JP2009518011A - 結合ポリペプチド及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年12月2日に出願の米国特許第60/742185号及び2006年6月22日に出願の米国特許第60/805553号の優先権を主張する非仮出願であり、出典明記により本明細書にその内容全体が援用されるものである。
本発明は、一般的に非常に制限されたアミノ酸レパートリーを用いて多様化した変異型CDR、及びそのような配列を複数含むライブラリに関する。また、本発明はこれら変異型CDRを含む融合ポリペプチドに関する。また、本発明は治療に又は試薬として用いることができる新規の結合型ポリペプチドを同定するために有用な方法及び組成物に関する。
ファージディスプレイ技術は抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成し、選別するための強力なツールである。ファージディスプレイ技術の使用により、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速に分類することができるタンパク質変異体の大きなライブラリを作製することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルスコートタンパク質、例えば遺伝子IIIタンパク質又は遺伝子VIIIタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質ないしポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子IIIタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990);Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子IIIタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリを作製してそのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている(例として、米国特許第5,723,286号、米国特許第5,432,018号、米国特許第5,580,717号、米国特許第5,427,908号および米国特許第5,498,530号)。
本発明は、制限された多様性を有する配列を含むが、抗原結合能を維持している変異型CDRを含むポリペプチドを生成する簡素化した利便性の高い方法を提供する。特定のCDR又はすべてのCDRを多様化した場合にのみ標的結合体の十分な多様性が生じるという定理に基づいた従来の方法や、多様な範囲のアミノ酸置換(一般的に20アミノ酸すべて又はそのほとんどを置換することによる)に依存して十分な多様性を得るという従来の概念と異なり、本発明は、参照ポリペプチド又は由来する抗原の特定のCDRや特定数のCDRを多様化することに頼る必要がない高質の標的結合体を生成することができる方法を提供する。本発明は、標的抗原に結合することができる機能的ポリペプチドを含む高質の非常に多様なライブラリが非常に制限された数のアミノ酸残基がある最小限の数のアミノ酸位置を多様化することによって生成することができるという驚くべきかつ不測の発見に少なくともある程度は基づいている。本発明の方法は、迅速、利便性が高く、順応性があり、少ない数のアミノ酸をコードする制限したコドンセットの使用に基づく。配列の多様性を制限しているので、本発明の方法によって生成したポリペプチドの集団(例えば、ライブラリ)は一般的により小さいので、必要又は希望に応じてこれら集団の更なる多様化が可能となる。これは一般的に従来法では得られなかった有益性である。本発明によって生成される候補結合体ポリペプチドは質の高い標的結合特性を有しており、細胞培養物中の生成物の回収率が高い構造的特性を有する。本発明は、これら結合体ポリペプチド生成方法、これらポリペプチドの使用方法、及びこれらを含む組成物を提供する。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がR、Y及びMから選択され、X2がY及びRから選択され、X3がY、S、R、P及びGから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY、S、R及びHから選択され、X6がR、Y及びSから選択され、X7がG、Y及びSから選択され、X8がR、Y及びSから選択され、X9がG、Y及びSから選択され、X10がR、Y及びSから選択され、X11がG、Y及びSから選択され、X12がS、Y、R、G及びAから選択され、X13がG及びYから選択され、X14がL、M、R、G及びAから選択され、そして、X15がG、F及びLから選択されるかないしは存在せず、そして、X16がFであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−D−Y(配列番号:31)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:26)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:27)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む。
(i) CDRL3が、X1が位置91にあって、Y、H及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY、S及びTから選択され、X4がY、S及びTから選択され、そして、X5がS、P及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。一実施態様では、CDRL1は、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含む。一実施態様では、CDRL2は、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1は位置28にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、X1がアミノ酸位95であって、Y、S、R、G及びEから選択され、X2がY、S、R及びGから選択され、X3がS、Y、G及びWから選択され、X4がS、Y、G及びQから選択され、X5がG、Y及びSから選択され、X6がG、Y、S、R及びVから選択され、X7がS、Y、G及びRから選択され、X8がY、S、G、R、P及びVから選択され、X9がG、A,Y、S及びRから選択され、X10がM、F、G、Y、S及びRから選択され、X11がA、Y、S、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、F、L、A、G、S、Y、R及びTから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、Y、T及びSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、M、F、I、G、Y、A及びTから選択されるかないしは存在せず、X15がM、L、Y、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X16がY及びGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、M及びGから選択されるかないしは存在せず、X18がP及びAから選択されるかないしは存在せず、そして、X18がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:584)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−G−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX12が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X19がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−X15−X16−(X17)n−X18−X19−D−Yを含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−S−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX14が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X17がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−(X15)n−X16−X17(配列番号: )を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む。
i) アミノ酸配列GFSIYSSYIH(配列番号:821)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:848)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAFDY(配列番号:875)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFSIWWSWIH(配列番号:932)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SISPSSGWTSYADSVKG(配列番号:959)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAMDY(配列番号:986)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFSISSSYIH(配列番号:944)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:971)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列YYSYALDY(配列番号:998)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFYISnSSSIH(配列番号:230)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列YIYPSSGYTSYADSVKG(配列番号:336)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列GYYYSYYSGYALDY(配列番号:442)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。
(i) CDRL1は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、
(ii) CDRL2は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、そして、
(iii) CDRL3は、X1−X6がシステイン以外の天然に生じる任意のアミノ酸であり、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91である、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−(X4)n−X5−X6−T(配列番号: )を含む。
(i) CDRL1は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、
(ii) CDRL2は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、そして、
(iii) CDRL3は、X1−X5がシステイン以外の天然に生じる任意のアミノ酸であり、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91である、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含む。
ある実施態様では、上記いずれかの重鎖ポリペプチドによる免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドと、上記いずれかの軽鎖ポリペプチドによる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドとを含んでなる抗体が提供される。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号: )を含むCDRH3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がY、S、G、RおよびEから選択され、X2がY、S、G、R、MおよびAから選択され、X3がG、Y、S、R、WおよびHから選択され、X4がY、S、G、R、FおよびQから選択され、X5がG、Y、N、AおよびSから選択され、X6がF、M、L、A、R、G、H、W、V、YおよびSから選択され、X7がM、L、G、A、R、F、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X8がM、L、F、I、R、G、P、V、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X9がG、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X10がM、F、G、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X11がA、G、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、L、F、A、G、R、T、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、T、YおよびSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、F、M、I、G、A、T及びYから選択されるかないしは存在せず、X15がM、Y G、LおよびRから選択されるかないしは存在せず、X16がYおよびGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、MおよびGから選択されるかないしは存在せず、X18がPおよびAから選択されるかないしは存在せず、そしてX19がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号:25)を含むCDRL3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そしてX19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R及びFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そしてX19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(a) CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3からなる群から選択した起源抗体の少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDRを含む起源抗体のうちの軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、又はその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを構築し;
(b) 起源抗体の少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDRを変異させて、上記の一又は複数の高頻度可変領域を生成する
ことを含んでなる方法が提供される。
(a) 上記の一又は複数のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し、
(b) 標的抗原に結合する前記組成物から一又は複数のポリペプチドを選別し、
(c) 標的抗原に結合しないポリペプチドから標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(d) 標的抗原に対して所望の親和性を有する標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを同定する
ことを含んでなる方法が提供される。
(a) 上記の一又は複数のライブラリを標的抗原と接触させ、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、およそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の減少した量の標的抗原を含む一連の溶液中で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドをインキュベートし、そして、
(c) 最も低い濃度の標的抗原に結合することができる、又はおよそ0.1nM〜およそ200nMの親和性を有する、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを選別する、
ことを含んでなる方法が提供される。
(a) 上記のいずれかのポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる方法が提供される。
(d) 結合に適した条件下で、混合物を形成するためにおよそ0.1nM〜およそ1000nMの範囲の標識した標的抗原の濃縮物とともにサブ集団をインキュベートし、
(e) 標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を該混合物に接触させ;
(f) 標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを検出して、標識した標的抗原から標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、
(g) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団と、以前の選別ラウンドよりも低い濃度の標識した標的抗原を用いて(d)−(f)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる。
(a) 上記いずれかのポリペプチドを複数含むライブラリに少なくともおよそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原から標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られたサブ集団と、最も低い濃度の標的抗原で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離するために以前のラウンドで用いた標的抗原の低い濃度を用いて(a)及び(b)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる方法が提供される。
(a)本明細書中に記載の本発明のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し;
(b)前記組成物から標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し;
(c)非結合体からポリペプチド結合体を単離し;
(d)単離したポリペプチド結合体から所望の親和性を有する結合体を同定する
ことを含む方法を提供する。
(a)本発明の(本明細書中に記載のような)抗体可変ドメインのライブラリに標的抗原を接触させ;
(b)非結合体から結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して、そして約0.1nM〜1000nMの濃度の減少した量の標的抗原を含む溶液中で結合体をインキュベートし;
(c)最も低濃度の標的抗原に結合することができる、約0.1nM〜200nMの親和性を有する結合体を選別する
ことを含む方法を提供する。
一実施態様では、標的抗原の濃度は約100〜250nM、又は約25〜100nMである。
(a)本発明の(本明細書中に記載の)ポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し;
(b)非結合体からライブラリ中のポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、
(d)結合体が混合物を形成するのに適した条件下で0.1nM〜1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体のサブ集団をインキュベートし;
(e)標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ;
(f)標識した標的抗原に結合したポリペプチド結合体を検出して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し;
(g)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標識標的抗原を用いて、(d)〜(f)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含む方法を提供する。
(a)本発明の(本明細書中に記載の)ポリペプチドを複数含むライブラリに少なくとも約0.1nM〜1000nMの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し;
(b)標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、ポリペプチド結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返して、もっとも低い濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離する
ことを含む方法を提供する。
(a)結合に適した条件下にてライブラリに0.1nM〜1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原を接触させて、ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体を形成させ;
(b)複合体を単離して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含むアッセイを提供する。
(a)ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を濃縮した標的抗原とともにインキュベートし;
(b)標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし;
(c)ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ;
(d)各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し;
(e)第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料の結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する
ことを含む方法を提供する。
一実施態様では、本明細書中に記載の腫瘍、悪性腫瘍、及び炎症性疾患又は免疫疾患を含む異常な血管新生に関連する他の疾患、及び/又は糖尿病又は他のインスリン関連の疾患を治療するのに有用な本発明の結合ポリペプチドはFab又はscFv抗体である。したがって、このような結合ポリペプチドは炎症性疾患や免疫疾患の治療のための医薬の製造において用いることができる。本明細書中に記載の疾患又は疾病に罹患しているか、その発症リスクがある哺乳動物を、本発明のポリペプチド(例えば抗体)と第二治療薬と同時、連続して、又は組み合わせて投与することによって治療することができる。第二治療薬に加えて他の治療薬は哺乳動物に投与できる、又は所望の適応症の医薬の製造において用いることができることが理解されるであろう。
本発明は、CDR配列(抗体可変ドメイン配列を含む)を多様化するための新規の、非慣習的な、非常に簡略化された順応性のある方法及び、多数、一般的には非常に多くの多様化されたCDR(抗体可変ドメイン配列を含む)を含むライブラリを提供する。そのようなライブラリは、例えば結合親和性や結合力などの所望の活性を有する合成抗体クローンを選別する及び/又はスクリーニングするのに有用な組み合わせライブラリを提供する。このようなライブラリは、多種多様な任意の標的抗原と相互作用することができる免疫グロブリンポリペプチド配列を同定するために有用である。例えば、本発明のファージディスプレイとして発現される多様化した免疫グロブリンポリペプチドを含むライブラリは所望の抗原結合分子を選択したり、又はスクリーニングするために特に有用であり、そのためのハイスループットで効率が良く、自動化したシステムを提供する。本発明の方法は、起源又は鋳型分子の変異を最小限にして標的抗原への親和性の高い結合体を提供するため、及び抗体又は抗原結合断片が細胞培養物で産生される場合に産生効率が良いように設定するものである。
アミノ酸は本明細書中において、一文字表記又は三文字表記又はその両方で表す。
用語「親和性精製」は、化学物質または結合パートナーへ分子が特異的に誘引または結合され、その結果パートナーに結合または誘引されたままの状態でその分子が不純物から分離されるような組合せまたは複合体の形成に基づく分子の精製を意味する。
場合によって、いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、結合アッセイにおいて測定されるところの、およそ1nMからおよそ20nMのIC50値を表す。
他の実施態様によると、〜100反応単位(RU)の固定したhVEGF(8−109) CM5チップを用いて25℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってKd又はKd値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN-ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化した。ヒトVEGFを10mM 酢酸ナトリウム(pH4.8)で5μg/ml(〜0.2μM)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(RU)がおよそ10になるように5μl/分の流速で注入した。ヒトVEGFの注入後、反応しない群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、2倍の段階希釈したFab(0.78nMから500nM)を25℃、およそ25μl/分の流速で0.05%Tween20(PBST)を含むPBSに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Kon)と解離速度(Koff)を算出した。平衡解離定数(Kd)をKoff/Kon比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。
本発明の一態様では、抗体可変ドメインの高品質のライブラリーが作製される。このライブラリーは、限定した多様性のあるCDR配列の異なる配列、例えば多様性のある抗体可変ドメインを有する。このライブラリーは一以上の抗原、例えばDR5及びヒトHER-2などに対して高い親和性を有する結合抗体可変ドメインを含む。このライブラリーの多様性は、単一の起源抗体内の溶媒と接触しうる非常に多様であるアミノ酸位置を選択し、制限コドンセットを使って少なくとも1つのCDR内のそれらの位置を突然変異させることによって設定する。制限コドンセットは、ある実施態様では、19、15、10、8、6、又は4アミノ酸をコードする、又は2アミノ酸のみをコードする。
CDRL1:28、30、31、32
CDRL2:50、53
CDRL3:91、92、93、94、96
CDRH1:28、30、31、32、33
CDRH2:50、52、52A、53、54、55、56、57、58。
鋳型核酸に選択されたアミノ酸を置換する方法は当技術分野で確立されており、その幾つかは本明細書で記載されている。例えば、キュンケル方法を使用し、少なくとも1つのCDR領域の溶媒に露出しかつ/または非常に多様な位置を対象に変異体アミノ酸でアミノ酸を置換することによってライブラリーを作製することができる。例えば、Kunkel他, Methods Enzymol.(1987), 154:367-382頁を参照。ランダム化された配列の生成は、下の実施例でも後述する。
G グアニン
A アデニン
T チミン
C シトシン
R(AまたはG)
Y(CまたはT)
M(AまたはC)
K(GまたはT)
S(CまたはG)
W(AまたはT)
H(AまたはCまたはT)
B(CまたはGまたはT)
V(AまたはCまたはG)
D(AまたはGまたはT)
N(AまたはCまたはGまたはT)
本発明の1つの態様は遺伝子融合をコードしている核酸配列を含んでいる複製可能な発現ベクターを含み、前記遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した、1つのCDR含有ポリペプチド(抗体可変ドメインなど)、または1つの抗体可変ドメインと1つの定常ドメインを含む融合タンパク質をコードする。先に述べたように多様な配列で生成された複数の融合ポリペプチドを含む複数の異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合を含む、多様で複製可能な発現ベクターのライブラリーも含まれる。ベクターは様々な構成成分を含んでいてもよく、好ましくは異なるベクターの間で抗体可変ドメインが移動できるように、かつ/または異なるフォーマットで融合タンパク質が提示されるように構築される。
CDR含有ポリペプチド(例として抗体可変ドメイン)の融合ポリペプチドは、細胞、ウイルスまたはファジミド粒子の表面で様々な形式で提示することができる。これらの形式には、単鎖Fv断片(scFv)、F(ab)断片およびこれらの断片の多価の形態が含まれる。例えば、多価の形態は、ScFv、FabまたはF(ab’)の二量体を含み、これらは本明細書では(ScFv)2、F(ab)2およびF(ab’)2とそれぞれ称す。多価の形態の提示は、それらが、通常低親和性クローンの同定をもたらし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にする複数の抗原結合部位を有することにおいて有益である。
本発明に従って記載されているように構築されたベクターは、増幅および/または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む標準の形質転換法を使って、宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイルスのような感染性の粒子であるならば、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。遺伝子融合をコードする複製可能な発現ベクターを含んでいる宿主細胞のトランスフェクションおよび標準手法によるファージ粒子の生産は、融合タンパク質がファージ粒子の表面で提示されるファージ粒子を提供する。
方法論に様々な置換および変更を加えた、対象抗原結合体を同定するためのファージディスプレイの使用は、当技術分野で確立されている。一手法では、融合ポリペプチドをコードしている遺伝子融合体と作用可能に連結した転写調節要素を含む複製可能な変異体ベクターのファミリーを構築し、適当な宿主細胞に形質転換し、この形質転換細胞を培養して前記融合ポリペプチドをファージ粒子表面で提示するファージ粒子を形成し、その後選択の過程で結合しない粒子と比較して結合する粒子のサブセットを増加させる目的で、少なくとも粒子集団の一部が対象と結合するように組換え体ファージ粒子を対象抗原と接触させることによる選択または選別を伴うプロセスを行う。選択されたプールは、異なるかまたは同じストリンジェンシーで同じ対象をさらに1回選別するために、宿主細胞、例えば新鮮なXL1−Blue細胞を感染させて増幅することができる。得られた変異体のプールは、次に新規高親和性結合タンパク質を同定するために、対象抗原に対してスクリーニングされる。これらの新規高親和性結合タンパク質は、アンタゴニストまたはアゴニストなどの治療薬として、かつ/または診断薬および研究試薬として有用であり得る。
一又は複数の選別ないしは分類ラウンドにカウンター選別を含め、一又は複数の非標的抗原に対して望ましくない結合も示す結合体を単離してもよい。
ポリペプチド
抗体可変ドメインの少なくとも1つのCDR内の溶媒と接触しうるかつ/または非常に多様な位置を突然変異させて、変異型CDRポリペプチドのライブラリーを作製することができる。いくつかまたはすべてのCDRは、本発明の方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態では、CDRH1、CDRH2およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはCDRL3およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはCDRL3、CDRH1、CDRH2およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより多様な抗体ライブラリーを作製することが好ましいかもしれない。
本発明の方法に従ってコドンセットとCDRの任意の組み合わせを多様化することができる。様々なCDRの組み合わせ内の好適なコドンの例を図2、6、9、13に挙げる。
本発明の抗体ポリペプチドの組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はPCR法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、DNAを原核生物宿主中に導入し、そのDNAを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(LB)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約20℃から約39℃、約25℃から約37℃の範囲、約30℃である。培地のpHは、主として宿主生物に応じて、約5から約9の範囲の任意のpHでありうる。大腸菌に対しては、pHは約6.8から約7.4、約7.0である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにPhoAプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はC.R.A.P培地である(例として、Simmonsら., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約180−220のOD550まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約12−50時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼIII、OmpT、DegP、Tsp、プロテアーゼI、プロテアーゼMi、プロテアーゼV、プロテアーゼVI及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998);Georgiou等, 米国特許第5264365号;Georgiou等, 米国特許第5508192号;Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
ある実施態様では、本明細書に記載の生成した抗体タンパク質をさらに精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である:免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカ又はDEAEなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G−75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインAを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインAは抗体のFc領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した41kDの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。ある実施態様では、プロテインAを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面を含むカラムである。ある実施態様では、プロテインAを固定した固形層は、孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムである。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインA固定固形層に適応し、プロテインAに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む:シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
(i)シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。ある実施態様では、異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、多価抗体をコードするDNAに読み枠を一致させて結合される。
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばDHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネインI及びII、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA(配列番号:586)配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンcDNAの発現について、Reyes等, Nature, 297:598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうる。ある実施態様では、エンハンサーはプロモーターから5'位に位置している。
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34); バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。ある実施態様では、低pH疎水性作用クロマトグラフィは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)で行う。
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的/化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、N末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
特定の実施態様では、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、エライザ(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインAイムノアッセイのような技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。
本発明は、ヒト抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
一態様では、本発明は、Fc領域を含むFcポリペプチドの作用面内に修飾を有する抗体断片を提供するものであり、ここでいう修飾によって異種性二量体化を容易にする及び/又は促進される。この修飾は、第一Fcポリペプチド内への隆起と第二Fcポリペプチド内への腔の導入を含むものであり、ここでいう隆起は第一Fcポリペプチドと第二Fcポリペプチドの複合体化を促進するために腔内に位置する。これらの修飾を有する抗体の生成方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第5,731,168号に記載されている。
ある実施態様では、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせをその最終コンストラクトに達するまでなされることによって最終コンストラクトが所望の特徴を有する。配列を作製すると同時に目的の抗体アミノ酸配列にアミノ酸修飾を導入するのがよい。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、FR変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表2に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
(1) 非極性:Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 荷電のない極性:Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 酸性:Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性:Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる:
(1) 疎水性:ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 中性親水性:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 酸性:Asp, Glu;
(4) 塩基性:His, Lys, Arg;
(5) 鎖配向に影響する残基:Gly, Pro;
(6) 芳香族:Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、保存的置換部位又はより好ましくは残りの(非保存的)部位内に置換された残基を導入してもよい。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばFc領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、WO99/51642などに記載のようにC1q結合及び/又は補体依存性細胞障害(CDC)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるFc領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Fc領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;及びWO94/29351を参照。
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)に関する。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4137230号;同4248870号;同4256746号;同4260608号;同4265814号;同4294757号;同4307016号;同4308268号;同4308269号;同4309428号;同4313946号;同4315929号;同4317821号;同4322348号;同4331598号;同4361650号;同4364866号;同4424219号;同4450254号;同4362663号;及び同4371533号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体C242に結合するDM1と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体A7、又はHER-2/neuオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。TA.1-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞SK-BR-3におけるインビトロで試験され、細胞当たり3×105HER-2表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。A7-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。1分子の毒素/抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均3−4のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5208020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。ある実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235B1号、及びChari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)より)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる:(1)共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2)共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ab−(L−D)p I
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む:(i)N末端アミン基、(ii)側鎖アミン基、例えばリシン、(iii)側鎖チオール基、例えばシステイン、および(iv)抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる:(i)活性エステル、例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物;(ii)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;(iii)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばDTT(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、2の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる2-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。ある実施態様では、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A. 編 (1980))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
例えば、本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法で用いてもよい。本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及び/又はインビボで特異的抗原活性を部分的に又は完全にブロック(遮断)するアンタゴニストとして用いることができる。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種から抗原活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含んでいる細胞培養物中、患者、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類対象動物(例えばチンパンジ、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよび赤毛猿、ブタ又はマウス)の特異的抗原活性を阻害するために用いることができる。一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように抗原と抗体とを接触させることによって抗原活性を阻害するために用いることができる。ある実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子である。
治療的に有効である本発明の遮断又はアンタゴニスト抗体には、例えば、限定するものではなく、抗HER2抗体が含まれる。例えば、本発明の抗HER-2抗体は一以上の抗原分子の異常発現及び/又は活性が関与する疾患、疾病又は症状、の治療、阻害、経過を遅延、再発を予防/遅延、寛解、又は予防に用いることができる。この疾患、疾病又は症状には、限定するものではないが、悪性及び良性の腫瘍;非白血病及びリンパ系の悪性腫瘍;神経系、神経膠、星状膠、視床下部、他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性の疾患;及び炎症性、血管形成性、免疫系の疾患が含まれる。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は癌細胞のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はDR5のアゴニストである。他の実施態様では、抗体はDR5のApo-2Lとの結合について競合する。
本明細書に記載の様々な病理学的状態の哺乳動物の診断は当業者によってなされうる。診断用技術は、例えば、哺乳動物の癌や免疫関連の疾患の診断又は検出を行う技術に利用できる。例えば、癌は、限定するものではないが触診、血液分析、X線、NMRなどを含む技術により同定されうる。免疫性関連の疾患もまた、容易に同定することができる。例えば、全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心的メディエータは、自己タンパク質/組織に対する自己応答性抗体の産生とその後の免疫が媒介する炎症の生成である。腎臓、肺、筋骨格システム、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄、および血液を含む複数の臓器及びシステムは、臨床的に影響を受ける。医師は、免疫および/または炎症性応答の介入が利点を有する多くの疾患に詳しい。
本発明の抗体(及び補助治療薬)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、好適な任意の方法投与することができる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0.1mg/kg〜10mg/kg)の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な1日量は、上記の要因に応じて、約1μg/kg〜100mg/kg以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲であろう。ゆえに、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg又は10mg/kgの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は3週ごとに投与してもよい(例えば患者に約2〜約20、例えば約6用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約4mg/kgの初期負荷投与量の後、約2mg/kgの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と;(b)組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞毒性剤を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二抗体組成物を特定の症状、例えば癌の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。このベクターは、米国公開特許第20050119455号及びLee et al., J. Immunol. Meth. 284: 119-132 (2004)に記載されるように構築した。前記ベクター(図5に概略的に示す)はIPTG誘導性Ptacプロモーターの制御下にヒト化抗体4D5可変ドメインを含む。ヒト化抗体4D5は、主に重鎖及び軽鎖のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域と、HER-2に特異的なマウスモノクローナル抗体のCDR領域を有する。抗HER-2抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同定は、米国特許第5821337号及び同第6054297号に示される。
ライブラリYSGR-A−D(実施例1に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトDR5又はHER-2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
ヒトDR5配列を表1に示す。表1に示すようにDR5の細胞外ドメインを結合選別に用いた。同様に、ヒトのHER-2配列の細胞外ドメインは、Franklin MC. Carey KD. Vajdos FF. Leahy DJ. de Vos AM. Sliwkowski MX. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex.. Cancer Cell. 5(4): 317-28, 2004に記載のように調製する。ヒトHER-2 ECD(アミノ酸23−646)の配列は、タンパク質データバンク記録1S78(2004)に示される。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して5回の選別ラウンドを行った。各回の選別ラウンドから得た個々のクローンをカルベニシリンとM13−K07を添加した500μLの2YT培養液を含む96ウェルフォーマットにて生育させた。培養物上清をファージELISA(上掲のSidhu等)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがBSAでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイFabを検出した。BSAコートプレートと比較して標的コートプレート上で少なくとも10倍より大きなELISAシグナルを呈するファージクローンを特異的結合体として定義した。ヒトDR5又はヒトHER-2への結合について4及び5回の選別ラウンドの後に個々のクローンをスクリーニングした。特定の結合体を用いて配列分析を行った。また、スポットアフィニティELISA、特異性ELISA及び本明細書中に記載の方法を用いたHER2についての親和性を用いて特定の結合体を分析した。(図11Bを参照)。図10に示すように、YSGR-A−Dライブラリは、両方の標的タンパク質に対して特異的な結合体を生産した。
抗HER-2重鎖可変ドメインは、オリゴライブラリに含まれない短いCDRH3(例えば、95−100aに対応する位置の6〜7アミノ酸)配列の優先度を示す。(図12を参照)。CDRH3は、位置95のN末端に保存されたチロシン残基を示す。他の保存された位置は主にグリシンである位置99に見られる。コンセンサス配列は、CDRL3:QQSYYX4PST(配列番号:587);CDRH1:GFSIX2X3SYIH(配列番号:588);及びCDRH2:SIYPX3SGYTSYADSKVG (配列番号:589)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、各CDRのX位置はY又はSである。
中程度の長さ(例えばおよそ12〜14アミノ酸)のCDRH3領域を有する重鎖可変ドメインの分析により、CDRH3コンセンサス配列X1X2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY (配列番号:592)が示され、このXはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、X1はY、S及びRから選択され、X2はYおよびSから選択され、X3はG、YおよびSから選択され、X4はY、S、RおよびGから選択され、X10はY、SおよびGから選択され、X12はY、S、GおよびRから選択され、X13はGおよびAから選択され、そして、X14はI、F、F及びLから選択される(図14を参照)。CDRH3はループを形成するので、CDRH3のコンセンサスは2アミノ酸に対していくつかのクローンで配列を変えることによって作製し、配列の位置95は、この場合クローン52の配列であった参照配列の位置97と配列比較を行う。また、コンセンサス配列も、CDRH1:GFX1ISSSSIH(配列番号:593)とCDRH2:X1IX2PSSGYTX6YADSKVG(配列番号:594)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、Y又はSである。
図10に示すように、ヒトDR5に対して特異的な結合体であったFabを発現したクローンが144同定された。図15に示す144のクローンから配列分析により18の異なるアミノ酸配列を同定した。
ヒトDR5に対するApo 2Lリガンドの結合部位は既にマッピングされており、結合部位の結晶構造が決定された(Hymowitz et al, Molecular Cell 4:564 (1999);WO01/19861を参照)。結晶構造とモデルは、抗DR5抗体の結合をマッピングするために用いることができる。
以前の研究で、ヒトDR5に結合する抗体が同定されている。これらの抗体はBDF1およびYSD1と称される。抗体BDF1は、CDRが20すべてのアミノ酸によってランダム化されたライブラリから単離され、以下のCDR配列を有する:1) IGKSGIH(配列番号:600)のCDRH1配列;2) VAVIYPHDGNTAYA(配列番号:601)のCDR2配列;そして、3) RLALVRMWMD(配列番号:602)のCDRH3配列。YSD1抗体は、CDR位置がチロシンおよびセリンによって変化していたライブラリから単離して、YSSYYSYYYSSSSYSYのCDRH3配列を有する(配列番号:603)。ヒトDR5に対するこれら抗体の結合部位は分子のN末端に位置し、Apo 2Lリガンドの結合部位とほとんどオーバーラップしていない。これは主にC末端に見られる(50sループのアミノ酸、例えばアミノ酸50−65、90sループのアミノ酸、例えばDR5のアミノ酸91−104)。各々のこれら抗体のCDRH3領域の結合を示すモデルを図18に示す。BDF1とYSD1のCDRH3はオーバーラップしており、DR5への結合のためのホットスポットを形成する。YSD1 CDRH3の結合はチロシンによって媒介され、BFD1の結合はLAL配列によって媒介される。DR5に対するYSD1の結合は、DR5ロイシン、グルタミン、アラニン、フェニルアラニンおよびアルギニン残基を伴う。
既に実施例1に記載したように、Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。
12のライブラリ:SAH3、SCH3、SFH3、SGH3、SLH3、SNH3、SPH3、SRH3、STH3、SWH3およびSYH3が構築された。ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3のランダム化した残基により構築した。各ライブラリは、CDRL3の位置91−94および96、CDRH1の位置28および30−33、CDRH2の位置50、52−54、56および58、およびCDRH3の位置95−100、100aから100mでランダム化した。各々のランダム化した位置で得られるアミノ酸の種類と比率を図19A−19Bに記載する。さらに、位置95と100の間の6つの野生型コドンを4〜17のコドンと置換したオリゴヌクレオチドを用いることによってCDRH3の長さを変えた。これらの位置にあるアミノ酸の種類と比率は、CDRH3の位置95−100に関して図19A−19Bに示したものと同じであった。
多様化させる位置の縮重コドンでの突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、(a) CDR多様化の導入と(b) 停止コドンの修復を同時に行った。これらの突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列を図20A−20Lに示す。すべてのライブラリについて、オリゴヌクレオチドH1、H2およびL3(配列番号:)にてそれぞれCDRH1、CDRH2およびCDRL3に多様性を導入した。
ライブラリSCH3では、オリゴヌクレオチドH3−SC4、H3−SC5、H3−SC6、H3−SC7、H3−SC8、H3−SC9、H3−SC10、H3−SC11、H3−SC12、H3−SC13、H3−SC14、H3−SC15、H3−SC16およびH3−SC17(配列番号:635−648)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSGH3では、オリゴヌクレオチドH3−SG4、H3−SG5、H3−SG6、H3−SG7、H3−SG8、H3−SG9、H3−SG10、H3−SG11、H3−SG12、H3−SG13、H3−SG14、H3−SG15、H3−SG16およびH3−SG17(配列番号:663−676)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSLH3では、オリゴヌクレオチドH3−SL4、H3−SL5、H3−SL6、H3−SL7、H3−SL8、H3−SL9、H3−SL10、H3−SL11、H3−SL12、H3−SL13、H3−SL14、H3−SL15、H3−SL16およびH3−SL17(配列番号:691−704)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSPH3では、オリゴヌクレオチドH3−SP4、H3−SP5、H3−SP6、H3−SP7、H3−SP8、H3−SP9、H3−SP10、H3−SP11、H3−SP12、H3−SP13、H3−SP14、H3−SP15、H3−SP16およびH3−SP17(配列番号:719−732)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSTH3では、オリゴヌクレオチドH3−ST4、H3−ST5、H3−ST6、H3−ST7、H3−ST8、H3−ST9、H3−ST10、H3−ST11、H3−ST12、H3−ST13、H3−ST14、H3−ST15、H3−ST16およびH3−ST17(配列番号:747−760)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSYH3では、オリゴヌクレオチドH3−SY4、H3−SY5、H3−SY6、H3−SY7、H3−SY8、H3−SY9、H3−SY10、H3−SY11、H3−SY12、H3−SY13、H3−SY14、H3−SY15、H3−SY16およびH3−SY17(配列番号:775−788)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSXH3(上記実施例4に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトHER2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
5μg/mLの標的タンパク質(HER2)にてNUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを4℃で終夜をかけてコートし、PBTの溶液(Sigma)にて2時間かけて反応を止めた。既に記載したように(上掲のSidhu等)、ファージを終夜37℃で生育させた後、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、PBTに再懸濁した。コートしたイムノプレートにファージ溶液(およそ1012ファージ/mL)を加えた。2時間インキュベートしてファージを結合させた後、PBSにてプレートを10回洗浄した。0.1M HClにて結合したファージを10分間溶出し、1.0M トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌XL1-ブルーで増幅し、さらなる選別ラウンドに用いた。
既に実施例1に記載したように、Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。
4つのライブラリ:SFH3、SRH3、SWH3およびSYH3が構築された。ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3のランダム化した残基により構築した。各ライブラリは、CDRL3の位置91−94および96、CDRH1の位置28および30−33、CDRH2の位置50、52−54、56および58、およびCDRH3の位置95−100、100aから100mでランダム化した。各々のランダム化した位置で得られるアミノ酸の種類と比率を図22に記載する。さらに、位置95と100の間の6つの野生型コドンを4〜17のコドンと置換したオリゴヌクレオチドを用いることによってCDRH3の長さを変えた。これらの位置にあるアミノ酸の種類と比率は、CDRH3の位置95−100に関して図22に示したものと同じであった。
ライブラリSW−表面では、オリゴヌクレオチドL3−SW、H1−SWおよびH2−SW(配列番号:747−760)にてそれぞれCDR−L3、CDR−H1およびCDR−H2に多様性を導入し(図23)、オリゴヌクレオチドH3−SW4、H3−SW5、H3−SW6、H3−SW7、H3−SW8、H3−SW9、H3−SW10、H3−SW11、H3−SW12、H3−SW13、H3−SW14、H3−SW15、H3−SW16およびH3−SW17(配列番号:761−774)(図20K)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSY−表面では、オリゴヌクレオチドL3、H1およびH2(配列番号:)にてそれぞれCDR−L3、CDR−H1およびCDR−H2に多様性を導入し(図20A)、オリゴヌクレオチドH3−SY4、H3−SY5、H3−SY6、H3−SY7、H3−SY8、H3−SY9、H3−SY10、H3−SY11、H3−SY12、H3−SY13、H3−SY14、H3−SY15、H3−SY16およびH3−SY17(配列番号:775−788)(図20L)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
突然変異誘発反応物を大腸菌SS320内に電気穿孔した(上掲のSidhu等)。形質転換細胞をM13-KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて終夜生育させて、前記ファジミドDNAを包含し、その細胞表面上にFab断片をディスプレイしたファージ粒子を生成した。組み合わせたライブラリは3×1010の異なるメンバーを含有した。
ライブラリSX-表面(上記実施例6に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトHER2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
5μg/mLの標的タンパク質(ヒトHER2)にてNUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを4℃で終夜をかけてコートし、PBTの溶液(Sigma)にて2時間かけて反応を止めた。既に記載したように(上掲のSidhu等)、ファージを終夜37℃で生育させた後、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、PBTに再懸濁した。コートしたイムノプレートにファージ溶液(およそ1012ファージ/mL)を加えた。2時間インキュベートしてファージを結合させた後、PBSにてプレートを10回洗浄した。0.1M HClにて結合したファージを10分間溶出し、1.0M トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌XL1-ブルーで増幅し、さらなる選別ラウンドに用いた。
Claims (117)
- 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がR、Y及びMから選択され、X2がY及びRから選択され、X3がY、S、R、P及びGから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY、S、R及びHから選択され、X6がR、Y及びSから選択され、X7がG、Y及びSから選択され、X8がR、Y及びSから選択され、X9がG、Y及びSから選択され、X10がR、Y及びSから選択され、X11がG、Y及びSから選択され、X12がS、Y、R、G及びAから選択され、X13がG及びYから選択され、X14がL、M、R、G及びAから選択され、そして、X15がG、F及びLから選択されるかないしは存在せず、そして、X16がFであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−D−Y(配列番号:31)を含む、ポリペプチド。 - 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む、ポリペプチド。 - 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:26)を含む、ポリペプチド。 - 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:27)を含む、ポリペプチド。 - 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む、ポリペプチド。 - CDRH1が配列番号:524−540及び189−294のいずれか一から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から5のいずれか一に記載のポリペプチド。
- CDRH2が配列番号:541−557及び295−400から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から5のいずれか一に記載のポリペプチド。
- CDRH3が配列番号:558−574及び401−506から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から5のいずれか一に記載のポリペプチド。
- CDRH3において、X1のアミノ酸位が位置95であって、R及びYから選択され、X3が位置97にあって、Sであり、X8がアミノ酸位100bであって、Sであり、X9がアミノ酸位100cであって、Yであり、そして、X10がアミノ酸位100dにあって、Y又はRである、請求項1に記載のポリペプチド。
- CDRH3がアミノ酸配列X1−R−S−Y−R−Y−G−S−Y−X10−G−S−Y−X14−F−D−Y(配列番号:575)を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドがヒトのDR5に結合する、請求項1から10のいずれか一に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが抗体である、請求項11に記載のポリペプチド。
- 重鎖可変ドメインが、
i) アミノ酸配列GFYISSSSIH(配列番号:576)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SISPSSGSTYYADSVKG(配列番号:577)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列YRSYRYGSYYGSYGFDY(配列番号:578)を含むCDRH3とを含んでなる、請求項12に記載のポリペプチド。 - 重鎖可変ドメインが、
i) アミノ酸配列GFYIYSSSIH(配列番号:579)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SISPSSGYTSYADSVKG(配列番号:580)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列RRSYRYGSYRGSYAFDY(配列番号:581)を含むCDRH3とを含んでなる、請求項12に記載のポリペプチド。 - ヒト及びマウスのDR5に結合する、請求項1から14のいずれか一に記載のポリペプチド。
- さらに、(i) CDRL3が、X1が位置91にあって、Y、H及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY、S及びTから選択され、X4がY、S及びTから選択され、そして、X5がS、P及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む、軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項1から15のいずれか一に記載のポリペプチド。
- さらに、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含むCDRL1を含んでなる、請求項16に記載のポリペプチド。
- さらに、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含むCDRL2を含んでなる、請求項16に記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあり、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、X5がS及びYから選択され、そして、X6がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1が位置95にあって、Y及びRから選択され、X2がY、S及びRから選択され、X3がS、G、Y及びHから選択され、X4がS、G、Y及びRから選択され、X5がG及びAから選択され、X6がF、M、L及びAから選択され、そして、X7がF、M及びLから選択されるかないしは欠失している、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−D−Y(配列番号:582)を含む、ポリペプチド。 - CDRH1が配列番号:189−198から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のポリペプチド。
- CDRH2が配列番号:295−304から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のポリペプチド。
- CDRH3が配列番号:401−410から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1が位置28にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミ ノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:22)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位95にあって、Y、S及びGから選択され、X2がY、S、G、R、A及びMから選択され、X3がG、Y、S及びRから選択され、X4がG、Y及びFから選択され、X5がY、S、N及びGから選択され、X6がY、R、H及びWから選択され、X7がG及びAから選択され、そして、X8がF、M、L及びIから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−D−Y(配列番号:583)を含む、ポリペプチド。 - CDRH1が配列番号:199−216から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項23に記載のポリペプチド。
- CDRH2が配列番号:305−322から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項23に記載のポリペプチド。
- CDRH3が配列番号:411−428から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項23に記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1は位置28にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、X1がアミノ酸位95であって、Y、S、R、G及びEから選択され、X2がY、S、R及びGから選択され、X3がS、Y、G及びWから選択され、X4がS、Y、G及びQから選択され、X5がG、Y及びSから選択され、X6がG、Y、S、R及びVから選択され、X7がS、Y、G及びRから選択され、X8がY、S、G、R、P及びVから選択され、X9がG、A,Y、S及びRから選択され、X10がM、F、G、Y、S及びRから選択され、X11がA、Y、S、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、F、L、A、G、S、Y、R及びTから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、Y、T及びSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、M、F、I、G、Y、A及びTから選択されるかないしは存在せず、X15がM、L、Y、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X16がY及びGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、M及びGから選択されるかないしは存在せず、X18がP及びAから選択されるかないしは存在せず、そして、X18がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:584)を含む、ポリペプチド。 - 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−G−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX12が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X19がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−X15−X16−(X17)n−X18−X19−D−Yを含む、ポリペプチド。 - nが1〜12である、請求項28に記載のポリペプチド。
- X1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、請求項28に記載のポリペプチド。
- X6がY及びSから選択され、X7がY及びSから選択され、X8がY及びSから選択され、X9がY及びSから選択され、X10がY及びSから選択され、そして、X11がY及びSから選択される、請求項28に記載のポリペプチド。
- 位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、このときX18がG及びAから選択され、X19がI、M、L及びFから選択される、請求項28に記載のポリペプチド。
- 位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、このときX18がG及びAから選択され、X19がI、M、L及びFから選択される、請求項28に記載のポリペプチド。
- 位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、このときX18がG及びAから選択され、X19がI、M、L及びFから選択される、請求項28に記載のポリペプチド。
- 位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1%私、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V、そして、1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、このときX18がG及びAから選択され、X19がI、M、L及びFから選択される、請求項28に記載のポリペプチド。
- CDRH1が配列番号:217−294から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項27から35のいずれか一に記載のポリペプチド。
- CDRH2が配列番号:323−400から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項27から35のいずれか一に記載のポリペプチド。
- CDRH3が配列番号:429−506から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項27から35のいずれか一に記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む、ポリペプチド。 - CDRH1が配列番号:816−842から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項39に記載のポリペプチド。
- CDRH2が配列番号:843−869から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項39に記載のポリペプチド。
- CDRH3が配列番号:870−896から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項39に記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む、ポリペプチド。 - CDRH1が配列番号:924−950から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項43に記載のポリペプチド。
- CDRH2が配列番号:951−977から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項43に記載のポリペプチド。
- CDRH3が配列番号:978−1004から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項43に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドがヒトのHER-2を結合する、請求項2から8又は16から46のいずれか一に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが抗体である、請求項47に記載のポリペプチド。
- 重鎖可変ドメインが、
i) アミノ酸配列GFSIYSSYIH(配列番号:821)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:848)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAFDY(配列番号:875)を含むCDRH3とを含んでなる、請求項39又は40に記載のポリペプチド。 - 重鎖可変ドメインが、
i) アミノ酸配列GFSIWWSWIH(配列番号:932)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SISPSSGWTSYADSVKG(配列番号:959)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAMDY(配列番号:986)を含むCDRH3とを含んでなる、請求項39又は40に記載のポリペプチド。 - 重鎖可変ドメインが、
i) アミノ酸配列GFSISSSYIH(配列番号:944)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:971)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列YYSYALDY(配列番号:998)を含むCDRH3とを含んでなる、請求項39又は40に記載のポリペプチド。 - 重鎖可変ドメインが、
i) アミノ酸配列GFYISnSSSIH(配列番号:230)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列YIYPSSGYTSYADSVKG(配列番号:336)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列GYYYSYYSGYALDY(配列番号:442)を含むCDRH3とを含んでなる、請求項39又は40に記載のポリペプチド。 - さらに、軽鎖可変ドメインを含んでなり、i) CDRL3は、カバット番号付けに従ってX1が位置91にあって、S及びYから選択され、X2がS、Y及びFから選択され、X3がYから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む、請求項19から52のいずれか一に記載のポリペプチド。
- CDRL3配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、このときCDRL3は、カバット番号付けに従ってX1が位置91にあって、S及びYから選択され、X2がS、Y及びFから選択され、X3がY、S及びFから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む、ポリペプチド。
- 免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、このときCDRL3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−Tを含む、ポリペプチド。
- 免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRL1は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、
(ii) CDRL2は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、そして、
(iii) CDRL3は、X1−X6がシステイン以外の天然に生じる任意のアミノ酸であり、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91である、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−(X4)n−X5−X6−Tを含む、ポリペプチド。 - カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がP及びLから選択され、そして、X6がF、L、I及びVから選択される、請求項56に記載のポリペプチド。
- nが1〜3である、請求項56に記載のポリペプチド。
- CDRL3が配列番号:83−188、789−815及び897−923から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項54から58のいずれか一に記載のポリペプチド。
- さらに、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含むCDRL1を含んでなる、請求項54から58のいずれか一に記載のポリペプチド。
- さらに、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含むCDRL2を含んでなる、請求項54から58及び55及び56のいずれか一に記載のポリペプチド。
- 請求項1から53のずれか一に記載の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドと、請求項54から61のいずれか一に記載の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドとを含んでなる抗体。
- 少なくとも2の抗体可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(a) 請求項1から53のいずれかに記載のポリペプチドを含む重鎖抗体可変ドメインと、
(b) 請求項54から61のいずれかに記載のポリペプチドを含む軽鎖抗体可変ドメインとを含んでなる、ポリペプチド。 - 単鎖Fvである、請求項1から63のいずれか一に記載のポリペプチド。
- Fabポリペプチドである、請求項1から63のいずれか一に記載のポリペプチド。
- 完全なヒトのポリペプチドである、請求項1から58のいずれか一に記載のポリペプチド。
- さらに、変異体CDRH1、CDRH2、CDRH3及び/又はCDRL3に対応するポリペプチド可変ドメインについてフレームワーク領域FR1、FR2、FR3及び/又はFR4を含んでなり、該フレームワーク領域が単一ポリペプチド鋳型から得られる、請求項1から66のいずれか一に記載のポリペプチド。
- 各々のフレームワーク領域がポリペプチド4D5のフレームワーク領域アミノ酸配列(配列番号:1及び2)に対応するアミノ酸配列を含む、請求項67に記載のポリペプチド。
- 抗体が変異体4D5抗体フレームワーク領域のアミノ酸配列(配列番号:14−17及び18−21)に対応するフレームワーク領域を含む請求項67に記載のポリペプチド。
- さらに、重鎖ポリペプチド可変ドメインのC末端領域に連結される二量体化ドメインを含んでなる、請求項1から69のいずれか一に記載のポリペプチド。
- 二量体化ドメインがロイシンジッパードメイン又は少なくとも1のシステイン残基を含む配列を含んでなる、請求項70に記載のポリペプチド。
- 二量体化ドメインがポリペプチドのヒンジ領域及びロイシンジッパーを含んでなる、請求項70に記載のポリペプチド。
- 二量体化ドメインが単一のシステインである、請求項70に記載のポリペプチド。
- ポリペプチド可変ドメインがウイルスコートタンパク質の少なくとも一部に融合される、請求項1から73のいずれか一に記載のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチド。
- ウイルスコートタンパク質が、タンパク質pIII、主要なコートタンパク質pVIII、Soc、Hoc、gpD、pv1及びその変異体からなる群から選択される、請求項74に記載の融合ポリペプチド。
- さらに、可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に二量体化ドメインを含む、請求項75に記載の融合ポリペプチド。
- さらに、ペプチドタグを含んでなる、請求項74に記載の融合ポリペプチド。
- ペプチドタグがgD、c-myc、ポリ-his、蛍光タンパク質及びB−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項77に記載の融合タンパク質。
- 請求項1から78のいずれか一に記載のポリペプチドと担体を含んでなる組成物。
- 請求項1から78のいずれか一に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項80のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
- 請求項81に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- ポリペプチドの産生に適切な条件下で請求項82の宿主細胞を培養して、ポリペプチド又はその抗原結合断片を回収することを含んでなる、ポリペプチドの産生方法。
- 少なくとも1×104の異なる抗体可変ドメイン配列を有する、請求項1から78のいずれか一に記載の複数のポリペプチドを含んでなるライブラリ。
- 複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含むCDRH3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法。 - 複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、そして、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法。 - さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択されるかないしは存在せず、X6がY及びSから選択されるかないしは存在せず、X7がP及びLから選択され、X8がF、L、I及びVから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−Tを含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる、請求項85又は86に記載の方法。 - (b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−Tを含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる、請求項85又は86に記載の方法。 - (b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がSとY、W、R及びFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−Tを含むCDRL3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる、請求項85又は86に記載の方法。 - 複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Yを含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法。 - 複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Yを含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法。 - 複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Yを含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法。 - 複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Yを含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法。 - さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−Tを含むCDRL3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる、請求項90から93のいずれか一に記載の方法。 - 第一コンセンサス高頻度可変配列がカバットコンセンサスCDRL1配列を含む、請求項87から89及び94のいずれか一に記載の方法。
- 第一コンセンサス高頻度可変配列がR−A−S−Q−D−V−N−T−A−V−A (配列番号:29)である、請求項95に記載の方法。
- 第二コンセンサス高頻度可変配列がカバットコンセンサスCDRL2配列を含む、請求項87から89及び94のいずれか一に記載の方法。
- 第二コンセンサス高頻度可変配列がS−A−S−S−L−Y−S(配列番号:30)である、請求項97に記載の方法。
- 複数のポリペプチドが複数のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項85から98のいずれか一に記載の方法。
- 抗体可変ドメインのライブラリの標的抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選別する方法であって、
(a) 請求項84に記載のライブラリを標的抗原と接触させ、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、およそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の減少した量の標的抗原を含む一連の溶液中で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドをインキュベートし、そして、
(c) 最も低い濃度の標的抗原に結合することができる、又はおよそ0.1nM〜およそ200nMの親和性を有する、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを選別する、
ことを含んでなる方法。 - 標的抗原がHER2又はDR5である、請求項100に記載の方法。
- 標的抗原の濃度がおよそ100〜およそ250nMである、請求項100に記載の方法。
- 標的抗原の濃度がおよそ25〜およそ100nMである、請求項100に記載の方法。
- ポリペプチドのライブラリから標的抗原に結合するポリペプチドを選別する方法であって、
(a) 請求項1から79のいずれか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる方法。 - さらに、
(d) 結合に適した条件下で、混合物を形成するためにおよそ0.1nM〜およそ1000nMの範囲の標識した標的抗原の濃縮物とともにサブ集団をインキュベートし、
(e) 標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を該混合物に接触させ;
(f) 標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを検出して、標識した標的抗原から標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、
(g) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団と、以前の選別ラウンドよりも低い濃度の標識した標的抗原を用いて(d)−(f)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる、請求項104に記載の方法。 - さらに、過剰量の非標識標的抗原を混合物に加え、十分な時間該混合物をインキュベートして、親和性の低い標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収することを含んでなる、請求項105に記載の方法。
- 親和性の高い標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離する方法であって、
(a) 請求項1から79のいずれか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリに少なくともおよそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原から標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られたサブ集団と、最も低い濃度の標的抗原で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離するために以前のラウンドで用いた標的抗原の低い濃度を用いて(a)及び(b)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる方法。 - 請求項1から79のいずれか一に記載のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物の癌の治療方法。
- 癌が、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞性肺癌、非ホジキンリンパ腫(NHL)、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫から選択される、請求項108に記載の方法。
- 抗体が抗HER2抗体である、請求項108又は109に記載の方法。
- 抗体が抗DR5抗体である、請求項108又は109に記載の方法。
- さらに、治療が抗体とともに第二の治療薬を同時ないしは順次投与する工程を含んでなる、請求項108から111のいずれか一に記載の方法。
- 第二治療薬が、抗血管新生薬、抗新生物薬、化学療法薬及び細胞障害性薬から選択される、請求項112に記載の方法。
- 抗血管新生薬が抗hVEGF抗体である、請求項113に記載の方法。
- 請求項1から17のいずれか一に記載の抗体によって哺乳動物を治療する工程を含んでなる、炎症性又は免疫性の疾患に罹患しているか又は該疾患を発達させるリスクにある哺乳動物の治療方法。
- 炎症性又は免疫性の疾患が関節リウマチである、請求項115に記載の方法。
- 抗体が抗DR5抗体である、請求項115又は116に記載の方法。
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