ほとんどの組織で検出可能である。ＩＧＦ−１は、構造的にインスリンに類似しており、細胞分化および細胞増殖を刺激し、持続的な増殖をするために、ほとんどの哺乳類細胞型によって必要とされている。これらの細胞型には、とりわけ、ヒト二倍体線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔリンパ球、神経細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および骨髄系幹細胞が含まれる。

ＩＧＦ−１刺激の細胞増殖または分化をもたらす伝達経路における最初のステップは、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）へのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２（または超生理学的濃度のインスリン）の結合である。ＩＧＦ−１Ｒは、チロシンキナーゼ成長因子受容体ファミリーに属し（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ、６１：２０３−２１２、１９９０年）、インスリン受容体と構造的に類似している（Ｕｌｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：２５０３−２５１２、１９８６年）。

疫学研究は、正常レベルの上端にあるＩＧＦ−１レベルが、正常レベルの下端にあるＩＧＦ−１レベルを有する個体と比較して、肺癌、乳癌、前立腺癌、および結腸直腸癌などの癌のリスクを増大させることを示している。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の維持における、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒの役割に関する考慮すべき証拠がある。ＩＧＦ−１Ｒレベルは、肺癌（Ｋａｉｓｅｒら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１９：６６５−６６８、１９９３年；Ｍｏｏｄｙら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５２：１１６１−１１７３、１９９３年；Ｍａｃａｕｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０：２５１１−２５１７、１９９０年）、乳癌（Ｐｏｌｌａｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３８：２２３−２３０、１９８７年；Ｆｏｅｋｅｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：７００２−７００９、１９８９年；Ａｒｔｅａｑａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４１８−１４２３、１９８９年）、前立腺癌および大腸癌（Ｒｅｍａｏｌｅ−Ｂｅｎｎｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５：６０９−６１６、１９９２年；Ｇｕｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０２：１１０１−１１０８、１９９２年）で上昇している。前立腺上皮におけるＩＧＦ−１の脱調節発現は、トランスジェニックマウスにおける異常増殖をもたらす（ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３４５５−３４６０、２０００年）。加えて、ＩＧＦ−１は、ヒト神経膠腫のオートクリン刺激因子のようであるが（Ｓａｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３（１１）：２４７５−７８、１９９３年）、一方で、ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する線維肉腫の成長を刺激することが示されている（Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：３０２１−３０２７、１９９８年）。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ相互作用が様々なヒト腫瘍の成長で演じている役割に関する概説については、Ｍａｃａｕｌａｙ，Ｂｒ．、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６５：３１１−２０、１９９２年を参照のこと。

ＩＧＦ−１Ｒ ＲＮＡに対するアンチセンス発現ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＩＧＦ−１Ｒの干渉によって、ＩＧＦ−１媒介の細胞成長の阻害がもたらされることが示された（例えば、Ｗｒａｉｇｈｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：５２１−５２６、２０００年を参照）。ＩＧＦ−１のペプチドアナログ（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆ．３：１９９−２０５、１９９２年；Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３８８３−３８８９、１９９２年）またはＩＧＦ−１ ＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現するベクター（Ｔｒｏｊａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９４−９７、１９９２年）を用いて、成長を抑制することもできる。加えて、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（Ａｒｔｅａｇａら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔｍ．２２：１０１−１０６、１９９２年；およびＫａｌｅｂｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５５３１−３４、１９９４年）、およびＩＧＦ−１Ｒのドミナントネガティブ変異体（Ｐｒａｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１８１−８５、１９９４年；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２５５８−２５６４、１９９４年；Ｊｉａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：６０７１−６０７７、１９９９年）は、形質転換表現型を逆戻りさせること、腫瘍形成を阻害すること、および転移性表現型の減失を誘導することができる。

ＩＧＦ−１は、アポトーシスの調節でも重要である。アポトーシスは、プログラム細胞死であり、免疫系および神経系の成熟過程を含めた様々な発生過程に関与している。発生での役割に加えて、アポトーシスは、腫瘍形成に対する細胞の重要な安全装置としても意味づけられている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｃｅｌｌ ６５：１０９７−１０９８、１９９１年；Ｌａｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７８６−７８７、１９９３年）。アポトーシスプログラムの抑制は、悪性腫瘍の発達および進行に寄与しうる。

ＩＧＦ−１は、ＩＬ−３依存性造血細胞におけるサイトカイン供給停止によるアポトーシス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔａｒｄｕｃｈｙ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５３５−５４０、１９９２年）およびＲａｔ−１／ｍｙｃＥＲ細胞における血清供給停止によるアポトーシス（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｅ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２８６−３２９５、１９９４年）から防御する。ｃ−ｍｙｃによる誘導を受けた線維芽細胞がそれらの生存に関してＩＧＦ−１に依存していることの実証は、ＩＧＦ−１受容体が、アポトーシスの特異的な抑制による腫瘍細胞の維持における重要な役割、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１Ｒの増殖効果とは異なる役割を有することを示唆している。

アポトーシスに対するＩＧＦ−１の防御効果は、ＩＧＦ−１と相互作用する、細胞表面に存在するＩＧＦ−１Ｒを有することに依存している（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３７３９−４１、１９９５年）。腫瘍細胞の維持における、ＩＧＦ−１Ｒの抗アポトーシス機能への支持は、ＩＧＦ−１Ｒレベルと、アポトーシスの程度と、ラット同系腫瘍の腫瘍形成能との間の定量的相関性を同定した、ＩＧＦ−１Ｒに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた研究によっても提供された（Ｒｅｓｃｉｎｏｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３７３９−３７４１、１９９５年）。過剰発現されたＩＧＦ−１Ｒがｉｎ ｖｉｔｒｏでエトポシド誘導性アポトーシスから腫瘍細胞を防御すること（Ｓｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３０３−０６、１９９５年）、さらに劇的なことに、野生型レベルより低いレベルへの、ＩＧＦ−１Ｒレベルの低減がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞の大規模なアポトーシスを引き起こしたこと（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２４６３−６９、１９９５年）が見出されている。

一部の研究は、ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルが臨床成果と相関していることを示している。腫瘍モデルにおいて、ＩＧＦ−１Ｒは、細胞増殖、生存、および転移を調節し、標的療法に対する耐性を誘導する。ＩＧＦ−１Ｒの阻害は、細胞障害性薬物の活性を有意に増強する（Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１（５）：２０６３−７３）。したがって、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害は、新規な癌療法開発のための有望な戦略と思われる。

上皮組織の悪性腫瘍は、癌の最も一般的な形態であり、癌関連死の大部分の原因となっている。これらの腫瘍の手術療法における進歩により、死亡率は、早期の転移および再発に関連したものが増加しているが、これらは一次診断の時点では、しばしば潜在性である（Ｒａｃｉｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４５８９−９４、１９９８年；Ｐａｎｔｅｌら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１（１３）：１１１３−２４、１９９９年）。例えば、一部の臓器は解剖学的に離れた位置にあるので、それによって、それらが隣接している構造に浸潤し、かつ１ｃｍより大きくなっている前に、それらの臓器の腫瘍が検出される可能性は低くなっている。乳癌に関してさえ、マンモグラフィーによって検出される、乳癌の小腫瘍（＜１ｃｍ）の１２〜３７％は、診断時に既に転移している（Ｃｈａｄｈａ Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ ７３（２）：３５０−３、１９９４年）。

循環腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）は、様々な固形悪性腫瘍を有する患者の血行中に存在している上皮由来の細胞である。それらは原発腫瘍のクローンに由来し、悪性である（Ｆｅｈｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：２０７３−８４、２００２年を参照）。ＣＴＣを、癌腫の癌進行に関する独立的な徴候であると考えることができることを示す証拠が諸文献に蓄積されている（ＢｅｉｔｓｃｈおよびＣｌｉｆｆｏｒｄ、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１８０（６）：４４６−４９、２０００年（乳房）；Ｆｅｅｚｏｒら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．Ｓｕｒｇ．９（１０）：９４４−５３、２００２年（結腸直腸）；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら、Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．８（４）：１６５−７５、１９９９年（黒色腫、前立腺、甲状腺）；Ｇｌａｖｅｓ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４８：６６５−７３、１９８３年（肺）；Ｍａｔｓｕｎａｍｉら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１０（２）：１７１−５、２００３年（胃）；Ｒａｃｉｌａら、１９９８年；Ｐａｎｔｅｌら、１９９９年）。

循環腫瘍細胞の検出および計数は、いくつもの理由から患者ケアにとって重要である。これらは、原発腫瘍の前に検出可能でありえ、したがって、早期診断が可能となる。これらは治療に反応して減少する。したがって、ＣＴＣを計数する能力は、所与の治療レジメンの有効性をモニタリングすることを可能にする。これらは、アジュバントセッティングで、測定可能疾患がない患者における再発をモニタリングするツールとして用いることができる。例えば、ＣＴＣは、乳房切除術の８〜２２年後に、３６％の乳癌患者で存在していることが判明しており、これらは明らかに微小転移巣（単一腫瘍細胞の沈着または複数の腫瘍細胞の非常に小さいクラスター）由来のものであった（Ｍｅｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１０（２４）：８１５２−６２、２００４年）。

加えて、転移性癌を有する患者の循環腫瘍細胞の存在／数は無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）の両方と相関していることが示されているので、ＣＴＣは、ＰＦＳおよびＯＳを予測するのにも使用できる。例えば、Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（１）：１４２０−１４３０、２００５年；Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１（８）：７８１−７９１、２００４年を参照。

しかし、ＣＴＣの単なる検出より感度が高い迅速かつ信頼性の高いアッセイの必要性が残っている。

本発明は、患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性を予測する方法であって、ａ）患者から生物検体を取得するステップと、ｂ）他の試料成分が実質的に除外されるように、生物検体を、腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドと混合して、試料を調製するステップと、ｃ）試料を、上皮細胞に特異的に結合する少なくとも１種の試薬と接触させるステップと、ｄ）試料を、細胞表面のインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する結合親和性を有する薬剤と接触させるステップと、ｅ）試料を分析して、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在を決定するステップとを含み、試料中の、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在が、患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性を予測するものである方法を対象とする。

本発明は、患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性をモニタリングする方法であって、ａ）患者から第１の生物検体を取得するステップと、ｂ）他の試料成分が実質的に除外されるように、第１の生物検体を、腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドと混合して、第１の試料を調製するステップと、ｃ）第１の試料を、上皮細胞に特異的に結合する少なくとも１種の試薬と接触させるステップと、ｄ）第１の試料を、細胞表面のインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する結合親和性を有する薬剤と接触させるステップと、ｅ）第１の試料を分析して、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在および数を決定するステップと、ｆ）ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法を患者に施すステップと、ｇ）ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法を施した後に、患者から第２の生物検体を取得するステップと、ｈ）第２の生物検体を、腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドと混合して、第２の生物検体から第２の試料を調製し、第２の試料に関してステップｃ）〜ｅ）を行うステップと、ｉ）第１の試料中の、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の数を、第２の試料中の、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の数と比較するステップとを含み、第２の試料中の数の方が少ないことが、患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性を示すものである方法も対象とする。

好ましい実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法が抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体である。

本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する循環腫瘍細胞の存在に関して患者試料をスクリーニングするためのキットであって、ａ）磁気コア物質、タンパク質ベースコーティング物質、および腫瘍細胞に特徴的な決定基に特異的に結合する抗体を含み、抗体が前記ベースコーティング物質に直接または間接的に連結されているコーティングされた磁性ナノ粒子と、ｂ）腫瘍細胞以外の試料成分を分析から除外するための細胞特異的色素と、ｃ）ＩＧＦ−１Ｒに対する結合親和性を有する少なくとも１つの検出可能標識された薬剤とを含むキットをさらに対象とする。

以下において明らかになるであろう本発明の以上および他の目的、ならびに利点および特徴と共に、以下の本発明の詳細な説明、図、および添付されている特許請求の範囲を参照して、本発明の本質を、より明確に理解することができる。

本明細書中で別段に定義されない限り、本発明に関連して使用する科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈が別段のことを要求しない限り、単数形の用語には複数が含まれるものとし、複数形の用語には単数が含まれるものとする。

米国では毎年、１００万件を超える、癌の新規の症例が診断されており、この国での死亡のうち約５件につき１件が、癌、またはその治療に関連した合併症によって引き起こされている。この疾患の治療および診断の改善を目的として、少なからぬ継続的努力が行われている。ほとんどの癌患者は、彼らの原発腫瘍によって死亡するのではなく、むしろ彼らは転移、すなわち元の腫瘍から脱離し、しばしば遠隔部位まで体内を移動する悪性細胞によって確立された複数の広範囲の腫瘍コロニーのため死亡する。残念ながら、転移コロニーは、しばしば、検出および排除するのが原発腫瘍より困難であり、それらすべての治療に成功することはしばしば不可能である。悪性細胞の転移能は、依然として癌治療に対する主要な障害の１つとして残っており、ＩＧＦ−１受容体によって促進されうる。例えば、Ｂａｈｒら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２３：１−１４、２００５年を参照。

癌および癌転移の複雑さ、ならびに癌患者を治療する際の長年にわたるフラストレーションに基づいて、治療を導き、かつ転移または再発へのそのような治療の影響をモニタリングするための診断検査を開発するために、多くの試みがなされてきた。そのような試験は、おそらく、乳房腫瘍に関するマンモグラフィー、または前立腺癌に関するデジタル直腸試験などの比較的粗い試験の代わりに、癌のスクリーニングにも使用できるであろう。

ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒの、ある種の癌との相関に関する知識に鑑みて、循環腫瘍細胞の数およびそれらのＩＧＦ−１Ｒ発現への抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の影響、ならびに抗体の臨床的有効度を評価する研究を行った。現在では、ＩＧＦ−１Ｒを発現する循環腫瘍細胞（ＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣ）を検出および計数するための、癌の診断および治療に有用であり、かつＣＴＣに関する従来技術の方法より優れているアッセイが開発されている。上記アッセイは、ＩＧＦ−１受容体の生物学的機能の、より良い理解に寄与しうる。例えば、腫瘍細胞の侵襲的／転移性表現型を誘発するのには、高いＩＧＦ−１Ｒレベルが必要であると仮定されているが、ＩＧＦ−１Ｒ発現のレベルと転移能との間の相関は、まだ完全に解明されているわけではない。ＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣ数が高い患者は、急速な疾患進行によって証明される、より攻撃的な腫瘍を有するようであったことが見出されている。したがって、ＩＧＦ−１Ｒ発現の増大と転移能との間の潜在的相関は、不良転帰および／または治療介入の予測因子として、ＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの検出の基礎となりうるであろう。

まず初めに、本発明のＣＴＣ−ＩＧＦ−１Ｒアッセイ法は、腫瘍の早期検出に、または診断を確認するのに有用である。それらは、予後の評価にも使用できる。

本発明の方法は、治療の計画にも有用である。治療前にＩＧＦ−１Ｒ陽性循環腫瘍細胞を有する患者は、そうでない患者より、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法に反応する可能性が高いことが見出されている。何らかの治療を開始する前に、ＩＧＦ−１Ｒ陽性抗体に関して患者をスクリーニングすることによって、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法に反応する可能性が最も高い集団を予め選択し、それに従って治療レジメンを計画することが可能である。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の生物マーカーとしての、ＣＴＣ−ＩＧＦ−１Ｒアッセイの潜在的使用は、生物学的最適用量の同定、用量および治療レジメン選択、ならびに治療期間の決定を含みうるであろう。

化学療法を受けた血中におけるＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣレベルの変化と、臨床状態との間に良好な相関関係があることが見出されている。この相関関係に鑑みて、治療に対する患者の反応または疾患進行を、本発明のアッセイ法を用いて評価することも可能である。循環腫瘍細胞表面のＩＧＦ−１受容体の測定は、真の薬力学的（ＰＤ）エンドポイントを提供する。ひとたび治療が開始されたならば、腫瘍細胞表面のＩＧＦ−１Ｒの測定は、最大耐量（ＭＴＤ）に到達せずに、標的の最大阻害に到達したかどうかを判定するのに使用できる。所与の治療に対する耐性の進展をモニタリングすることもできる。本発明の付加的利益は、ＣＴＣを測定することによって、伝統的な手段によるものより頻繁に薬物効果を測定できることである。

最後に、本発明の方法は、臨床症状がないときでさえ、腫瘍の再発を検出するのにも使用できる。

本発明の方法は、乳房、前立腺、卵巣、肺、および大腸の癌、とりわけ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）およびホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）を含めた非血液学的悪性腫瘍の診断および／または治療に関連して使用できる。

複数の腫瘍型を有する患者のスクリーニングは、ＨＲＰＣ患者でＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣが頻繁に検出されることを示している。ＨＲＰＣにおけるこれらの細胞の同定は、予後または治療上の含意を有しうる。実際、以前の研究において、ＨＲＰＣ患者の生存期間を予測する上で、ＣＴＣの存在が最も有意なパラメータであることが見出された（Ｍｏｒｅｎｏら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ６５：７１３−７１８、２００５年）。複数の研究が、前立腺癌の進展におけるＩＧＦ−１Ｒの役割を確立しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータは、ＩＧＦ−１Ｒ発現および／または活性の増大が、ホルモン不応性表現型への進行と関連していることを示唆している（Ｈｅｌｌａｗｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６２：２９４２−２９５０、２００２年；Ｃｈｏｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：１２７１−１２７９、１９９９年）。ここに記載の一研究では、ＩＧＦ−１Ｒ陽性と考えられたＨＲＰＣ患者（すなわち、少なくとも１つのＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣが検出された）が、検出可能なＣＴＣのない患者より高い血清ＰＳＡレベルの中央値を登録時に有していた。さらに、ＰＳＡレベル、ならびにＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数は、治療反応または疾患進行中に平行して変化した。進行性の転移性ＨＲＰＣを有する患者は、より早期の疾患群におけるものより有意に高いＣＴＣ数を有したことが以前に示されており、さらに、２人の患者で、ドセタキセルを用いた初期治療の１週間後におけるＣＴＣ数の低下が報告された（Ｍｏｒｅｎｏら、２００５年、同上）。しかし、両方の患者とも進行し、ドセタキセルを追加投与したのにもかかわらず、ＣＴＣ数およびＰＳＡレベルの上昇を示した。ここに記載された研究は、ＣＴＣ数の持続的な低減のみがＨＲＰＣでの治療に対する反応と関連していることを示唆している。したがって、ＣＴＣ数は、ＰＳＡレベルのものとは独立した予後情報を提供しうる。重要なことに、前臨床データは、抗ＩＧＦ−１Ｒ治療に反応したＰＳＡの変化が、前立腺腫瘍成長における変化を反映することを示している（Ｗｕら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：３０６５−３０７４、２００５年）。

試験参入時に検出可能なＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣを有する患者における、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体およびドセタキセル療法の併用に対する反応者の比率が、これらの細胞が検出されなかった患者におけるものより高かったことも見出されている。さらに、遅延反応は必ずしも臨床利益と関連しているわけではないが（例えば、Ｐｅｔｒｙｌａｋら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９８：５１６−５２１、２００６年参照）、ＩＧＦ−１Ｒ−ＣＴＣ陰性患者で遅延反応が見られた。これらのデータは、抗ＩＧＦ−１Ｒ療法の利益を得ることができるであろうＨＲＰＣ患者を同定するための、ＩＧＦ−１Ｒ ＣＴＣ計数の潜在的使用を示唆するものである。

本発明の方法は、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を抑制する様々な化学療法化合物を用いた治療の計画および／またはモニタリングに使用することができる。米国特許第７０３７４９８号および米国特許出願公開第２００５／００６９５３９号に記載のものなど、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が特に好ましい。他の好ましい抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体には、Ｆ−５００３５およびＭＫ−０６４６（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ社／Ｍｅｒｃｋ社）、１９Ｄ１２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社）、Ｒ１５０７（Ｒｏｃｈｅ社／Ｇｅｎｍａｂ社）、ＥＭ−１６４／ＡＶＥ−１６４２（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ社／Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社）、ＩＭＣ−Ａ１２（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ならびにＡＭＧ４７９（Ａｍｇｅｎ社）と、国際公開第２００６／０６９２０２号、米国特許出願公開第２００５／０１４７６１２号、米国特許出願公開第２００５／００８４９０６号、米国特許出願公開第２００５／０２４９７３０号、米国特許出願公開第２００４／００１８１９１号、米国特許出願公開第２００５／０１３６０６３号、米国特許出願公開第２００３／０２３５５８２号、米国特許出願公開第２００４／０２６５３０７号、米国特許出願公開第２００４／０２２８８５９号、米国特許出願公開第２００５／０００８６４２号、欧州特許出願公開第１６２２９４２号、米国特許出願公開第２００３／０１６５５０２号、および米国特許出願公開第２００５／００４８０５０号に記載の抗体とが含まれる。

本発明を用いた使用に適した分子の他のクラスには、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するペプチドアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＧＦ−１Ｒ調節因子、および小分子ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤が含まれる。好ましい小分子ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤には、ＯＳＩ−９０６（ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＡＥＷ−５４１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）、ＢＭＳ−５３６９２４およびＢＭＳ−５５４４１７（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）、ＩＮＳＭ−１８（Ｉｎｓｍｅｄ社）、ＡＧ−１０２４（Ｐｆｉｚｅｒ社）、ＸＬ２２８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ社）、ピクロポドフィリン、ならびに国際公開第２００４／０４３９６２号および国際公開第２００４／０５４９９６号に開示されているものが含まれる。

以下により詳細に記述するように、本発明の方法は、患者試料からの特定の抗原性反応部位を有する細胞の選択的除去を行うものである。そのような選択的除去の方法および装置は当業者によく知られている。例えば、米国特許第４５５１４３５号、第４７９５６９８号、第４９２５７８８号、第５１０８９３３号、第５２０００８４号、および米国特許出願公開第２００４／０１５７２７１号を参照のこと。好ましい実施形態では、対象とする細胞を、磁性流体を用いて患者試料から免疫磁気的に単離する。磁性流体は、小さな磁性粒子をコロイド懸濁液中に含有しており、この磁性粒子の流動を磁石または磁場によって制御することができる。

本発明がより明解に理解されるように、以下の実施例を記述する。これらの実施例は、例示のみを目的とし、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

ここに記載する実施例では、複数の地理的位置でヒト対象から、細胞形態および細胞表面抗原の発現を保存する細胞保存剤を含有している１０ｍＬ真空採血管であるＣＥＬＬＳＡＶＥ（商標）保存チューブ（Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ社、米国ペンシルベニア州ハンティンドンバレー（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ Ｖａｌｌｅｙ）所在）内に血液試料を採取した。試料は、室温で維持し、血液採取の７２時間以内に上述の通りに処理した。

治療に対する患者の反応は、固形癌の治療効果判定のための基準（ＲＥＣＩＳＴ）（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６、２０００年を参照）を用いて、またはＨＲＰＣ患者では、前立腺特異抗原ワーキンググループ（ＰＳＡＷＧ）判定規準（Ｂｕｂｌｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：３４６１−３４６７、１９９９年を参照）を用いて放射線学的に評価した。

（実施例１）
（ＩＧＦ−１Ｒ循環腫瘍細胞アッセイの開発）
細胞培養および細胞スパイキング（Ｃｅｌｌ Ｓｐｉｋｉｎｇ）：乳癌細胞系ＭＣＦ−７、前立腺細胞系ＰＣ３−９、膀胱細胞系Ｔ−２４、および造血細胞系ＣＥＭは、１０％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地を含有するフラスコ中で培養し、その後、トリプシンを用いて採取した。トリパンブルー排除で評価した、細胞懸濁液の生存率が９０％を超えた場合のみ、その細胞懸濁液を用いた。実際の細胞数を決定するために、５０μｌアリコートの細胞を透過処理し、０．０５％サポニンと、最終濃度０．５μｇ／ｍｌの、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した抗サイトケラチンモノクローナル抗体１０μｌとを含有するＰＢＳ２００μｌを添加することによって蛍光標識した。室温での１５分間のインキュベーションの後、緩衝液２００μｌと、全部で約２万個のビーズを含有する蛍光ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国フロリダ州マイアミ（Ｍｉａｍｉ）所在）２０μｌを添加した。ビーズのみを含有するデュプリケートチューブを、試料の１００％が吸引されるまでフローサイトメータ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）所在）で計測した。これは、２０μｌ中に存在するビーズの数の正確な推定値を与えた。その後、実験チューブを、各チューブ内で１万個のビーズが計数されるまで、上記フローサイトメータ上でトリプリケートで試験した。単位容積あたりのビーズの既知数を用いて、細胞の濃度を決定した。ＩＧＦ−１Ｒ検出用には、スパイキングされた細胞の数は、７．５ｍＬ血液中で１３０から２２０の間であると見積もられた。

ＣＴＣの単離および計数：血液から細胞を単離するための試料は、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ ＡＵＴＯＰＲＥＰ（登録商標）システム、試薬キット、およびＣＥＬＬＳＰＯＴＴＥＲ（登録商標）アナライザーからなるＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ（登録商標）システム（Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ社、米国ペンシルベニア州ハンティンドンバレー所在）を用いて、調製および分析した。ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ ＡＵＴＯＰＲＥＰシステムは、希少細胞検出用の自動試料調製システムである。上記試薬キットは、免疫磁気的に細胞を濃縮するための、抗体でコーティングされた磁気流体と、蛍光結合した抗体のカクテル（それぞれ上皮細胞および白血球を標識するためのＰＥおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合した抗体）と、核色素と、上記細胞を洗浄、透過処理、および再懸濁するための緩衝液とからなる。癌細胞の検出には、血液７．５ｍＬを、腫瘍関連抗原ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子または上皮細胞表面抗原）に対する抗体でコーティングされた磁性流体と混合する。免疫磁気濃縮後に、免疫磁気的に標識された細胞を蛍光標識するために、サイトケラチン４、５、６、８、１０、１３、１８、および１９を認識するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗体、白血球抗原ＣＤ４５を認識するＡＰＣ標識抗体、ＩＧＦ−１Ｒを認識するＰＥ標識抗体、および核酸色素４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を透過処理緩衝液と共に添加した。上記システムでのインキュベーションの後に、磁気分離を反復し、余分な染色試薬を吸引した。最終加工ステップでは、細胞をＭＡＧＮＥＳＴ（登録商標）細胞プレゼンテーション装置（Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ社、米国ペンシルベニア州ハンティンドンバレー所在）内で再懸濁した。この装置は、１つのチャンバーと、蛍光顕微鏡を用いた分析に供する免疫磁気標識細胞を方向付ける２つの磁石とからなる。

上記ＭＡＧＮＥＳＴを、半自動四色蛍光顕微鏡であるＣＥＬＬＳＰＯＴＴＥＲアナライザー上に置いた。４つの蛍光フィルターキューブそれぞれのためのカートリッジの全表面を包含する画像フレームをキャプチャーした。所定の判定規準を満たした対象を含有するキャプチャー画像をウェブ対応ブラウザに自動的に提示させ、それらから、オペレータが細胞の最終選択を行った。ＣＴＣと定義されるべき対象の判定規準には、円形から楕円形の形態、可視的な核（ＤＡＰＩ陽性）、サイトケラチン染色陽性、およびＣＤ４５の発現の欠如（ネガティブＣＤ４５−ＡＰＣ染色によって判定される）が含まれた。細胞計数の結果は、常に、７．５ｍＬ血液あたりの細胞数で表した。

ＩＧＦ−１Ｒ抗体の選択および腫瘍細胞系におけるＩＧＦ−１Ｒの検出：抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１Ｈ７（ＰＥ結合体；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州サンノゼ所在）および３３２５５．１１１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国ミネソタ州ミネアポリス所在）を、乳癌細胞系ＭＣＦ−７細胞由来の細胞で力価決定した。交差ブロック実験は、いかなる阻害も示さなかった。これは、これらの抗体がＩＧＦ−１Ｒの別々の非競合的エピトープに結合することを示している。ＣＰ−７５１，８７１ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｐｆｉｚｅｒ社；米国特許第７０３７４９８号を参照）を用いた交差ブロック実験は、本質的に等モル量のＣＰ−７５１，８７１によって、細胞への抗体３３２５５．１１１の結合が完全にブロックされたことを示した。対照的に、１Ｈ７抗体は、ＣＰ−７５１，８７１の存在下で、結合の阻害を示さなかった。これらのデータは、３３２５５．１１１およびＣＰ−７５１，８７１が同一または関連したエピトープのいずれかに結合することを実証する。ＩＧＦ−１Ｒへの１Ｈ７抗体の結合がＣＰ−７５１，８７１の存在下でブロックされないので、これ以降の評価用に１Ｈ７を選択した。

造血細胞系ＣＥＭ、前立腺癌細胞系ＰＣ３−９、膀胱細胞系Ｔ−２４、およびＭＣＦ−７乳癌細胞系の抗原密度を、ＰＥ標識された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１Ｈ７で染色し、その後フローサイトメトリー分析を行うことによって評価した。図１は、上記細胞系のＩＧＦ−１Ｒ−ＰＥ染色のヒストグラムのオーバレイを示す。ＣＥＭ細胞の染色は、対照のものに類似しており、したがってＩＧＦ−１Ｒ密度は検出限界以下であった。ＰＣ３−９細胞のＩＧＦ−１Ｒ−ＰＥ染色は、バックグランドから分離することができた。また、Ｔ２４およびＭＣＦ−７細胞は、さらに明るい染色を明確に有した。既知数のＰＥ分子を有するビーズを用いた、フローサイトメータの較正によって、抗原密度の推定値を得た。ＰＣ３−９細胞表面のＩＧＦ−１Ｒ密度は約１００００ＩＧＦ−１Ｒ抗原、Ｔ−２４細胞表面は約５００００ＩＧＦ−１Ｒ抗原、ＭＣＦ−７細胞は約１００００００ＩＧＦ−１Ｒ抗原であった。

ＩＧＦ−１Ｒアッセイ特性分析：ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳシステムを用いた標準ＣＴＣアッセイは、上皮由来の細胞表面に存在するサイトケラチンを検出するのにＰＥを使用し、造血系由来の細胞表面に存在するＣＤ４５を検出するのにＡＰＣを使用し、サイトケラチン陽性かつＣＤ４５陰性の有核細胞として特定されたＣＴＣ表面の分析物特異試薬を検出するためにＦＩＴＣを使用する。ＦＩＴＣ標識抗体を用いた抗原検出に関する、ＣＥＬＬＳＰＯＴＴＥＲアナライザーの現在の検出限界は、１細胞あたり約１０００００抗原である。この感度を増強するために、ＩＧＦ−１Ｒ検出の検出限界が低下するように上記ＣＴＣアッセイを再構成した。上皮細胞表面で高密度で発現されているサイトケラチンをＦＩＴＣで標識した。これは、ＰＥ標識された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の使用を可能にした。別々の実験で、１３０から２００のＰＣ３−９細胞、Ｔ−２４またはＭＣＦ−７細胞を７．５ｍＬ血液中にスパイキングし、新規に構成された染色試薬を用いて調製した。調製の後、上記試料をＣＥＬＬＳＰＯＴＴＥＲアナライザー上でスキャンした。サイトケラチンＦＩＴＣ陽性であり、かつ有核のＤＡＰＩ陽性であるイベントがＣＴＣ候補として使用者に提示されるようにアナライザーを再構成した。

図２のパネルＡに、７．５ｍＬの血液から回収されたＭＣＦ−７細胞の典型的な例を示す。最上列は、ＩＧＦ−１Ｒ受容体を明確に発現した３つのＭＣＦ−７細胞のクラスターを示す。合成画像の横のチェックマークは、オペレータがその細胞をＣＴＣとして分類したことを示し、ＩＧＦ−１Ｒ染色を示す画像の横のチェックマークは、オペレータがこのＣＴＣを、ＩＧＦ−１Ｒを発現したものとして分類したことを示している。パネルＡに示したすべての細胞が明確にＩＧＦ−１Ｒ受容体を発現した。ＭＣＦ−７細胞でスパイキングされた、１６人の健康個体からの血液では、回収されたＭＣＦ−７細胞の８０．６％（ＳＤ７．７）が、ＩＧＦ−１Ｒを発現したＣＴＣとして分類された。図２のパネルＢに、７．５ｍＬの血液から回収されたＴ−２４細胞の典型的な例を示す。４つのＴ−２４細胞のＩＧＦ−１Ｒの発現は、ＭＣＦ−７細胞のＩＧＦ−１Ｒ染色と比較して明確に暗かった。最下部の２つの細胞のみが、オペレータによってＩＧＦ−１Ｒ受容体を発現したＣＴＣとして分類された。Ｔ−２４細胞でスパイキングされた、６人の健康個体からの血液では、回収されたＭＣＦ−７細胞の１３．６％（ＳＤ３．９）が、ＩＧＦ−１Ｒを発現したＣＴＣとして分類された。ＰＣ３−９細胞でスパイキングされた、６人の健康個体からの血液では、回収されたＭＣＦ−７細胞の３．８％（ＳＤ６．０）が、ＩＧＦ−１Ｒを発現したＣＴＣとして分類された。これらのデータは、転移性癌を有する患者のＣＴＣ表面の、このアッセイによって転移性癌が検出されるのに必要とされているＩＧＦ−１Ｒ抗原密度に関するガイダンスを提供した。

転移性癌のＣＴＣ表面におけるＩＧＦ−１Ｒ発現：１３９人の健康個体からの７．５ｍＬ血液中には、事実上、ＣＴＣが欠如していた（１３５人でＣＴＣ数０、４人でＣＴＣ数１）。転移性癌を有する患者のＣＴＣで、実際にＩＧＦ−１Ｒを検出することができるであろうかどうか試験するために、５０人の患者からの血液試料を試験した。７．５ｍＬ血液中において、５０人の患者のうちの１１人（２２％）でＣＴＣが検出された。これら５０人の患者のうち、１８人は乳癌を有し、その２８％でＣＴＣが検出され、１３人が結腸直腸癌を有し、その３１％でＣＴＣが検出され、３人が前立腺癌を有し、その３３％でＣＴＣが検出され、１２人が肺癌を有し、その８％でＣＴＣが検出され、卵巣癌を有する４人の患者では、誰もＣＴＣが検出されなかった。検出されたＣＴＣの例を図３に示す。８つのＣＴＣ候補を図に示す。イベント１、４、５、７、および８はＣＴＣとして分類された。横列１および４のＣＴＣのみが、ＩＧＦ−１Ｒを発現したＣＴＣとして分類された。潜在的なＩＧＦ−１Ｒ染色が、横列５および７のＣＴＣで観察できるが、これは、ＩＧＦ−１Ｒ陽性のＣＴＣであると分類するには不十分であると考えられたことに留意されたし。表１は、ＣＴＣを有する１１人の患者で検出されたＣＴＣの数と、ＩＧＦ−１Ｒを発現したＣＴＣの数と、ＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＴＣの割合とを示す。１１人の患者のうちの８人（９１％）で、ＩＧＦ−１Ｒを発現したＣＴＣが検出された。しかし、ＩＧＦ−Ｒを発現したＣＴＣの割合は大きく異なっていた。

（実施例２）
（抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の第１相用量設定試験におけるＣＴＣ表面のＩＧＦ−Ｒ発現）
試験１は、進行固形腫瘍を有する患者における、米国特許第７０３７４９８号に記載の完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の安全性および耐容性を定めるために設計された用量設定第１相試験であった。この試験では、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体治療を３〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で２１日毎（２１日サイクル）に与えた。これらの患者におけるＣＴＣの数およびＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＴＣの数への抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた治療の影響を評価するために、２１日の治療サイクルそれぞれの１日目投与前および試験８日目のスクリーニングの際に血液試料を採取した。増悪により患者が試験を中止した場合には常に、追加試料を１つ採取した。この試験の過程において、２６人の患者が、ＣＴＣの計数のために血液試料を提供した。

２６人の患者のうち１６人（６１％）は、試験中（投薬前または治療中）の何らかの時点で１つまたは複数のＣＴＣを有していた。試験中の何らかの時点で検出されたＣＴＣを有していた１６人の患者のうちの３人では、ＩＧＦ−１Ｒ陽性のＣＴＣが検出されなかった。２つの事例では、７．５ｍＬ血液中にＣＴＣが１つのみ検出された。ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣのレベルを時間に対してプロットし、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体治療に対するいくつかのパターンの反応が観察された。４つの例を図４に示す。パネルＡには、６ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の単回投与で治療された患者からのＣＴＣ数を示す。この患者では、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた治療の８日目に、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数が減少し、１５日目には、もはや検出可能でなく、その後、サイクル２の開始前に再出現した。パネルＢには、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の単回投与で治療された患者からのＣＴＣ数を示す。治療の８日後および１５日後におけるＣＴＣの微減の後、患者が試験を中止するまでに、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数が増大した。この患者は、ＣＴスキャンで増悪を示した。パネルＣには、２０ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の単回投与で治療された患者からのＣＴＣ数を示す。上記用量を投与した１５日後のＣＴＣの急上昇を除いて、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性の数は影響されなかった。パネルＤは、３ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の単回投与で治療された患者からのＣＴＣ数を示す。ここでは、ほとんどすべての検出されたＣＴＣがＩＧＦ−１Ｒを発現していた。患者が試験を中止した時に、ＣＴＣの増大が認められた。これらのデータの１つの可能な解釈は、これらの患者におけるほとんどの循環腫瘍細胞がＩＧＦ−１Ｒを発現し、かつＣＴＣの維持に必要な生存シグナルを、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体での治療が遮断するようであるというものである。別の解釈では、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の効果が直接的に腫瘍塊に作用し、ＣＴＣの移動を抑制している可能性がある。

可変的ではあるが、投与後におけるＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数の減少が観察され、同様に、治療サイクルの終わりまでに、循環細胞の数の再増加が観察された。試験後のフォローアップ来診でも、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣ数の増大が認められた。これらのデータは、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に対する生物学的反応および臨床反応のモニタリングにおける、ＣＴＣおよびＣＴＣ−ＩＧＦ−１Ｒアッセイの役割を支持するものである。

（実施例３）
（ドセタキセルと併用した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の試験におけるＣＴＣ表面のＩＧＦ−１Ｒ発現）
試験２は、進行固形腫瘍を有する患者における、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））と併用した、米国特許第７０３７４９８号に記載の完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の第１ｂ相用量設定試験であった。ドセタキセルおよび抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、それぞれ７５ｍｇ／ｍ^２および０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日目および２２日目に投与した。１９人のホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）患者を含めた２７人の患者がＣＴＣの計数のために血液試料を提供した。ＣＴＣ試料は、各サイクルにおける１日目投与前および８日目に収集した。

２７人の患者のうちの１９人（７０％）が、試験中の何らかの時点で１つまたは複数のＣＴＣを有していた。試験中の何らかの時点でＣＴＣが検出された１９人の患者のうち１人のみで、ＩＧＦ−１Ｒ−陽性ＣＴＣが検出されなかった。興味深いことに、この患者の５回のＣＴＣ評価すべてで、ＣＴＣが検出され、かつＩＧＦ−１Ｒ−陽性ＣＴＣは検出されなかった。これは、この患者の腫瘍部位自体がＩＧＦ−１Ｒを発現していない可能性があることを示している。

治療に反応したＣＴＣ数の減少は、患者の大部分で観察された。ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣのレベルを時間に対してプロットし、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体治療に対するいくつかのパターンの反応が観察された。４つの例を図５に示す。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体および７５ｍｇ／ｍ^２のドセタキセル（２１日サイクル）で治療されたホルモン不応性前立腺癌患者における、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数を示す。治療の後、併用治療に対する反応を反映して、ＣＴＣの総数が減少した。この患者から得られたＰＳＡ値は、治療に対する臨床反応を確認した。加えて、この患者では、ＣＴＣの約５０％が、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体／ドセタキセル治療の前に、元々、ＩＧＦ−１Ｒ陽性であった。治療に伴って、ＩＧＦ−１Ｒ−陽性ＣＴＣの数は急速に減少した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の生物学的作用はＩＧＦ−１Ｒの下方調節を誘導することであるので、これらのデータは、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の臨床的活動性および生物学的活性（バイオマーカー）の両方のモニタリングにおける、ＣＴＣおよびＣＴＣ−ＩＧＦ−１Ｒアッセイの潜在的役割を支持する。パネルＢは、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数における同様な減少を有する患者を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数が、それぞれの用量の投与の後に減少したが、その度に再増加もあった２人の患者を示す。両方の患者とも、低用量（それぞれ０．８および３ｍｇ／ｋｇ）の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で治療された。

試験２で登録されたＨＲＰＣ患者は、登録時に少なくとも１つの検出可能なＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣを有していたが、ＩＧＦ−１Ｒ−ＣＴＣ陰性であった患者（ｎ＝８、ＰＳＡの中央値は９２ｎｇ／ｍＬ）より高いＰＳＡレベル（ｎ＝１０、ＰＳＡの中央値は４７５ｎｇ／ｍＬ）を有していた。２人の患者では、試料が失われたので、いかなる評価も可能でなかった。表２に示す通り、見かけの腫瘍量が、より多いのにもかかわらず、登録時にＩＧＦ−１Ｒ−ＣＴＣ陽性であった患者は、ドセタキセルおよび抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の併用に対する、ＰＳＡ判定規準による反応を、ＩＧＦ−１Ｒ−ＣＴＣ陰性であった患者（８人のうちの２人）より高い割合（１０人のうちの６人）で、かつ全体的に早く示した。

試験参入時に検出可能なＣＴＣを有していなかった８人のＨＲＰＣ患者のうち、６人は治療に反応しなかった。彼らのうちの３人は、増悪時に、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣ数の増大を実際に経験した。最後に、検出可能なＣＴＣを有していたが、検出可能なＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣを有していなかった、ドセタキセルおよび抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で治療された１人のＨＲＰＣ患者は、併用治療に反応しなかった。彼のＣＴＣ数の減少も長続きしなかった（１サイクル）。

表３に、試験２におけるＨＲＰＣ患者の最良患者反応（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｂｅｓｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の概要を示す。治療開始前に、検出可能なＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣを７．５ｍＬ中に有していなかった８人の患者のうちの２人（２５％）は治療の部分奏功を示し、７．５ｍＬ中に＞１のＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣを有していた１１人の患者のうちの６人（５５％）は部分奏功を示した。これらのデータは、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体治療で利益を得ることができるであろう患者を特定するのに、最適用量を特定し、かつ治療時間を決定するのに、ＣＴＣ−ＩＧＦ−１Ｒアッセイを利用することができるであろうという考えを強く支持する。

（実施例４）
（パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の試験におけるＣＴＣ表面のＩＧＦ−１Ｒ発現）
試験３は、進行固形腫瘍を有する患者における、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびカルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））と併用した、米国特許第７０３７４９８号に記載の完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の第１ｂ相試験であった。パクリタキセル、カルボプラチン、および抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の用量は、それぞれ、２００ｍｇ／ｍ^２、６のＡＵＣ、および０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇであった。４１人の患者が、ＣＴＣの計数のために血液試料を提供した。血液試料は、各サイクルにおける１日目投与前および８日目に収集した。

４１人の患者のうちの２１人（５１％）は、試験中何らかの時点で１つまたは複数のＣＴＣを有しており、一方、４１人の患者のうちの１０人（２４％）は、初回用量が投与される前に１つまたは複数のＣＴＣを有していた。４１人の患者のうちの１６人（３９％）は、試験中何らかの時点で１つまたは複数のＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣを有しており、一方、４１人の患者のうちの８人（２０％）は、初回用量が投与される前に１つまたは複数のＩＧＦ−Ｒ陽性ＣＴＣを有していた。試験に登録された１人のＨＲＰＣ患者は、試験参入時に多数のＣＴＣ（７１のＣＴＣおよび１５のＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣ）を有しており、それらは治療に反応して減少した（治療２１日目までに２１のＣＴＣおよび２つのＩＧＦ−１Ｒ ＣＴＣ）。

ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣのレベルを時間に対してプロットし、治療に対するいくつかのパターンの反応が観察された。４つの例を図６に示す。パネルＡは、非常に少ない数のＣＴＣを有する状態で試験に参加した患者のデータを表す。パクリタキセル／カルボプラチンおよび０．０５ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた６サイクルと、その後における３ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた追加の２サイクルの治療の後には、この患者は、もはや治療に反応しなかった。臨床反応のこの欠如は、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣの数の劇的な増加を伴っていた。この患者における疾患の進行は、ＣＴスキャンで確認した。パネルＢには、試験の経過中に、ＣＴＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陽性ＣＴＣが上昇した類似したパターンを有する患者のデータを示す。パネルＣおよびＤには、治療開始前にＣＴＣを有した２人の患者を示す。これらの患者には、それぞれ１．５および６ｍｇ／ｋｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を投与した。患者が抗ＩＧＦ−１Ｒ治療を続けている間は、ＩＧＦ−１Ｒ陽性細胞の数は減少しているか（パネルＣ）、または低いまま（パネルＤ）のようである。これらのデータは、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体治療の影響および耐性進展のモニタリングにおける、ＣＴＣおよびＣＴＣ−ＩＧＦ−１Ｒアッセイの潜在的役割をさらに支持する。

本発明の特定の現在好ましい実施形態をここに記載したが、本発明が属する分野の技術者には、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、記載した実施形態の変形および改変を行えることが容易に明らかとなるであろう。したがって、本発明は、添付されている特許請求の範囲および法の適用可能な規則によって必要とされる範囲でのみ限定されるものとする。

様々な細胞系のＩＧＦ−１Ｒ−フィコエリトリン染色のヒストグラムのオーバレイを示す図である。 標識されたＭＣＦ−７肺癌細胞（パネルＡ）およびＴ−２４膀胱細胞（パネルＢ）の蛍光顕微鏡画像の収集物を示す図である。 潜在的循環腫瘍細胞の蛍光顕微鏡画像の収集物を示す図である。 抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で治療された４人の患者の総循環腫瘍細胞およびＩＧＦ−１Ｒ−陽性循環腫瘍細胞の数を示すグラフである。 ドセタキセルと併用した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で治療された４人の患者の総循環腫瘍細胞およびＩＧＦ−１Ｒ−陽性循環腫瘍細胞の数を示すグラフである。 パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で治療された４人の患者の総循環腫瘍細胞およびＩＧＦ−１Ｒ−陽性循環腫瘍細胞の数を示すグラフである。

Claims (17)

1. 患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性を予測する方法であって、ａ）患者から生物検体を取得するステップと、ｂ）他の試料成分が実質的に除外されるように、生物検体を、腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドと混合して、試料を調製するステップと、ｃ）試料を、上皮細胞に特異的に結合する少なくとも１種の試薬と接触させるステップと、ｄ）試料を、細胞表面のインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する結合親和性を有する薬剤と接触させるステップと、ｅ）試料を分析して、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在を決定するステップとを含み、試料中の、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在が、患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性を予測するものである方法。
2. ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の数を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドが第１の検出可能標識に連結されており、上皮細胞に特異的に結合する試薬が第２の検出可能標識に連結されており、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合親和性を有する薬剤が第３の検出可能標識に連結されており、第１、第２、および第３の検出可能標識が相違しており、少なくとも１種の試薬がサイトケラチンに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
4. リガンドが、腫瘍細胞表面の上皮細胞接着分子に特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
5. 分析からの残留無核細胞および細胞破片の除外を可能にするために、試料に細胞特異的色素を添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 標識腫瘍細胞が、多パラメータフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野ベース画像解析、毛細管容積測定、スペクトル画像分析、手操作細胞解析、ＣＥＬＬＳＰＯＴＴＥＲ分析、および自動細胞解析からなる群から選択された少なくとも１つのプロセスで分析される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 試料が、リガンドに連結された磁性粒子と混合されている生物検体を含む免疫磁気試料であり、免疫磁気試料が濃縮腫瘍細胞懸濁液となるように、免疫磁気試料を磁場にさらすステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 磁性粒子がコロイド性である、請求項７に記載の方法。
9. 患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性をモニタリングする方法であって、ａ）患者から第１の生物検体を取得するステップと、ｂ）他の試料成分が実質的に除外されるように、第１の生物検体を、腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドと混合して、第１の試料を調製するステップと、ｃ）第１の試料を、上皮細胞に特異的に結合する少なくとも１種の試薬と接触させるステップと、ｄ）第１の試料を、細胞表面のインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する結合親和性を有する薬剤と接触させるステップと、ｅ）第１の試料を分析して、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在および数を決定するステップと、ｆ）ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法を患者に施すステップと、ｇ）ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法を施した後に、患者から第２の生物検体を取得するステップと、ｈ）第２の生物検体を、腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドと混合して、第２の生物検体から第２の試料を調製し、第２の試料に関してステップｃ）〜ｅ）を行うステップと、ｉ）第１の試料中の、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の数を、第２の試料中の、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の数と比較するステップとを含み、第２の試料中の数の方が少ないことが、患者でのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法の有効性を示すものである方法。
10. リガンドが、腫瘍細胞表面の上皮細胞接着分子に特異的に結合する、請求項９に記載の方法。
11. 腫瘍細胞と特異的に反応するリガンドが第１の検出可能標識に連結されており、上皮細胞に特異的に結合する試薬が第２の検出可能標識に連結されており、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合親和性を有する薬剤が第３の検出可能標識に連結されており、第１、第２、および第３の検出可能標識が相違している、請求項９に記載の方法。
12. 標識腫瘍細胞が、多パラメータフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野ベース画像解析、毛細管容積測定、スペクトル画像分析、手操作細胞解析、ＣＥＬＬＳＰＯＴＴＥＲ分析、および自動細胞解析からなる群から選択された少なくとも１つのプロセスで分析される、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 試料が、リガンドに連結された磁性粒子と混合されている生物検体を含む免疫磁気試料であり、免疫磁気試料が濃縮腫瘍細胞懸濁液となるように、免疫磁気試料を磁場にさらすステップをさらに含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 磁性粒子はコロイド性である、請求項１３に記載の方法。
15. ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法が抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. ＩＧＦ−１Ｒを発現する循環腫瘍細胞の存在に関して患者試料をスクリーニングするための試験キットであって、ａ）磁気コア物質、タンパク質ベースコーティング物質、および腫瘍細胞に特徴的な決定基に特異的に結合する抗体を含み、抗体が前記ベースコーティング物質に直接または間接的に連結されているコーティングされた磁性ナノ粒子と、ｂ）腫瘍細胞以外の試料成分を分析から除外するための細胞特異的色素と、ｃ）ＩＧＦ−１Ｒに対する結合親和性を有する少なくとも１つの検出可能標識された薬剤とを含む試験キット。
17. ＩＧＦ−１Ｒを発現する循環腫瘍細胞を分析するための装置をさらに含む、請求項１６に記載の試験キット。

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