CN109406245A - 一种电子线照射对小鼠igf相关蛋白表达影响的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于辐射防护技术领域，涉及一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法。所述的检测方法包括小鼠IGF相关蛋白表达量分析和/或小鼠IGF相关蛋白表达分布分析和/或小鼠肝组织中细胞凋亡情况分析，小鼠IGF相关蛋白表达量分析包括如下步骤：(1)小鼠肝脏总蛋白提取和浓度测定；(2)小鼠肝脏总蛋白电泳和Western‑Blot检测；(3)分子量与表达量分析，小鼠IGF相关蛋白表达分布分析、小鼠肝组织中细胞凋亡情况分析包括如下步骤：(A)制片；(B)共聚焦显微镜观察。利用本发明的检测方法，能够探索辐射致损伤、癌症的机制，结果可为辐射对肝脏的早期损伤提供理论依据，为放疗提供新的靶向指标。

Description

一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法
技术领域
本发明属于辐射防护技术领域，涉及一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法。
背景技术
核能与核技术广泛应用于发电、地质勘探、工业探伤、医疗照射、灭菌等领域。然而，核能与核技术应用中造成的电离辐射可直接或通过继发反应损害人体。因此，预防和治疗辐射损伤十分重要，了解辐射损伤的作用机理更加必要。
胰岛素样生长因子(IGF)是一个庞大的家族，是一类结构与胰岛素相似的多肽，主要包括IGF-1和IGF-2两类多肽类生长因子，以及其相应受体IGF-1R、IGF-2R和至少6种胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)。IGF在人体各脏器中起着重要的代谢作用，控制各种细胞的增殖、分化和凋亡进程，其中IGF-1主要由肝脏分泌，存在于血浆内，是生长激素发挥生物学效应的重要媒介。IGF-1的功能主要由IGF-1R介导，IGFBP1运输和调节IGF-1与IGF-1R结合。
近年来，关于IGF的研究大多着眼于肿瘤、癌症等方面，并且IGF-1R在癌症治疗中已经成为一个新的靶点。由于IGF在人体的生命活动中承担着重要的作用，因此电离辐射后它的表达情况的变化显得尤为重要。且由于电离辐射也被列为癌症发生的潜在诱因之一，因此通过研究辐射对IGF的影响为切入点，探讨辐射损伤致癌症发生的作用机制有重要意义。
但是目前辐射致损伤、癌症的机制未明，IGF在其中的作用未知。
发明内容
本发明的目的是提供一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，以能够利用其探索辐射致损伤、癌症的机制，使结果可为辐射对肝脏的早期损伤提供理论依据，为放疗提供新的靶向指标。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，所述的检测方法包括小鼠IGF相关蛋白表达量分析和/或小鼠IGF相关蛋白表达分布分析和/或小鼠肝组织中细胞凋亡情况分析，
所述的小鼠IGF相关蛋白表达量分析包括如下步骤：
(1)小鼠肝脏总蛋白提取和浓度测定：小鼠在电子线辐射照射后麻醉提取肝脏，肝脏经清洗后加入蛋白裂解液进行组织匀浆，匀浆液静置后离心取上清，测定上清中蛋白质浓度；
(2)小鼠肝脏总蛋白电泳和Western-Blot检测：对上清进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot检测；
(3)表达量分析：用凝胶图像处理系统分析Western-Blot显色目标条带的分子量与表达量，
所述的小鼠IGF相关蛋白表达分布分析包括如下步骤：
(A)制片：小鼠在电子线辐射照射后麻醉提取肝脏，剔除多余脂肪并经清洗后放入含多聚甲醛的溶液中进行固定，固定后的肝脏涂包埋剂覆盖组织，在冰冻机中进行切片后烘箱干燥；
(B)共聚焦显微镜观察：干燥后的切片经清洗、盐酸处理并中和后破膜，清洗、BSA封闭并先后加入一抗、洗涤、加入二抗、洗涤，然后在染色后在共聚焦显微镜下采集图像进行分析，
所述的小鼠肝组织中细胞凋亡情况分析包括如下步骤：
(I)制片：小鼠在电子线辐射照射后麻醉提取肝脏，剔除多余脂肪并经清洗后放入含多聚甲醛的溶液中进行固定，固定后的肝脏涂包埋剂覆盖组织，在冰冻机中进行切片后烘箱干燥；
(II)共聚焦显微镜观察：干燥后的切片经低聚甲醛处理、清洗后进行固定、洗涤，然后在先后加缓冲液、抗体分别进行孵育后再孵育染色，清洗后在共聚焦显微镜下采集图像进行分析。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，其中步骤(1)、步骤(A)、步骤(I)中，所述的辐射照射的总剂量为1-4Gy。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，其中步骤(1)中，所述的麻醉为水合氯醛麻醉，所述的蛋白质浓度测定采用BCA法。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，其中步骤(2)中，所述的SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为8％；所述的Western-Blot检测加入的一抗为IGF单抗。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，其中步骤(A)与步骤(I)中，所述的麻醉为乙醚麻醉，所述的固定在含多聚甲醛的离心管中进行。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，其中步骤(B)与步骤(II)中，在染色后还滴加抗荧光衰减封片剂，以盖玻片封片。
本发明的有益效果在于，利用本发明的电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，能够探索辐射致损伤、癌症的机制，结果可为辐射对肝脏的早期损伤提供理论依据，为放疗提供新的靶向指标。
附图说明
图1为实施例1中电子线照射后小鼠肝脏中IGF1R蛋白相对表达情况示意图，图中左图为6h点，右图为24h点，A为1Gy照射组，B为2Gy照射组，C为对照组，D为4Gy照射组。
图2为实施例1中电子线照射后小鼠肝脏中IGFBP1蛋白相对表达情况示意图，图中左图为6h点，右图为24h点，A为1Gy照射组，B为2Gy照射组，C为对照组，D为4Gy照射组。
图3为实施例1中电子线照射后小鼠肝脏中IGFBP4蛋白相对表达情况示意图，图中左图为6h点，右图为24h点，A为1Gy照射组，B为2Gy照射组，C为对照组，D为4Gy照射组。
图4为实施例1中电子线照射后小鼠肝脏中IGF-1蛋白相对表达情况示意图，图中左图为6h点，右图为24h点，A为1Gy照射组，B为2Gy照射组，C为对照组，D为4Gy照射组。
图5为实施例2中激光共聚焦检测照射后6小时肝组织IGF–1的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图6为实施例2中激光共聚焦检测照射后12小时肝组织IGF–1的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图7为实施例2中激光共聚焦检测照射后24小时肝组织IGF–1的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图8为实施例2中激光共聚焦检测照射后6小时肝组织IGF–1R的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图9为实施例2中激光共聚焦检测照射后12小时肝组织IGF–1R的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图10为实施例2中激光共聚焦检测照射后24小时肝组织IGF–1R的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图11为实施例2中激光共聚焦检测照射后6小时肝组织IGFBP1的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图12为实施例2中激光共聚焦检测照射后12小时肝组织IGFBP1的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图13为实施例2中激光共聚焦检测照射后24小时肝组织IGFBP1的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图14为实施例2中激光共聚焦检测照射后6小时肝组织IGFBP4的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图15为实施例2中激光共聚焦检测照射后12小时肝组织IGFBP4的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图16为实施例2中激光共聚焦检测照射后24小时肝组织IGFBP4的表达情况(×400)示意图，图中A为对照组，B为1Gy照射组，C为2Gy照射组，D为4Gy照射组。
图17为实施例3中激光共聚焦检测照射后6小时肝组织凋亡情况示意图，图中自左至右依次为对照组，1Gy照射组，2Gy照射组，4Gy照射组。
图18为实施例3中激光共聚焦检测照射后24小时肝组织凋亡情况示意图，图中自左至右依次为对照组，1Gy照射组，2Gy照射组，4Gy照射组。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
本发明前期利用基因芯片技术筛查电子线照射人肝细胞后基因表达变化的情况，发现胰岛素生长因子家族(IGF)中的基因差异表达显著。其后又从动物水平上发现，γ射线照射后，小鼠肝脏及血液中胰岛素生长因子家族中的基因也发生明显的差异表达。
实施例1：电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测-小鼠IGF相关蛋白表达量分析
(一)材料与方法
1、实验动物
清洁级BALB/c雄性小鼠100只，25～30g，中国食品药品检定研究院生产，实验动物生产许可证号：SCXK-(京)2014-013；中国辐射防护研究院GLP中心动物实验室饲养管理，实验动物使用许可证号：
SYXK(晋)2013-0002。
2、辐照源
直线加速器，Elekta Synergy，英国Elekta Limited公司生产，山西大医院放疗科提供，剂量率为3Gy/min。
3、仪器
台式离心机，德国Heraeus instrumennts公司生产；
QL-901涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂生产；
电动匀浆机，CONNTROL公司生产；
高速冷冻离心机，ThermoFisher SCIENTIFIC公司生产；
电泳仪Power PacTMBasic，BIO-RAD公司生产；
转膜仪Tras-Blot，BIO-RAD公司生产；
程控金属浴Inanbator Thermoelectric公司生产。
4、试剂
哺乳动物组织总蛋白提取试剂，博士德生物；
Mouse Anti-β-Actin一抗，博士德生物；
BCA蛋白质定量试剂盒，博士德生物；
广谱彩虹预染蛋白Marker，康为世纪；
超敏ECL化学发光底物，博士德生物；
过硫酸铵Ammonium Persulfate，博士德生物。
5、动物分组及照射
电子线照射100只雄性BALB/c小鼠，经过7天检疫期后，随机分为3个照射剂量组，每组30只。采用直线加速器全身照射小鼠，每次照射30只，照射剂量分别为：1.0、2.0、4.0Gy，剂量率为3Gy/min。
6、检测方法
(1)总蛋白提取和浓度测定
于照射后6、24h应用1％(m/V)水合氯醛将小鼠麻醉后提取肝脏，置于预冷的生理盐水中漂洗数次后，称取100mg，加入蛋白裂解液(含1μl PMSF)，用超声破碎仪进行组织匀浆。匀浆后在4℃下静置3小时，取出后在4℃下13000rpm离心20min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
按照BCA法制备蛋白样品，用酶标仪测定562nm波长吸光值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
(2)SDS－PAGE电泳
按比例配制12％分离胶和8％的浓缩胶，加入50μg/10μl浓度的蛋白样品和标准品，采用恒压的模式，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处停止。
(3)Western-Blot
SDS-PAGE结束后，按照标准的“三明治”方法将条带转移至PVDF膜上，条件为15V恒压转15min。
转膜结束后，用TBST洗三次，采用5％(m/V)浓度的BSA室温封闭1h，用TBST漂洗3次后，将PVDF膜放入一抗稀释液中，4℃孵育过夜。然后取出膜漂洗3次，放入HRP标志的二抗稀释液中，室温孵育2h。
显影：将超敏ECL化学发光底物中A和B两种试剂等体积混合，混合液与膜蛋白面充分接触，将胶片进行扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目标条带的分子量和净光密度值。
(二)结果
1、IGF–1R的Western-Blot结果
以凝胶电泳图像分析系统检测小鼠肝脏中，3个不同剂量照后3个时间点IGF–1R蛋白相对表达水平，采用IGF1R蛋白与内参蛋白β-actin积分光密度的比值表示，结果见图1、表1。
由图1、表1可看出，与对照组相比，以1.0Gy、2.0Gy、4.0Gy照射后6h及24h点，IGF1R蛋白与β-actin积分光密度的比值，除了照后6h1.0Gy照射组大于1，其余均小于1。表明以1.0Gy照射小鼠，照后6h其肝脏中IGF1R的表达为上调，其余组别的表达趋势为下调。且照射后6h、24h，均为4.0Gy照射组的小鼠表达最低。
表1小鼠肝脏不同照射剂量IGF1R蛋白相对表达水平比较
2、IGFBP1的Western-Blot结果
以凝胶电泳图像分析系统检测小鼠肝脏中3个不同剂量照后2个时间点IGFBP1蛋白相对表达水平，采用IGFBP1蛋白与内参蛋白β-actin积分光密度的比值表示，结果见图2、表2。
由图2、表2可看出，与对照组相比，以1.0Gy、2.0Gy、4.0Gy照射后6h及24h点，IGFBP1蛋白与β-actin积分光密度的比值除了2.0Gy照射组大于1，其余均小于1。表明以1.0Gy、4.0Gy照射小鼠，其肝脏中IGFBP1的表达趋势为下调，以2.0Gy照射小鼠，其IGFBP1的表达趋势为上调。照射后6h，1.0Gy照射组的小鼠表达最低，而照后24h为4.0Gy组表达最低。
表2小鼠肝脏不同照射剂量IGFBP1蛋白相对表达水平比较
3、IGFBP4的Western-Blot结果
以凝胶电泳图像分析系统检测小鼠肝脏中3个不同剂量照后2个时间点IGFBP4蛋白相对表达水平，采用IGFBP4蛋白与内参蛋白β-actin积分光密度的比值表示，结果见图3、表3。
由图3、表3可看出，与对照组相比，以1.0Gy、2.0Gy、4.0Gy照射后6h及24h点，IGFBP4蛋白与β-actin积分光密度的比值，除了照后6h1.0Gy照射组大于1，其余均小于1。表明以1.0Gy照射小鼠，照后6h其肝脏中IGFBP4的表达为上调，其余组别IGFBP4的表达趋势为下调。照射后6h，4.0Gy照射组的小鼠表达最低，而照后24h为2.0Gy组表达最低。
表3小鼠肝脏不同照射剂量IGFBP4蛋白相对表达水平比较
4、IGF–1的Western-Blot结果
以凝胶电泳图像分析系统检测IGF–1蛋白相对表达水平，采用IGF–1蛋白与内参蛋白β–actin积分光密度的比值表示。如图4、表4所示，与对照组相比，以1Gy、2Gy、4Gy电子射线照射后6h及24h点，IGF–1蛋白与β–actin积分光密度的比值均小于1。表明小鼠受照后其肝脏中IGF–1的表达趋势为下调。
照射后6h，1Gy照射组的小鼠表达最低，而照后24h为2Gy组表达最低。
表4小鼠肝脏不同照射剂量IGF–1蛋白相对表达水平比较
5、结论
本实验从动物水平上利用Western-Blot技术，观察比较照后不同时间小鼠肝脏中胰岛素生长因子蛋白的表达情况。通过从不同照射剂量的角度分析可看出：
(1)IGF–1R蛋白在肝组织中的表达趋势总体为下调。其中基因为4Gy6h组下调表达量最低。此结果与人肝细胞中的结果相类似，但蛋白的表达情况为照射后24h点4Gy照射组的表达最低。此结果表明蛋白表达的影响滞后于基因的表达。
(2)IGFBP1蛋白的表达为照射剂量2Gy时，表达上调；照射剂量1Gy和4Gy时表达下调。其中照射后6h，1Gy照射组的IGFBP1蛋白表达最低，与IGF–1蛋白6h点的趋势相同，而照后24h为4Gy组表达最低。
(3)IGFBP4蛋白在小鼠肝组织中的表达总体为下调。其中IGFBP4基因为4Gy 12h组下调表达量最低，而蛋白表达为4Gy 24h组下调表达量最低，此结果与IGF–1R的表达情况类似，表明蛋白表达的影响滞后于基因的表达。
(4)小鼠肝脏中IGF–1蛋白的表达趋势总体为下调。照射后6h，1Gy照射组的表达最低；照后24h为2Gy组表达最低。说明低剂量照射组在照后短时间内IGF–1表达差异最大，照后24h时，中剂量照射组的表达差异最大。
此四种基因与蛋白表达趋势总体一致，但对蛋白表达的影响表现出了滞后，表明电子辐射对胰岛素生长因子体系的影响是错综复杂的，但总体表现为低表达。发现电离辐射可抑制总RNA合成，其可能的主要原因是电子射线引起模板DNA的链断裂、碱不稳定性位点和无嘌呤位点的形成，从而阻止RNA合成时链延伸。因此提示电子射线照射4.0Gy剂量及24小时内导致小鼠肝脏中IGF–1、IGFBP1、IGFBP4和IGF–1R基因与蛋白表达降低的情况可能与RNA生物合成的质和量发生改变有关。同时由于成年后，肝细胞是这四种蛋白的主要来源，因此低表达原因也可能与电离辐射致肝细胞受损相关。肝细胞在正常状态下更新较慢，受到放射损伤后，剩余的正常肝细胞立即进入增殖过程，IGF–IR和IGF–1具有促进细胞分裂与增殖的作用。本实验中电子射线照射4.0Gy剂量内IGF–1和IGF–1R蛋白表达下调，会影响到放射性损伤后肝组织的自我修复。
本发明利用Western–Blot技术，采用电子射线全身照射BALB/c小鼠，观察比较小鼠肝脏受到不同剂量照射及照后不同时间点IGF–1R、IGFBP1、IGFBP4和IGF–1蛋白表达水平的改变。结果表明，四种基因和蛋白的表达水平基本上以下调表达趋势为主，可为辐射对肝脏的早期损伤提供依据。。
实施例2：电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测-小鼠IGF相关蛋白表达分布分析
(一)材料与方法
1、实验动物
清洁级BALB/c雄性小鼠36只，25～30g，中国食品药品检定研究院生产，实验动物生产许可证号：SCXK-(京)2014-013；中国辐射防护研究院GLP中心动物实验室饲养管理，实验动物使用许可证号：
SYXK(晋)2013-0002。
2、辐照源
直线加速器，Elekta Synergy，英国Elekta Limited公司生产，山西大医院放疗科提供，剂量率为3Gy/min。
3、仪器
冰冻切片机，德国Leica公司生产；
激光共聚焦显微镜FV1200，日本Olympus公司生产；
Forma 311型CO2培养箱，美国Thermo公司生产；
Research系列移液器，德国Eppendorf公司生产；
台式离心机，德国Heraeus instrumennts公司生产；
QL-901涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂生产。
4、试剂
TUNEL试剂盒，Loche公司生产；
4％(m/V)多聚甲醛、抗荧光衰减封片剂、DAPI染色液、羊抗兔LgG-FITC、山羊Anti-Rabbit lgGH&L(TRITC)、IGF-1Rα抗体IGFBP1抗体Anti-IGF1抗体、Anti-IGFBP4抗体、PBS缓冲液、樱花冰冻包埋剂(OCT)均购买自博士德生物。
5、动物分组及照射
电子线照射27只雄性BALB/c小鼠，经过7天检疫期后，随机分为3个照射剂量组，每组9只。采用直线加速器全身照射小鼠，照射剂量分别为：1.0、2.0、4.0Gy，剂量率为3Gy/min。
6、检测方法
(1)制片
1)于照射后6h、24h时，将照射组和对照组的小鼠用乙醚麻醉，取肝脏剔除多余脂肪，用生理盐水冲洗，放入含有4％多聚甲醛的离心管中固定。
2)取出固定后的肝脏组织放于样品托上，涂OTC包埋剂覆盖组织，置于恒温冰冻切片机中，温度降为-20℃时，切5μm厚度的薄片，用防脱载玻片贴附其上，烘箱干燥15min左右。
(2)免疫荧光染色及Olympus共聚焦显微镜观察
1)将切片拿出，室温复温半小时；
2)0.01MPBS洗3次，每次5min；
3)2N盐酸37℃处理半小时；
4)硼酸盐缓冲液中和室温10min；
5)采用甲醇破膜，放置-20℃中20min；
6)0.01MPBS洗3次，每次5min；
7)10％(m/V)BSA室温封闭一小时；
8)按比例加入一抗，置4℃过夜；
9)24小时后用0.01MPBS缓冲液洗3次，每次5min；
10)按比例加入荧光二抗，室温孵育1小时；
11)用PBS缓冲液洗脱二抗3次，每次10min；
12)加入DAPI染色液，室温孵育10min，用PBS缓冲液洗掉未结合的染液3次，每次5min；
13)滴加抗荧光衰减封片剂，以盖玻片封片，4℃避光保存；
14)用Olympus共聚焦显微镜采集图像，选FITC激发光488nm，波长530nm，绿色；第二通道用TRITC激发光543nm，波长590nm，红色；第三通道用DAPI激发光405nm，波长420nm，蓝色。每张切片取3个视野，分单通道单色荧光彩图及多通道多重荧光合成采图，将所得的数字化图像存于共聚焦显微镜系统计算机内，进一步进行图像分析。
(二)结果
1、IGF-1的表达情况
荧光免疫组化观察照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏中IGF–1的表达，激光共聚焦扫描显微镜检查结果如图5、图6、图7所示：IGF–1抗体结合部位发出红色荧光，小鼠肝脏细胞有IGF–1表达，未照射时IGF–1主要分布于细胞内，但电子线照射后，其表达弥散到细胞之间，并且随着照射剂量增加呈表达增强的趋势。
比较图5、图6、图7可看出照后6h点为部分细胞表达增强，随着照后时间延长，表达增强的细胞增多，且照射后24小时点，4Gy照射组表达弥散程度减弱。
2、IGF-1R的表达情况
荧光免疫组化观察照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏中IGF–1R的表达，激光共聚焦扫描显微镜检查结果如图8、图9、图10所示：IGF–1R抗体结合部位发出绿色荧光，小鼠肝脏细胞有IGF–1R表达，未照射时IGF–1R主要分布于细胞内，但电子线照射后，其表达弥散到细胞之间。照后6h点的表达随着照射剂量增加呈减弱的趋势，照后12h点的表达随着照射剂量增加呈先减弱后增强的趋势，照后24h点的表达随着照射剂量增加呈先增强后减弱的趋势。其中12h点1Gy照射组表达最弱，且照射后24h点，4Gy照射组表达弥散程度减弱。
3、IGFBP1的表达情况
荧光免疫组化观察照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏中IGFBP1的表达，激光共聚焦扫描显微镜检查结果如图11、图12、图13所示：IGFBP1抗体结合部位发出绿色荧光，小鼠肝脏细胞有IGFBP1表达，与对照组相比，电子线照射后IGFBP1的表达呈弥散状态。
比较图11、图12、图13可看出照后6h、12h点，1Gy、2Gy照射组IGFBP1的表达减弱，但4Gy照射组在细胞膜的位置表达明显增强。而照后24h点为1Gy、2Gy照射组表达增强，4Gy照射组表达减弱，并且弥散程度降低，细胞间表达减弱。
4、IGFBP4的表达情况
荧光免疫组化观察照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏中IGFBP4的表达，激光共聚焦扫描显微镜检查结果如图14、图15、图16所示：IGFBP4抗体结合部位发出红色荧光，小鼠肝脏细胞有IGFBP4表达，电子线照射后，其表达呈现随着照射剂量增而减弱的趋势。其中照后12h点1Gy照射组表达最弱，只有部分细胞参与表达。照后6h、12h点，4Gy照射组IGFBP4的表达弥散到细胞之间，而且照射后24h点，三个照射组IGFBP4表达弥散程度减弱，仅在细胞内表达。
实施例3：电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测-小鼠肝组织中细胞凋亡情况分析
(一)材料与方法
1、实验动物
清洁级BALB/c雄性小鼠36只，25～30g，中国食品药品检定研究院生产，实验动物生产许可证号：SCXK-(京)2014-013；中国辐射防护研究院GLP中心动物实验室饲养管理，实验动物使用许可证号：
SYXK(晋)2013-0002。
2、辐照源
直线加速器，Elekta Synergy，英国Elekta Limited公司生产，山西大医院放疗科提供，剂量率为3Gy/min。
3、仪器
冰冻切片机，德国Leica公司生产；
激光共聚焦显微镜FV1200，日本Olympus公司生产；
Forma 311型CO2培养箱，美国Thermo公司生产；
Research系列移液器，德国Eppendorf公司生产；
台式离心机，德国Heraeus instrumennts公司生产；
QL-901涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂生产。
4、试剂
TUNEL试剂盒，Loche公司生产；
4％(m/V)多聚甲醛、抗荧光衰减封片剂、DAPI染色液、羊抗兔LgG-FITC、山羊Anti-Rabbit lgGH&L(TRITC)、IGF-1Rα抗体IGFBP1抗体Anti-IGF1抗体、Anti-IGFBP4抗体、PBS缓冲液、樱花冰冻包埋剂(OCT)均购买自博士德生物。
5、动物分组及照射
电子线照射27只雄性BALB/c小鼠，经过7天检疫期后，随机分为3个照射剂量组，每组9只。采用直线加速器全身照射小鼠，照射剂量分别为：1.0、2.0、4.0Gy，剂量率为3Gy/min。
6、检测方法
(1)制片
1)于照射后6h、24h时，将照射组和对照组的小鼠用乙醚麻醉，取肝脏剔除多余脂肪，用生理盐水冲洗，放入含有4％多聚甲醛的离心管中固定。
2)取出固定后的肝脏组织放于样品托上，涂OTC包埋剂覆盖组织，置于恒温冰冻切片机中，温度降为-20℃时，切5μm厚度的薄片，用防脱载玻片贴附其上，烘箱干燥15min左右。
(2)免疫荧光染色及Olympus共聚焦显微镜观察
1)使切片室温复温半小时；
2)采用1％(m/V)低聚甲醛处理10min，PBS缓冲液洗2次，每次5min；
3)固定于乙醇乙酸(2:1)混合液中，-20℃中保存5min，之后用PBS缓冲液洗2次，每次5min；
4)去掉多余液体，以75μl/5cm2将Equilibration Buffer直接加到组织上，室温条件下孵育10s；
5)去掉多余液体，滴加55μl/5cm2Working Strength TdT Enzyme到组织上，37℃条件下,于湿盒中孵育1小时；
6)将切片放入加有Working Strength stop/wash buffer的染缸中，室温条件下孵育10min；
7)用PBS缓冲液洗1次5min，轻轻吸去多余液体；
8)将室温放置好的Anti-Digoxigenin conjugate以65μl/5cm2加入到每张玻片上，室温条件下，湿盒放置30min，避光；
9)用PBS缓冲液洗4次，每次2min；
10)滴加抗荧光衰减封片剂，以盖玻片封片，4℃避光保存；
11)用rhodamine激发，Olympus共聚焦显微镜采集图像选rhodamine激发，红色；第二通道用DAPI激发，蓝色。每张切片取3个视野，分单通道单色荧光彩图及多通道多重荧光合成采图，将所得的数字化图像存于共聚焦显微镜系统计算机内，进一步进行图像分析。
(二)结果
采用TUNEL法检测电子线照射后6h、24h点，小鼠肝脏细胞凋亡的情况检测结果如图17、图18所示：与抗体结合发出红色荧光的部位为染色体DNA出现断裂或缺口的部位，显示细胞出现凋亡。图中对照组细胞核显示蓝色且完整，随着照射剂量增加图中红色部位增多，显示凋亡细胞增多。其中照后24h点2Gy照射组凋亡情况最为显著，提示电子线照射可引起小鼠肝脏细胞凋亡。
本实验通过采用激光共聚焦显微镜进一步探讨电子线照射后，小鼠肝脏中IGF–1、IGF–1R、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表达情况。同时采用TUNEL法检测电子线照射后6h、24h点，小鼠肝脏细胞凋亡的情况。结果显示：
(1)照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏细胞有IGF–1蛋白的表达，未照射时IGF–1主要分布于细胞内，但电子线照射后，其表达弥散到细胞之间，并且随着照射剂量增加呈表达增强的趋势。照后6h点为部分细胞表达增强，随着照后时间延长，表达增强的细胞增多，且照射后24小时点，4Gy照射组表达弥散程度减弱。正常情况下，机体内的IGF–1主要由肝脏细胞以旁分泌或自分泌方式产生，因此照射后表达弥散到细胞之间，且随着照射剂量增加而增强，提示电子线照射可刺激肝脏细胞对IGF–1的表达和分泌。TUNEL法检测到电子线照射后6h、24h，小鼠肝脏细胞出现凋亡。因此照后24h点，4Gy照射组IGF–1表达弥散程度减弱，可能由于肝细胞受到损伤影响了IGF–1的表达。
(2)照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏细胞有IGF–1R蛋白的表达，未照射时IGF–1R主要分布于细胞内，但电子线照射后，其表达弥散到细胞之间，提示电子线照射可刺激肝脏细胞对IGF–1R的表达和分泌。照后6h点的表达随着照射剂量增加呈减弱的趋势，照后12h点的表达随着照射剂量增加呈先减弱后增强的趋势，照后24h点的表达随着照射剂量增加呈先增强后减弱的趋势。其中12h点1Gy照射组表达最弱，且照射后24h点，4Gy照射组表达弥散程度减弱，此结果与IGF–1的表达结果相呼应，可能由于肝细胞受到损伤影响了IGF–1的分泌。IGF–1与IGF1R结合，可以促进细胞分化、增殖，而照射后IGF–1和IGF1R表达水平降低，影响肝脏自我修复。因此辐射后IGF–1与IGF1R蛋白表达降低，可能是一个相互影响下的结果。
(3)照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏细胞有IGFBP1蛋白的表达，与对照组相比，电子线照射后IGFBP1的表达呈弥散状态，提示电子线照射可刺激肝脏细胞对IGFBP1的表达和分泌。照后6h、12h点，1Gy、2Gy照射组IGFBP1的表达减弱，但4Gy照射组在细胞膜的位置表达明显增强。可推测短时间内，照射剂量较高时，会刺激肝细胞表达IGFBP1。而照后24h点为1Gy、2Gy照射组表达增强，4Gy照射组表达减弱，并且弥散程度降低，细胞间表达减弱。可推测照后时间延长，照射剂量较低时，会刺激肝细胞表达IGFBP1，而照射剂量增强会抑制肝细胞表达IGFBP1。
(4)电子线照射后6h、12h、24h点，小鼠肝脏细胞有IGFBP4蛋白的表达，且照射后，其表达呈现随着照射剂量增加而减弱的趋势。其中照后12h点1Gy照射组表达最弱，只有部分细胞参与表达。照后6h、12h点，4Gy照射组IGFBP4的表达弥散到细胞之间，而且照射后24h点，三个照射组IGFBP4表达弥散程度减弱，仅在细胞内表达。提示电子线照射可抑制肝脏细胞对IGFBP4的表达，且随着照后时间延长分泌到细胞外的IGFBP4也随之减少。IGFBP4是一个主要由肝脏分泌的细胞增殖抑制因子，它通过与IGF–1结合来阻止IGF–1与其受体的结合，从而发挥其生物学作用。因此照射后IGFBP4蛋白的表达下调，首先提示肝细胞受损，导致它的表达减少。TUNEL法检测到照射后6h、24h，小鼠肝脏细胞出现凋亡，也印证了上述结果。其次IGFBP4表达下调，对机体中IGF–1浓度的调节作用降低，反而缓和了IGF–l表达下调对肝组织的影响。此外有研究表明IGFBP4是强有力的Wnt通路抑制剂，而Wnt通路过度激活导致DNA损伤，因此IGFBP4的低表达也可能间接导致DNA损伤。
本实验中电子线照射4.0Gy剂量内IGF–1和IGF–1R蛋白表达下调，IGFBP1、IGFBP4表达上调，会影响到放射性损伤后肝组织的自我修复。同时本实验结果显示四种蛋白的表达既有上调也有下调，且趋势互有相同，表明肝损伤是一个错综复杂的过程。
本发明采用电子线全身照射BALB/c小鼠，采用激光共聚焦显微镜、TUNEL法，观察比较小鼠肝脏受到不同剂量照射及照后不同时间点IGF–1R、IGFBP1、IGFBP4和IGF–1蛋白表达水平的改变。结果表明，电子线照射后6h、24h，小鼠肝脏细胞出现凋亡，电子线照射可刺激肝脏细胞对IGF–1、IGF–1R、IGFBP1蛋白的表达和分泌。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种电子线照射对小鼠IGF相关蛋白表达影响的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括小鼠IGF相关蛋白表达量分析和/或小鼠IGF相关蛋白表达分布分析和/或小鼠肝组织中细胞凋亡情况分析，
所述的小鼠IGF相关蛋白表达量分析包括如下步骤：
(1)小鼠肝脏总蛋白提取和浓度测定：小鼠在电子线辐射照射后麻醉提取肝脏，肝脏经清洗后加入蛋白裂解液进行组织匀浆，匀浆液静置后离心取上清，测定上清中蛋白质浓度；
(2)小鼠肝脏总蛋白电泳和Western-Blot检测：对上清进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot检测；
(3)表达量分析：用凝胶图像处理系统分析Western-Blot显色目标条带的分子量与表达量，
所述的小鼠IGF相关蛋白表达分布分析包括如下步骤：
(A)制片：小鼠在电子线辐射照射后麻醉提取肝脏，剔除多余脂肪并经清洗后放入含多聚甲醛的溶液中进行固定，固定后的肝脏涂包埋剂覆盖组织，在冰冻机中进行切片后烘箱干燥；
(B)共聚焦显微镜观察：干燥后的切片经清洗、盐酸处理并中和后破膜，清洗、BSA封闭并先后加入一抗、洗涤、加入二抗、洗涤，然后在染色后在共聚焦显微镜下采集图像进行分析，
所述的小鼠肝组织中细胞凋亡情况分析包括如下步骤：
(I)制片：小鼠在电子线辐射照射后麻醉提取肝脏，剔除多余脂肪并经清洗后放入含多聚甲醛的溶液中进行固定，固定后的肝脏涂包埋剂覆盖组织，在冰冻机中进行切片后烘箱干燥；
(II)共聚焦显微镜观察：干燥后的切片经低聚甲醛处理、清洗后进行固定、洗涤，然后在先后加缓冲液、抗体分别进行孵育后再孵育染色，清洗后在共聚焦显微镜下采集图像进行分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)、步骤(A)、步骤(I)中，所述的辐射照射的总剂量为1-4Gy。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的麻醉为水合氯醛麻醉，所述的蛋白质浓度测定采用BCA法。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为8％；所述的Western-Blot检测加入的一抗为IGF单抗。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(A)与步骤(I)中，所述的麻醉为乙醚麻醉，所述的固定在含多聚甲醛的离心管中进行。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(B)与步骤(II)中，在染色后还滴加抗荧光衰减封片剂，以盖玻片封片。
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