JP2009518011A5 - - Google Patents
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Description
(関連出願についての相互参照)
本出願は、2005年12月2日に出願の米国特許第60/742185号及び2006年6月22日に出願の米国特許第60/805553号の優先権を主張する非仮出願であり、出典明記により本明細書にその内容全体が援用されるものである。
本出願は、2005年12月2日に出願の米国特許第60/742185号及び2006年6月22日に出願の米国特許第60/805553号の優先権を主張する非仮出願であり、出典明記により本明細書にその内容全体が援用されるものである。
(発明の分野)
本発明は、一般的に非常に制限されたアミノ酸レパートリーを用いて多様化した変異型CDR、及びそのような配列を複数含むライブラリに関する。また、本発明はこれら変異型CDRを含む融合ポリペプチドに関する。また、本発明は治療に又は試薬として用いることができる新規の結合型ポリペプチドを同定するために有用な方法及び組成物に関する。
本発明は、一般的に非常に制限されたアミノ酸レパートリーを用いて多様化した変異型CDR、及びそのような配列を複数含むライブラリに関する。また、本発明はこれら変異型CDRを含む融合ポリペプチドに関する。また、本発明は治療に又は試薬として用いることができる新規の結合型ポリペプチドを同定するために有用な方法及び組成物に関する。
(発明の背景)
ファージディスプレイ技術は抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成し、選別するための強力なツールである。ファージディスプレイ技術の使用により、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速に分類することができるタンパク質変異体の大きなライブラリを作製することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルスコートタンパク質、例えば遺伝子IIIタンパク質又は遺伝子VIIIタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質ないしポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子IIIタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990);Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子IIIタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリを作製してそのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている(例として、米国特許第5,723,286号、米国特許第5,432,018号、米国特許第5,580,717号、米国特許第5,427,908号および米国特許第5,498,530号)。
ファージディスプレイ技術は抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成し、選別するための強力なツールである。ファージディスプレイ技術の使用により、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速に分類することができるタンパク質変異体の大きなライブラリを作製することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルスコートタンパク質、例えば遺伝子IIIタンパク質又は遺伝子VIIIタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質ないしポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子IIIタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990);Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子IIIタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリを作製してそのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている(例として、米国特許第5,723,286号、米国特許第5,432,018号、米国特許第5,580,717号、米国特許第5,427,908号および米国特許第5,498,530号)。
糸状ファージの表面上のペプチドの発現と大腸菌周辺質での機能的抗体断片の発現を証明することは、抗体ファージディスプレイライブラリの開発に重要であった(Smithら, Science (1985), 228:1315;Skerra及びPluckthun, Science (1988), 240:1038)。抗体又は抗原結合ポリペプチドのライブラリは、ランダムなDNA配列を挿入したり、関連遺伝子のファミリーをクローニングして単一遺伝子を変更することを含むいくつかの方法で調製していた。ファージディスプレイを用いた抗体又は抗原結合断片を表出させる方法は、米国特許第5,750,373号、同第5,733,743号、同第5,837,242号、同第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,580,717号、及び同第5,658,727号に記載されている。ついで、ライブラリは所望の特性を有する抗体又は抗原結合タンパク質の発現についてスクリーニングする。
ファージディスプレイ技術は、所望の特徴を有する抗体を調製する従来のハイブリドーマおよび組換え方法に勝るいくつかの効果がある。この技術により、より少ない時間で動物を用いることなく多様な配列を有する抗体の大きなライブラリを作製することができる。ハイブリドーマの調製又はヒト化抗体の調製は、きっと数か月で可能である。加えて、免疫化が必要ないので、ファージ抗体ライブラリは毒性のある抗原又は抗原性が低い抗原について作製することができる(Hogenboom, Immunotechniques (1988), 4:1-20)。また、ファージ抗体ライブラリは、新規なヒト抗体を生成して同定するために用いることができる。
抗体は、多種多様な場で治療的作用剤として非常に有効になってきている。例えば、腫瘍抗原であるHER-2に対するヒト化抗体は、癌の診断および治療に有効である。抗INF-γ抗体などの他の抗体は、クローン病などの炎症性状態を治療する際に有効である。ファージディスプレイライブラリは、免疫化されたヒト、免疫化されていないヒト、生殖細胞系配列又は未処理のB細胞Igレパートリーからヒト抗体を生成するために用いられた(Barbas & Burton, Trends Biotech (1996), 14:230;Griffithsら, EMBO J. (1994), 13:3245;Vaughanら, Nat. Biotech. (1996), 14:309;Winter EP 0368 684 B1)。未処理、または免疫化されていない、抗原結合ライブラリは種々のリンパ系組織を用いて作製されている。Cambridge Antibody Technology及びMorphosysにより開発されたものなど、いくつかのライブラリが市販されている (Vaughanら, Nature Biotech 14:309 (1996);Knappikら, J. Mol. Biol. 296:57 (1999))。しかしながら、これらのライブラリの多くは、多様性が制限されている。
高親和性抗体をファージディスプレイライブラリから同定して、単離できることは、治療的用途のための新規なヒト抗体を単離するために重要である。ライブラリからの高親和性抗体の単離は、以前から、ライブラリのサイズ、細菌細胞の産生の効率およびライブラリの多様性に少なくともある程度依存していると思われる。例えば、Knappikら, J. Mol. Biol. (1999), 296:57を参照。ライブラリのサイズは、抗体又は抗原結合タンパク質の不適当な折畳み(ホールディング)および終止コドンの存在による効率的でない産生によって減少する。抗体又は抗原結合ドメインが適切に折り畳まれない場合、細菌細胞での発現は阻害されうる。発現は、可変/定常の境界面の表層、または、選択されたCDR残基で順に残基を変異させることによって改良することができる。(Dengら, J. Biol. Chem. (1994), 269:9533, Ulrichら, PNAS (1995), 92:11907-11911;Forsbergら, J. Biol. Chem. (1997), 272:12430)。抗体ファージライブラリを細菌細胞において作製するとき、フレームワーク領域の配列は適当な折畳みを提供する因子である。
また、抗体又は抗原結合タンパク質の多様なライブラリを作製することは、高親和性抗体の単離に重要である。限定したCDRに多様化を有するライブラリは種々の方法を用いて作製されている。例えば、Tomlinson, Nature Biotech. (2000), 18:989-994を参照。抗原結合に関与することが明らかなことが多いので、CDR3領域にいくらか関心がある。重鎖上のCDR3領域は、サイズ、配列および構造的立体配座が非常に変化する。
また、各可変重鎖及び可変軽鎖位置の全20アミノ酸を用いて可変重鎖および可変軽鎖のCDR領域をランダム化することによって、多様性を生成したものもある。全20アミノ酸を用いることで変異型抗体の配列に大きな多様性をもたらし、新規な抗体を同定する可能性を増やすと思われた。(Barbas, PNAS 91:3809 (1994);Yelton, DE, J. Immunology, 155:1994 (1995);Jackson, J.R., J. Immunology, 154:3310 (1995)及びHawkins, RE, J. Mol. Biology, 226:889 (1992))。
また、天然に生じる抗体のアミノ酸分布を反映させるためにいくつかのCDRのアミノ酸置換の群を制限することによって多様性をつくる試みがあった。Garrard & Henner, Gene (1993), 128:103; Knappikら, J. Mol. Biol. (1999), 296:57を参照。これらの試みは様々な成功があったが、系統的で定量的方法に適用されなかった。CDR領域の多様性をつくる一方で、アミノ酸変異の数を最小にすることに取り組んでいる。さらに、例えば、第一ライブラリが一つの基準に従って作製されると、第一ライブラリの多様性をさらに強化することが望まれるであろう。しかしながら、実質的に収率などの実用的限界を超えることなく更なる多様化が可能になるように、この第一ライブラリは十分な多様性がありなおかつ十分にサイズを小さく保つことが必要とされる。
いくつかの研究グループは、タンパク質を生成するために必要な最小数のアミノ酸蓄積の理論上及び実験上の分析を報告している。しかしながら、一般的にこれらの分析は範囲及び性質に限りがあり、制限した一連のアミノ酸タイプを用いて複合的機能を有するポリペプチドを生成することの実施可能性に関してかなりの懐疑的疑問が残る。例として、Riddleら, Nat. Struct. Biol. (1997), 4(10):805-809;Shangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91:8373-8377;Heinzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89:3751-3755;Regan & Degrado, Science (1988), 241:976-978;Kamtekerら, Science (1993), 262:1680-1685;Wang & Wang, Nat. Struct. Biol. (1999), 6(11):1033-1038;Xiongら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), 92:6349-6353;Heinzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89:3751-3755;Cannataら, Bioinformatics (2002), 18(8):1102-1108;Davidsonら, Nat. Struct. Biol. (1995), 2(10):856-863;Murphyら, Prot. Eng. (2000), 13(3):149-152;Brown & Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:1983-1988;Akanumaら, Proc. Natl. Acad. Sci. (2002), 99(21):13549-13553;Chan, Nat. Struct. Biol. (1999), 6(11):994-996を参照。
ゆえに、十分な程度の配列多様性を有する機能的ポリペプチドを含み、さらに更なる多様化、高率な発現などを目的とした操作に反応しやすいライブラリを作製する方法を改良する必要がある。本明細書中に記載する発明は、この必要性に応じたものであり、他の有益性も提供するものである。
(本発明の開示)
本発明は、制限された多様性を有する配列を含むが、抗原結合能を維持している変異型CDRを含むポリペプチドを生成する簡素化した利便性の高い方法を提供する。特定のCDR又はすべてのCDRを多様化した場合にのみ標的結合体の十分な多様性が生じるという定理に基づいた従来の方法や、多様な範囲のアミノ酸置換(一般的に20アミノ酸すべて又はそのほとんどを置換することによる)に依存して十分な多様性を得るという従来の概念と異なり、本発明は、参照ポリペプチド又は由来する抗原の特定のCDRや特定数のCDRを多様化することに頼る必要がない高質の標的結合体を生成することができる方法を提供する。本発明は、標的抗原に結合することができる機能的ポリペプチドを含む高質の非常に多様なライブラリが非常に制限された数のアミノ酸残基がある最小限の数のアミノ酸位置を多様化することによって生成することができるという驚くべきかつ不測の発見に少なくともある程度は基づいている。本発明の方法は、迅速、利便性が高く、順応性があり、少ない数のアミノ酸をコードする制限したコドンセットの使用に基づく。配列の多様性を制限しているので、本発明の方法によって生成したポリペプチドの集団(例えば、ライブラリ)は一般的により小さいので、必要又は希望に応じてこれら集団の更なる多様化が可能となる。これは一般的に従来法では得られなかった有益性である。本発明によって生成される候補結合体ポリペプチドは質の高い標的結合特性を有しており、細胞培養物中の生成物の回収率が高い構造的特性を有する。本発明は、これら結合体ポリペプチド生成方法、これらポリペプチドの使用方法、及びこれらを含む組成物を提供する。
本発明は、制限された多様性を有する配列を含むが、抗原結合能を維持している変異型CDRを含むポリペプチドを生成する簡素化した利便性の高い方法を提供する。特定のCDR又はすべてのCDRを多様化した場合にのみ標的結合体の十分な多様性が生じるという定理に基づいた従来の方法や、多様な範囲のアミノ酸置換(一般的に20アミノ酸すべて又はそのほとんどを置換することによる)に依存して十分な多様性を得るという従来の概念と異なり、本発明は、参照ポリペプチド又は由来する抗原の特定のCDRや特定数のCDRを多様化することに頼る必要がない高質の標的結合体を生成することができる方法を提供する。本発明は、標的抗原に結合することができる機能的ポリペプチドを含む高質の非常に多様なライブラリが非常に制限された数のアミノ酸残基がある最小限の数のアミノ酸位置を多様化することによって生成することができるという驚くべきかつ不測の発見に少なくともある程度は基づいている。本発明の方法は、迅速、利便性が高く、順応性があり、少ない数のアミノ酸をコードする制限したコドンセットの使用に基づく。配列の多様性を制限しているので、本発明の方法によって生成したポリペプチドの集団(例えば、ライブラリ)は一般的により小さいので、必要又は希望に応じてこれら集団の更なる多様化が可能となる。これは一般的に従来法では得られなかった有益性である。本発明によって生成される候補結合体ポリペプチドは質の高い標的結合特性を有しており、細胞培養物中の生成物の回収率が高い構造的特性を有する。本発明は、これら結合体ポリペプチド生成方法、これらポリペプチドの使用方法、及びこれらを含む組成物を提供する。
一態様では、本発明は、所望の標的に対する候補結合体となる特異で別々の複数のポリペプチド及び単一のポリペプチドとして異種ポリペプチド配列(ある実施態様では、ウイルスポリペプチドの少なくとも一部の配列)及び、多様化したCDRを含む融合ポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドを含む組成物(ライブラリなど)は、例えば所望の標的に結合する候補免疫グロブリンポリペプチド(例えば、抗体及び抗体断片)のプールとして様々な用途に使用される。また、本ポリペプチドは非免疫グロブリンの足場(例えば、ヒト成長ホルモンなどのタンパク質)を用いて生成することができるであろう。本発明は、本発明の方法によって生成したポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む様々な態様、本発明の方法を実施するためのシステム、キット及び製造品、及び/又は本発明のポリヌクレオチド/ポリペプチド及び/又は本発明の組成物の使用方法も包含する。
一態様では、本発明はH1、H2、H3、L1、L2又はL3からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4又は5の変異型CDRを有するポリペプチドであり、所望の標的抗原に結合することができるポリペプチドを生成する方法を提供し、該方法は、変異型CDRに対応する参照CDR中の少なくとも一の(又はすべての数までの任意の数の)溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を多様化すること;(ii)制限したコドンセット(以下の「制限コドンセット」の定義を参照)を用いてCDRの変異型コピーを生成することによって溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を変異させることを含む。
本発明の方法の多様な態様や実施態様は、本発明の複数のポリペプチドを含むプールを生成する及び/又は使用するため、特に所望の標的抗原への候補結合体を選択して同定するために有用である。例えば、本発明は複数のポリペプチドを含んでなる組成物を生成する方法を提供するものであり、各ポリペプチドはH1、H2、H3、L1、L2又はL3からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4又は5の変異型CDRを有し、該ポリペプチドが所望の標的抗原に結合することができ、該方法が、変異型CDRに対応する参照CDR中の少なくとも一の(又はすべての数までの任意の数の)溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を多様化すること;(ii) 制限したコドンセットを用いてCDRの変異型コピーを生成することによって溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を変異させることを含み;複数のポリペプチドは、変異型アミノ酸をコードする配列中に含まれる非常に制限されたオリゴヌクレオチド縮重のある鋳型ポリヌクレオチドを増幅することによって生成され、該制限された縮重が制限コドンセットの限定した数のコドン配列を反映する。
他の例では、本発明は、CDRL1、L2、L3、H1、H2及びH3からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDRを含む起源抗原の軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築し;少なくとも一の(又はすべての数までの任意の数の)溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置の少なくとも1、2、3、4、5又はすべての起源抗体のCDRを制限コドンセットを用いて変異させることを含む方法を提供する。
他の例では、本発明は、本発明の複数のポリペプチドを表出するファージ又はファジミド粒子のライブラリを構築し;粒子と標的抗原との結合に適した条件下にて粒子のライブラリに標的抗原を接触させて;標的抗原に結合しないものと結合した粒子とを分離することを含む方法を提供する。
本明細書中に記載の何れかの本発明の方法において、溶解性があり利用しやすく及び/又は非常に多様なアミノ酸位置は本明細書に記載の定義に当てはまる任意のもの、特に本明細書に記載の位置の組み合わせ、例えば本発明のポリペプチドについて記載した位置の任意の組み合わせ(ここでより詳細に記載する)であり得る。好適な変異型アミノ酸は、本明細書に記載の定義に当てはまる任意のもの、例えば、以下のより詳細に記載した本発明のポリペプチドの中の変異型アミノ酸であり得る。
CDRの多様化の設定には、CDRの長さ及び/又は配列を多様化することを伴うであろう。例えば、CDRH3は、制限コドンセットによってコードされるアミノ酸を有する非常に多様な及び/又は溶媒と接触しうる位置を変異させることによって、例えば7〜21アミノ酸の長さやその配列を多様化されるかもしれない。いくつかの実施態様では、CDRH3の一部は5〜21、7〜20、9〜15又は11〜13アミノ酸の範囲の長さであり、限られた数のアミノ酸をコードする制限コドンセット、例として19、15、10、8、6、4又は2以下のアミノ酸をコードするコドンセットによってコードされる一以上の位置に変異型アミノ酸を有する。ある実施態様では、C末端にアミノ酸配列AM、AMDY又はDYを有する。
ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに標的結合する機能がある限り多様な型であってよい。ある実施態様では、本発明のポリペプチドは融合ポリペプチドである(すなわち、異種ポリペプチド由来の2又はそれ以上の配列の融合)。本発明に従って多様化したCDRを有するポリペプチドは、例えばファージディスプレイの使用のために、ウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合ポリペプチドとして調製することができる。本発明のポリペプチドの表出のために使用することができるウイルスコートタンパク質には、タンパク質pIII、主要コートタンパク質pVIII、Soc(T4ファージ)、Hoc(T4ファージ)、gpD(λファージ)、pVI又はそれらの変異体又はそれらの断片が含まれる。ある実施態様では、融合ポリペプチドは、pIII、pVIII、Soc、Hoc、gpD、pVIおよびそれらの変異体又はそれらの断片からなる群から選択されるウイルスコートタンパク質などのウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合している。
ある実施態様では、多様化されたCDRを有するポリペプチドは一以上の抗体可変ドメインであり、抗体可変ドメインはScFv、Fab、ScFv2、F(ab')2及びF(ab)2を含む多様な型でウイルス表面上に表出されうる。二価のポリペプチドの表出には、融合ポリペプチドは、ある実施態様では、二量体化ドメインを包含する。二量体化ドメインは、二量体化配列及び/又は一以上のシステイン残基を有する配列を含みうる。二量体化ドメインは好ましくは、重鎖の可変又は定常ドメイン(CH1など)のC末端に直接的にまたは間接的に連結している。二量体化ドメインの構造は、抗体可変ドメインが(例えば、二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含まないで)ウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質成分として産生されるか、抗体可変ドメインが(例えば、二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含んで)主にウイルスコートタンパク質成分なしで産生されるかによって変わりうる。抗体可変ドメインが主にウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質として産生される場合、一以上のジスルフィド結合及び/又は単一二量体化配列により二価表出される。ウイルスコートタンパク質成分に融合せずに主に産生される抗体可変ドメイン(例えば、アンバー停止コドンあり)には、二量体化ドメインがシステイン残基と二量体化配列の両方を含みうる。
加えて、場合によっては、融合ポリペプチドは精製、検出及び/又はスクリーニングに有用なタグ、例としてFLAG、ポリ-his、gDタグ、c-myc、蛍光タンパク質又はB-ガラクトシダーゼを含みうる。一実施態様では、融合ポリペプチドはポリペプチドタグに融合した軽鎖可変又は定常ドメインを含む。
本発明の他の態様では、抗体可変ドメインなどのポリペプチドは単一起源又は鋳型分子から得たものである。起源又は鋳型分子は、原核細胞又は真核細胞の培養で産生される場合に効率よく安定しているなどの特性について選択又は設定する、及び/又は長さの違うCDRH3領域に適応するように選択又は設定しうる。ファージコートタンパク質成分を有する融合タンパク質としてある場合、鋳型分子の配列は可変ドメインのホールディング及び/又は表出を改善するように変更することができる。例えば、起源抗体はヒト化抗体4D5の可変ドメイン(軽鎖可変ドメイン(図1;配列番号1));(重鎖可変ドメイン(図1;配列番号2))のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、重鎖又は軽鎖の抗体可変ドメイン中のフレームワーク領域残基を起源又は鋳型分子から修飾又は変更して、抗体可変ドメインのホールディング、効率、表出又は親和性を改良することができる。ある実施態様では、起源分子のフレームワーク位置にあるアミノ酸が天然に生じる抗体又はサブグループの一致配列内の位置に共通してみられる単一又は複数のアミノ酸と異なる場合、フレームワーク残基を選択して起源又は鋳型分子から修飾する。この位置にあるアミノ酸を天然に生じる抗体又はサブグループの一致配列内にもっとも共通してみられるアミノ酸に変更することができる。一実施態様では、重鎖のフレームワーク残基71はR、V又はAであるかもしれない。他の例では、重鎖のフレームワーク残基93はS又はAであるかもしれない。更なる他の例では、フレームワーク残基94はR、K又はTであるか、MRTによりコードされるかもしれない。他の例では、フレームワーク残基93はAであり、フレームワーク残基94はRである。更なる他の例では、重鎖のフレームワーク残基49はアラニン又はグリシンであるかもしれない。また、軽鎖のフレームワーク残基は変更しうる。例えば、位置66のアミノ酸はアルギニン又はグリシンであるかもしれない。野生型ヒト化抗体4D5-8軽鎖及び重鎖の配列のフレームワーク領域を図6に示す(それぞれ配列番号:6−9及び10−13)。軽鎖が位置66で修飾され、重鎖が位置71、73及び78で修飾されるヒト化抗体4D5-8軽鎖及び重鎖の配列の変異体バージョンのフレームワーク領域を図7に示す(それぞれ配列番号:14−17及び18−21)。
本発明の方法は、CDR配列の多様な一群を含む多種多様なポリペプチドを生成することが可能である。ある実施態様では、本明細書に記載の本発明の方法を用いて一又は複数のライブラリが構成される。ライブラリは、標的抗原、例えばヒトDR5およびHER-2への結合についてスクリーニングされる。
多様性を与えるためにランダム化した免疫グロブリン重鎖可変ドメインが提供される。ある態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がR、Y及びMから選択され、X2がY及びRから選択され、X3がY、S、R、P及びGから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY、S、R及びHから選択され、X6がR、Y及びSから選択され、X7がG、Y及びSから選択され、X8がR、Y及びSから選択され、X9がG、Y及びSから選択され、X10がR、Y及びSから選択され、X11がG、Y及びSから選択され、X12がS、Y、R、G及びAから選択され、X13がG及びYから選択され、X14がL、M、R、G及びAから選択され、そして、X15がG、F及びLから選択されるかないしは存在せず、そして、X16がFであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−D−Y(配列番号:31)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がR、Y及びMから選択され、X2がY及びRから選択され、X3がY、S、R、P及びGから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY、S、R及びHから選択され、X6がR、Y及びSから選択され、X7がG、Y及びSから選択され、X8がR、Y及びSから選択され、X9がG、Y及びSから選択され、X10がR、Y及びSから選択され、X11がG、Y及びSから選択され、X12がS、Y、R、G及びAから選択され、X13がG及びYから選択され、X14がL、M、R、G及びAから選択され、そして、X15がG、F及びLから選択されるかないしは存在せず、そして、X16がFであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−D−Y(配列番号:31)を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:26)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:26)を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:27)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:27)を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む。
ある態様では、CDRH1は少なくとも配列番号:524−540及び189−294のいずれか一から選択されるアミノ酸配列か、又は図11Aないしは図15のいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH1アミノ酸配列を含む。CDRH2は配列番号:541−557及び295−400から選択されるアミノ酸配列か、又は図11Aないしは図15のいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH2アミノ酸配列を含む。CDRH3は配列番号:558−574及び401−506から選択されるアミノ酸配列か、又は図11Aないしは図15のいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH3アミノ酸配列を含む。
他の態様では、CDRH3は、R及びYから選択されるX1と、SであるX3と、SであるX8と、YであるX9と、Y又はRであるX10を含む。他の実施態様では、CDRH3はアミノ酸配列X1−R−S−Y−R−Y−G−S−Y−X10−G−S−Y−X14−F−D−Y(配列番号:575)を含む。
他の態様では、ポリペプチドはヒトDR5に結合するか、ヒトDR5及びマウスDR5に結合する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは抗体である。
一実施態様では、抗体は、i) アミノ酸配列GFYISSSSIH(配列番号:576)を含むCDRH1と、ii) アミノ酸配列SISPSSGSTYYADSVKG(配列番号:577)を含むCDRH2と、iii) アミノ酸配列YRSYRYGSYYGSYGFDY(配列番号:578)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗体は、i) アミノ酸配列GFYIYSSSIH(配列番号:579)を含むCDRH1と、ii) アミノ酸配列SISPSSGYTSYADSVKG(配列番号:580)を含むCDRH2と、iii) アミノ酸配列RRSYRYGSYRGSYAFDY(配列番号:581)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。
他の態様では、ポリペプチドは、さらに軽鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRL3が、X1が位置91にあって、Y、H及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY、S及びTから選択され、X4がY、S及びTから選択され、そして、X5がS、P及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。一実施態様では、CDRL1は、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含む。一実施態様では、CDRL2は、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含む。
(i) CDRL3が、X1が位置91にあって、Y、H及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY、S及びTから選択され、X4がY、S及びTから選択され、そして、X5がS、P及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。一実施態様では、CDRL1は、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含む。一実施態様では、CDRL2は、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあり、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、X5がS及びYから選択され、そして、X6がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1が位置95にあって、Y及びRから選択され、X2がY、S及びRから選択され、X3がS、G、Y及びHから選択され、X4がS、G、Y及びRから選択され、X5がG及びAから選択され、X6がF、M、L及びAから選択され、そして、X7がF、M及びLから選択されるかないしは欠失している、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−D−Y(配列番号:582)を含む。
ある態様では、CDRH1は配列番号:189−198のいずれか一から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を含む。CDRH2は配列番号:295−304から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を含む。CDRH3は配列番号:401−410から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1が位置28にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミ ノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:22)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位95にあって、Y、S及びGから選択され、X2がY、S、G、R、A及びMから選択され、X3がG、Y、S及びRから選択され、X4がG、Y及びFから選択され、X5がY、S、N及びGから選択され、X6がY、R、H及びWから選択され、X7がG及びAから選択され、そして、X8がF、M、L及びIから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−D−Y(配列番号:583)を含む。
ある態様では、CDRH1は配列番号:199−216のいずれ一から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を含む。CDRH2は配列番号:305−322から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を含む。CDRH3は配列番号:411−428から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1は位置28にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、X1がアミノ酸位95であって、Y、S、R、G及びEから選択され、X2がY、S、R及びGから選択され、X3がS、Y、G及びWから選択され、X4がS、Y、G及びQから選択され、X5がG、Y及びSから選択され、X6がG、Y、S、R及びVから選択され、X7がS、Y、G及びRから選択され、X8がY、S、G、R、P及びVから選択され、X9がG、A,Y、S及びRから選択され、X10がM、F、G、Y、S及びRから選択され、X11がA、Y、S、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、F、L、A、G、S、Y、R及びTから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、Y、T及びSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、M、F、I、G、Y、A及びTから選択されるかないしは存在せず、X15がM、L、Y、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X16がY及びGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、M及びGから選択されるかないしは存在せず、X18がP及びAから選択されるかないしは存在せず、そして、X18がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:584)を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けに従ってX1は位置28にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位50にあって、S及びYから選択され、X2がS及びYから選択され、X3がS及びYから選択され、X4がS及びYから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G (配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、X1がアミノ酸位95であって、Y、S、R、G及びEから選択され、X2がY、S、R及びGから選択され、X3がS、Y、G及びWから選択され、X4がS、Y、G及びQから選択され、X5がG、Y及びSから選択され、X6がG、Y、S、R及びVから選択され、X7がS、Y、G及びRから選択され、X8がY、S、G、R、P及びVから選択され、X9がG、A,Y、S及びRから選択され、X10がM、F、G、Y、S及びRから選択され、X11がA、Y、S、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、F、L、A、G、S、Y、R及びTから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、Y、T及びSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、M、F、I、G、Y、A及びTから選択されるかないしは存在せず、X15がM、L、Y、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X16がY及びGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、M及びGから選択されるかないしは存在せず、X18がP及びAから選択されるかないしは存在せず、そして、X18がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:584)を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−G−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX12が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X19がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−X15−X16−(X17)n−X18−X19−D−Yを含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−G−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX12が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X19がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−X15−X16−(X17)n−X18−X19−D−Yを含む。
ある態様では、nは1〜12である。ある態様では、X1はY及びSから選択され、X2はY及びSから選択され、X3はY及びSから選択され、X4はY及びSから選択され、X5はY及びSから選択され、そして、X6はY及びSから選択される。ある態様では、X6はY及びSから選択され、X7はY及びSから選択され、X8はY及びSから選択され、X9はY及びSから選択され、X10はY及びSから選択され、そして、X11はY及びSから選択される。ある態様では、位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸は50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、X18はG及びAから選択され、X19はI、M、L及びFから選択される。選択的な態様では、位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、X18がG及びAから選択され、X19がI、M、L及びFから選択される。他の選択的な態様では、位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸は38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、X18はG及びAから選択され、X19はI、M、L及びFから選択される。他の選択的な態様では、位置X12−X17のそれぞれのアミノ酸は20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1%私、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V、そして、1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、X18がG及びAから選択され、X19がI、M、L及びFから選択される。ある態様では、CDRH1は配列番号:217−294から選択されるアミノ酸配列か、又は図11のいずれかのCDRH1配列を含む。ある態様では、CDRH2が配列番号:323−400から選択されるアミノ酸配列か、又は図11のいずれかのCDRH2配列を含む。ある態様では、CDRH3は配列番号:429−506から選択されるアミノ酸配列か、又は図11のいずれかのCDRH3配列を含む。
他の実施態様では、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドが提供され、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−S−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX14が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X17がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−(X15)n−X16−X17(配列番号: )を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−S−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX14が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X17がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−(X15)n−X16−X17(配列番号: )を含む。
ある態様では、nは1〜14である。他の態様では、X1はY及びSから選択され、X2はY及びSから選択され、X3はY及びSから選択され、X4はY及びSから選択され、X5はY及びSから選択される。他の態様では、X1はW及びSから選択され、X2はW及びSから選択され、X3はW及びSから選択され、X4はW及びSから選択され、X5はW及びSから選択される。他の態様では、X1はR及びSから選択され、X2はR及びSから選択され、X3はR及びSから選択され、X4はR及びSから選択され、X5はR及びSから選択される。他の態様では、X1はF及びSから選択され、X2はF及びSから選択され、X3はF及びSから選択され、X4はF及びSから選択され、X5はF及びSから選択される。他の態様では、X6はY及びSから選択され、X7はY及びSから選択され、X8はY及びSから選択され、X9はY及びSから選択され、X10はY及びSから選択され、そして、X11はY及びSから選択される。他の態様では、X6はW及びSから選択され、X7はW及びSから選択され、X8はW及びSから選択され、X9はW及びSから選択され、X10はW及びSから選択され、そして、X11はW及びSから選択される。他の態様では、X6はR及びSから選択され、X7はR及びSから選択され、X8はR及びSから選択され、X9はR及びSから選択され、X10はR及びSから選択され、そして、X11はR及びSから選択される。他の態様では、X6はF及びSから選択され、X7はF及びSから選択され、X8はF及びSから選択され、X9はF及びSから選択され、X10はF及びSから選択され、そして、X11はF及びSから選択される。他の態様では、X12はY及びSから選択され、X13はY及びSから選択され、X14はY及びSから選択され、X15はY及びSから選択され、X16はG及びAから選択され、X17はF、L、I及びMから選択される。他の態様では、X12はW及びSから選択され、X13はW及びSから選択され、X14はW及びSから選択され、X15はW及びSから選択され、X16はG及びAから選択され、X17はF、L、I及びMから選択される。他の態様では、X12はR及びSから選択され、X13はR及びSから選択され、X14はR及びSから選択され、X15はR及びSから選択され、X16はG及びAから選択され、X17はF、L、I及びMから選択される。他の態様では、X12はF及びSから選択され、X13はF及びSから選択され、X14はF及びSから選択され、X15はF及びSから選択され、X16はG及びAから選択され、X17はF、L、I及びMから選択される。
他の態様では、位置X12−X15のそれぞれのアミノ酸はSと、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W及びYのいずれか一から選択され、X16はG及びAから選択され、そしてX17はF、L、I及びMから選択される。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む。
ある態様では、CDRH1は配列番号:816−842のいずれかから選択される少なくとも一のアミノ酸配列か、又は図21Aのいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH1アミノ酸配列を含む。CDRH2は配列番号:843−869から選択される少なくとも一のアミノ酸配列か、又は図21Aのいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH2アミノ酸配列を含む。CDRH3は配列番号:870−896から選択される少なくとも一のアミノ酸配列か、又は図21Aのいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH3アミノ酸配列を含む。
他の実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む。
ある態様では、CDRH1は配列番号:924−950のいずれか一から選択される少なくとも一のアミノ酸配列か、又は図24Aのいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH1アミノ酸配列を含む。CDRH2は配列番号:951−977から選択される少なくとも一のアミノ酸配列か、又は図24Aのいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH2アミノ酸配列を含む。CDRH3は配列番号:978−1004から選択される少なくとも一のアミノ酸配列か、又は図24Aのいずれかの配列から選択される少なくとも一のCDRH3アミノ酸配列を含む。
ある態様では、ポリペプチドはヒトのHER-2を結合する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは抗体を含む。ある実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFSIYSSYIH(配列番号:821)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:848)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAFDY(配列番号:875)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFSIWWSWIH(配列番号:932)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SISPSSGWTSYADSVKG(配列番号:959)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAMDY(配列番号:986)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFSISSSYIH(配列番号:944)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:971)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列YYSYALDY(配列番号:998)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFYISnSSSIH(配列番号:230)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列YIYPSSGYTSYADSVKG(配列番号:336)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列GYYYSYYSGYALDY(配列番号:442)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。
i) アミノ酸配列GFSIYSSYIH(配列番号:821)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:848)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAFDY(配列番号:875)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFSIWWSWIH(配列番号:932)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SISPSSGWTSYADSVKG(配列番号:959)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列WWSSAMDY(配列番号:986)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFSISSSYIH(配列番号:944)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列SIYPYSGYTSYADSVKG(配列番号:971)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列YYSYALDY(配列番号:998)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は、
i) アミノ酸配列GFYISnSSSIH(配列番号:230)を含むCDRH1と、
ii) アミノ酸配列YIYPSSGYTSYADSVKG(配列番号:336)を含むCDRH2と、
iii) アミノ酸配列GYYYSYYSGYALDY(配列番号:442)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。
他の態様では、抗体は、さらに、CDRL3配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでなり、CDRL3は、カバット番号付けに従ってX1が位置91にあって、S及びYから選択され、X2がS、Y及びFから選択され、X3がY、S及びFから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。
他の実施態様では、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドが提供され、このときCDRL3は、カバット番号付けに従ってX1が位置91にあって、X1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号: )を含む。他の実施態様では、ポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなり、このときCDRL3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−Tを含む。 ある態様では、CDRL3は、配列番号83−188、507−523、789−815及び897−923から選択されるアミノ酸配列か、又は図11、15、21又は24のいずれかのCDRL3配列を含む。
他の実施態様では、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドが提供され、
(i) CDRL1は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、
(ii) CDRL2は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、そして、
(iii) CDRL3は、X1−X6がシステイン以外の天然に生じる任意のアミノ酸であり、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91である、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−(X4)n−X5−X6−T(配列番号: )を含む。
(i) CDRL1は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、
(ii) CDRL2は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、そして、
(iii) CDRL3は、X1−X6がシステイン以外の天然に生じる任意のアミノ酸であり、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91である、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−(X4)n−X5−X6−T(配列番号: )を含む。
ある態様では、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がP及びLから選択され、そしてX6がF、L、I及びVから選択される。ある態様では、nは1〜3である。他の態様では、CDRL3は、配列番号83−188、507−523、789−815及び897−923から選択されるアミノ酸配列か、又は図11、15、21又は24のいずれかのCDRL3配列を含む。ある態様では、第一コンセンサス高頻度可変配列はRASQDVNTAVA(配列番号:29)である。ある態様では、第二コンセンサス高頻度可変配列はSASSLYS(配列番号:30)である。
他の実施態様では、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドが提供され、
(i) CDRL1は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、
(ii) CDRL2は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、そして、
(iii) CDRL3は、X1−X5がシステイン以外の天然に生じる任意のアミノ酸であり、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91である、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含む。
(i) CDRL1は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、
(ii) CDRL2は、対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含み、そして、
(iii) CDRL3は、X1−X5がシステイン以外の天然に生じる任意のアミノ酸であり、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91である、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含む。
ある態様では、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される。他の態様では、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R及びFのいずれか一から選択される。ある態様では、CDRL3は、配列番号83−188、507−523、789−815及び897−923から選択されるアミノ酸配列か、又は図11、15、21又は24のいずれかのCDRL3配列を含む。他の態様では、第一コンセンサス高頻度可変配列はRASQDVNTAVA(配列番号:29)である。他の態様では、第二コンセンサス高頻度可変配列はSASSLYS(配列番号:30)である。
ある実施態様では、(a) 上記のいずれかの重鎖ポリペプチドを含む重鎖抗体可変ドメインと、(b) 上記のいずれかの軽鎖ポリペプチドを含む軽鎖抗体可変ドメインとを含む、少なくとも2の抗体可変ドメインを含んでなるポリペプチドが提供される。
ある実施態様では、上記いずれかの重鎖ポリペプチドによる免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドと、上記いずれかの軽鎖ポリペプチドによる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドとを含んでなる抗体が提供される。
ある実施態様では、上記いずれかの重鎖ポリペプチドによる免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドと、上記いずれかの軽鎖ポリペプチドによる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドとを含んでなる抗体が提供される。
ある態様では、上記のポリペプチド及び抗体は、重鎖抗体可変ドメインのC末端の領域に連結した二量体化ドメインをさらに含む。あるこのような態様では、二量体化ドメインはロイシンジッパードメイン又は少なくとも1のシステイン残基を含む配列を含んでなる。あるこのような態様では、二量体化ドメインは抗体のヒンジ領域及びロイシンジッパーを含んでなる。ある他の態様では、二量体化ドメインは単一のシステインである。
ある実施態様では、上記のいずれかのポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドが提供され、上記のポリペプチドを含む抗体可変ドメインがウイルスコートタンパク質の少なくとも一部に融合される。ある態様では、ウイルスコートタンパク質は、タンパク質pIII、主要なコートタンパク質pVIII、Soc、Hoc、gpD、pv1及びその変異体からなる群から選択される。ある態様では、融合ポリペプチドは、さらに、可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に二量体化ドメインを含む。このような態様では、可変ドメインは重鎖可変ドメインである。他の態様では、融合ポリペプチドはさらに、ペプチドタグに融合した可変ドメインを含んでなる。このような態様では、可変ドメインは軽鎖可変ドメインである。他のこのような態様では、ペプチドタグはgD、c-myc、ポリ-his、蛍光タンパク質及びβ-ガラクトシダーゼからなる群から選択される。
ある実施態様では、一又は複数の上記のポリペプチドは、変異体CDRH1、CDRH2、CDRH3および/またはCDRL3に対応する抗体可変ドメインにフレームワーク領域FR1、FR2、FR3および/またはFR4を更に含んでなり、該フレームワーク領域は単一の抗体鋳型から得られる。このような実施態様では、各々のフレームワーク領域は、抗体4D5のフレームワーク領域アミノ酸配列(配列番号:6−9および10−13)に対応するアミノ酸配列又は抗体4D5の変異体(配列番号:14−17および18−21)を含む。
ある実施態様では、一又は複数の上記のポリペプチドの複数を含むライブラリが提供され、該ライブラリは少なくとも1×104の異なる抗体可変ドメイン配列を有する。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号: )を含むCDRH3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号: )を含むCDRH3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある態様では、複数のポリペプチドは複数のポリヌクレオチドによってコードされる。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある態様では、複数のポリペプチドは複数のポリヌクレオチドによってコードされる。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGは位置26であり、X1は位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある態様では、複数のポリペプチドは複数のポリヌクレオチドによってコードされる。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
他の実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含むCDRH1と、
(ii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含むCDRH2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号: )を含むCDRH3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある態様では、第一コンセンサス高頻度可変配列はカバットコンセンサスCDRL1配列を含む。あるこのような態様では、第一コンセンサス高頻度可変配列はR−A−S−Q−D−V−N−T−A−V−A(配列番号:29)である。ある態様では、第二コンセンサス高頻度可変配列はカバットコンセンサスCDRL2配列を含む。あるこのような態様では、第二コンセンサス高頻度可変配列はS−A−S−S−L−Y−S(配列番号:30)である。ある態様では、複数のポリペプチドは複数のポリヌクレオチドによってコードされる。
ある実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がY、S、G、RおよびEから選択され、X2がY、S、G、R、MおよびAから選択され、X3がG、Y、S、R、WおよびHから選択され、X4がY、S、G、R、FおよびQから選択され、X5がG、Y、N、AおよびSから選択され、X6がF、M、L、A、R、G、H、W、V、YおよびSから選択され、X7がM、L、G、A、R、F、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X8がM、L、F、I、R、G、P、V、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X9がG、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X10がM、F、G、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X11がA、G、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、L、F、A、G、R、T、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、T、YおよびSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、F、M、I、G、A、T及びYから選択されるかないしは存在せず、X15がM、Y G、LおよびRから選択されるかないしは存在せず、X16がYおよびGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、MおよびGから選択されるかないしは存在せず、X18がPおよびAから選択されるかないしは存在せず、そしてX19がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そして、X6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がY、S、G、RおよびEから選択され、X2がY、S、G、R、MおよびAから選択され、X3がG、Y、S、R、WおよびHから選択され、X4がY、S、G、R、FおよびQから選択され、X5がG、Y、N、AおよびSから選択され、X6がF、M、L、A、R、G、H、W、V、YおよびSから選択され、X7がM、L、G、A、R、F、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X8がM、L、F、I、R、G、P、V、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X9がG、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X10がM、F、G、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X11がA、G、Y、RおよびSから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、L、F、A、G、R、T、Y及びSから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、T、YおよびSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、F、M、I、G、A、T及びYから選択されるかないしは存在せず、X15がM、Y G、LおよびRから選択されるかないしは存在せず、X16がYおよびGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、MおよびGから選択されるかないしは存在せず、X18がPおよびAから選択されるかないしは存在せず、そしてX19がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、CDRH1は配列番号:189−294から選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様では、CDRH2は配列番号:295−400から選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様では、CDRH3は配列番号:401−506から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号:25)を含むCDRL3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号:25)を含むCDRL3とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある態様では、複数のポリペプチドは複数のポリヌクレオチドによってコードされる。
ある実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そしてX19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そしてX19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある実施態様では、複数のポリペプチドを含んでなる組成物の生成方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R及びFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そしてX19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R及びFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号: )を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号: )を含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そしてX19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む、複数のポリペプチドを生成することを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
(b) (i) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第一コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL1と、
(ii) 対応するコンセンサス高頻度可変配列と比較して一又は複数の位置に置換を含む第二コンセンサス高頻度可変配列ないしはその変異体を含むCDRL2と、
(iii) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置91であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T(配列番号: )を含むCDRL3、とを含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含んでなる。
ある実施態様では、上記のCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及びCDRL3配列の一又は複数を生成するための方法であって、
(a) CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3からなる群から選択した起源抗体の少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDRを含む起源抗体のうちの軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、又はその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを構築し;
(b) 起源抗体の少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDRを変異させて、上記の一又は複数の高頻度可変領域を生成する
ことを含んでなる方法が提供される。
(a) CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3からなる群から選択した起源抗体の少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDRを含む起源抗体のうちの軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、又はその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを構築し;
(b) 起源抗体の少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDRを変異させて、上記の一又は複数の高頻度可変領域を生成する
ことを含んでなる方法が提供される。
ある実施態様では、標的抗原に結合するポリペプチドについて選別するための方法であって、
(a) 上記の一又は複数のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し、
(b) 標的抗原に結合する前記組成物から一又は複数のポリペプチドを選別し、
(c) 標的抗原に結合しないポリペプチドから標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(d) 標的抗原に対して所望の親和性を有する標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを同定する
ことを含んでなる方法が提供される。
(a) 上記の一又は複数のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し、
(b) 標的抗原に結合する前記組成物から一又は複数のポリペプチドを選別し、
(c) 標的抗原に結合しないポリペプチドから標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(d) 標的抗原に対して所望の親和性を有する標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを同定する
ことを含んでなる方法が提供される。
ある実施態様では、抗体可変ドメインのライブラリの標的抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選別する方法であって、
(a) 上記の一又は複数のライブラリを標的抗原と接触させ、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、およそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の減少した量の標的抗原を含む一連の溶液中で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドをインキュベートし、そして、
(c) 最も低い濃度の標的抗原に結合することができる、又はおよそ0.1nM〜およそ200nMの親和性を有する、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを選別する、
ことを含んでなる方法が提供される。
(a) 上記の一又は複数のライブラリを標的抗原と接触させ、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、およそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の減少した量の標的抗原を含む一連の溶液中で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドをインキュベートし、そして、
(c) 最も低い濃度の標的抗原に結合することができる、又はおよそ0.1nM〜およそ200nMの親和性を有する、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを選別する、
ことを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、標的抗原がHER2又はDR5である。ある態様では、標的抗原の濃度がおよそ100〜およそ250nMである。ある態様では、標的抗原の濃度がおよそ25〜およそ100nMである。いくつかの実施態様では、一又は複数のライブラリ、クローン又はポリペプチドは、標的抗原を含む抗原のパネルに対してスクリーニングされる。いくつかの実施態様では、標的抗原に特異的に結合するクローンないしはポリペプチドとパネル上で他の抗原のいずれにも実質的に交差反応しないクローンないしはポリペプチドが選別される。抗原のパネルは少なくとも3つであり100未満の異なる抗原を含みうる。場合によって、抗原のパネルは3〜100、3〜50、3〜25、又は3〜10の異なる抗原を含む。
ある実施態様では、ポリペプチドのライブラリから標的抗原に結合するポリペプチドを選別する方法であって、
(a) 上記のいずれかのポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる方法が提供される。
(a) 上記のいずれかのポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる方法が提供される。
ある態様では、前記方法は、さらに、
(d) 結合に適した条件下で、混合物を形成するためにおよそ0.1nM〜およそ1000nMの範囲の標識した標的抗原の濃縮物とともにサブ集団をインキュベートし、
(e) 標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を該混合物に接触させ;
(f) 標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを検出して、標識した標的抗原から標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、
(g) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団と、以前の選別ラウンドよりも低い濃度の標識した標的抗原を用いて(d)−(f)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる。
(d) 結合に適した条件下で、混合物を形成するためにおよそ0.1nM〜およそ1000nMの範囲の標識した標的抗原の濃縮物とともにサブ集団をインキュベートし、
(e) 標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を該混合物に接触させ;
(f) 標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを検出して、標識した標的抗原から標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、そして、
(g) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標識した標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団と、以前の選別ラウンドよりも低い濃度の標識した標的抗原を用いて(d)−(f)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる。
ある態様では、前記方法はさらに、過剰量の非標識標的抗原を混合物に加え、十分な時間該混合物をインキュベートして、親和性の低い標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収することを含んでなる。いくつかの実施態様では、本明細書中に記載のいずれかの方法では、一又は複数のライブラリ、クローン又はポリペプチドは、標的抗原を含む抗原のパネルに対してスクリーニングされる。いくつかの実施態様では、標的抗原に特異的に結合するクローンないしはポリペプチドとパネル上で他の抗原のいずれにも実質的に交差反応しないクローンないしはポリペプチドが選別される。抗原のパネルは少なくとも3つであり100未満の異なる抗原を含みうる。場合によって、抗原のパネルは3〜100、3〜50、3〜25、又は3〜10の異なる抗原を含む。
ある実施態様では、親和性の高い標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離する方法であって、
(a) 上記いずれかのポリペプチドを複数含むライブラリに少なくともおよそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原から標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られたサブ集団と、以前のラウンドで用いた標的抗原の低い濃度を用いて(a)及び(b)の工程を少なくとも2度繰り返し、最も低い濃度の標的抗原で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離する、
ことを含んでなる方法が提供される。
一実施態様では、上記のいずれかのポリペプチドを複数含むライブラリから標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを選別するアッセイであり、
(a) 標識した標的抗原と標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドとの一又は複数の複合体の形成に適した条件下にて、および0.1nM〜およそ1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原にライブラリを接触させ;
(b) 一又は複数の複合体を単離し、標識した標的抗原から、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離して、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮したサブ集団を得て;
(c) 場合によっては、前回の選択ラウンドから得られたサブ集団と前回のラウンドで用いたより低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも二度繰り返す、ことを含むアッセイが提供される。
ある態様では、前記アッセイはさらに、一又は複数の複合体に過剰な非標識標的抗原を加えることを含む。ある態様では、工程(a)および(b)は二度繰り返され、選別の第一ラウンドでの標的抗原の濃度は約100nM〜約250nM、選別の第二ラウンドでの標的抗原の濃度は約25nM〜約100nM、選別の第三ラウンドでの標的抗原の濃度は約0.1nM〜約25nMである。
一実施態様では、上記のいずれかのポリペプチドを複数含むライブラリのスクリーニング方法であり、
(a) ポリペプチドの標的抗原への結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を標的抗原とともにインキュベートし;
(b) 標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし;
(c) ポリペプチドの固定した標的抗原への結合に適した条件下にて、第一試料及び第二試料のそれぞれを固定した標的抗原と接触させ;
(d) 各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し;そして、
(e) 第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料からの結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する、ことを含む方法が提供される。
ある態様では、標的抗原はDR5又はHER−2である。ある態様では、標的抗原の濃度はおよそ100〜およそ250nMである。ある態様では、標的抗原の濃度はおよそ25〜およそ100nMである。いくつかの実施態様では、一又は複数のライブラリ、クローン又はポリペプチドは、標的抗原を含む抗原のパネルに対してスクリーニングされる。いくつかの実施態様では、標的抗原に特異的に結合し、パネル上で他の抗原のいずれにも実質的に交差反応しないクローンないしはポリペプチドが選別される。抗原のパネルは少なくとも3つから100までの異なる抗原を含みうる。場合によって、抗原のパネルは3〜100、3〜50、3〜25、又は3〜10の異なる抗原を含む。
ある実施態様では、上記のポリペプチドの一又は複数はヒトDR5を特異的に結合する。一態様では、ポリペプチドはヒトDR5を特異的に結合する抗体である。前記一態様では、抗体は4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体は変異4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。前記一態様では、抗体は二重特異性抗体である。前記一態様では、抗体は合成抗体である。
一実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がR、Y及びMから選択され、X2がY及びRから選択され、X3がY、S、R、P及びGから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY、S、R及びHから選択され、X6がR、Y及びSから選択され、X7がG、Y及びSから選択され、X8がR、Y及びSから選択され、X9がG、Y及びSから選択され、X10がR、Y及びSから選択され、X11がG、Y及びSから選択され、X12がS、Y、R、G及びAから選択され、X13がG及びYから選択され、X14がL、M、R、G及びAから選択され、そして、X15がG、F及びLから選択されるかないしは存在せず、そして、X16がFであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−D−Y(配列番号:31)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、 このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:26)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:27)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、 このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は、図15に示す配列番号:524−540のいずれか一から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含む。また、抗DR5抗体は、図15に示す配列番号:541−557から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。また、抗DR5抗体は、図15に示す配列番号:558−574から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。一態様では、ヒトDR5を特異的に結合する抗体は、Fab1−17のいずれかについて、図15に示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はCDRH3を含み、このとき、X1のアミノ酸位が位置95であって、R及びYから選択され、X3が位置97にあって、Sであり、X8がアミノ酸位100bであって、Sであり、X9がアミノ酸位100cであって、Yであり、そして、X10がアミノ酸位100dにあって、Y又はRである。ある実施態様では、CDRH3はアミノ酸配列X1−R−S−Y−R−Y−G−S−Y−X10−G−S−Y−X14−F−D−Y(配列番号:575)を含む。特定の実施態様では、抗DR5抗体は、i) アミノ酸配列GFYISSSSIH(配列番号:576)を含むCDRH1と、ii) アミノ酸配列SISPSSGSTYYADSVKG(配列番号:577)を含むCDRH2と、iii) アミノ酸配列YRSYRYGSYYGSYGFDY(配列番号:578)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の特定の実施態様では、抗DR5抗体は、i) アミノ酸配列GFYIYSSSIH(配列番号:579)を含むCDRH1と、ii) アミノ酸配列SISPSSGYTSYADSVKG(配列番号:580)を含むCDRH2と、iii) アミノ酸配列RRSYRYGSYRGSYAFDY(配列番号:581)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は、X1及びX2がY又はSである、アミノ酸配列GFX1IX2SSSIH(配列番号:598)を含むCDRH1を含んでなる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、X1、X3、X4及びX6がY又はSである、アミノ酸配列X1ISPX3X4GYTX6YADSKVG (配列番号:599)を含むCDRH2を含んでなる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、X3はY、S、R、P及びGから選択され、X8はR、YおよびSから選択され、X9はG、YおよびSから選択され、X10はS、YおよびRから選択され、X14はGおよびAから選択され、X15はL及びFから選択される、アミノ酸配列YRX3YRYGX8X9X10GSYX14X15DY (配列番号:596)を含むCDRH3を含んでなる。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は、1から20nMのIC50でヒトDR5に結合する。他の実施態様では、抗DR5抗体はヒト及びネズミ科DR5に結合する。
抗DR5抗体は、場合によってさらに、軽鎖可変ドメインを含み、このときCDRL3は、X1が位置91にあって、Y、H及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY、S及びTから選択され、X4がY、S及びTから選択され、そして、X5がS、P及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。また、抗DR5抗体は、場合によって、軽鎖可変ドメインを含み、このときCDRL3は、X1、X2及びX3がY又はSである、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−S−P−S−T (配列番号:597)を含む。軽鎖可変ドメインは、さらに、図15に示す配列番号:507−523からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRL3を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含むCDRL1を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含むCDRL2を含んでよい。
一態様では、DR5に特異的な抗体は、アゴニスト又はアンタゴニスト活性についてスクリーニングされる。前記抗体は、本明細書に記載のアポトーシスアッセイなどのDR5レセプターシグナル伝達アッセイにおいてスクリーニングされうる。アゴニスト抗体は、コントロールと比較してアポトーシスを増加させ、アンタゴニスト抗体はアポトーシスを低減する。
ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞が提供される。ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞を培養し、該ポリヌクレオチドを発現させることを含む、抗体の製造方法が提供される。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養培地から抗体を回収することを含む。
ある実施態様では、哺乳動物に一又は複数の抗体を投与する工程を含む、治療を必要とする哺乳動物の異常な血管形成と関連する疾患を治療するための、ヒトDR5を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の使用方法が提供される。いくつかの実施態様では、アポトーシスを阻害するDR5への抗体は、細胞死の阻害が望まれる状況(例えば黄斑変性)において有用であろう。一態様では、疾患は癌である。いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はアポトーシスを増加する。前記一態様では、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞性肺癌、非ホジキンリンパ腫(NHL)、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫から選択される。他の態様では、前記治療は、さらに、前記抗体と同時又は連続して、第二治療薬を投与する工程を含む。前記一態様では、第二治療薬は、抗血管新生薬、抗新生物薬、化学療法薬及び細胞障害性薬から選択される。
ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の一又は複数のFabによって哺乳動物を治療する工程を含む、炎症性又は免疫性の疾患に罹患しているか又は該疾患を発症するリスクにある哺乳動物の治療方法が提供される。一態様では、炎症性又は免疫性の疾患は関節リウマチである。いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はアポトーシスを増加する。
また、本明細書中に記載の方法は、抗HER2抗体の単離を提供する。ある実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、Y及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1が位置95にあって、Y及びRから選択され、X2がY、S及びRから選択され、X3がS、G、Y及びHから選択され、X4がS、G、Y及びRから選択され、X5がG及びAから選択され、X6がF、M、L及びAから選択され、そして、X7がF、M及びLから選択されるかないしは欠失している、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−D−Y(配列番号:582)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、Y及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位95にあって、Y、S及びGから選択され、X2がY、S、G、R、A及びMから選択され、X3がG、Y、S及びRから選択され、X4がG、Y及びFから選択され、X5がY、S、N及びGから選択され、X6がY、R、H及びWから選択され、X7がG及びAから選択され、そして、X8がF、M、L及びIから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−D−Y(配列番号:583)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、Y及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、X1がアミノ酸位95であって、Y、S、R、G及びEから選択され、X2がY、S、R及びGから選択され、X3がS、Y、G及びWから選択され、X4がS、Y、G及びQから選択され、X5がG、Y及びSから選択され、X6がG、Y、S、R及びVから選択され、X7がS、Y、G及びRから選択され、X8がY、S、G、R、P及びVから選択され、X9がG、A、Y、S及びRから選択され、X10がM、F、G、Y、S及びRから選択され、X11がA、Y、S、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、F、L、A、G、S、Y、R及びTから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、Y、T及びSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、M、F、I、G、Y、A及びTから選択されるかないしは存在せず、X15がM、L、Y、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X16がY及びGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、M及びGから選択されるかないしは存在せず、X18がP及びAから選択されるかないしは存在せず、そして、X18がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:584)を含む。
さらに他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む。
さらに他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:26)を含む。
さらに他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:27)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3が、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択されるかないしは存在せず、そしてX19がF、L、I及びMから選択されるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、図11に示す配列番号:189−294からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、また、図11に示す配列番号:295−400からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、また、図11に示す配列番号:401−506からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、図21Aに示す配列番号:816−842からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、また、図21Aに示す配列番号:843−869からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、また、図21Aに示す配列番号:870−896からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、図24Aに示す配列番号:924−950からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含んでよい。抗HER2抗体は、また、図24Aに示す配列番号:951−977からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、また、図24Aに示す配列番号:978−1004からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。
一態様では、ヒトHER2を特異的に結合する抗体は、Fab1−106のいずれかについて、図11に示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。一態様では、ヒトHER2を特異的に結合する抗体は、B1−B28のいずれかについて、図21Aに示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。他の態様では、ヒトHER2を特異的に結合する抗体は、クローンG29−G61のいずれかについて、図24Aに示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、X2及びX3がY又はSである、アミノ酸配列GFSIX2X3SYIH(配列番号:588)を含むCDRH1を含む。抗HER2抗体は、また、X3がY又はSである、アミノ酸配列SIYPX3SGYTSYADSKVG (配列番号:589)を含むCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、さらに、X4がY又はSである、アミノ酸配列QQSYYX4PST(配列番号:587)を含むCDRL3を含む、可変軽鎖ドメインを含んでよい。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、X1がY又はSである、アミノ酸配列GFX1ISYSSIH(配列番号:590)を含む。抗HER2抗体は、さらに、X3、X5及びX6がY又はSである、アミノ酸配列SIYPX3YGX5TX6YADSKVG(配列番号:591)を含むCDRH2を含んでよい。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、X1がY又はSである、アミノ酸配列GFX1ISSSSIH(配列番号:593)を有するCDRH1を含む。抗HER2抗体は、さらに、X1、X2及びX6がY又はSである、アミノ酸配列X1IX2PSSGYTX6YADSKVG(配列番号:594)を有するCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、さらに、アミノ酸配列X1X2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY (配列番号:592)を有するCDRH3を含み、このときX1はY、S及びRから選択され、X2はYおよびSから選択され、X3はG、YおよびSから選択され、X4はG、YおよびSから選択され、X4はY、S、RおよびGから選択され、X10はY、SおよびGから選択され、X12はY、S、GおよびRから選択され、X13はGおよびAから選択され、そして、X14はI、F、M及びLから選択される。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、場合によってさらに、CDRL3配列をF汲む軽鎖可変ドメインを含み、このときCDRL3が、カバット番号付けに従ってX1が位置91にあって、S及びYから選択され、X2がS、Y及びFから選択され、X3がY、S及びFから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。軽鎖可変ドメインは、さらに、図11に示す配列番号:83−188、図24Aの配列番号:789−815、及び図24Aの配列番号:897−923からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRL3を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含むCDRL1を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含むCDRL2を含んでよい。
一態様では、ポリペプチドはHER2を特異的に結合する抗体である。前記一態様では、抗体は4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体は変異4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。前記一態様では、抗体は二重特異性抗体である。
ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞が提供される。ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞を培養し、該ポリヌクレオチドを発現させることを含む、抗体の製造方法が提供される。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養培地から抗体を回収することを含む。
ある実施態様では、哺乳動物に一又は複数の抗体を投与する工程を含む、HER2関連疾患を治療するための、HER2を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の使用方法。他の態様では、前記治療は、さらに、前記抗体と同時又は連続して、第二治療薬を投与する工程を含む。前記一態様では、第二治療薬は、抗血管新生薬、抗新生物薬、化学療法薬及び細胞障害性薬から選択される。
ある実施態様では、HER2を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の一又は複数のFabによって哺乳動物を治療する工程を含む、HER2関連疾患に罹患しているか又は該疾患を発症するリスクにある哺乳動物の治療方法。ある実施態様では、上記のポリペプチドの一又は複数はHER2を特異的に結合する。
一態様では、本発明のポリペプチドは、重鎖及び軽鎖の抗体可変ドメインの少なくとも1、又は両方を含み、このとき、抗体可変ドメインは、1、2又は3の明細書中に記載の(例えば前述の)可変CDRを含む。
いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチド(特に、抗体可変ドメインを含むもの)は、さらに、変異CDRに対応する抗体可変ドメインについての抗体フレームワーク配列、例えばFR1、FR2、FR3及び/又はFR4、単鎖抗体鋳型から得られるFR配列を含む。ある実施態様では、FR配列はヒト抗体から得られる。ある実施態様では、FR配列は、ヒトコンセンサス配列(例えばサブグループIIIコンセンサス配列)から得られる。ある実施態様では、フレームワーク配列は、本明細書中に記載の修飾したコンセンサス配列(例えば、重鎖の位置49、71、93及び/又は94、及び/又は軽鎖の位置66に修飾を含む)を含む。ある実施態様では、フレームワーク領域は、野生型ヒト化抗体4D5−8軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域の配列(図16(それぞれ配列番号:6−9及び10−13)に示す)を有する。ある実施態様では、フレームワーク領域は、ヒト化抗体4D5−8軽鎖及び重鎖の変異バージョンのフレームワーク領域の配列を有し、このとき軽鎖は位置66で修飾され、重鎖は位置71、73及び78で修飾されている(図17(配列番号:14−17及び18−21)に示す)。
(a) 上記いずれかのポリペプチドを複数含むライブラリに少なくともおよそ0.1nM〜およそ1000nMの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原から標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られたサブ集団と、以前のラウンドで用いた標的抗原の低い濃度を用いて(a)及び(b)の工程を少なくとも2度繰り返し、最も低い濃度の標的抗原で標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離する、
ことを含んでなる方法が提供される。
一実施態様では、上記のいずれかのポリペプチドを複数含むライブラリから標的抗原に結合する一又は複数のポリペプチドを選別するアッセイであり、
(a) 標識した標的抗原と標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドとの一又は複数の複合体の形成に適した条件下にて、および0.1nM〜およそ1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原にライブラリを接触させ;
(b) 一又は複数の複合体を単離し、標識した標的抗原から、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離して、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮したサブ集団を得て;
(c) 場合によっては、前回の選択ラウンドから得られたサブ集団と前回のラウンドで用いたより低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも二度繰り返す、ことを含むアッセイが提供される。
ある態様では、前記アッセイはさらに、一又は複数の複合体に過剰な非標識標的抗原を加えることを含む。ある態様では、工程(a)および(b)は二度繰り返され、選別の第一ラウンドでの標的抗原の濃度は約100nM〜約250nM、選別の第二ラウンドでの標的抗原の濃度は約25nM〜約100nM、選別の第三ラウンドでの標的抗原の濃度は約0.1nM〜約25nMである。
一実施態様では、上記のいずれかのポリペプチドを複数含むライブラリのスクリーニング方法であり、
(a) ポリペプチドの標的抗原への結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を標的抗原とともにインキュベートし;
(b) 標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし;
(c) ポリペプチドの固定した標的抗原への結合に適した条件下にて、第一試料及び第二試料のそれぞれを固定した標的抗原と接触させ;
(d) 各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し;そして、
(e) 第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料からの結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する、ことを含む方法が提供される。
ある態様では、標的抗原はDR5又はHER−2である。ある態様では、標的抗原の濃度はおよそ100〜およそ250nMである。ある態様では、標的抗原の濃度はおよそ25〜およそ100nMである。いくつかの実施態様では、一又は複数のライブラリ、クローン又はポリペプチドは、標的抗原を含む抗原のパネルに対してスクリーニングされる。いくつかの実施態様では、標的抗原に特異的に結合し、パネル上で他の抗原のいずれにも実質的に交差反応しないクローンないしはポリペプチドが選別される。抗原のパネルは少なくとも3つから100までの異なる抗原を含みうる。場合によって、抗原のパネルは3〜100、3〜50、3〜25、又は3〜10の異なる抗原を含む。
ある実施態様では、上記のポリペプチドの一又は複数はヒトDR5を特異的に結合する。一態様では、ポリペプチドはヒトDR5を特異的に結合する抗体である。前記一態様では、抗体は4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体は変異4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。前記一態様では、抗体は二重特異性抗体である。前記一態様では、抗体は合成抗体である。
一実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このときX1がR、Y及びMから選択され、X2がY及びRから選択され、X3がY、S、R、P及びGから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY、S、R及びHから選択され、X6がR、Y及びSから選択され、X7がG、Y及びSから選択され、X8がR、Y及びSから選択され、X9がG、Y及びSから選択され、X10がR、Y及びSから選択され、X11がG、Y及びSから選択され、X12がS、Y、R、G及びAから選択され、X13がG及びYから選択され、X14がL、M、R、G及びAから選択され、そして、X15がG、F及びLから選択されるかないしは存在せず、そして、X16がFであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−D−Y(配列番号:31)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、 このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:26)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:27)を含む。
他の実施態様では、抗DR5抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、 このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は、図15に示す配列番号:524−540のいずれか一から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含む。また、抗DR5抗体は、図15に示す配列番号:541−557から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。また、抗DR5抗体は、図15に示す配列番号:558−574から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。一態様では、ヒトDR5を特異的に結合する抗体は、Fab1−17のいずれかについて、図15に示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はCDRH3を含み、このとき、X1のアミノ酸位が位置95であって、R及びYから選択され、X3が位置97にあって、Sであり、X8がアミノ酸位100bであって、Sであり、X9がアミノ酸位100cであって、Yであり、そして、X10がアミノ酸位100dにあって、Y又はRである。ある実施態様では、CDRH3はアミノ酸配列X1−R−S−Y−R−Y−G−S−Y−X10−G−S−Y−X14−F−D−Y(配列番号:575)を含む。特定の実施態様では、抗DR5抗体は、i) アミノ酸配列GFYISSSSIH(配列番号:576)を含むCDRH1と、ii) アミノ酸配列SISPSSGSTYYADSVKG(配列番号:577)を含むCDRH2と、iii) アミノ酸配列YRSYRYGSYYGSYGFDY(配列番号:578)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の特定の実施態様では、抗DR5抗体は、i) アミノ酸配列GFYIYSSSIH(配列番号:579)を含むCDRH1と、ii) アミノ酸配列SISPSSGYTSYADSVKG(配列番号:580)を含むCDRH2と、iii) アミノ酸配列RRSYRYGSYRGSYAFDY(配列番号:581)を含むCDRH3とを含む重鎖可変ドメインを含んでなる。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は、X1及びX2がY又はSである、アミノ酸配列GFX1IX2SSSIH(配列番号:598)を含むCDRH1を含んでなる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、X1、X3、X4及びX6がY又はSである、アミノ酸配列X1ISPX3X4GYTX6YADSKVG (配列番号:599)を含むCDRH2を含んでなる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、X3はY、S、R、P及びGから選択され、X8はR、YおよびSから選択され、X9はG、YおよびSから選択され、X10はS、YおよびRから選択され、X14はGおよびAから選択され、X15はL及びFから選択される、アミノ酸配列YRX3YRYGX8X9X10GSYX14X15DY (配列番号:596)を含むCDRH3を含んでなる。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は、1から20nMのIC50でヒトDR5に結合する。他の実施態様では、抗DR5抗体はヒト及びネズミ科DR5に結合する。
抗DR5抗体は、場合によってさらに、軽鎖可変ドメインを含み、このときCDRL3は、X1が位置91にあって、Y、H及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY、S及びTから選択され、X4がY、S及びTから選択され、そして、X5がS、P及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。また、抗DR5抗体は、場合によって、軽鎖可変ドメインを含み、このときCDRL3は、X1、X2及びX3がY又はSである、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−S−P−S−T (配列番号:597)を含む。軽鎖可変ドメインは、さらに、図15に示す配列番号:507−523からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRL3を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含むCDRL1を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含むCDRL2を含んでよい。
一態様では、DR5に特異的な抗体は、アゴニスト又はアンタゴニスト活性についてスクリーニングされる。前記抗体は、本明細書に記載のアポトーシスアッセイなどのDR5レセプターシグナル伝達アッセイにおいてスクリーニングされうる。アゴニスト抗体は、コントロールと比較してアポトーシスを増加させ、アンタゴニスト抗体はアポトーシスを低減する。
ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞が提供される。ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞を培養し、該ポリヌクレオチドを発現させることを含む、抗体の製造方法が提供される。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養培地から抗体を回収することを含む。
ある実施態様では、哺乳動物に一又は複数の抗体を投与する工程を含む、治療を必要とする哺乳動物の異常な血管形成と関連する疾患を治療するための、ヒトDR5を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の使用方法が提供される。いくつかの実施態様では、アポトーシスを阻害するDR5への抗体は、細胞死の阻害が望まれる状況(例えば黄斑変性)において有用であろう。一態様では、疾患は癌である。いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はアポトーシスを増加する。前記一態様では、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞性肺癌、非ホジキンリンパ腫(NHL)、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫から選択される。他の態様では、前記治療は、さらに、前記抗体と同時又は連続して、第二治療薬を投与する工程を含む。前記一態様では、第二治療薬は、抗血管新生薬、抗新生物薬、化学療法薬及び細胞障害性薬から選択される。
ある実施態様では、ヒトDR5を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の一又は複数のFabによって哺乳動物を治療する工程を含む、炎症性又は免疫性の疾患に罹患しているか又は該疾患を発症するリスクにある哺乳動物の治療方法が提供される。一態様では、炎症性又は免疫性の疾患は関節リウマチである。いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はアポトーシスを増加する。
また、本明細書中に記載の方法は、抗HER2抗体の単離を提供する。ある実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、Y及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1が位置95にあって、Y及びRから選択され、X2がY、S及びRから選択され、X3がS、G、Y及びHから選択され、X4がS、G、Y及びRから選択され、X5がG及びAから選択され、X6がF、M、L及びAから選択され、そして、X7がF、M及びLから選択されるかないしは欠失している、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−D−Y(配列番号:582)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、Y及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位95にあって、Y、S及びGから選択され、X2がY、S、G、R、A及びMから選択され、X3がG、Y、S及びRから選択され、X4がG、Y及びFから選択され、X5がY、S、N及びGから選択され、X6がY、R、H及びWから選択され、X7がG及びAから選択され、そして、X8がF、M、L及びIから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−D−Y(配列番号:583)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置28であり、S及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、Y及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、X1がアミノ酸位95であって、Y、S、R、G及びEから選択され、X2がY、S、R及びGから選択され、X3がS、Y、G及びWから選択され、X4がS、Y、G及びQから選択され、X5がG、Y及びSから選択され、X6がG、Y、S、R及びVから選択され、X7がS、Y、G及びRから選択され、X8がY、S、G、R、P及びVから選択され、X9がG、A、Y、S及びRから選択され、X10がM、F、G、Y、S及びRから選択され、X11がA、Y、S、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、F、L、A、G、S、Y、R及びTから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、Y、T及びSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、M、F、I、G、Y、A及びTから選択されるかないしは存在せず、X15がM、L、Y、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X16がY及びGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、M及びGから選択されるかないしは存在せず、X18がP及びAから選択されるかないしは存在せず、そして、X18がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:584)を含む。
さらに他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)を含む。
さらに他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:26)を含む。
さらに他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:27)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3が、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択されるかないしは存在せず、そしてX19がF、L、I及びMから選択されるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、このとき、(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がS及び、Y、W、R又はFのいずれか一から選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19(配列番号: )を含む。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、図11に示す配列番号:189−294からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、また、図11に示す配列番号:295−400からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、また、図11に示す配列番号:401−506からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、図21Aに示す配列番号:816−842からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、また、図21Aに示す配列番号:843−869からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、また、図21Aに示す配列番号:870−896からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、図24Aに示す配列番号:924−950からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH1を含んでよい。抗HER2抗体は、また、図24Aに示す配列番号:951−977からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、また、図24Aに示す配列番号:978−1004からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRH3を含んでよい。
一態様では、ヒトHER2を特異的に結合する抗体は、Fab1−106のいずれかについて、図11に示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。一態様では、ヒトHER2を特異的に結合する抗体は、B1−B28のいずれかについて、図21Aに示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。他の態様では、ヒトHER2を特異的に結合する抗体は、クローンG29−G61のいずれかについて、図24Aに示すCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列に対応するCDRH1、CDRH2、CDRH3及びCDRL3配列を含む。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、X2及びX3がY又はSである、アミノ酸配列GFSIX2X3SYIH(配列番号:588)を含むCDRH1を含む。抗HER2抗体は、また、X3がY又はSである、アミノ酸配列SIYPX3SGYTSYADSKVG (配列番号:589)を含むCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、さらに、X4がY又はSである、アミノ酸配列QQSYYX4PST(配列番号:587)を含むCDRL3を含む、可変軽鎖ドメインを含んでよい。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、X1がY又はSである、アミノ酸配列GFX1ISYSSIH(配列番号:590)を含む。抗HER2抗体は、さらに、X3、X5及びX6がY又はSである、アミノ酸配列SIYPX3YGX5TX6YADSKVG(配列番号:591)を含むCDRH2を含んでよい。
他の実施態様では、抗HER2抗体は、X1がY又はSである、アミノ酸配列GFX1ISSSSIH(配列番号:593)を有するCDRH1を含む。抗HER2抗体は、さらに、X1、X2及びX6がY又はSである、アミノ酸配列X1IX2PSSGYTX6YADSKVG(配列番号:594)を有するCDRH2を含んでよい。抗HER2抗体は、さらに、アミノ酸配列X1X2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY (配列番号:592)を有するCDRH3を含み、このときX1はY、S及びRから選択され、X2はYおよびSから選択され、X3はG、YおよびSから選択され、X4はG、YおよびSから選択され、X4はY、S、RおよびGから選択され、X10はY、SおよびGから選択され、X12はY、S、GおよびRから選択され、X13はGおよびAから選択され、そして、X14はI、F、M及びLから選択される。
いくつかの実施態様では、抗HER2抗体は、場合によってさらに、CDRL3配列をF汲む軽鎖可変ドメインを含み、このときCDRL3が、カバット番号付けに従ってX1が位置91にあって、S及びYから選択され、X2がS、Y及びFから選択され、X3がY、S及びFから選択され、X4がY及びSから選択され、そして、X5がS及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含む。軽鎖可変ドメインは、さらに、図11に示す配列番号:83−188、図24Aの配列番号:789−815、及び図24Aの配列番号:897−923からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRL3を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列RASQDVNTAVA(配列番号:29)を含むCDRL1を含んでよい。また、抗体は、さらに、アミノ酸配列SASSLYS(配列番号:30)を含むCDRL2を含んでよい。
一態様では、ポリペプチドはHER2を特異的に結合する抗体である。前記一態様では、抗体は4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体は変異4D5抗体のフレームワーク領域を含む。前記一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。前記一態様では、抗体は二重特異性抗体である。
ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞が提供される。ある実施態様では、HER2を特異的に結合する前記いずれかの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入した宿主細胞を培養し、該ポリヌクレオチドを発現させることを含む、抗体の製造方法が提供される。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む。一態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養培地から抗体を回収することを含む。
ある実施態様では、哺乳動物に一又は複数の抗体を投与する工程を含む、HER2関連疾患を治療するための、HER2を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の使用方法。他の態様では、前記治療は、さらに、前記抗体と同時又は連続して、第二治療薬を投与する工程を含む。前記一態様では、第二治療薬は、抗血管新生薬、抗新生物薬、化学療法薬及び細胞障害性薬から選択される。
ある実施態様では、HER2を特異的に結合する上記の一又は複数の抗体の一又は複数のFabによって哺乳動物を治療する工程を含む、HER2関連疾患に罹患しているか又は該疾患を発症するリスクにある哺乳動物の治療方法。ある実施態様では、上記のポリペプチドの一又は複数はHER2を特異的に結合する。
一態様では、本発明のポリペプチドは、重鎖及び軽鎖の抗体可変ドメインの少なくとも1、又は両方を含み、このとき、抗体可変ドメインは、1、2又は3の明細書中に記載の(例えば前述の)可変CDRを含む。
いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチド(特に、抗体可変ドメインを含むもの)は、さらに、変異CDRに対応する抗体可変ドメインについての抗体フレームワーク配列、例えばFR1、FR2、FR3及び/又はFR4、単鎖抗体鋳型から得られるFR配列を含む。ある実施態様では、FR配列はヒト抗体から得られる。ある実施態様では、FR配列は、ヒトコンセンサス配列(例えばサブグループIIIコンセンサス配列)から得られる。ある実施態様では、フレームワーク配列は、本明細書中に記載の修飾したコンセンサス配列(例えば、重鎖の位置49、71、93及び/又は94、及び/又は軽鎖の位置66に修飾を含む)を含む。ある実施態様では、フレームワーク領域は、野生型ヒト化抗体4D5−8軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域の配列(図16(それぞれ配列番号:6−9及び10−13)に示す)を有する。ある実施態様では、フレームワーク領域は、ヒト化抗体4D5−8軽鎖及び重鎖の変異バージョンのフレームワーク領域の配列を有し、このとき軽鎖は位置66で修飾され、重鎖は位置71、73及び78で修飾されている(図17(配列番号:14−17及び18−21)に示す)。
ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、軽鎖及び重鎖の抗体可変ドメインを含み、該軽鎖可変ドメインはCDRL1、L2及びL3からなる群から選択される少なくとも1、2又は3の変異型CDRを含み、重鎖可変ドメインはCDRH1、H2及びH3からなる群から選択される少なくとも1、2又は3の変異型CDRを含むものである。
ある実施態様では、本発明のポリペプチドはScFvである。ある実施態様では、Fab断片である。ある実施態様では、F(ab)2又はF(ab')2である。したがって、ある実施態様では、本発明のポリペプチドはさらに二量体化ドメインを含む。ある実施態様では、二量体化ドメインは抗体重鎖又は軽鎖の可変ドメインとウイルスコートタンパク質の少なくとも一部の間に位置する。二量体化ドメインは二量体化配列及び/又は一以上のシステイン残基を含む配列を含みうる。二量体化ドメインは好ましくは重鎖可変ドメイン又は定常ドメインのC末端に直接又は間接的に連結しうる。二量体化ドメインの構造は、抗体可変ドメインが(二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含まないで)ウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質成分として産生されるか、抗体可変ドメインが(二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含んで)主にウイルスコートタンパク質成分なしで産生されるかによって変わりうる。抗体可変ドメインが主にウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質として産生される場合、一以上のジスルフィド結合及び/又は単一二量体化配列により二価表出される。ウイルスコートタンパク質成分への融合なしで主に産生される抗体可変ドメイン(アンバー停止あり)には、たとえ必要でなくとも、システイン残基と二量体化配列の両方を含む二量体化ドメインを有することが好ましい。ある実施態様では、F(ab)2の重鎖はヒンジ領域を含まない二量体化ドメインで二量体化する。二量体化ドメインはロイシンジッパー配列を含みうる(例えばGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG(配列番号3)などのGCN4配列)。
ある実施態様では、本発明のポリペプチドはさらに、軽鎖可変ドメインに融合した軽鎖定常ドメインを含み、ある実施態様では、少なくとも1、2又は3の変異型CDRを含む。本発明のポリペプチドのある実施態様では、ポリペプチドはさらに、重鎖可変ドメインに融合した重鎖定常ドメインを含み、ある実施態様では、少なくとも1、2又は3の変異型CDRを含む。
ある場合では、参照ポリペプチド又は起源抗体に関して変異型となるようにフレームワーク残基を変異させることが好ましい。例えば、重鎖のフレームワーク残基71はアミノ酸R、V又はAであってよい。他の例では、重鎖のフレームワーク残基93はアミノ酸S又はAであってよい。更なる他の例では、重鎖のフレームワーク残基94はアミノ酸R、K又はT又はであるか、MRTによってコードされてよい。更なる他の例では、重鎖のフレームワーク残基49はアミノ酸A又はGであってよい。また、軽鎖のフレームワーク残基は変異されうる。例えば、軽鎖のフレームワーク残基66はアミノ酸R又はGであってよい。
本明細書に記載のように、変異型CDRは単一参照ポリペプチド/起源抗体の一致するCDRと比較して配列が変異しているCDRを指す。したがって、本発明の単一ポリペプチドのCDRは、ある実施態様では、単一参照ポリペプチド又は起源抗体の一組のCDRに一致しうる。本発明のポリペプチドは変異型CDRの何れか一又は組み合わせを含みうる。例えば、本発明のポリペプチドは変異型CDRH1及びCDRH2を含みうる。本発明のポリペプチドは変異型CDRH1、変異型CDRH2及び変異型CDRH3を含みうる。他の例では、本発明のポリペプチドは変異型CDRH1、変異型CDRH2、変異型CDRH3及びCDRL3を含む。他の例では、本発明のポリペプチドは変異体CDRL1、変異体CDRL2及び変異体CDRL3を含む。本発明の何れかのポリペプチドはさらに、変異体CDRL3を含んでもよい。本発明の何れかのポリペプチドはさらに、変異体CDRH3を含んでもよい。
一実施態様では、本発明のポリペプチドは図7、19及び22に示す変異型CDR配列の一又は複数を含む。一実施態様では、本発明のポリペプチドは図11Aに示す変異型CDR配列の一又は複数を含む。一実施態様では、本発明のポリペプチドは図15に示す変異型CDR配列の一又は複数を含む。一実施態様では、本発明のポリペプチドは図21A−21Bに示す変異型CDR配列の一又は複数を含む。一実施態様では、本発明のポリペプチドは図24Aに示す変異型CDR配列の一又は複数を含む。
本発明のポリペプチドは、互いに複合体であり得る。例えば、本発明は2のポリペプチドを含んでいるポリペプチド複合体を提供するものであり、各々のポリペプチドは本発明のポリペプチドであり、該ポリペプチドのうちの一は少なくとも1、2又はすべての変異体CDR H1、H2およびH3を含み、他のポリペプチドは変異体軽鎖CDR(例えばCDRL3)を含む。ポリペプチド複合体は第1および第2のポリペプチド(第1および第2のポリペプチドは本発明のポリペプチドである)を含んでもよく、第一のポリペプチドは少なくとも1、2又は3の変異体軽鎖CDRを含み、第2のポリペプチドは少なくとも1、2又は3の変異体重鎖CDRを含む。また、本発明は、同じ変異体CDR配列を含むポリペプチドの複合体を提供する。複合体形成は、ここで記載されているような二量体化/多量体化ドメインでの二量体化/多量体化又は共有結合的相互作用(例えばジスルフィド結合を介して)を含む任意の適切な技術によって可能である(この文脈において、二量体化ドメインの一部、例えば二量体化ドメインが、ロイシンジッパー配列およびシステインを含むものでよい)。
別の態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に記載の本発明の何れかのポリペプチドを複数含んでなる組成物を提供する。該複数は変異体アミノ酸をコード化している配列の縮重を含んでなる一組のオリゴヌクレオチドを用いて生成した複数のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドを含んでもよく、該縮重は変異型アミノ酸をコードする制限コドンセットの複数のコドン配列のものである。本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド又はライブラリを含んでなる組成物が、キット又は製造品(場合によって、指示書、バッファなどを内包する)の形であってもよい。
一態様では、本発明は、ここで記載されているような本発明のポリペプチドをコード化しているポリヌクレオチドを提供する。他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードしている配列を含んでなるベクターを提供する。ベクターは、例えば、複製発現ベクターであり得る(例えば、複製発現ベクターは、M13、f1、fd、Pf3ファージ又はその誘導体、又はλ様ファージ、例えばλ、21、phi80、phi81、82、424、434など又はその誘導体でもよい)。ベクターは、本発明のポリペプチドをコードしている配列に連結されたプロモーター領域を含みうる。プロモータは、ポリペプチドの発現に好適な任意のもの、例えばlacZプロモータ系、アルカリホスファターゼpho Aプロモータ(Ap)、バクテリオファージlPLプロモータ(温度感受性プロモータ)、tacプロモータ、トリプトファンプロモータおよびバクテリオファージT7プロモータであり得る。したがって、本発明も、前述のプロモータ系からなる群から選択したプロモータを含んでなるベクターを提供する。
本発明のポリペプチドは、専門家の必要および要求に従って任意の好適な形で表出されうる。例えば、本発明のポリペプチドは、ウイルス表層、例えばファージ又はファジミドウイルス粒子上に表出されうる。したがって、本発明は、本発明のポリペプチド及び/又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルス粒子を提供する。
一態様では、本発明は、複数の本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む母集団を提供するものであり、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの各々のタイプはここで記載されているような本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
いくつかの実施態様において、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドはライブラリとして提供され、例えば、ライブラリは複数の少なくとも約1×104、1×105、1×106、1×107、1×108の異なる本発明のポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド配列を含む。他の態様において、また本発明は、複数の本発明のウイルス又はウイルス粒子、本発明のポリペプチドを表出する各々のウイルス又はウイルス粒子を含むライブラリを提供する。本発明のライブラリは、いくらかの異なるポリペプチド、例えば少なくとも約1×104、1×105、1×106、1×107、1×108の異なるポリペプチド(配列)を表出するウイルス又はウイルス粒子を含んでよい。
他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
他の態様では、本発明は、特定の標的抗原に高い親和性のある結合体を選別する方法を提供する。あるこのような実施態様では、特異的な標的抗原には限定するものではないが、HER2又はDR5が含まれる。
本発明の方法は、一以上の多様化したCDR領域を有するポリペプチド(例えばポリペプチド(抗体可変ドメインなど)ライブラリ)の母集団を提供する。これらのライブラリを分類(選別)して及び/又はスクリーニングして、標的抗原に対して親和性の高い結合体を同定する。一態様では、ライブラリからのポリペプチド結合体は、標的抗原に対する結合及び親和性について選択する。ポリペプチド結合体は、この選別方法の一以上を用いて選択して、それから、親和性及び/又は特異性(非標的抗原でなく標的抗原に対してのみの結合)についてスクリーニングしてもよい。
一態様では、本発明の方法は、一以上の多様化されたCDR領域を有する複数のポリペプチドを生成し、結合に好適な条件下で標的抗原を有する複数のポリペプチドと接触させることによって標的抗原に対する結合体について複数のポリペプチドを分類する;結合しないものから標的抗原との結合体を分離し;結合体を単離し;高親和性結合体(または、所望の結合親和性を有する任意の結合体)を同定することを含む。標的抗原と結合する結合体の親和性は、例えば、当分野に公知の種々の技術、例えば本明細書中に記載の競合的ELISAなどを用いて測定することができる。場合によって、ポリペプチドは、標的抗原についての分類と組み合わせて結合体の分類に用いることができるポリペプチドタグ、例えばgD、ポリhis又はFLAGに融合させることができる。
他の実施態様では、抗体可変ドメインのライブラリから標的抗原に結合する抗体可変ドメインを単離又は選別する方法であり、(a)本発明のポリペプチドを複数含む母集団に、固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させて、標的抗原ポリペプチド結合体を単離し;(b)非結合体からポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出し;(c)場合によっては、(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返すことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、前記方法はさらに、(d)結合体が混合物を形成するのに適した条件下で0.1nM〜1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体をインキュベートし;(e)標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ;(f)標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し;(g)場合によっては、前回の選別より連続的に低い濃度の標識標的抗原を用いて、(d)〜(f)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す。場合によっては、前記方法は混合物に過剰な量の非標識の標的抗原を加えて、十分な時間インキュベートして標識した標的抗原から低親和性の結合体を溶出することを含むかもしれない。
本発明の他の態様は、標的抗原に対して高親和性の結合体(又は所望の結合親和性を有する結合体)を単離又は選別する方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、(a)本発明のポリペプチドを複数含む母集団に標的抗原を接触させて、標的抗原ポリペプチド結合体を単離し(ここで用いる抗原は約0.1nM〜1000nMの範囲の濃度である);(b)標的抗原からポリペプチド結合体を分離し;(c)場合によっては、(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)、各回とももっとも低濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するために連続的により低濃度の標的抗原を用いて繰り返し;(d)様々に異なる濃度の標的抗原とともにポリペプチド結合体をインキュベートすることによって高い親和性(又は所望の親和性)で最も低濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し、ポリペプチド結合体のIC50を測定し;(e)標的抗原に対して所望の親和性を有するポリペプチド結合体を同定することを含む。前記の親和性は、例えば約0.1nM〜200nM、0.5nM〜150nM、1nM〜100nM、及び/又は25nM〜75nMであり得る。
他の実施態様では、ポリペプチド結合体を単離又は選別するためのアッセイであり、(a)ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体が形成するための結合に適する条件下にて、本発明のポリペプチドを複数含む母集団に標識した標的抗原を接触させて、(ここで用いる標識した標的抗原は約0.1nM〜1000nMの範囲の濃度である);(b)複合体を単離して、標識標的抗原からポリペプチド結合体を分離し;(c)場合によっては、(a)−(b)の工程を少なくとも一度、各回ともより低濃度の標的抗原を用いて繰り返すことを含むアッセイを提供する。場合によって、前記方法はさらに、ポリペプチド結合体と標的抗原との複合体を過剰な量の非標識標的抗原と接触させることを含んでもよい。一実施態様において、該方法の工程が二回繰り返され、第1回目の選別に用いる標的の濃度は約100nM〜250nMの範囲であり、第2回目の選別(行われるならば)では約25nM〜100nMの範囲であり、第3回目の選別(行われるならば)では約0.1nM〜25nMの範囲である。
また、本発明は、複数の本発明のポリペプチドを含む母集団をスクリーニングする方法であり、(a)ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ポリペプチド母集団の第一試料を標的抗原とともにインキュベートし;(b)標的抗原なしでポリペプチド母集団の第二試料を同様にインキュベートし;(c)ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ;(d)各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドの量を検出し;(e)第二試料で結合した特定のポリペプチドの量に対する第一試料で結合した特定のポリペプチドの量の割合を算出することによって標的抗原に対する特定のポリペプチドの親和性を測定することを含むスクリーニング方法を提供する。
また、本明細書中に記載のように作製したライブラリを特定の標的への結合と非標的抗原への結合の欠損についてスクリーニングしてもよい。一態様では、本発明は、抗体可変ドメインのライブラリから特定の標的抗原に結合する本発明の抗体可変ドメインなどのポリペプチドについてのスクリーニング方法であり、(a)複数の本発明のポリペプチドを含む母集団を作製し;(b)結合に適する条件下で、標的抗原をポリペプチド母集団と接触させ;(c)ライブラリ中の結合ポリペプチドを非結合ポリペプチドから分離し;(d)結合ポリペプチドが非標的抗原と結合するかどうかを決定することによって、標的抗原特異的結合ポリペプチドを同定し;(e)標的抗原特異的結合ポリペプチドを単離することを含む方法を提供する。ある実施態様では、工程(e)に標的抗原から結合ポリペプチドを溶出して、前記結合ポリペプチドをコードする複製発現ベクターを増幅することを含む。いくつかの実施態様では、一又は複数のライブラリ、クローン又はポリペプチドは、標的抗原を含む抗原のパネルに対してスクリーニングされる。いくつかの実施態様では、標的抗原に特異的に結合するクローンないしはポリペプチドとパネル上で他の抗原のいずれにも実質的に交差反応しないクローンないしはポリペプチドが選別される。抗原のパネルは少なくとも3つであり100未満の異なる抗原を含みうる。場合によって、抗原のパネルは3〜100、3〜50、3〜25、又は3〜10の異なる抗原を含む。
前述の分類/選別の何れかの方法の組み合わせをスクリーニング方法と組み合わせてもよい。例えば、一実施態様では、ポリペプチド結合体は、固定された標的抗原への結合について第一に選択する。ついで、固定された標的抗原と結合するポリペプチド結合体は、標的抗原に結合して非標的抗原に結合しないものをスクリーニングすることができる。標的抗原に特異的に結合するポリペプチド結合体は、必要に応じて増幅することができる。これらポリペプチド結合体は、複合体を形成するように濃縮した標識標的抗原と接触させることによって親和性の高いものを選別することができ、該標識標的抗原の濃度範囲は、約0.1nM〜約1000nMであり、該複合体は標的抗原上の標識に結合する作用剤と接触させることによって単離する。ついで、ポリペプチド結合体は標識した標的抗原から溶出させることができ、場合によっては選別の回数を繰り返し、各回にはより低濃度の標識標的抗原を用いる。この選別方法を用いて単離した結合ポリペプチドは、例えば実施例2及び4に記載のような溶液ファージELISAアッセイや当分野に公知の他の従来法を用いて親和性の高いものをスクリーニングすることができる。本発明の方法に用いた本発明のポリペプチドの母集団は、選別/スクリーニングの工程に適する任意の型で提供される。例えば、ポリペプチドは遊離可溶型、基質吸着型、又はファージやファジミド粒子などのウイルス粒子の表面上に存在する形でもよい。本発明の方法のある実施態様では、複数のポリペプチドはライブラリの型で提供される複数の複製ベクターによってコードされる。本明細書中に記載の選別/スクリーニング方法では、結合ポリペプチドをコードするベクターはさらに、選別/スクリーニングの反復工程(上記のように本発明の方法で選択的に行われる)に用いる十分量のポリペプチドを提供するために増幅してもよい。
一実施態様では、本発明は、標的抗原に結合するポリペプチドの選別方法であり、
(a)本明細書中に記載の本発明のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し;
(b)前記組成物から標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し;
(c)非結合体からポリペプチド結合体を単離し;
(d)単離したポリペプチド結合体から所望の親和性を有する結合体を同定する
ことを含む方法を提供する。
(a)本明細書中に記載の本発明のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し;
(b)前記組成物から標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し;
(c)非結合体からポリペプチド結合体を単離し;
(d)単離したポリペプチド結合体から所望の親和性を有する結合体を同定する
ことを含む方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、抗体可変ドメインのライブラリから標的抗原に結合する抗原結合可変ドメインの選別方法であり、
(a)本発明の(本明細書中に記載のような)抗体可変ドメインのライブラリに標的抗原を接触させ;
(b)非結合体から結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して、そして約0.1nM〜1000nMの濃度の減少した量の標的抗原を含む溶液中で結合体をインキュベートし;
(c)最も低濃度の標的抗原に結合することができる、約0.1nM〜200nMの親和性を有する結合体を選別する
ことを含む方法を提供する。
一実施態様では、標的抗原の濃度は約100〜250nM、又は約25〜100nMである。
(a)本発明の(本明細書中に記載のような)抗体可変ドメインのライブラリに標的抗原を接触させ;
(b)非結合体から結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して、そして約0.1nM〜1000nMの濃度の減少した量の標的抗原を含む溶液中で結合体をインキュベートし;
(c)最も低濃度の標的抗原に結合することができる、約0.1nM〜200nMの親和性を有する結合体を選別する
ことを含む方法を提供する。
一実施態様では、標的抗原の濃度は約100〜250nM、又は約25〜100nMである。
一実施態様では、本発明は、ポリペプチドライブラリから標的抗原に結合するポリペプチドの選別方法であり、
(a)本発明の(本明細書中に記載の)ポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し;
(b)非結合体からライブラリ中のポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、
(d)結合体が混合物を形成するのに適した条件下で0.1nM〜1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体のサブ集団をインキュベートし;
(e)標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ;
(f)標識した標的抗原に結合したポリペプチド結合体を検出して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し;
(g)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標識標的抗原を用いて、(d)〜(f)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含む方法を提供する。
(a)本発明の(本明細書中に記載の)ポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し;
(b)非結合体からライブラリ中のポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、
(d)結合体が混合物を形成するのに適した条件下で0.1nM〜1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体のサブ集団をインキュベートし;
(e)標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ;
(f)標識した標的抗原に結合したポリペプチド結合体を検出して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し;
(g)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標識標的抗原を用いて、(d)〜(f)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、前記方法はさらに、過剰量の非標識標的抗原を混合物に添加して、十分な時間インキュベートして標識標的抗原から親和性の低い結合体を溶出することを含む。
他の実施態様では、本発明は、標的抗原に対して親和性の高い結合体の単離方法であり、
(a)本発明の(本明細書中に記載の)ポリペプチドを複数含むライブラリに少なくとも約0.1nM〜1000nMの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し;
(b)標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、ポリペプチド結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返して、もっとも低い濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離する
ことを含む方法を提供する。
(a)本発明の(本明細書中に記載の)ポリペプチドを複数含むライブラリに少なくとも約0.1nM〜1000nMの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し;
(b)標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、ポリペプチド結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返して、もっとも低い濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離する
ことを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の(本明細書中に記載の)複数のポリペプチドを含むライブラリからポリペプチド結合体を選別するアッセイであり、
(a)結合に適した条件下にてライブラリに0.1nM〜1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原を接触させて、ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体を形成させ;
(b)複合体を単離して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含むアッセイを提供する。
(a)結合に適した条件下にてライブラリに0.1nM〜1000nMの範囲の濃度の標識した標的抗原を接触させて、ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体を形成させ;
(b)複合体を単離して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、結合体豊富なサブ集団を得て;
(c)場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返す
ことを含むアッセイを提供する。
ある実施態様では、前記方法はさらに、ポリペプチド結合体と標的抗原の複合体に過剰な非標識標的抗原を加えることを含む。ある実施態様では、前述の工程は少なくとも一度(ある実施態様では少なくとも二度)繰り返し、選別の第一回目の標的濃度は約100nM〜250nM、選別の第二回目では約25nM〜100nM、選別の第三回目では約0.1nM〜25nMである。
他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを複数含むライブラリのスクリーニング方法であり、
(a)ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を濃縮した標的抗原とともにインキュベートし;
(b)標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし;
(c)ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ;
(d)各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し;
(e)第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料の結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する
ことを含む方法を提供する。
(a)ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を濃縮した標的抗原とともにインキュベートし;
(b)標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし;
(c)ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ;
(d)各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し;
(e)第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料の結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する
ことを含む方法を提供する。
本発明の結合ポリペプチドの診断的及び治療的使用を包含する。ある診断的用途では、本発明は、対象とするタンパク質の存在を検出する方法であり、該タンパク質を含むことが予測される試料を本発明の結合ポリペプチドにさらし、試料への結合ポリペプチドの結合を検出することを含む方法を提供する。この使用には、本発明は、結合ポリペプチドと、タンパク質を検出するための結合ポリペプチドの使用についての指示書とを含むキットを提供する。
さらに本発明は、結合ポリペプチドをコードする単離した核酸;核酸、場合によってはベクターを形質移入した宿主細胞によって認識されるコントロール配列に操作可能に連結している核酸を含むベクター;ベクターを形質移入した宿主細胞;核酸が発現されるように該宿主細胞を培養して、場合によっては宿主細胞培養物(例えば宿主細胞培養液)から結合ポリペプチドを回収することを含む結合ポリペプチドの産生過程を提供する。
また、本発明は、本発明の結合ポリペプチドと担体(薬学的に受容可能な担体)又は希釈剤を含む組成物を提供する。治療的使用のための組成物は滅菌され、凍結乾燥されていてもよい。また、本明細書中に記載の適応症を治療するための医薬の製造における本発明の結合ポリペプチドの使用も包含する。さらに組成物は化学療法剤、細胞障害性剤又は抗血管形成剤などの第二治療剤を含みうる。
本発明はさらに、哺乳動物の治療方法であり、哺乳動物に本発明の結合ポリペプチドの有効量を投与することを含む方法を提供する。前記方法で治療する哺乳動物は非ヒト哺乳動物、例えばギャザリング臨床前データに好適な霊長類又は齧歯動物(例えばマウス又はネズミ又はウサギ)でもよい。非ヒト哺乳動物は健康体(例えば毒物学研究において)、又は対象とする結合ポリペプチドで治療する疾患に罹患していてもよい。ある実施態様では、哺乳動物はDR5関連の疾患に罹患している。他の実施態様では、哺乳動物はHER2関連の疾患に罹患している。
一実施態様では、哺乳動物は異常血管形成症(例えば病理学的血管形成症)に罹患しているか、その発症リスクがある。ある特定の実施態様では、疾患は、結腸直腸癌、腎臓細胞上皮癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、気管支肺胞上皮癌および膵癌からなる群から選択した癌である。他の実施態様では、疾患は、眼血管新生、例えば糖尿病性盲目、網膜症、原発性糖尿病性網膜症、年齢によって誘発された黄斑変性およびルベオーシスに起因する疾病である。他の実施態様では、治療する哺乳動物は、浮腫(例えば脳腫瘍と関連している浮腫、脳卒中と関連している浮腫又は大脳浮腫)に罹患しているか、そのリスクがある。他の実施態様では、哺乳動物は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、抵抗性腹水、乾癬、サルコイドーシス、動脈の動脈硬化症、敗血症、熱傷および膵炎からなる群から選択される疾患又は疾病に罹患しているか、そのリスクがある。他の実施態様によると、哺乳動物は、多嚢胞性卵巣疾患(POD)、子宮内膜症および子宮類線維腫からなる群から選択される尿生殖器性疾病に罹患しているか、そのリスクがある。一実施態様では、疾患は、限定するものではないが、癌、免疫系の疾患、神経系の疾患および維管束系の疾患を含む細胞生存の調節不全(例えば細胞死の異常な量)に起因する疾病である。投与する本発明の結合ポリペプチドの量は、疾患を治療するために治療的に有効な量であろう。用量段階的増大研究では、様々な用量の結合ポリペプチドを哺乳動物に投与するであろう。他の実施態様では、治療的有効量の結合ポリペプチドをヒト患者の疾患を治療するために患者に投与する。
一実施態様では、本明細書中に記載の腫瘍、悪性腫瘍、及び炎症性疾患又は免疫疾患を含む異常な血管新生に関連する他の疾患、及び/又は糖尿病又は他のインスリン関連の疾患を治療するのに有用な本発明の結合ポリペプチドはFab又はscFv抗体である。したがって、このような結合ポリペプチドは炎症性疾患や免疫疾患の治療のための医薬の製造において用いることができる。本明細書中に記載の疾患又は疾病に罹患しているか、その発症リスクがある哺乳動物を、本発明のポリペプチド(例えば抗体)と第二治療薬と同時、連続して、又は組み合わせて投与することによって治療することができる。第二治療薬に加えて他の治療薬は哺乳動物に投与できる、又は所望の適応症の医薬の製造において用いることができることが理解されるであろう。
一実施態様では、本明細書中に記載の腫瘍、悪性腫瘍、及び炎症性疾患又は免疫疾患を含む異常な血管新生に関連する他の疾患、及び/又は糖尿病又は他のインスリン関連の疾患を治療するのに有用な本発明の結合ポリペプチドはFab又はscFv抗体である。したがって、このような結合ポリペプチドは炎症性疾患や免疫疾患の治療のための医薬の製造において用いることができる。本明細書中に記載の疾患又は疾病に罹患しているか、その発症リスクがある哺乳動物を、本発明のポリペプチド(例えば抗体)と第二治療薬と同時、連続して、又は組み合わせて投与することによって治療することができる。第二治療薬に加えて他の治療薬は哺乳動物に投与できる、又は所望の適応症の医薬の製造において用いることができることが理解されるであろう。
本ポリペプチドは、例えばヒトの腫瘍を移植したモデルマウスにおいて移植された非宿主腫瘍の成長への宿主間質性細胞の協調の役割を理解するために用いることができる。本ポリペプチドは、本発明のポリペプチドで治療した後の齧歯動物又はウサギに移植した腫瘍の成長を観察又はモニタリングすることによって、治療的処置を回避したヒト腫瘍を同定する方法に用いることができる。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドと他の治療薬との併用療法を研究し、評価するために用いることができる。本発明のポリペプチドは、疾患又は類似の疾患に罹患した動物に該ポリペプチドを投与して該疾患の一以上の症状が寛解するかどうかを決定することによって他の疾患における対象とする標的分子の役割を研究するために用いることができる。
明確にするために、本明細書中に記載のすべてのアミノ酸番号付けは、特に又は文中でて示さない限り、Kabatら(以下の「定義」の詳述を参照)に従った。
(本発明の実施形態)
本発明は、CDR配列(抗体可変ドメイン配列を含む)を多様化するための新規の、非慣習的な、非常に簡略化された順応性のある方法及び、多数、一般的には非常に多くの多様化されたCDR(抗体可変ドメイン配列を含む)を含むライブラリを提供する。そのようなライブラリは、例えば結合親和性や結合力などの所望の活性を有する合成抗体クローンを選別する及び/又はスクリーニングするのに有用な組み合わせライブラリを提供する。このようなライブラリは、多種多様な任意の標的抗原と相互作用することができる免疫グロブリンポリペプチド配列を同定するために有用である。例えば、本発明のファージディスプレイとして発現される多様化した免疫グロブリンポリペプチドを含むライブラリは所望の抗原結合分子を選択したり、又はスクリーニングするために特に有用であり、そのためのハイスループットで効率が良く、自動化したシステムを提供する。本発明の方法は、起源又は鋳型分子の変異を最小限にして標的抗原への親和性の高い結合体を提供するため、及び抗体又は抗原結合断片が細胞培養物で産生される場合に産生効率が良いように設定するものである。
本発明は、CDR配列(抗体可変ドメイン配列を含む)を多様化するための新規の、非慣習的な、非常に簡略化された順応性のある方法及び、多数、一般的には非常に多くの多様化されたCDR(抗体可変ドメイン配列を含む)を含むライブラリを提供する。そのようなライブラリは、例えば結合親和性や結合力などの所望の活性を有する合成抗体クローンを選別する及び/又はスクリーニングするのに有用な組み合わせライブラリを提供する。このようなライブラリは、多種多様な任意の標的抗原と相互作用することができる免疫グロブリンポリペプチド配列を同定するために有用である。例えば、本発明のファージディスプレイとして発現される多様化した免疫グロブリンポリペプチドを含むライブラリは所望の抗原結合分子を選択したり、又はスクリーニングするために特に有用であり、そのためのハイスループットで効率が良く、自動化したシステムを提供する。本発明の方法は、起源又は鋳型分子の変異を最小限にして標的抗原への親和性の高い結合体を提供するため、及び抗体又は抗原結合断片が細胞培養物で産生される場合に産生効率が良いように設定するものである。
本発明の方法及び組成物は多くの付加的な利便性をもたらす。例えば、相対的に簡便なCDR配列を、十分に多様化した特定の標的結合配列を保持しつつ、制限した数のアミノ酸をコードするコドンセットを用いて生成することができる(対照的に従来の方法は最大限の数のアミノ酸をコードするコドンセットを用いる)。本発明に従って生成した配列母集団の性質が単純化されている(一般的に相対的にサイズが小さい)ので、母集団又はそのサブ集団が所望の特性を有するように一度同定したものの更なる多様化が可能である。
本発明の方法によって得られた標的抗原結合体の配列を単純化すると、所望の結果を得るために個別化した更なる配列修飾の余地が著しく広がる。例えば、配列修飾は、親和性成熟化、ヒト化などにおいて通常行われる。限定した数のアミノ酸しかコードしていない制限コドンセットの多様化に基づくことによって、異なる制限コドンセットを用いて異なるエピトープを標的とすることができ、それ故に最大限数のアミノ酸に基づくランダム化と比較して、実施者が多様化の方法を大きくコントロールすることができるであろう。制限コドンセットを用いることはさらに、望ましくないアミノ酸、例えばメチオニンや停止コドンをこの過程から排除し、それによってライブラリの全体の質や生産性を改善することができるという利便性がある。さらに、場合によっては、潜在的結合体の構造的多様性を限定することが望ましいであろう。本発明の方法及び組成物は、この目的を達成するための順応性がある。例えば、あるアミノ酸、例えばチロシンが配列中に存在すると、旋回配位がより少なくなる。
定義
アミノ酸は本明細書中において、一文字表記又は三文字表記又はその両方で表す。
用語「親和性精製」は、化学物質または結合パートナーへ分子が特異的に誘引または結合され、その結果パートナーに結合または誘引されたままの状態でその分子が不純物から分離されるような組合せまたは複合体の形成に基づく分子の精製を意味する。
アミノ酸は本明細書中において、一文字表記又は三文字表記又はその両方で表す。
用語「親和性精製」は、化学物質または結合パートナーへ分子が特異的に誘引または結合され、その結果パートナーに結合または誘引されたままの状態でその分子が不純物から分離されるような組合せまたは複合体の形成に基づく分子の精製を意味する。
用語「抗体」は最も広義で使われており、具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、単一のモノクローナル抗体(アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む)、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体ならびに抗原結合断片(例えば、Fab、F(ab’)2、scFvおよびFv)をカバーする。一実施態様では、「抗体」なる用語はヒト抗体も包含する。本明細書で使われるように、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域(CDR;すなわち、CDR1、CDR2およびCDR3)ならびにフレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。VHは重鎖の可変ドメインを指す。VLは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される組成物及び方法によると、CDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987及び1991))。抗体または抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
本明細書で使われるように、用語「相補性決定領域(CDR;すなわち、CDR1、CDR2およびCDR3)は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にCDR1、CDR2およびCDR3と同定される3つのCDR領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約24〜34(L1)、50〜56(L2)、および89〜97(L3)ならびに重鎖可変ドメインの31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3);Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))、および/または「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)ならびに重鎖可変ドメインの26〜32(H1),53〜55(H2)および96〜101(H3);Chothia及びLesk, J.Mol.Biol.196:901-917頁(1987))を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているCDR領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体4D5の重鎖のCDRH1は、アミノ酸26〜35を含む。4D5抗体のCDRL1のコンセンサス配列は(カバットの定義に従う)、R−A−S−Q−D−V−N−T−A−V−A(配列番号:29)である。4D5抗体のCDRL2のコンセンサス配列は(カバットの定義に従う)、S−A−S−S−L−Y−S(配列番号:30)である。
「フレームワーク領域」(以下FRと称す)は、CDR残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にFR1、FR2、FR3およびFR4と同定される4つのFRを持つ。CDRがカバットの定義に従うならば、軽鎖FR残基は残基約1〜23(LCFR1)、35〜49(LCFR2)、57〜88(LCFR3)および98〜107(LCFR4)に位置し、重鎖FR残基は重鎖残基の残基約1〜30(HCFR1)、36〜49(HCFR2)、66〜94(HCFR3)および103〜113(HCFR4)に位置する。CDRが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖FR残基は軽鎖の残基約1〜25(LCFR1)、33〜49(LCFR2)、53〜90(LCFR3)および97〜107(LCFR4)に位置し、重鎖FR残基は重鎖残基の残基約1〜25(HCFR1)、33〜52(HCFR2)、56〜95(HCFR3)および102〜113(HCFR4)に位置する。いくつかの場合には、CDRがカバットの定義によるCDRと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、FR残基はそれに応じて調節される。例えば、CDRH1がアミノ酸H26−H35を含むとき、重鎖FR1残基は位置1〜25にあり、FR2残基は位置36〜49にある。
本明細書で使われるように、「コドンセット」は所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。標準的なコドン指定形式はIUBコードのそれであり、このコードは当技術分野で公知であり本明細書で記載されている。コドンセットは、一般的に3つのイタリック大文字、例えばNNK、NNS、XYZ、DVKなどで表される。ある位置の選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で公知であり、例えば、TRIM手法が知られている(Knappek他、J.Mol.Biol.(1999)、296:57〜86頁);GarrardおよびHenner, Gene(1993), 128:103頁)。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー(Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能)を使って合成することができ、または市販品を入手することができる(例えば、Life Technologies, Rockville, MDから)。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、必ずしもそうではないが、例えばクローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
「制限コドンセット(制限されたコドンセット)」なる用語とその変異型は、本明細書中において、配列多様性を生じさせる当分野の方法で典型的に有用なコドンセットより非常に制限された数のアミノ酸をコードしているコドンセットを意味する。本明細書の一態様では、配列多様化に用いる制限コドンセットは2〜10、2〜8、2〜6、2〜4又は2のみのアミノ酸をコードしている。ある実施態様では、配列多様化に用いる制限コドンセットは、少なくとも2であるが10以下、8以下、6以下、4以下のアミノ酸をコードしている。典型的な例では、4単位のコドンセットを用いる。4単位のコドンセットの例には、当分野で公知のようにRMC、RMG、RRC、RSA、MKC、YMT、RST、KMT、SRC、MRT及びWMTが含まれる。他の典型例では、2単位コドンセットが用いられる。2単位のコドンセットの例にはTMT、KAT、YAC、WAC、TWC、TYT、YTC、WTC、KTT、YCT、MCG、SCG、MGC、SGT、GRT、GKT及びGYTが含まれる。好適な制限コドンの決定、及び特定の制限コドンセットによってコードされる特定のアミノ酸の同定は公知であり、当業者に明らかであろう。CDR配列の多様化に用いられる好適なアミノ酸の決定は、当分野で公知の基準によって経験的に及び/又は導かれうる(例えば、疎水性及び親水性のアミノ酸型などの組み合わせを含む)。
「Fv」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン1つと軽鎖可変ドメイン1つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばscFvにおけるように共有結合である。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH−VL二量体の表面の抗原結合部位を確定するのはこの構成である。この6つのCDRまたはそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を賦与する。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的なCDRを3つしか含んでいないFvの半分)でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
「Fab」断片は、軽鎖の可変および定常ドメインと重鎖の可変ドメインおよび第1の定常ドメイン(CH1)を含む。F(ab')2抗体断片は一対のFab断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、FvポリペプチドはVHおよびVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはscFvが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。scFvのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。
用語「ダイアボディ(diabody)」は、抗原結合部位を2つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖(VHおよびVL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に連結した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の上の2つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、2つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第404097号;WO93/11161号;およびHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448頁(1993)でさらに詳しく記載されている。
表現「線状抗体」はZapata他, Protein Eng., 8(10):1057-1062頁(1995)に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムFdセグメント(VH−CH1−VH−CH1)を含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得た抗体の特性を表し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって、作ることができる(例えば、米国特許第4816567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第4816567号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986);Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗-ヒトIgE抗体は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原(すなわち、約1×10−7M以下、好ましくは約1×10−8M以下、最も好ましくは約1×10−9M以下の結合親和性(Kd)値を有する)と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約50倍、又は少なくとも約500倍、又は少なくとも約1000倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上にて定義した種々の型の抗体のいずれでもあることが可能だが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
ここで用いる「抗体変異体」又は「抗体変異体」は、種依存性の抗体のアミノ酸残基の一つ以上が変更された種依存性の抗体のアミノ酸配列変異体を指す。このような変異体は、必然的に種依存性の抗体と100%未満の配列同一性又は類似性がある。好ましい実施形態では、抗体変異体は、種依存性の抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、少なくとも75%、より好ましくは、少なくとも80%、より好ましくは、少なくとも85%、より好ましくは、少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有する。ここでは、最大のパーセント配列同一性を得るために、本配列に関する同一性又は類似性は、種依存性の抗体残基と同一(すなわち同じ残基)又は類似(すなわち共通の側鎖の性質に基づく同じ群由来のアミノ酸残基、以下を参照)である候補配列配列を整列し、必要であれば間隙(ギャップ)を入れて、候補配列中のアミノ酸残基の割合として測定したものである。配列同一性又は類似性に影響を及ぼすように、可変ドメインを除く抗体配列、N末端、C末端又は内部伸展のいずれにも、削除又は挿入はない。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(1)ローリー(Lowry)法によって定量して95重量%以上の、最も好ましくは99重量%以上の抗体まで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
「アンタゴニスト」なる用語は広義で用いられ、本明細書中に記載(例えばDR5又はHER-2)のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和する任意の分子を含む。DR5の生物学的活性の例には、DR5へのApo2L/TRAILの結合、アポトーシスの誘導並びに更に文献に報告されているものが含まれる。HER-2の生物学的活性の例には、ヘレグリン、HER-2のチロシンリン酸化、増殖及びアポトーシスの誘導、並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アンタゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アンタゴニストは、標的分子への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでの標的分子のリガンドの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和するために機能するかもしれない。また、アンタゴニストは、例えば、他のエフェクター分子を遮断ないし阻害する結果として標的分子のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和するために間接的に機能するかもしれない。アンタゴニスト分子には、分子が標的分子の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和することができる「二重」アンタゴニスト活性が含まれるかもしれない。
「アゴニスト」なる用語は広義で用いられ、本明細書中に記載(例えばDR5又はHER-2)のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。DR5の生物学的活性の例には、Apo2Lの結合、アポトーシス並びに更に文献に報告されているものが含まれる。HER-2の生物学的活性の例には、ヘレグリン、レセプターのチロシンリン酸化、増殖及びアポトーシスの誘導、並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を起こす標的分子への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでの標的分子の一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために機能するかもしれない。また、アゴニストは、例えば、標的分子の活性化ないしシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としての標的分子のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために間接的に機能するかもしれない。アゴニストは、標的分子の活性化ないし活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として働きうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物の内因性のApo−2Lの活性を亢進しうる。例えば、これはDR5をプレ複合体化することによって、ないし、DR5レセプターとのそれぞれのリガンドの複合体を安定化することによって達成することができる。
「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」は本明細書では同義で使われ、そのような呼称は細胞または細胞系のすべての後代を含む。このように、例えば、「形質転換体」および「形質転換細胞」のような用語は、継代数に関係なくそれらに由来する一次対象細胞および培養物を含む。また、故意または偶発的な突然変異により、すべての後代においてDNAの内容が正確に同一であるというわけではないことが理解される。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代が含まれる。異なった呼称を意図する場合は、前後関係から明白となろう。
発現に言及する場合の「制御(コントロール)配列」は、特定の宿主生物で作用可能に連結したコード配列の発現のために必要なDNA塩基配列を意味する。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、リボソーム結合部位、および恐らくはまだよく理解されていない他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
用語「コートタンパク質」はタンパク質を意味し、少なくともその一部はウイルス粒子の表面に存在する。機能上の観点からは、コートタンパク質は宿主細胞でのウイルスの構築過程でウイルス粒子と結合する任意のタンパク質であり、ウイルスが他の宿主細胞に感染するまでそれと結合したままである。コートタンパク質は、主要なコートタンパク質であってもよいし、マイナーなコートタンパク質であってもよい。「主要な」コートタンパク質は、通常ウイルスの外殻に存在するコートタンパク質であり、少なくとも約5個、少なくとも約7個、少なくとも約10個かそれ以上のタンパク質コピーが存在する。主要なコートタンパク質は、1ビリオンにつき数十、数百または数千のコピーが存在しうる。主要なコートタンパク質の例は、繊維状ファージのp8タンパク質である。
特定の検定におけるある化学物体の「検出限界」は、その検定でバックグラウンドレベルより高く検出されるその物体の最小限の濃度である。例えば、ファージELISAでは、特定の抗原結合断片を提示している特定のファージの「検出限界」は、その抗原結合断片を提示していない対照ファージによって生じたものよりも多くのELISAシグナルを特定のファージが生産するファージ濃度である。
本明細書で用いる「DR5レセプター」又は「DR5」は天然の配列レセプターおよびレセプター変異体を包含する。これらの用語は、ヒトを含む様々な哺乳動物において発現されるDR5レセプターを包含する。DR5レセプターは、様々なヒト組織系統において天然に生じるので内因的に発現されても、組み換え方法又は合成法によって発現されてもよい。「天然の配列DR5レセプター」は、天然由来のDR5レセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを備えている。ゆえに、天然の配列DR5レセプターは、何か哺乳動物からも自然に発生するDR5レセプターのアミノ酸配列を有してもよい。このような天然配列DR5レセプターは、天然から単離することができるか、組換え方法又は合成手段によって生産することができる。「天然配列DR5レセプター」なる用語は、特に、天然に生じる切断型又は分泌型のレセプター(例えば、細胞外ドメイン配列を含有する可溶型)、天然に生じる変異型(例えばオルタナティブなスプライス型)および天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。レセプター変異体は、天然配列DR5レセプターの断片又は欠失突然変異体を含みうる。ヒトDR5の411アミノ酸配列を表1に示し、1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号の図3Aの配列である。ヒトDR5の転写スプライス変異体は当分野で公知である。このDR5スプライス変異体は、1998年8月20日公開の国際公開第98/35986号の図3Bおよび3Cに示されるヒトDR5の440アミノ酸配列をコードする。また、マウスDR5のポリペプチド配列およびDR5の細胞外ドメインは下記の表1に示す。
DR5の生物学的活性には、(a) インビボ又はエクスビボでの少なくとも一種のウイルス感染細胞又は哺乳動物癌細胞におけるアポトーシスを誘導又は刺激又はシグナル伝達する能力を有する、(b) 天然に生じるApo2L/TRAILポリペプチド結合能が含まれる。アポトーシスなどの生物学的活性を決定するためのアッセイは、DNA断片化(例としてMarsters et al., Curr. Biology, 6: 1669 (1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、DR5結合(例として1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号を参照)などの当分野で公知の方法を用いて行うことができる。「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」なる用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はMTTアッセイ)、FACS分析、カスパーゼ活性化、DNA断片化(例えば、Nicoletti等, J. Immunol. Methods, 139:271-279(1991)を参照)、ポリ-ADPリボースポリメラーゼ、「PARP」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
「DR5レセプター抗体」、「DR5抗体」又は「抗DR5抗体」は広義に使用され、DR5レセプターの少なくとも一つの形態に結合する抗体を指す。場合によって、DR5抗体は異種性配列ないしは分子に融合又は連結される。好ましくは、異種性配列は抗体が高次複合体又はオリゴマー複合体を形成するのを促すないしは支援する。場合によって、DR5抗体はDR5レセプターに結合するが、任意の付加的なApo-2Lレセプター(例としてDR4、DcR1又はDcR2)を結合しないし交差反応もしない。場合によって、抗体はDR5シグナル伝達活性のアゴニストである。場合によって、本発明のDR5抗体は、BIAcore結合アッセイ(本発明に記載される)において測定されるところの、およそ0.1nMからおよそ20mMの濃度範囲でDR5レセプターに結合する。
場合によって、いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、結合アッセイ(以降の実施例に記載の競合ファージELISAなど)において測定されるところの、およそ1nMからおよそ20nMのIC50値を表す。
場合によって、いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、結合アッセイ(以降の実施例に記載の競合ファージELISAなど)において測定されるところの、およそ1nMからおよそ20nMのIC50値を表す。
「Apo2L/TRAIL」、「Apo-2L」及び「TRAIL」なる用語は、表1に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基114−281を含む、95−281を含む、残基92−281を含む、残基91−281を含む、残基41−281を含む、残基15−281を含む、又は残基1−281、並びに上記配列の生物学的活性な断片、欠失、挿入ないしは置換変異体を含むポリペプチド配列を指すために、本明細書中で使用される。Apo-2Lポリペプチドは、国際公開第2005100399号の図1に記載され示される天然のヌクレオチド配列によってコードされうる。
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合で互いに結合した2つの部分を持つポリペプチドを指し、各部分は異なる特性を有するポリペプチドである。この特性は、例えばインビトロまたはインビボ活性などの生物学的性質でよい。この特性はまた、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触媒などかもしれない。この2つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または1つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを通して結合していてもよい。通常、この2つの部分とリンカーは同じ読み枠に存在する。ある実施態様では、ポリペプチドの2つの部分は異種または異なるポリペプチドから得られる。
「異種DNA」は宿主細胞に導入される任意のDNAである。DNAは、ゲノムDNA、cDNA、合成DNAおよびこれらの融合または組合せを含む様々なソースに由来してもよい。DNAは、宿主または受容細胞と同じ細胞または細胞型からのDNA、あるいは異なる細胞型、例えば哺乳類または植物からのDNAを含むことができる。DNAは任意選択にマーカーまたは選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、耐熱性遺伝子、その他を含むことができる。
本明細書で使われるように、「非常に多様な位置」は、公知のかつ/または天然抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつかの異なるアミノ酸を持つ軽鎖および重鎖可変領域上のアミノ酸位置を指す。非常に多様な位置は一般的にCDR領域にある。一態様では、公知のかつ/または天然抗体の非常に多様な位置を決定する際には、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)が提供しているデータが有効である。インターネット上のデータベース(http/www.bioinf.org.uk.abs.structures.html)は収集された多数のヒト軽鎖(http/www.bioinf.org.uk.abs.lc.align)および重鎖(http/www.bioinf.org.uk.abs.hc.align)の配列とその配置を提供し、これらの配列の非常に多様な位置の決定に役立つ。本発明によると、アミノ酸がある位置で約2から約11、約4から約9、及び/又は約5から約7個の可能な異なるアミノ酸残基変異を有する場合は、その位置は非常に多様と言える。いくつかの実施形態では、あるアミノ酸位置は、少なくとも約2、少なくとも約4、少なくとも約6、及び/又は少なくとも約8つの可能な異なるアミノ酸残基変異を有するならば非常に多様である。
本明細書で使われるように、「ライブラリー」は複数の抗体もしくは抗体断片配列(例えば本発明のポリペプチド)またはこれらの配列をコードする核酸を指し、これらの配列は、本発明の方法によってこれらの配列に導入される変異体アミノ酸の組合せにおいて異なる。
「ライゲーション(連結)」は、2つの核酸断片の間でリン酸ジエステル結合を形成する方法である。この2つの断片のライゲーションのために、断片の末端は互いに適合していなければならない。場合によっては、この末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直ちに適合性を持つようになる。しかし、ライゲーションに適合させるためには、まずエンドヌクレアーゼ消化の後に一般的に形成される付着末端を平滑末端に変える必要がある。平滑末端にするためには、DNAを適当な緩衝液中で15℃で少なくとも15分間、4つのデオキシリボヌクレオチド三燐酸の存在下でDNAポリメラーゼIまたはT4DNAポリメラーゼのクレノー断片の約10単位で処理する。次にDNAをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはシリカ精製によって精製する。連結すべきDNA断片を溶液に等モル量入れる。この溶液は、ATP、リガーゼ緩衝およびT4DNAリガーゼのようなリガーゼも、DNA0.5μgにつき約10単位含む。DNAをベクターに連結する場合は、ベクターは適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化作用によってまず線状にする。線状にされた断片は、次に細菌のアルカリホスファターゼまたは仔ウシ腸管のホスファターゼで処理して、ライゲーションのステップの間のセルフライゲーションを予防する。他のライゲーション方法は当分野で周知である。
「突然変異」は、参照ヌクレオチド配列、例えば野生型配列と比較してのヌクレオチドの欠失、挿入または置換である。
本明細書で使われるように、「天然(自然)」または「天然に生じる」抗体は、非合成源、例えば生体外で得られる分化抗原特異的B細胞、またはその対応するハイブリドーマ細胞系、あるいは動物の血清から得られる抗体から特定された抗体を指す。これらの抗体には、天然のものであれ誘発されたものであれいかなる種類の免疫応答で生じた抗体も含まれる。天然抗体には、これらの抗体を構成するかコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、例えばカバットデータベースで特定されているようなものが含まれる。本明細書で使われるように、天然抗体は、ソース配列または鋳型配列を、例えばある位置で起源抗体配列と異なる抗体配列を提供する異なるアミノ酸を用いて1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または追加により変更した抗体配列を指す「合成抗体」とは異なる。
核酸に関して「作用可能に連結した」は、その核酸が他の核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。例えば、プレシーケンス(presequence)または分泌リーダーのDNAは、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合は、そのポリペプチドのDNAと作動可能的に結合している。プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したDNA配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージの粒子表面でコートタンパク質の少なくとも一部と融合したタンパク質として提示する手法である。ファージディスプレイの有用さは、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーから対象抗原と高親和性で結合する配列を迅速に、効率的に選別できることにある。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドを特異的結合特性に関してスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIとの融合を通して小さなランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために利用されてきた。WellsおよびLowman, Curr.Opin.Struct.Biol., 3:355-362頁(1992)とその中の引用文献。一価のファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリーが遺伝子IIIまたはその一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の1個または0個のコピーを提示するように野生型遺伝子IIIタンパク質の存在下で低レベルで発現される。アビディティー効果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいておりファジミドベクターが使われるが、このベクターはDNA操作を単純化する。LowmanおよびWells, Methods:A Companion to Methods in Enzymology, 3:205-216頁(1991)。
「ファジミド」は、細菌の複製起点、例えばCo1E1およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファジミドはいかなる公知のバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージおよびラムドイドバクテリオファージでも使用できる。プラスミドは、通常、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたDNAセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを備える細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドDNAの1つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファジミドは感染性または非感染性ファージ粒子を形成することができる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合としてこの異種ポリペプチドの遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子、またはその断片を含むファジミドを含む。
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含んでいて複製ができるバクテリオファージの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ある実施態様では、ファージは、繊維状バクテリオファージ、例えばM13、f1、fd、Pf3ファージもしくはその誘導体、またはλ様ファージ、例えばλ、21、phi80、phi81、82、424、434、その他もしくはその誘導体である。
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法(例えば、固相手法、例えば欧州特許第266032号、1988年5月4日公布、に記載されている手法を利用したリン酸トリエステル、亜リン酸塩、またはホスホラミダイト化学、またはFroeshler他, Nucl.Acids.Res., 14:5399-5407頁(1986)に記載されているデオキシヌクレオチドH−ホスホン酸塩中間体を通した方法)によって化学的に合成される短い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。他の方法には、以下に記載のポリメラーゼ連鎖反応および他のオートプライマー法、および固体担体上のオリゴヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法のすべては、Engels他, Agnew.Chem.Int.Ed.Engl., 28:716-734頁(1989)に記載されている。遺伝子のすべての核酸配列が公知ならば、またはコード鎖と相補的な核酸の配列が利用できるならばこれらの方法が使われる。あるいは、対象アミノ酸配列が公知ならば、各アミノ酸残基の公知で好ましいコード残基を使って可能な核酸配列を推測できよう。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムで、または沈殿法によって精製することができる。
DNAが「精製される」のは、DNAが非核酸不純物から分離されるときである。不純物は極性、無極性、イオン性、その他である。
本明細書で使われるように、「起源抗体」は、その抗原結合配列が本明細書で記載される基準に従う多様化が実行される鋳型配列としての役目をする抗体、または抗原結合断片を指す。ある実施態様では、抗原結合配列は、通常、抗体可変部、少なくとも1つの好ましくはフレームワーク領域を含むCDRを含む。
本明細書で使われる「溶媒と接触しうる(solventaccessible)位置」は起源抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変部のアミノ酸残基の位置を指し、それは、この抗体または抗原結合断片の構造、構造アンサンブルおよび/またはモデル化された構造に基づき、溶媒露出が可能かつ/または抗体特異性抗原などの分子との接触が可能と判断されるものである。これらの位置は一般的にはCDRで、またタンパク質の外側に見られる。本明細書で定められるように、抗体または抗原結合断片の溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムのいずれかを使って決定できる。ある実施態様では、溶媒と接触しうる位置は抗体(又は抗体の一部、例えば抗体可変ドメインやCDRセグメント)の三次元モデルからの座標を使い、好ましくはInsightIIプログラム(Accelrys, San Diego, CA)のようなコンピュータプログラムを使って決定される。溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム(例えば、LeeおよびRichards, J.Mol.Biol.55, 379(1971)、および、Connolly, J.Appl.Cryst.16, 548(1983))を使用しても決定することができる。溶媒と接触しうる位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体(又はその一部)から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。このような目的のために利用できるソフトウェアには、SYBYL生体高分子モジュールソフトウェア(Tripos Associates)が含まれる。一般に、ある実施態様では、アルゴリズム(プログラム)がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約1.4オングストローム以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒と接触しうる領域の決定法が、Pacios, (1994)「ARVOMOL/CONTOUR:molecular surface areas and volumes on Personal Computers」Comput.Chem.18(4):377-386頁;および同(1995)「Variations of Surface Areas and Volumes in Distinct Molecular Surfaces of Biomolecules」J.Mol.Model.1:46-53頁に記載されている。
「転写調節因子」は、以下の構成成分の1つまたは複数を含む:エンハンサー要素、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子および転写終結配列。このような構成成分は当技術分野において公知である。米国特許第5667780号。
「形質転換体」は、そのDNAと関連する表現型(例えば、そのDNAによってコードされるタンパク質によって付与された抗生物質耐性)の発現によって証明されるような、DNAを取り込み、維持している細胞である。
「形質転換」は、細胞がDNAを取り込んで「形質転換体」になる過程を意味する。DNA取込みは永久的、または一過性である。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び/又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。ある実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Schier他、Gene, 169:147-155 (1995); Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
本発明の「Kd」又は「Kd値」は、一分子と他の分子との相互作用についての解離定数である。ある実施態様では、Kd値は放射標識したタンパク質結合アッセイ(RIA)によって測定される。ある実施態様では、DR5又はHER2のRIAは、それぞれ非標識DR5又はHER2分子の滴定シリーズの存在下で、最小濃度の(125I)-標識DR5又はHER2にてFabを均衡化して、抗Fab抗体コートプレートにて結合したDR5又はHER2分子をそれぞれ捕獲することによってDR5又はHER2に対するFabの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイで示されるように(Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、抗DR5又はHER2抗体およびDR5又はHER2分子のそれぞれのFab型(バージョン)を用いて実行される。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を5μg/mlの捕獲抗Fab抗体(Cappel Labs)を含む50mM炭酸ナトリウム(pH9.6)にて一晩コートして、その後2%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBSにて室温で2〜5時間(およそ23℃)、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、100pM又は26pMの[125I]DR5又はHER2を段階希釈した所望のFab、例えばFab−12と混合する(Prestaら., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599))。ついで対象のFabを一晩インキュベートする;しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに65時間かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で1時間インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを0.1%のTween20を含むPBSにて8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて10分間計測する。最大結合の20%か又はそれ以下濃度のFabをそれぞれ競合結合測定に選択する。
他の実施態様によると、Kd又はKd値は、BIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000機器(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定することができる。ある実施態様では、DR5又はHER2分子それぞれに対する抗DR5又はHER2分子抗体のKd値は、以下のプロトコールに従ってBIAcore TM 分析を用いて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN-ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化した。ヒトDR5又はHER2分子を10mM 酢酸ナトリウム(pH4.8)で5μg/ml(〜0.2μM)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(RU)がおよそ10になるように5μl/分の流量で注入した。ヒトDR5又はHER2の注入後、反応しない群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、2倍の段階希釈したFab(0.78nMから500nM)を25℃、およそ25μl/分の流量で0.05%Tween20(PBST)を含むPBSに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Kon)と解離速度(Koff)を算出した。平衡解離定数(Kd)をKoff/Kon比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。
他の実施態様によると、Kd又はKd値は、BIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000機器(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定することができる。ある実施態様では、DR5又はHER2分子それぞれに対する抗DR5又はHER2分子抗体のKd値は、以下のプロトコールに従ってBIAcore TM 分析を用いて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN-ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化した。ヒトDR5又はHER2分子を10mM 酢酸ナトリウム(pH4.8)で5μg/ml(〜0.2μM)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(RU)がおよそ10になるように5μl/分の流量で注入した。ヒトDR5又はHER2の注入後、反応しない群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、2倍の段階希釈したFab(0.78nMから500nM)を25℃、およそ25μl/分の流量で0.05%Tween20(PBST)を含むPBSに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Kon)と解離速度(Koff)を算出した。平衡解離定数(Kd)をKoff/Kon比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。
「疾患」は、本発明の物質/分子又は方法を用いて治療することによって利益を得る任意の症状である。これには、哺乳動物の問題とする疾患の素因となる病的状態を含む慢性及び急性の疾患又は疾病を包含する。限定するものでなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍;非白血病およびリンパ系の悪性腫瘍;神経系、神経膠系、星状膠系、視床下部性及び他の腺性、マクロファージ系、上皮性、間質性、胞胚腔系の疾患;及び、炎症性、免疫系関連の疾患が包含される。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語はここに示すように互いに独占的なものではない。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓性癌、並びに頭部及び頸部の癌が含まれる。
「免疫関連疾患」なる用語は、哺乳動物の免疫系の構成成分が哺乳動物の罹患率の原因となる、罹患率を調整する、さもなくば罹患率に寄与する疾患を意味する。また、免疫応答の刺激又は介入が疾患の進行において寛解性効果を及ぼす疾患も含まれる。この用語には、自己免疫性疾患、免疫が媒介する炎症性疾患、免疫が媒介しない炎症性疾患、感染性疾患及び免疫不全性疾患が含まれる。免疫又はT細胞が媒介するものであって、本発明に従って治療されうる免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症性ミオパシ(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、類肉腫症、自己免疫性溶血性貧血(免疫汎血球減少症、発作性夜行性ヘモグロビン尿症)、自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫が媒介する血小板減少症)、甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真正糖尿病、免疫が媒介する腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄性疾患、例として多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経炎ないしはギラン-バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎、肝胆嚢の疾患、例えば感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型の肝炎及び他の非肝指向性ウイルスの肝炎)自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆管萎縮症、肉芽腫肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性及び線維形成性肺疾患、例として炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病)、グルテン過敏性腸症、及びウィップル病、自己免疫性ないしは免疫が媒介する皮膚病、例えば水疱性皮膚病、多形性紅斑および接触皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例として喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品性過敏症および蕁麻疹、および肺の免疫疾患、例として好酸球性肺炎が含まれる。
「自己免疫性疾患」は本明細書中で広義の一般的な意味で用いられ、個体の自己組織成分に対する個々の哺乳動物の体液性又は細胞性免疫応答により正常組織又は健康な組織が破壊される哺乳動物の疾患又は症状を意味する。この例には、限定するものではないが、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、および炎症性腸疾患(IBD)が含まれる。
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の物質/分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力のような因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には、予防的量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、ヒト以外の霊長類、及び動物園、スポーツ用、又は愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を指す。
「抗腫瘍性組成物」なる用語は、少なくとも一の活性治療的作用剤、例えば「抗癌剤」を含む、癌を治療する際に有効な組成物を指す。治療的作用剤(抗癌剤)の例には、制限するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害性作用剤、細胞障害性作用剤、放射線療法に用いられる作用剤、抗血管新生作用剤、アポトーシス作用剤、抗チュービュリン作用剤および癌を治療する他の作用剤、例えば、抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮の成長因子レセプター(EGFR)アンタゴニスト(例えばチロシンキナーゼインヒビター)、HER1/EGFRインヒビター(例えばエルロチニブ(TarcevaTM)、血小板由来成長因子インヒビター(例えばGleevecTM(メシル酸イマチニブ))、COX-2インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ErbB3、ErbB4、PDGFR−β、BlyS、APRIL、BCMA又はVEGFレセプター(一又は複数)の一つ以上と結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)、TRAIL/Apo2および他の生理活性的で有機化学的作用材などが含まれる。また、その組合せは本発明に含まれる。
本願明細書において用いられる「タグ付加エピトープ」なる用語は、「エピトープタグ」に融合した抗体変異体を指す。エピトープタグポリペプチドは、対する抗体が作られうるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが抗体変異体の活性を妨げないように十分に短い。また、対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、エピトープタグが特異的であることが好ましい。一般的に、適切なタグポリペプチドは、最低6のアミノ酸残基で、そして、通常約8−50のアミノ酸残基(好ましくは約9−30の残基)である。例えば、インフルエンザHAタグポリペプチド及びその抗体12CA5(Fieldら. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988));c-mycタグ及び8F9、3C7、6E10、G4、B7、及びその9E10抗体(Evanら., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985));及び、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインD(gD)タグおよびその抗体(Paborskyら., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990))を含む。ある種の実施態様では、エピトープタグは、ある「サルベージレセプター結合エピトープ」である。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び/又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及びLuの放射性同位体)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロランブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び/又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商品名))のようなアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類;ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類;アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類;アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン);デルタ−9−テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標);βラパチョーネ;ラパコール;コルヒチン;ベツリン酸;カンプトセシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び9−アミノカンプトテシンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む);ポドフィロトキシン;ポドフィリン酸(podophyllinic acid);テニポシド;クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;ドゥオカルマイシン(合成アナログ、KW-2189及びCB1-TM1を含む);エロイテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンギスタチン;クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas);抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ1I及びカリケアマイシンωI1(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照);ダイネマイシン(dynemicin)Aを含むダイネマイシン;エスペラマイシン;並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin);代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate);プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、6-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine);アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone);抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン(amsacrine);ベストラブシル(bestrabucil);ビサントレン(bisantrene);エダトラキセート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルシン(demecolcine);ジアジコン(diaziquone);エルフォルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム(elliptinium);エポチロン(epothilone);エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン(lonidamine);メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine);ミトグアゾン(mitoguazone);ミトキサントロン;モピダモール(mopidamol);ニトラクリン(nitracrine);ペントスタチン;フェナメット(phenamet);ピラルビシン;ロソキサントロン;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR);ラゾキサン(razoxane);リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム(spirogermanium);テニュアゾン酸(tenuazonic acid);トリアジコン(triaziquone);2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン類(特にT-2毒素、ベラクリン(verracurin)A、ロリジン(roridine)A及びアングイジン(anguidine));ウレタン;ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標));ダカーバジン;マンノムスチン(mannomustine);ミトブロニトール;ミトラクトール(mitolactol);ピポブロマン(pipobroman);ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);チオテパ;タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);クロランブシル;ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標));6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン;ビンブラスチン(VELBAN(登録商標));プラチナ;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトキサントロン;ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標));オキサリプラチン;ロイコボビン(leucovovin);ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標));ノバントロン(novantrone);エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;イバンドロナート(ibandronate);トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチロールニチン(DMFO);レチノイン酸のようなレチノイド;カペシタビン(capecitabine)(XELODA(登録商標);上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体:並びに上記のうち2以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるCHOP、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質(SERM)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、EVISTA(登録商標)ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON(登録商標)トレミフェン;抗プロゲステロン;エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD);卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、例えばLUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標)酢酸ロイプロリド等の黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin);その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド;並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば4(5)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)酢酸メゲストロール、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾールである。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、DIDROCAL(登録商標)エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA(登録商標)ゾレドロン酸/ゾレドロネート、FOSAMAX(登録商標)アレンドロネート、AREDIA(登録商標)パミドロン酸、SKELID(登録商標)チルドロン酸、又はACTONEL(登録商標)リセドロン酸、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体);アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばPKC-α、Raf、及びH-Ras、及び上皮成長因子レセプター(EGF-R);THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン;LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ1阻害剤;ABARELIX(登録商標)rmRH;ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、対象とする標的分子の活性に依存して成長する細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、S期で標的分子依存性細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(S期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばG1停止又はM期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼII阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またG1停止させるこれらの薬剤は、S期停止にも波及し、例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、及びアラ-Cである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(8S-シス)-10-[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-α-L-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-8-(ヒドロキシアセチル)-1-メトキシ-5,12-ナフタセンジオンである。
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な5-フルオロシトシン及び他の5-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
関節リウマチ(「RA」)の治療に、本発明の抗体を以下の薬剤のうちの一またはそれ以上と組み合わせて患者を治療する:DMARDS(疾患変更姓抗リウマチ薬(例として、メトトレキセート))、NSAIまたはNSAID(非ステロイド性抗炎症薬)、HUMIRATM(アダリムマブ(adalimumab);Abbott Laboratories)、ARAVA(登録商標)(レフノミド(leflunomide))、REMICADE(登録商標)(インフリキシマブ(infliximab);Centocor Inc., of Malvern, Pa)、ENBREL(エターナルセプト(etanercept);Immunex, WA)、COX-2阻害剤。一般にRAに用いられるDMARDは、ヒドロキシクロロクイン(hydroxycloroquine)、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、エターナルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Dペニシラミン、ゴールド(Gold)(経口)、ゴールド(筋注)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A免疫吸着である。アダリムマブ(adalimumab)はTNFαに結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブはTNFαに結合するキメラモノクローナル抗体である。エターナルセプトはヒトIgG1のFc領域に結合するヒト75kD(p75)腫瘍壊死因子受容体(TNFR)の細胞外リガンド結合部位からなる「免疫吸着」融合タンパク質である。RAの従来治療は、例として“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、RA患者を本発明のCD20抗体をメトトレキセート(MTX)と組み合わせて治療する。MTXの例示的用量は、約7.5−25mg/kg/wkである。MTXは経口および皮下的ににより投与される。
硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびクローン病の治療には、本発明の抗体を、例としてRemicadeR (インフリキシマブ; Centocor Inc., of Malvern, Paより)、ENBREL (エターナルセプト;Immunex, WA)と組み合わせて患者を治療する。
SLEの治療には、高用量副腎皮質ステロイドおよび/またはシクロスファミド(HDCC)を本発明の抗体と組み合わせて患者を治療することができる。
乾癬治療には、本発明の抗体を局所的治療、例として局所的ステロイド、アンスラリン、カルシポトリエン、およびタザロテン、またはメトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、PUVAおよびUVB治療と組み合わせて患者を治療する。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに続いてまたは同時にCD20結合抗体で治療する。
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「制御配列」なる表現は、特定の宿主生物で作用可能に連結したコード配列の発現のために必要なDNA配列を意味する。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及び、リボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド(例えば、起源抗体またはその可変ドメイン/CDR)の「変異体」または「突然変異体」、例えば融合タンパク質(ポリペプチド)または異種ポリペプチド(ファージに対して異種性)は、1)出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドのそれとは異なるアミノ酸配列を有し、また2)自然または人為の(人工)突然変異を通して出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドから導かれたポリペプチドである。そのような変異体は、例えば対象とするポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失、および/またはそれへの挿入、および/またはその置換を含む。例えば、変異体アミノ酸(起源抗体/抗原結合断片の対応する位置で見られるアミノ酸と比較して)を有する配列をコードする制限したコドンセットを含んでいるオリゴヌクレオチドを使って作製した本発明の融合ポリペプチドは、起源抗体及び/又は抗原結合断片及び/又はCDRと比較して変異体ポリペプチドとなる。このように、変異体CDRは、出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド配列に対する変異体配列(例えば、起源抗体及び/又は抗原結合断片及び/又はCDRのそれ)を含んでいるCDRを指す。この意味合いでは、変異体アミノ酸は出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド配列の対応する位置のアミノ酸(例えば、起源抗体及び/又は抗原結合断片及び/又はCDRのそれ)とは異なるアミノ酸を指す。最終的な変異体または突然変異体構築物に到達するには欠失、挿入および置換をいかように組み合わせてもよいが、最終的な構築物は所望の機能的特性を有するものとする。本明細書中に記載の実施例に中には、結合体配列は欠損や付加などの点突然変異を含む。アミノ酸変化はポリペプチドの翻訳後プロセス、例えばグリコシル化部位の数または位置を変えることもできる。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作製する方法は、本明細書で参照により取り込まれた米国特許第5,534,615号に記載されている。
「野生型」または「参照」配列、あるいは、「野生型」または「参照」タンパク質/ポリペプチド、例えばコートタンパク質または起源抗体のCDRまたは可変ドメインの配列は、突然変異の導入を通してそこから変異体ポリペプチドが導かれる参照配列かもしれない。一般的に、所与のタンパク質の「野生型」配列は、自然界で最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、その遺伝子の自然界で最も一般的に見られる配列である。突然変異は、自然過程を通してまたは人為的手段を通して「野生型」遺伝子(したがってそれがコードするタンパク質)に導入することができる。そのようなプロセスの産物は、原「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異体」または「突然変異体」形態である。
本明細書で使われるように、「複数」の物質、例えば本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、通常、その物質の2つ以上の種類の集合を指す。ある物質の2つ以上が特定の形質に関して互いと異なるならば、その物質には2種類以上が存在し、例としては特定のアミノ酸位置で見られる変異体アミノ酸がある。例えば、変異体CDRの配列以外、または特定の溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置の変異体アミノ酸以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の2つ以上のポリペプチドがあるならば、本発明のポリペプチドには複数個存在する。他の実施例では、変異体CDRをコードする配列以外、または特定の溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置の変異体アミノ酸をコードする配列以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の2つ以上のポリヌクレオチドがあるならば、本発明のポリヌクレオチドには複数個存在する。
本発明は、選択した抗原に対して高親和性を有する新規の標的抗原結合ポリペプチド、例として抗体または抗原結合断片を作製し、単離する方法を提供する。制限したコドンセットを用いて元となる抗体(起源抗体)の軽鎖可変ドメイン及び/又は重鎖可変ドメイン中の一以上の選択したアミノ酸位置を突然変異させる(多様化する)ことによって複数の異なる結合体ポリペプチドを調製して、少なくとも一のCDR配列に変異型アミノ酸を有する結合ポリペプチドのライブラリを作製するものであり、このときの変異型アミノ酸の数は最小にする(すなわち、19以下、15以下、10以下、8以下、6以下、4以下、又は2のみ、しかし一般的には少なくとも2)。このようなアミノ酸位置は溶媒と接触しうる位置であり、それは例えば起源抗体の構造を分析することで決定され、かつ/または公知のかつ/または天然に生じる免疫グロブリンポリペプチドの中で高い多様性を有する位置である。さらに本発明の多様化の限定的性質によって、非常に多様化した及び/又は溶媒と接触しうるアミノ酸位置以外の付加的なアミノ酸位置も実施者の必要や希望に応じて多様化することができるという利便性が生じる;この実施態様の例を本明細書中に記載する。
ある実施態様では、溶媒と接触しうる非常に多様であるアミノ酸位置は、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、CDRH3およびその混合物からなる群から選択した抗体可変ドメインのCDR領域にある。限定した数のアミノ酸(各位置で共通して生じるアミノ酸に一般的に依存しないアミノ酸を選択する)をコードする制限コドンセットを用いてアミノ酸位置をそれぞれ突然変異させる。いくつかの実施形態では、CDR領域中の溶媒と接触しうる非常に多様な位置を突然変異させる場合は、2〜10、2〜8、2〜6、2〜4、及び/又はたった2つのアミノ酸をコードするコドンセットを選択する。いくつかの実施形態では、CDR領域中の溶媒と接触しうる非常に多様な位置を突然変異させる場合は、2〜19、2〜15、2〜10、3〜9、4〜8、及び/又は5〜7アミノ酸をコードするコドンセットを選択する。いくつかの実施形態では、少なくとも2,しかし19以下、15以下、10以下、8以下、6以下、4以下のアミノ酸をコードするコドンセットを選択する。例えばCDRH3に関しては、長さを変えることによってもCDR配列を多様化することができ、制限コドンセットを用いて、選択した位置の長さが異なる及び/又は選択した位置がランダム化している変異型CDRH3領域を生成することができる。
変異型CDRを含むポリペプチドのライブラリーの多様性は、限られた数のアミノ酸のみをコードするコドンセットを用いて設定するので、最小であるが十分に多様性のある配列を有するCDRとなる。CDR内の変異した位置の数は最小であり、各位置の変異型アミノ酸は限定した数のアミノ酸を包含するように設定してあり、公知の及び/又は天然に生じるCDR内の同じ位置に共通して生じると思われるアミノ酸とは無関係である。ある実施態様では、少なくとも一のCDRを含む単一抗体は起源抗体(ソース抗体、元となる抗体)として用いる。驚くべきことに、配列と大きさが多様な抗体可変ドメインのライブラリは単一の起源抗体を鋳型として用いて作製し、従来にはない限定した数のアミノ酸置換によって特定の位置に多様性を持たせることができる。
抗体可変ドメインの多様性の設定(デザイン)
本発明の一態様では、抗体可変ドメインの高品質のライブラリーが作製される。このライブラリーは、限定した多様性のあるCDR配列の異なる配列、例えば多様性のある抗体可変ドメインを有する。このライブラリーは一以上の抗原、例えばDR5及びヒトHER-2などに対して高い親和性を有する結合抗体可変ドメインを含む。このライブラリーの多様性は、単一の起源抗体内の溶媒と接触しうる非常に多様であるアミノ酸位置を選択し、制限コドンセットを使って少なくとも1つのCDR内のそれらの位置を突然変異させることによって設定する。制限コドンセットは、ある実施態様では、19、15、10、8、6、又は4アミノ酸をコードする、又は2アミノ酸のみをコードする。
本発明の一態様では、抗体可変ドメインの高品質のライブラリーが作製される。このライブラリーは、限定した多様性のあるCDR配列の異なる配列、例えば多様性のある抗体可変ドメインを有する。このライブラリーは一以上の抗原、例えばDR5及びヒトHER-2などに対して高い親和性を有する結合抗体可変ドメインを含む。このライブラリーの多様性は、単一の起源抗体内の溶媒と接触しうる非常に多様であるアミノ酸位置を選択し、制限コドンセットを使って少なくとも1つのCDR内のそれらの位置を突然変異させることによって設定する。制限コドンセットは、ある実施態様では、19、15、10、8、6、又は4アミノ酸をコードする、又は2アミノ酸のみをコードする。
起源抗体の一つはヒト化抗体4D5であるが、多様性の設計方法は配列が公知の他の起源抗体にも適用することができる。起源抗体は、天然抗体、合成抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、生殖細胞系派生抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体またはそれらの抗原結合断片でよい。抗体は、ヒト、マウスおよびラットを含む様々な種類の哺乳類から得ることができる。いくつかの実施形態では、起源抗体は最初の1回または複数回の親和性スクリーニングの後で、親和性成熟段階の前に得られる抗体である。細胞培養において高収率で安定した生産を可能にするために、起源抗体を選択または修飾することができる。
抗体4D5は、Her-2(erbB2)として知られている癌関連の抗原に特異的なヒト化抗体である。この抗体は、コンセンサスフレームワーク領域を有する可変領域を含む。ヒト化抗体の親和性を高める過程で、2、3の位置がマウス配列に戻されている。ヒト化抗体4D5の配列と結晶構造は、米国特許第6,054,297号、Carter他, PNAS 89:4285頁(1992)に記載され、結晶構造はJ.Mol.Biol.229:969頁(1993)およびインターネットサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?form=6&db=t&Dopt=s&uid=990、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?form=6&db=t&Dopt=s&uid=991、及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?form=6&db=t&Dopt=s&uid=992 で示されている。
抗体可変ドメインで多様性を生み出す基準は、溶媒と接触しうる(上で定義される)位置で残基に突然変異を起こさせることである。これらの位置は一般的にはCDRで、またタンパク質の外側に見られる。ある実施態様では、溶媒と接触しうる位置は、InsightIIプログラム(Accelrys, San Diego, CA)のようなコンピュータプログラムを用いて、抗体の3次元モデルからの座標を使って決定される。溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム(例えば、LeeおよびRichards, J.Mol.Biol.55, 379(1971)、および、Connolly, J.Appl.Cryst.16, 548(1983))を使用しても決定することができる。溶媒と接触しうる位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。このような目的のために利用できるソフトウェアには、SYBYL生体高分子モジュールソフトウェア(Tripos Associates)が含まれる。一般に、ある実施態様では、アルゴリズム(プログラム)がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約1.4オングストローム以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒露出領域およびエリア決定法が、Pacios, (1994)「ARVOMOL/CONTOUR:molecular surface areas and volumes on Personal Computers」Comput.Chem.18(4):377-386頁;および同、「Variations of Surface Areas and Volumes in Distinct Molecular Surfaces of Biomolecules」J.Mol.Model.(1995), 1:46-53頁に記載されている。
いくつかの場合には、溶媒と接触しうる残基の選択は、協同で最小限の連続するパッチを形成する溶媒と接触しうる残基を選ぶことによってさらに洗練され、例えば参照ポリペプチドまたは起源抗体がその三次元折畳み構造の場合がそうである。例えば、図2で示すように、コンパクト(最小)な連続したパッチは、ヒト化4D5のCDRH1/H2/H3/L1/L2/L3に対して選択された残基によって形成される。コンパクト(最小)な連続したパッチは、CDRの全域の1つのサブセット(例えば2〜5個のCDR)、例えばCDRH1/H2/H3/L3だけを含むことができる。そのようなパッチの形成に貢献しない溶媒と接触しうる残基は、任意選択に多様化から排除してもよい。この基準による選択の洗練化により、実務者は、希望により多様化する残基数を最小化することができる。例えば、H1の残基28はパッチの端にあるので、多様化において任意選択で排除することができる。しかし、この選択基準は、希望により、必ずしも溶媒に露出しているとは考えられない多様化のための残基を選ぶためにも用いることができる。例えば、溶媒に露出していると考えられなくても、溶媒に露出していると考えられる他の残基と共に三次元折畳み構造で連続するパッチを形成する残基は、多様化の対象に選んでもよい。この例はCDRL1−29である。そのような残基の選択は当業者には明らかとなるもので、その適切さも経験的に、また熟練実務者のニーズと希望に応じて決定することができる。
ヒト化抗体4D5の結晶構造から特定された、各CDRの溶媒と接触しうる位置は次の通りである(残基の位置はカバットに従う):
CDRL1:28、30、31、32
CDRL2:50、53
CDRL3:91、92、93、94、96
CDRH1:28、30、31、32、33
CDRH2:50、52、52A、53、54、55、56、57、58。
CDRL1:28、30、31、32
CDRL2:50、53
CDRL3:91、92、93、94、96
CDRH1:28、30、31、32、33
CDRH2:50、52、52A、53、54、55、56、57、58。
さらにまた、ある実施態様ではCDRL1の残基29は、他の溶媒と接触しうる残基を含んでいる連続するパッチに含まれているかどうかに基づいて選択してよい。前述の溶媒と接触しうる位置のすべて又はサブセットは本発明の方法及び組成物で多様化してもよい。例えば、ある実施態様では、CDRH2内の位置50、52、52a、53−56、及び58のみが多様化される。
突然変異させる位置を選択するための他の基準は、公知のかつ/または天然抗体の配列と比較したときにアミノ酸配列に変異を示す位置である。非常に多様な位置は、公知のかつ/または天然抗体/抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつかの異なるアミノ酸を持つ軽鎖または重鎖可変領域上のアミノ酸位置を指す。非常に多様な位置は好ましくはCDR領域にある。CDRH3の位置はすべて非常に多様であると考えられている。ある実施態様では、アミノ酸がその位置で好ましくは約2から約19個(本明細書に記載されているようにこの数字には幅があるが)の可能な異なるアミノ酸残基変異を有する場合は、そのアミノ酸残基は非常に多様と言える。
一態様では、公知のかつ/または天然抗体の非常に多様な位置を同定する際には、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)が提供しているデータが有効である。インターネット上のデータベース(http://www.bioinf.org.uk/abs/structures.html)は収集された多数のヒト軽鎖(http://www.bioinf.org.uk/abs/lc.align)および重鎖(http://www.bioinf.org.uk/abs/hc.align)の配列とその配置を提供し、これらの配列の非常に多様な位置の決定に役立つ。公知のかつ/または天然の軽鎖および重鎖のヒト化抗体4D5の溶媒露出位置における多様性を、図3および4に示す。
本発明の一態様では、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2およびその混合物からなる群から選ばれた少なくとも1つのCDRの非常に多様化した溶媒と接触しうる残基を突然変異させる(すなわち、本明細書で記載されている制限コドンセットを用いてランダム化する)。例えば、制限コドンを用いて、CDRL3およびCDRH3の溶媒と接触しうるかつ/または非常に多様な少なくとも一の残基を多様化させることによってポリペプチド母集団を作製してもよい。したがって、本発明は起源抗体の可変ドメインの少なくとも一のCDRの溶媒と接触しうる非常に多様化した少なくとも一の位置を制限コドンによってコードされる変異型アミノ酸で置換することによって形成する大きな数の新規の抗体配列を提供する。例えば、変異型CDR又は抗体可変ドメインは、CDRH1の位置28、30、31、32、33及び/又は34のうちの一以上のアミノ酸位置;及び/又はCDRH2の位置50、52、52a、53、54、55、56及び/又は58のうちの一以上のアミノ酸位置;CDRL1の位置28、29、30及び/又は31のうちの一以上のアミノ酸位置;CDRL2の位置50及び/又は53のうちの一以上のアミノ酸位置;及び/又はCDRL3の位置91、92、93、94及び/又は96のうちの一以上のアミノ酸位置に変異型アミノ酸を含みうる。他の例では、変異型CDR又は抗体可変ドメインは、CDRH1のアミノ酸位置28、30、31、32及び/又は33の一以上;及び/又はCDRH2のアミノ酸位置50、52、53、54、56及び/又は58の一以上;及び/又はCDRH3のアミノ酸位置95−100、100a、100b及び100cの一以上;及び/又はCDRL1のアミノ酸位置28、29、30及び/又は31の一以上;及び/又はCDRL2のアミノ酸位置50及び/又は53の一以上;及び/又はCDRL3のアミノ酸位置91、92、93、94及び/又は96の一以上に変異型アミノ酸を含みうる。これらの位置の変異型アミノ酸は、本明細書中に記載のように制限コドンセットによってコードされる。
上で示したように、変異体アミノ酸は制限コドンセットによってコードされる。コドンセットとは、所望のアミノ酸群をコードするのに用いられる一組のオリゴヌクレオチドを形成するのに用いることができる一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成機(Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能)を使って合成することができ、または市販品を入手することができる(例えば、Life Technologies, Rockville, MDから)。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
一態様では、ヒト化抗体4D5のCDR内の溶媒と接触しうる非常に多様化した位置の一以上を占めるように意図したアミノ酸の制限したレパートリーを決定する(実施者の希望に基づいて、希望する特定の位置の特定のアミノ酸、特定の位置が欠損するような特定のアミノ酸、希望するライブラリの大きさ、分類する抗原結合体の特徴などを含めた任意の数の基準に基づいてよい)。
公知の抗体の重鎖CDR3(CDRH3)は多様な配列、高次構造および長さを持つ。CDRH3は抗原結合ポケットの中央でしばしば見られ、抗原接触にしばしば関与する。このようにCDRH3の設定は好ましくは他のCDRのそれとは別に構築されるが、それはCDRH3の高次構造を予測することが難しく、またこの領域のアミノ酸の多様性は公知の抗体で特に多様なためである。本発明に従って、CDRH3はCDRH3内の特定の位置(例えば位置95、96、97、98、99、100a、100b及び100c(例として抗体4D5内のカバット番号付けに従う))で多様化されるように設定される。ある実施態様では、制限コドンセットを用いてCDRH3の長さを変えることによっても多様化する。長さの多様性は、抗原結合タンパク質を十分な割合で含むポリペプチドの母集団を作製するのに適するように経験的に範囲を決定することができる。例えば、配列:X1−X2−X3−X4−X5−(X6)n−X7−X8−X9−D−Y(配列番号:4)、X1−X9は制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、nは様々な長さ、例えばn=1〜11、5〜11、又は7〜11である配列を有する変異型CDRH3を含むポリペプチドを生成することができる。nの値としてあり得る他の例は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11である。CDRH3配列の長さを変えるために有用であり得るオリゴヌクレオチドの例示的実施態様は、図9A−9D、図20A−L及び図23に示すものを含む。
特定のCDR、例えばCDRH3内の変異体アミノ酸の導入によってつくられるライブラリーの配列多様性は、抗体の他の領域、特に軽鎖または重鎖何れかの可変配列の他のCDR内に変異を含む他のCDRを変異型CDRと組み合わせることによって高めることができると考える。このセットの構成メンバーをコードする核酸配列は、コドンセットを通して、軽鎖または重鎖の配列のCDRにおける他の変異体アミノ酸の導入によってさらに多様化することができると考える。このように、例えば、一実施形態では、対象抗原と結合する融合ポリペプチドからのCDRH3配列は、多様化されたCDRL3、CDRH1またはCDRH2配列、あるいは多様化されたCDRのいかなる組合せとも組み合わせることができる。
いくつかの例では、例えばコンセンサス配列を反映させるため、または安定性を向上させるため、または提示するために、フレームワーク残基を起源抗体または抗原結合断片の配列に対して変化させることができる点に留意する必要がある。例えば、重鎖のフレームワーク残基49、93、94または71は変化させることができる。重鎖フレームワーク残基93は、セリンまたはアラニン(その位置のヒトコンセンサス配列アミノ酸)でもよい。重鎖フレームワーク残基94は、フレームワークコンセンサス配列を反映するためにトレオニンからアルギニンまたはリジンに変更してもよい。変えることができるフレームワーク残基の他の例は重鎖フレームワーク残基71であり、カバットデータベースで見られるようにそれは約1970のポリペプチドではR、約627のポリペプチドではV、約527のポリペプチドではAである。重鎖のフレームワーク残基49は、アラニンまたはグリシンでよい。さらに、任意選択に、H鎖可変ドメインの3つのN末端アミノ酸は取り除くことができる。軽鎖では、任意選択に、アミノ酸位置66のアルギニンはグリシンに変更することができる。ある実施態様では、重鎖フレームワーク残基93はアラニンであり、重鎖フレームワーク残基94はアルギニンである。
一態様では、本発明は潜在的なリガンドに顕著な親和性で結合する融合ポリペプチドを生成するためのベクター構築物を提供する。これらの構築物は、融合ポリペプチドに存在するとき重鎖が二量体化してFabまたはFab’の抗体断片/部分の二量体を形成する傾向を強める二量体化可能なドメインを含む。これらの二量体化ドメインは、例えば、重鎖ヒンジ配列(例えば、融合ポリペプチドに存在しうるTCPPCPAPELLG(配列番号:5)を含む配列)を含んでよい。融合ファージポリペプチドの二量体化ドメインは2組の融合ポリペプチド(LC/HC−ファージタンパク質/断片(例えばpIII))で構成され、こうして2組の融合ポリペプチド間で適当な結合(例えば重鎖間ジスルフィド架橋)の形成を可能にする。そのような二量体化ドメインを含んでいるベクター構築物を用いて、ファージ上で抗体可変ドメイン、例えば、本明細書で記載される多様化された融合タンパク質の二価提示を達成することができる。ある実施態様では、各単量体抗体断片(融合ポリペプチド)の内在性親和性は、二量体化ドメインとの融合によって著しく変更されることはない。ある実施態様では、二量体化は、著しく低下した解離速度でファージ結合のアビディティーを高める二価ファージディスプレイをもたらし、このことは当技術分野で公知の方法により、また本明細書で記載されているように測定することができる。本発明の二量体化ドメイン含有ベクターは、二量体化ドメインの後ろにアンバー終止コドンを含んでもよいし含まなくてもよい。
異なる提示特性を達成するために二量体化を変更することができる。二量体化ドメインは、システイン残基、完全長抗体からのヒンジ領域、ロイシンジッパー配列もしくはGCN4ジッパー配列のような二量体化配列またはその混合物を含んでいる配列を含むことができる。二量体化配列は当技術分野で公知であり、例えば、GCN4ジッパー配列(GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG)(配列番号3)などが含まれる。ある実施態様では、この二量体化ドメインは、重鎖可変ドメインまたは定常ドメインの配列のC末端、および/あるいは重鎖可変ドメインまたは定常ドメインの配列とウイルスコートタンパク質成分の配列との間に位置する。アンバー終止コドンも、二量体化ドメインのC末端またはその後に存在してもよい。アンバー終止コドンが存在する一実施形態では、二量体化ドメインは少なくとも1つのシステインおよびロイシンジッパーなどの二量体化配列をコードする。アンバー終止コドンが存在しない他の実施形態では、二量体化ドメインは単一のシステイン残基を含むかもしれない。
本発明のポリペプチドは、変異体ポリペプチドの提示のために、または前記ポリペプチドの精製、スクリーニングもしくは選別および検出のために他の種類のポリペプチドと融合することもできる。ファージディスプレイを含む実施形態に関しては、本発明のポリペプチドはウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合される。ウイルスコートタンパク質の例としては、タンパク質PIII、主コートタンパク質、pVIII、Soc、Hoc、gpD、pVIおよびその変異体が含まれる。さらに、本発明の方法によって生成される変異体ポリペプチドは、ポリペプチドマーカーまたはタグ、例えばFLAG、ポリヒスチジン、gD、c−myc、β−ガラクトシダーゼなどと任意選択に融合することができる。
ランダム化可変ドメインライブラリー作製法
鋳型核酸に選択されたアミノ酸を置換する方法は当技術分野で確立されており、その幾つかは本明細書で記載されている。例えば、キュンケル方法を使用し、少なくとも1つのCDR領域の溶媒に露出しかつ/または非常に多様な位置を対象に変異体アミノ酸でアミノ酸を置換することによってライブラリーを作製することができる。例えば、Kunkel他, Methods Enzymol.(1987), 154:367-382頁を参照。ランダム化された配列の生成は、下の実施例でも後述する。
鋳型核酸に選択されたアミノ酸を置換する方法は当技術分野で確立されており、その幾つかは本明細書で記載されている。例えば、キュンケル方法を使用し、少なくとも1つのCDR領域の溶媒に露出しかつ/または非常に多様な位置を対象に変異体アミノ酸でアミノ酸を置換することによってライブラリーを作製することができる。例えば、Kunkel他, Methods Enzymol.(1987), 154:367-382頁を参照。ランダム化された配列の生成は、下の実施例でも後述する。
オリゴヌクレオチド配列は、異なる長さのCDRH3のためにまたはCDRの溶媒に露出し非常に多様な位置のために設定された制限コドンセットの1つまたは複数を含む。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。コドンセットは、IUBコードによって下で示すように、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を示すために符号を使って表される。コドンセットは、一般的に3つの大文字、例えばKMT、TMTなどで表される。
IUBコード
G グアニン
A アデニン
T チミン
C シトシン
R(AまたはG)
Y(CまたはT)
M(AまたはC)
K(GまたはT)
S(CまたはG)
W(AまたはT)
H(AまたはCまたはT)
B(CまたはGまたはT)
V(AまたはCまたはG)
D(AまたはGまたはT)
N(AまたはCまたはGまたはT)
G グアニン
A アデニン
T チミン
C シトシン
R(AまたはG)
Y(CまたはT)
M(AまたはC)
K(GまたはT)
S(CまたはG)
W(AまたはT)
H(AまたはCまたはT)
B(CまたはGまたはT)
V(AまたはCまたはG)
D(AまたはGまたはT)
N(AまたはCまたはGまたはT)
例えば、コドンセットTMTでは、Tはヌクレオチドチミンであり、MはAまたはCでありうる。このコドンセットは複数のコドンが存在し、限定した数のアミノ酸のみ、すなわちチロシン及びセリンをコードしうる。
オリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットは、標準の方法を使って合成できる。一組のオリゴヌクレオチドは、例えば、制限コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを代表し、所望の制限されたアミノ酸群をコードする配列を含む固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー(Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能)を使って合成することができ、または市販品を入手することができる(例えば、Life Technologies, Rockville, MDから)。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメインCDR(例えば可変ドメイン内に含まれるもの)の核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
1つの方法では、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、4D5の抗体可変ドメインなどのソースまたは鋳型ポリペプチドをコードしている核酸配列のオリゴヌクレオチドを媒介した突然変異生成によって作製することができる。この手法はZoller他, Nucleic Acids Res.10:6487-6504頁(1987)が記載しているように、当技術分野で公知である。つまり、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は所望の制限コドンセットをコードしているオリゴヌクレオチドセットをDNA鋳型とハイブリダイズすることによって作製され、前記鋳型は可変部核酸鋳型配列を含むプラスミドの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、DNAポリメラーゼを用いて鋳型の二次相補鎖すべてを合成し、この相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、前記オリゴヌクレオチドセットによって提供される制限コドンセットを含むようになる。他のソースまたは鋳型分子をコードしている核酸は公知であるか、または容易に決定することができる。
通常、長さが少なくとも25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使われる。最適オリゴヌクレオチドは、突然変異体をコードするヌクレオチドの両側が鋳型と完全に相補性である少なくとも12から15個のヌクレオチドを持つ。これにより、オリゴヌクレオチドが正しく一本鎖DNA鋳型分子にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の手法、例えばCrea他, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA, 75:5765頁(1978)に記載の手法を使って容易に合成される。
DNA鋳型はバクテリオファージM13ベクター(市販のM13mp18およびM13mp19ベクターが適当)に由来するベクター、またはViera他, Meth.Enzymol.153:3頁(1987)に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきDNAは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの1つに挿入することができる。一本鎖鋳型の生産は、前記Sambrook他のセクション4.21〜4.41で記載されている。
未変性のDNA配列を変えるために、オリゴヌクレオチドが適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型にハイブリダイズされる。DNA重合酵素、通常、T7DNAポリメラーゼまたはDNAポリメラーゼIのクレノー断片を次に加え、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使って鋳型の相補鎖を合成する。こうしてDNAの1つの鎖は遺伝子1の突然変異した形態をコードし、他の鎖(元の鋳型)は遺伝子1の未変性、未変更の配列をコードするようにヘテロ二本鎖分子が形成される。このヘテロ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞、通常大腸菌JM101のような原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後にアガロースプレートの上へプレートし、突然変異したDNAを含む細菌コロニーを同定するために32リン酸塩で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使ってスクリーニングする。
この上で記載されている方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含むホモ二本鎖分子が作製されるように修正することができる。この修正は以下の通りである。一本鎖オリゴヌクレオチドを先に述べたように一本鎖鋳型にアニールする。3つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン(dATP)、デオキシリボグアノシン(dGTP)およびデオキシリボチミジン(dTT)の混合物を、dCTP−(aS)と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン(Amershamから入手できる)と合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。DNAポリメラーゼをこの混合物へ追加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一のDNA鎖が生成する。さらに、この新しいDNA鎖はdCTPの代わりにdCTP−(aS)を含み、これはDNA鎖を制限酵素による消化作用から保護するのに役立つ。二本鎖ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、突然変異を起こさせる部位を含む領域の後方で鋳型鎖はExoIIIヌクレアーゼまたは適当な他のヌクレアーゼで消化することができる。反応を終了すると、部分的にだけ一本鎖の分子が残る。次に、完全な二本鎖DNAホモ二本鎖が、4つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のすべて、ATPおよびDNAリガーゼの存在下でDNAポリメラーゼを使って形成される。このホモ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞に形質転換することができる。
前に示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位を含むこともできる。DNA鋳型はバクテリオファージM13ベクターに由来するベクター、またはViera他((1987), Meth.Enzymol.153:3頁)に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきDNAは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの1つに挿入する必要がある。一本鎖鋳型の生産は、前記Sambrook他のセクション4.21〜4.41で記載されている。
他の方法によると、ライブラリーは上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによって生成することができ、各セットは、オリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコドンセットによって確立された異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを持つ。上流および下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、PCR産物の「ライブラリー」を作製するためにPCR法で使うことができる。PCR産物は確立された分子生物学的手法を使って他の関連した、または無関係な核酸配列、例えばウイルスのコートタンパク質構成成分および二量体化ドメインと融合することができるので、「核酸カセット」と呼ぶこともある。
PCRプライマー配列は、CDR領域の溶媒に露出し非常に多様な位置のために設計されたコドンセットの1つまたは複数を含む。前記したように、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。
オリゴヌクレオチドセットは、核酸カセットを作製するための鋳型として可変部核酸鋳型配列を使ってPCR法で使うことができる。可変部核酸鋳型配列は、対象核酸配列(すなわち、置換の対象となるアミノ酸をコードしている核酸配列)を含む免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のいかなる部分でもよい。可変部核酸鋳型配列は、第1の核酸鎖および相補性の第2の核酸鎖を有する二本鎖DNA分子の一部である。可変部核酸鋳型配列は、少なくとも可変ドメインの一部を含み、また少なくとも1つのCDRを持つ。場合によっては、可変部核酸鋳型配列は複数のCDRを含む。可変部核酸鋳型配列の上流部および下流部は、上流域のオリゴヌクレオチドセットおよび下流域のオリゴヌクレオチドセットの構成メンバーによるハイブリダイゼーションの対象とすることができる。
上流のプライマーセットの第1のオリゴヌクレオチドは第1の核酸鎖にハイブリダイズすることができ、下流のプライマーセットの第2のオリゴヌクレオチドは第2の核酸鎖にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは1つまたは複数のコドンセットを含むことができ、可変部核酸鋳型配列の一部にハイブリダイズするように設計することができる。これらのオリゴヌクレオチドの使用により、PCR後に2つ以上のコドンセットをPCR産物(すなわち核酸カセット)に導入することができる。抗体可変ドメインをコードしている核酸配列の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸置換の対象となるCDR残基をコードする部分を含む。
上流域および下流域のオリゴヌクレオチドセットは、オリゴヌクレオチド配列内に制限部位を含むように合成することもできる。これらの制限部位は、さらなる抗体配列を有している発現ベクターへの核酸カセット(すなわちPCR反応生成物)の挿入を容易にする。ある実施態様では、制限部位は外来の核酸配列を導入することなく、または元のCDRまたはフレームワーク核酸配列を取り除くことなく核酸カセットのクローニングを容易にするようになっている。
核酸カセットは、作製した対象アミノ酸置換を含む軽鎖または重鎖の配列の一部またはすべての発現のために、いかなる適当なベクターにもクローニングすることができる。本発明で詳述される方法によると、核酸カセットはウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した軽鎖または重鎖配列の一部またはすべて(すなわち、融合タンパク質を形成)の生産を可能にしているベクターにクローニングされるか、あるいは、粒子または細胞の表面で提示される。数種類のベクターが入手でき、それらは本発明の実施に用いることができるが、ファジミドベクターが本明細書での使用には好ましいベクターであり、その訳はそれらが相対的に容易に構築し、また容易に増幅することができるからである。当業者に公知のように、ファジミドベクターは、通常、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位および他の必要な構成成分を含む様々な構成成分を含む。
特定の変異体アミノ酸の組合せが発現される他の実施形態では、核酸カセットは、重鎖または軽鎖の可変ドメインのすべてまたは一部をコードすることができ、また変異体アミノ酸の組合せをコードすることができる配列を含む。ライブラリーの場合のようにこれらの変異体アミノ酸または変異体アミノ酸の組合せを含んでいる抗体の作製のために、核酸カセットは、さらなる抗体配列、例えば軽鎖および重鎖可変部の可変または定常ドメインのすべてまたは一部を含んでいる発現ベクターに挿入することができる。これらのさらなる抗体配列は他の核酸配列、例えばウイルスコートタンパク質構成成分をコードしている配列と融合することができ、したがって融合タンパク質の生産を可能にする。
ベクター
本発明の1つの態様は遺伝子融合をコードしている核酸配列を含んでいる複製可能な発現ベクターを含み、前記遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した、1つのCDR含有ポリペプチド(抗体可変ドメインなど)、または1つの抗体可変ドメインと1つの定常ドメインを含む融合タンパク質をコードする。先に述べたように多様な配列で生成された複数の融合ポリペプチドを含む複数の異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合を含む、多様で複製可能な発現ベクターのライブラリーも含まれる。ベクターは様々な構成成分を含んでいてもよく、好ましくは異なるベクターの間で抗体可変ドメインが移動できるように、かつ/または異なるフォーマットで融合タンパク質が提示されるように構築される。
本発明の1つの態様は遺伝子融合をコードしている核酸配列を含んでいる複製可能な発現ベクターを含み、前記遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した、1つのCDR含有ポリペプチド(抗体可変ドメインなど)、または1つの抗体可変ドメインと1つの定常ドメインを含む融合タンパク質をコードする。先に述べたように多様な配列で生成された複数の融合ポリペプチドを含む複数の異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合を含む、多様で複製可能な発現ベクターのライブラリーも含まれる。ベクターは様々な構成成分を含んでいてもよく、好ましくは異なるベクターの間で抗体可変ドメインが移動できるように、かつ/または異なるフォーマットで融合タンパク質が提示されるように構築される。
ベクターの例としてはファージベクター及びファジミドベクター(ここでは広範囲に例示されるものであり、上記により詳細に記載される)が含まれる。ファージベクターは一般的に、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは一般に繊維状バクテリオファージ、例えばM13、f1、fd、Pf3ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、21、phi80、phi81、82、424、434、その他、もしくはその誘導体である。
ウイルスコートタンパク質の例には、感染性タンパク質PIII(ときにp3とも称される)、主要コートタンパク質PVIII、Soc(T4)、Hoc(T4)、gpD(バクテリオファージλ)、マイナーバクテリオファージコートタンパク質6(pVI)(繊維状ファージ;J Immunol Methods.1999年12月10日;231(1-2):39-51頁)、M13バクテリオファージ主コートタンパク質変異体(P8)(Protein Sci 2000年4月;9(4):647-54頁)が含まれる。融合タンパク質はファージの表面で提示されるが、適当なファージ系にはM13KO7ヘルパーファージ、M13R408、M13−VCSおよびPhi X 174、pJuFoファージ系(J Virol.2001年8月;75(15):7107-13頁.v)、ハイパーファージ(Nat Biotechnol.2001年1月;19(1):75-8頁)が含まれる。ある実施態様では、ヘルパーファージはM13KO7であり、コートタンパク質はM13ファージ遺伝子IIIコートタンパク質である。ある実施態様では、宿主は大腸菌、および大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。ベクター、例えばfth1ベクター(Nucleic Acids Res.2001年5月15日;29(10):E50-0)は、融合タンパク質の発現に役立つことがある。
発現ベクターは、CDR含有融合ポリペプチド(例えば抗体の各サブユニットまたはその断片)をコードしているDNAと融合した分泌シグナル配列も持つことができる。この配列は典型的には融合タンパク質をコードしている遺伝子の直ぐ5’側に位置し、したがって融合タンパク質のアミノ末端で転写される。しかし、あるケースでは、シグナル配列は分泌されるべきタンパク質をコードしている遺伝子の5’以外の位置にあることが証明された。この配列は、それが細菌細胞の内膜を横切って結合するタンパク質を対象とする。シグナル配列をコードしているDNAは、シグナル配列を持つタンパク質をコードしている遺伝子のいずれかから、制限エンドヌクレアーゼ断片として得られる。原核生物の適当なシグナル配列は、例えば、LamBまたはOmpF(Wong他, Gene,68:1931頁(1983))、MalE、PhoAをコードしている遺伝子および他の遺伝子から得られるかもしれない。一実施態様では、本発明の実施のための好ましい原核生物シグナル配列は、Chang他,Gene 55:189頁(1987)、に記載されている大腸菌耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列及び/又はmalEである。
上述のように、ベクターは、一般的に、融合ポリペプチドの発現を促進するためにプロモーターを含む。原核生物ベクターで最も一般的に使われるプロモーターには、lac Zプロモーター系、アルカリホスファターゼpho Aプロモーター(Ap)、バクテリオファージlPLプロモーター(温度感受性プロモーター)、tacプロモーター(lacリプレッサーによって制御されるハイブリッドtrp−lacプロモーター)、トリプトファンプロモーターおよびバクテリオファージT7プロモーターが含まれる。プロモーターの総説に関しては、前出Sambrook他のセクション17を参照。これらが最も一般的に使用されるプロモーターであるが、他の適当なプロモーターも同様に使うことができる。
ベクターは、また、他の核酸配列、例えば、gDタグ、c−Mycエピトープ、ポリ−ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質(例えば、GFP)またはファージまたは細胞の表面で発現する融合タンパク質の検出または精製に役立つβ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードしている配列を含むことができる。例えばgDタグをコードしている核酸配列は、また、融合タンパク質を発現する細胞またはウイルスの正または負の選択を可能にする。いくつかの実施形態では、gDタグはウイルスコートタンパク質構成成分に融合していない抗体可変ドメインと融合する。例えば、ポリヒスチジン標識をコードしている核酸配列は、免疫組織化学手法を使って特異的抗原と結合する抗体可変ドメインを含む融合タンパク質を同定するために役立つ。抗原結合の検出に役立つタグは、ウイルスコートタンパク質構成成分に融合していない抗体可変ドメイン、またはウイルスコートタンパク質構成成分に融合した抗体可変ドメインに融合することができる。
本発明を実践するのに用いられるベクターの他の有用構成成分は、表現型選択遺伝子である。典型的表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードしている遺伝子である。実例として、アンピシリン耐性遺伝子(ampr)およびテトラサイクリン耐性遺伝子(tetr)はこの目的のために容易に使用される。
ベクターは、独特の制限部位および抑制性終止コドンを含んでいる核酸配列も含むことができる。独特の制限部位は異なるベクターおよび発現系の間で抗体可変ドメインを移動させるために役立ち、特に細胞培養による完全長抗体または抗原結合断片の生産に役立つ。抑制性終止コドンは融合タンパク質の発現レベルを調節するのに役立ち、可溶性抗体断片の精製を容易にする。例えば、アンバー終止コドンはファージディスプレイを可能にするsupE宿主ではGlnと解釈することができるが、非supE宿主ではそれはファージコートタンパク質と融合していない可溶性抗体断片を産生する終止コドンと解釈される。これらの合成配列は、ベクター内の1つまたは複数の抗体可変ドメインと融合させることができる。
対象とする抗体配列、例えば変異体アミノ酸を有するCDRをコードしている核酸がベクター系から容易に取り出されて他のベクター系に入れられるようにするベクター系を使うことがときに有用である。例えば、変異体アミノ酸を有する抗体または抗体可変ドメインをコードしている核酸配列の取り出しを容易にするために、適当な制限部位をベクター系に組み込むことができる。制限配列は、通常、効率的な切出しおよび新しいベクターへのライゲーションを容易にするために、ベクター内でユニークなものが選ばれる。抗体または抗体可変ドメインは、その後外来の融合配列、例えばウイルスコートタンパク質または他の配列タグなしでベクターから発現され得る。
抗体可変ドメインまたは定常ドメインをコードしている核酸(遺伝子1)とウイルスのコートタンパク質構成成分(遺伝子2)との間に、終結または終止コドンをコードしているDNAを挿入することができ、そのような終結コドンにはUAG(アンバー)、UAA(オーカー)およびUGA(オペル)が含まれる。(Microbiology, Davis他, Harper & Row, New York, 1980年, 237頁, 245-47頁および374頁)。野生型宿主細胞で発現する終結または終止コドンは、遺伝子2タンパク質が結合しない遺伝子1タンパク質産物の合成をもたらす。しかし、抑制宿主細胞での増殖は検出可能な量の融合タンパク質の合成をもたらす。そのような抑制宿主細胞は公知であり、大腸菌抑制遺伝子株(Bullock他, Bio Techniques 5:376-379頁(1987))などが記載されている。そのような終結コドンを融合ポリペプチドをコードしているmRNAに入れるために、許容できるいかなる方法でも用いることができる。
抑制性コドンは、抗体可変または定常ドメインをコードしている第1の遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第2の遺伝子との間に挿入することができる。あるいは、抑制性終結コドンは、抗体可変ドメインの最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質の最初のアミノ酸を置換することによって融合部位に隣接して挿入することができる。抑制性終結コドンは、二量体化ドメインのC末端またはその後に位置してもよい。抑制性コドンを含んでいるプラスミドがサプレッサー宿主細胞で増殖された場合、ポリペプチドおよびコートタンパク質を含んでいる融合ポリペプチドの検出可能な量が生産される。プラスミドが非サプレッサー宿主細胞で増殖された場合、抗体可変ドメインは挿入された抑制性トリプレットUAG、UAAまたはUGAにおける終結のために、実質的にファージコートタンパク質と融合せずに合成される。非サプレッサー細胞では、抗体可変ドメインはそれを宿主メンブランに固定する融合ファージコートタンパク質が存在しないために、合成された後に宿主細胞から分泌される。
いくつかの実施形態では、多様化される(ランダム化される)CDRは、鋳型配列(本明細書では「終止鋳型」と呼ぶ)に組み込まれた終止コドンを持つことができる。この特徴は、関心の変異体アミノ酸の配列を含むオリゴヌクレオチドの取り込みのために、鋳型配列における終止コドンの修復の成功に基づき、多様化が成功した配列の検出と選択を可能にする。この特徴は、下記の実施例でさらに例示される。
軽鎖および/または重鎖抗体可変または定常ドメインはさらなるペプチド配列に融合することもでき、このさらなるペプチド配列はウイルス粒子または細胞の表面での1つまたは複数の融合ポリペプチドの相互作用を可能にする。これらのペプチド配列は、本明細書では「二量体化ドメイン」と称す。二量体化ドメインは、少なくとも1つまたは複数の二量体化配列、またはシステイン残基を含んでいる配列を少なくとも1つ、あるいはこの両方共含むことができる。適当な二量体化配列には、疎水残基が一定の間隔をあけて存在し、各タンパク質の疎水残基の相互作用による二量体の形成を可能にする両親媒性のαヘリックスを有するタンパク質のそれらが含まれる。そのようなタンパク質およびタンパク質部分には、例えばロイシンジッパー領域が含まれる。二量体化ドメインは、また、1つまたは複数のシステイン残基を含むことができる(例えば、二量体化ドメイン内に抗体ヒンジ配列を含むことにより提供される)。システイン残基は、1つまたは複数のジスルフィド結合の形成による二量体化を可能にする。終止コドンが二量体化ドメインの後方に存在する一実施形態では、二量体化ドメインは少なくとも1つのシステイン残基を含む。ある実施態様では、二量体化ドメインは、抗体可変または定常ドメインとウイルスコートタンパク質構成成分との間に位置する。
場合によっては、ベクターは、例えばコートタンパク質に融合した重鎖および軽鎖可変部を含んでいる単鎖形態の単一の抗体ファージポリペプチドをコードする。これらのケースでは、ベクターは、ある種のプロモーターの制御下で1つの転写産物を発現する「一シストロン性」と考えられる。例えばベクターは、VLおよびVHドメインの間にリンカーペプチドを有し、VLおよびVHドメインをコードしている一シストロン性配列の発現を促進するためにプロモーター(例えばアルカリホスファターゼ(AP)またはTacプロモーター)を利用してもよい。このシストロン配列は、5’末端でシグナル配列(例えば大腸菌のmalEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列)に連結し、3’末端でウイルスコートタンパク質(例えばバクテリオファージpIIIタンパク質)のすべてまたは一部に連結する。本実施態様のベクターによってコードされる融合ポリペプチドは、本明細書では「ScFv−pIII」と称す。いくつかの実施形態では、ベクターは第2の可変ドメイン配列(例えばVH)とウイルスコートタンパク質配列との間のその3’末端に、二量体化ドメイン(例えばロイシンジッパー)をコードしている配列をさらに含むことができる。この二量体化ドメインを含んでいる融合ポリペプチドは、二量体化により2つのscFvポリペプチドの複合体(本明細書では「(ScFv)2−pIII」と称す)を形成することができる。
その他の場合、重鎖および軽鎖の可変部は別々のポリペプチドとして発現され、このようにベクターは「二シストロン性」であり、別々の転写産物の発現を可能にする。これらのベクターでは、適当なプロモーター、例えばPtacまたはPhoAプロモーターは二シストロン性メッセージの発現を促すために利用する。例えば軽鎖可変および定常ドメインをコードしている第1のシストロンは、5’末端でシグナル配列、例えば大腸菌のmalEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列に連結し、3’末端でタグ配列、例えばgDタグをコードしている核酸配列に連結している。例えば重鎖可変および定常ドメインCH1をコードしている第2のシストロンは、5’末端でシグナル配列、例として大腸菌のmalEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列に連結し、3’末端でウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に連結している。
二シストロン性メッセージ及びF(ab’)2−pIIIを表出するための好適なプロモーター、例えばPtacまたはPhoA(AP)プロモーターを提供するベクターの一実施態様では、5’末端でシグナル配列、例えば大腸菌malEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列と作用可能に連結し、3’末端でタグ配列、例えばgDタグをコードしている核酸配列と連結した軽鎖可変および定常ドメインをコードしている第1のシストロンの発現を促進する。第2のシストロンは、例えば5’末端でシグナル配列、例えば大腸菌のmalEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列と作用可能に連結した重鎖可変および定常ドメインをコードし、3’末端にはIgGヒンジ配列およびロイシンジッパー配列、さらにその後方に少なくとも一部のウイルスコートタンパク質を含む二量体化ドメインを持つ。
融合ポリペプチドの表出(提示、ディスプレイ)
CDR含有ポリペプチド(例として抗体可変ドメイン)の融合ポリペプチドは、細胞、ウイルスまたはファジミド粒子の表面で様々な形式で提示することができる。これらの形式には、単鎖Fv断片(scFv)、F(ab)断片およびこれらの断片の多価の形態が含まれる。例えば、多価の形態は、ScFv、FabまたはF(ab’)の二量体を含み、これらは本明細書では(ScFv)2、F(ab)2およびF(ab’)2とそれぞれ称す。多価の形態の提示は、それらが、通常低親和性クローンの同定をもたらし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にする複数の抗原結合部位を有することにおいて有益である。
CDR含有ポリペプチド(例として抗体可変ドメイン)の融合ポリペプチドは、細胞、ウイルスまたはファジミド粒子の表面で様々な形式で提示することができる。これらの形式には、単鎖Fv断片(scFv)、F(ab)断片およびこれらの断片の多価の形態が含まれる。例えば、多価の形態は、ScFv、FabまたはF(ab’)の二量体を含み、これらは本明細書では(ScFv)2、F(ab)2およびF(ab’)2とそれぞれ称す。多価の形態の提示は、それらが、通常低親和性クローンの同定をもたらし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にする複数の抗原結合部位を有することにおいて有益である。
バクテリオファージの表面で抗体断片を含んでいる融合ポリペプチドを提示する方法は当技術分野で公知であり、例えばWO92/01047号および本明細書で記載されている。他の公開特許公報WO92/20791号;WO93/06213号;WO93/11236号および国際出願第93/19172号は関連した方法を記載しており、参照によりすべて本明細書に組み込まれている。他の刊行物は、ファージ表面で提示された様々な抗原に対する、人工的に再配置されたV遺伝子レパートリーによる抗体の同定を示した(例えば、H.R.Hoogenboom & G.Winter J.Mol.Biol.227, 381-388頁, 1992年;またWO93/06213号およびWO93/11236号で開示されている)。
ベクターがscFv形式での提示のために構築される場合、このベクターは抗体可変軽鎖ドメインおよび抗体可変重鎖可変ドメインをコードしている核酸配列を含む。一般的には、抗体重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質構成成分に融合する。抗体可変ドメインの一方または両方は、少なくとも1つのCDR領域に変異体アミノ酸を持つことができる。抗体可変軽鎖をコードしている核酸配列は、ペプチドリンカーをコードしている核酸配列によって抗体可変重鎖ドメインに連結される。ペプチドリンカーは、一般的に約5から15個のアミノ酸を含む。任意選択に、例えば精製または検出に役立つ標識をコードしている他の配列を、抗体可変軽鎖もしくは抗体可変重鎖ドメインのいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の3’末端に融合することができる。
ベクターがF(ab)提示のために構築される場合、このベクターは抗体可変ドメインおよび抗体定常ドメインをコードしている核酸配列を含む。軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列に融合される。抗体重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、重鎖定常CH1ドメインをコードする核酸配列に融合される。一般的には、重鎖可変および定常ドメインをコードしている核酸配列は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部をコードしている核酸配列に融合される。抗体軽鎖または重鎖の可変ドメインの一方または両方は、少なくとも1つのCDR領域に変異体アミノ酸を持つことができる。ある実施態様では、重鎖可変および定常ドメインは好ましくはウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合体として発現され、軽鎖可変および定常ドメインは重鎖ウイルスコート融合タンパク質とは別々に発現される。重鎖および軽鎖は互いと結合し、その結合は共有結合でも非共有結合でもよい。任意選択に、例えば精製または検出に役立つポリペプチド標識をコードしている他の配列を、抗体軽鎖定常ドメインもしくは抗体重鎖定常ドメインのいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の3’末端に融合することができる。
ある実施態様では、好ましくは、二価の成分、例えばF(ab)2二量体またはF(ab’)2二量体が、粒子表面で変異体アミノ酸置換を有する抗体断片を提示するために使用される。F(ab’)2二量体は一般的に溶相抗原結合検定でF(ab)二量体と同じ親和性を持つことが分かっているが、F(ab’)2の解離速度は高アビディティーのため低下している。したがって、二価の形態(例えばF(ab’)2)は低親和性クローンの同定を可能にし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にするので、特に有用な形態である。
宿主細胞へのベクターの導入
本発明に従って記載されているように構築されたベクターは、増幅および/または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む標準の形質転換法を使って、宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイルスのような感染性の粒子であるならば、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。遺伝子融合をコードする複製可能な発現ベクターを含んでいる宿主細胞のトランスフェクションおよび標準手法によるファージ粒子の生産は、融合タンパク質がファージ粒子の表面で提示されるファージ粒子を提供する。
本発明に従って記載されているように構築されたベクターは、増幅および/または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む標準の形質転換法を使って、宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイルスのような感染性の粒子であるならば、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。遺伝子融合をコードする複製可能な発現ベクターを含んでいる宿主細胞のトランスフェクションおよび標準手法によるファージ粒子の生産は、融合タンパク質がファージ粒子の表面で提示されるファージ粒子を提供する。
複製可能な発現ベクターは、様々な方法を使用して宿主細胞に導入される。一実施形態では、ベクターはWO00/106717号で記載されているようにエレクトロポレーション法を使って細胞に導入することができる。細胞は標準の培養液中で任意に約6〜48時間(またはOD600=0.6〜0.8になるまで)、37℃で培養し、次にブロースを遠心分離して上清を取り出す(例えばデカンテーションにより)。ある実施態様では、初期の精製には、緩衝液(例えば1.0mMのHEPES pH7.4)の中に細胞ペレットを再懸濁し、次に再遠心分離を行い、上清を取り出すことが含まれる。得られた細胞ペレットを希釈したグリセリン(例えば5〜20%v/v)の中に再懸濁し、再度再遠心分離をして細胞ペレットを形成し、上清を取り除く。最終的な菌体濃度は、所望の濃度に細胞ペレットを水または希釈したグリセリンの中に再懸濁することによって得られる。
ある実施態様では、受容細胞は本発明のエレクトロポレーション応答能のある大腸菌株SS320である(Sidhu他, Methods Enzymol.(2000), 328:333-363頁)。大腸菌株SS320は、稔性エピソーム(F’プラスミド)またはXL1−BLUEをMC1061細胞に移転するのに十分な条件の下で、MC1061細胞をXL1−BLUE細胞と交接させて調製した。大腸菌株SS320は、1998年6月18日、アメリカ基準株保存機構(ATCC)、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USAに寄託され、寄託番号98795が割り当てられた。この菌株でのファージ複製を可能にするいかなるF’エピソームでも、本発明で用いることができる。適当なエピソームはATCCに預けられている株から入手可能であるし、または市販品を入手できる(CJ236、CSH18、DHF’、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1−BLUE、71−18、その他)。
エレクトロポレーションでより高いDNA濃度(約10倍)を使用すると、形質転換率が向上し、宿主細胞に形質転換されるDNAの量が増加する。高い菌体濃度の使用も効率を高める(約10倍)。移転されたDNA量の増加により、より大きな多様性を有し、複合ライブラリーのより多くの独特なメンバーを示すより大きなライブラリーが生じる。形質転換細胞は、通常、抗生物質を含む培地上の増殖によって選択される。
選択した対象への結合体の選択(選別)とスクリーニング
方法論に様々な置換および変更を加えた、対象抗原結合体を同定するためのファージディスプレイの使用は、当技術分野で確立されている。一手法では、融合ポリペプチドをコードしている遺伝子融合体と作用可能に連結した転写調節要素を含む複製可能な変異体ベクターのファミリーを構築し、適当な宿主細胞に形質転換し、この形質転換細胞を培養して前記融合ポリペプチドをファージ粒子表面で提示するファージ粒子を形成し、その後選択の過程で結合しない粒子と比較して結合する粒子のサブセットを増加させる目的で、少なくとも粒子集団の一部が対象と結合するように組換え体ファージ粒子を対象抗原と接触させることによる選択または選別を伴うプロセスを行う。選択されたプールは、異なるかまたは同じストリンジェンシーで同じ対象をさらに1回選別するために、宿主細胞、例えば新鮮なXL1−Blue細胞を感染させて増幅することができる。得られた変異体のプールは、次に新規高親和性結合タンパク質を同定するために、対象抗原に対してスクリーニングされる。これらの新規高親和性結合タンパク質は、アンタゴニストまたはアゴニストなどの治療薬として、かつ/または診断薬および研究試薬として有用であり得る。
方法論に様々な置換および変更を加えた、対象抗原結合体を同定するためのファージディスプレイの使用は、当技術分野で確立されている。一手法では、融合ポリペプチドをコードしている遺伝子融合体と作用可能に連結した転写調節要素を含む複製可能な変異体ベクターのファミリーを構築し、適当な宿主細胞に形質転換し、この形質転換細胞を培養して前記融合ポリペプチドをファージ粒子表面で提示するファージ粒子を形成し、その後選択の過程で結合しない粒子と比較して結合する粒子のサブセットを増加させる目的で、少なくとも粒子集団の一部が対象と結合するように組換え体ファージ粒子を対象抗原と接触させることによる選択または選別を伴うプロセスを行う。選択されたプールは、異なるかまたは同じストリンジェンシーで同じ対象をさらに1回選別するために、宿主細胞、例えば新鮮なXL1−Blue細胞を感染させて増幅することができる。得られた変異体のプールは、次に新規高親和性結合タンパク質を同定するために、対象抗原に対してスクリーニングされる。これらの新規高親和性結合タンパク質は、アンタゴニストまたはアゴニストなどの治療薬として、かつ/または診断薬および研究試薬として有用であり得る。
変異体アミノ酸を含んでいる抗体可変ドメインのような融合ポリペプチドは、ファージ、ファジミド粒子または細胞の表面で発現され、次に融合ポリペプチド群の構成メンバーの、一般的に関心の抗原である対象抗原に結合する能力について選択および/またはスクリーニングをすることができる。対象結合体についての選択の方法は、タンパク質Lまたはファージ上で提示される抗体もしくは抗体断片と結合する標識特異抗体のような抗体可変ドメインと親和性を有する一般的なタンパク質上での選別も含み、これは正しくフォールドされた抗体断片(融合ポリペプチド)を提示するライブラリーメンバーを豊富にするために使うことができる。
標的(対象)タンパク質、例えばDR5レセプター及びHER2は、天然源から単離することができ、または当技術分野で公知の手法による組換え方法により調製することができる。ヒト及びネズミ科DR5の配列を表1に示す。HER-2 ECDの配列及び調製は、Franklin MC. Carey KD. Vajdos FF. Leahy DJ. de Vos AM. Sliwkowski MX. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex, Cancer Cell. 5(4): 317-28, 2004に記載のように調製する。HER-2の細胞外ドメインアミノ酸23−646の配列は、タンパク質データバンク記録1S78(2004)に示される。
対象抗原としては、治療上関心のある多くの分子が含まれる。
対象抗原としては、治療上関心のある多くの分子が含まれる。
親和性のための選択(選別)のために様々な方策を使うことができる。ある方策は固体担体方法またはプレート選別または固定化対象選別である。他の方策は、溶液−結合法である。
固体担体方法については、対象タンパク質は当技術分野で公知である適当な固体または半固体マトリックス、例えばアガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、メタクリル酸ヒドロキシアルキルゲル、ポリアクリルおよびポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性およびイオン性担体などに結合してもよい。マトリックスへの対象タンパク質の結合は、Methods in Enzymology, 44(1976)に記載されている方法、または当技術分野で公知の他の手段で達成することができる。
マトリックスへの対象抗原の結合の後、固定化された対象をファージ粒子集団の少なくとも1サブセットと固定化対象抗原との結合に適した条件下で、融合ポリペプチドを発現しているライブラリーと接触させる。通常、pH、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣する。前記固定化対象と結合する粒子(「結合体」)は、水洗により対象と結合しない粒子から分離する。洗浄条件は、高親和性結合体以外のすべてが取り除かれるように調節することができる。結合体は様々な方法によって固定化された対象から解離させることができる。これらの方法には野生型リガンド(例えば過剰な対象抗原)を使う競合的解離、pHおよび/またはイオン強度の変更、ならびに当技術分野で公知の方法が含まれる。結合体の選択は、一般的に0.1MのHClなどの酸またはリガンドのような、適当な溶出材料によるアフィニティーマトリックスからの溶出を含む。リガンドの濃度を上昇させて溶出すると、提示されたより親和性の高い結合分子を溶出させることができた。
結合体は単離してから細胞を結合体であるウイルス粒子(および、例えばウイルス粒子がファジミド粒子である場合は必要に応じてヘルパーファージ)に感染させることによって、適当な宿主細胞で再増幅させることができ、この宿主細胞は所望の融合ポリペプチドを提示する粒子の増幅に適した条件下で培養される。次にファージ粒子を採取し、対象抗原の結合体がいくらか豊富になるまで選択工程を1回または複数回繰り返し、選択または選別は何回でも利用できる。選択または選別方法の1つは、タンパク質Lまたは提示されるポリペプチドに存在するポリペプチドタグに対する抗体、例えばgDタンパク質またはポリヒスチジンタグに対する抗体のような一般の親和性タンパク質と結合する結合体を単離することを含むこともできる。
一又は複数の選別ないしは分類ラウンドにカウンター選別を含め、一又は複数の非標的抗原に対して望ましくない結合も示す結合体を単離してもよい。
一又は複数の選別ないしは分類ラウンドにカウンター選別を含め、一又は複数の非標的抗原に対して望ましくない結合も示す結合体を単離してもよい。
本発明の1つの態様は、「溶液−結合方法」と呼ばれる新規選択法を用いた本発明のライブラリの選別を伴う。本発明は、従来の溶液選別方法よりも効率が非常に改善された溶相選別を可能にする。ランダムなライブラリーから元の結合体を見つけるため、あるいは特定の結合クローンまたはクローン群の親和性を改善することを目的としたライブラリーから改善された結合体を見つけるために溶液結合方法を用いてもよい。この方法は、複数のポリペプチド、例えばファージまたはファジミド粒子(ライブラリー)上で提示されるポリペプチドを、タグ分子で標識されたか融合された対象抗原と接触させることを含む。タグはビオチンまたは他の特異的結合体が入手できる部分でよい。溶相のストリンジェンシーは、第1の溶液結合相で濃度を段階的に低くした標識された対象抗原を用いて変化させることができる。さらにストリンジェンシーを高めるために、第1の溶液結合相の後に、第1の溶相での最初の標識された対象との結合の後に高濃度の標識されていない対象抗原を有する第2の溶相が続いてもよい。通常、標識対象の100から1000倍の非標識対象が第2相で使われる(含まれるならば)。第1の溶相のインキュベーション時間は、平衡に達するまで2、3分から1、2時間またはそれ以上の範囲である。結合速度の速い結合体には、この第1相において結合時間を短くする傾向がある、または短くすることが選択されうる。第2相のインキュベーションの時間および温度は、ストリンジェンシーを高めるために変化させることができる。これにより、対象から離れる速度(解離速度)が遅い結合体に対する選択の偏りが生じる。複数のポリペプチド(ファージ/ファジミド粒子上で提示された)を対象抗原と接触させた後に、標識対象と結合したファージまたはファジミド粒子を結合しないファージから分離する。結合の溶相からの粒子−対象混合物は、それを標識対象分子成分と接触させて短時間(例えば2〜5分間)標識対象分子と結合する分子との結合を可能にすることによって単離する。標識対象抗原の初期濃度の範囲は、約0.1nMから約1000nMまでである。結合粒子を溶出して、次回の選別のために増殖させることができる。ある実施態様では、各回低い濃度の標識対象抗原を用いて選別を複数回繰り返す。
例えば、約100から250nMの標識対象抗原を使った最初の選別または選択は広範囲の親和性を捕えるのに十分なはずであるが、この因子は経験的にかつ/または実践者の希望に沿うように決定することができる。2回目の選択では、約25から100nMの標識対象抗原を使える。3回目の選択では、約0.1から25nMの標識対象抗原を使える。例えば、100nMの結合体の親和性を改善するためには、20nMの標識対象から始めて5および1nMへと進め、次にさらに低い濃度、例えば約0.1nMの標識対象抗原へ進めるのが望ましい。
従来の溶液選別法ではストレプトアビジンをコーティングしたビーズのようなビーズを使用するが、これは使用するのが非常に厄介であり、またファージ結合体の回収の効率が非常に低いことが多い。ビーズによる従来の溶液選別法は2〜5分よりもかなり長い時間を要し、高スループットの自動操作に適応させるのが上述の本発明より困難である。
本明細書で記載されているように、固体担体と溶液選別方法の組合せは、所望の特性を有している結合体を単離するために有利に使うことができる。対象抗原に対して2、3回選択/選別を繰り返した後、所望の性質/特性を有する特異的結合体を同定するために選択されたプールからの個々のクローンのスクリーニングを通常実行する。ある実施態様では、スクリーニングのプロセスは、ライブラリー候補物質の高スループットスクリーニングを可能にする自動化システムによって実行される。
2つの主なスクリーニング方法を以下で記載する。しかし、当技術分野で公知の他の方法も本発明の方法で用いることができる。第1のスクリーニング法は固定化された対象抗原によるファージELISA検定を含み、この方法は非結合クローンからの特異的結合クローンの同定を可能にする。特異性は、対象でコーティングされたウェルおよびBSA、または他の非対象タンパク質でコーティングしたウェル上のクローンの同時検定で測定することができる。この検定は高スループットスクリーニングが自動化可能である。
一実施形態は、抗体可変ドメインのライブラリーから特異的対象抗原に結合する抗体可変ドメインを選択する方法を提供し、この方法は複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップと、前記ライブラリーを、結合に適した条件下で対象抗原および少なくとも1つの非対象抗原と接触させるステップと、前記ライブラリーのポリペプチド結合体を非結合体から分離するステップと、前記対象抗原と結合し、前記非対象抗原とは結合しない結合体を同定するステップと、この結合体を前記対象抗原から溶出するステップと、特異的抗原に結合する前記ポリペプチド結合体を含んでいる複製可能な発現ベクターを増幅するステップとを含む。
第2のスクリーニング検定は低親和性クローンからの高親和性クローンのハイスループット選別を可能にする親和性スクリーニング検定法である。この検定では、各クローンはまずある濃度の対象抗原とある時間(例えば30〜60分)インキュベートするかまたはしないで、その後対象でコーティングしたウェルへ短時間(例えば5〜15分)塗布する。次に結合したファージを通常のファージELISA法、例えば抗M13 HRPコンジュゲートを用いて測定する。1つは対象でプリインキュベーションされ他のウェルは対象抗原でプリインキュベーションされていないが、この2つのウェルの結合シグナルの比率は親和性の指標である。第1のインキュベーションのための対象濃度の選択は、関心の親和性の範囲に依存する。例えば、10nMを超える親和性の結合体が所望であるならば、第1のインキュベーションでは100nMの対象がしばしば使われる。一旦結合体が特定の回の選別(選択)で検出されると、より高い親和性の結合体を同定するためにこれらのクローンは親和性スクリーニング検定でスクリーニングすることができる。
前記選別/選択法のいずれの組合せもこのスクリーニング法と組み合わせることができる。例えば、一実施形態ではポリペプチド結合体は、まず固定化対象抗原への結合に関して選択される。前記固定化対象抗原と結合するポリペプチド結合体は、次に増幅して、この対象抗原との結合および非対象抗原への非結合に関してスクリーニングすることができる。特異的に対象抗原と結合するポリペプチド結合体を増幅する。これらのポリペプチド結合体は、次に複合体を形成するためにある濃度の標識された対象抗原と接触させることにより、より高い親和性に関して選択でき、この標識された対象抗原の濃度域は約0.1nMから約1000nMであり、この複合体は対象抗原上の標識と結合する因子との接触によって単離される。このポリペプチド結合体は、次に標識された対象抗原から溶出され、また各回より低い濃度の標識された対象抗原を用いて選択を繰り返すこともできる。この選択方法を使用して単離された高親和性ポリペプチド結合体は、次に、本明細書中に記載のいくつか、当分野で公知の様々な方法を用いて高親和性に関してスクリーニングすることができる。
これらの方法は、多数のクローンに対する長く、複雑な競合親和性検定を必要としないで、高親和性のクローンの検出を容易にする。多くのクローンに対して複雑な検定を行うことは手間が掛かり、選択による最良のクローンの検出に対してしばしば著しい障害となる。この方法は、類似した親和性の複数の結合体が選択プロセスから回収される場合の親和性の改善に特に役立つ。異なるクローンは、ファージまたはファジミド粒子上の発現/提示の効率が非常に異なることがある。より多く発現するクローンは、回収される可能性が高い。つまり、選択は変異体の提示または発現の量によって一方に偏らせることができる。本発明の溶液−結合選別方法は、高親和性結合体を見つけるための選択プロセスを改善することができる。この方法は、最良の結合体を迅速かつ容易にスクリーニングする際に著しく有利な親和性スクリーニング検定法である。
抗体又は抗原結合断片は、さらに、例えばアンタゴニスト又はアゴニスト活性などの機能的な活性について選別されうる。例えば、抗HER2抗体は、HER2のチロシンリン酸化である癌細胞の増殖を阻害する能力、又は癌細胞のアポトーシスを誘導する能力について選別されうる。これら活性を同定し測定するためのアッセイは例えば国際公開98/17797に記載される。
さらに、抗DR5抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導する能力及び/又は炎症性細胞の機能を阻害する能力について選別されうる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、DR5への結合についてApo2Lと競合する能力について選別される。更に他の実施態様では、抗ヒトDR5抗体はネズミ科及び/又はカニクイザルDR5への結合について選別される。生物学的活性を測定するためのアッセイは、DNA断片化(例としてMarsters et al., Curr. Biology, 6: 1669 (1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、DR5結合(例として1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号を参照)などの当分野で公知の方法を用いて行うことができる。アポトーシスは、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失を同定することによって測定されうる。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はMTTアッセイ)、FACS分析、カスパーゼ活性化、DNA断片化(例えば、Nicoletti等, J. Immunol. Methods, 139:271-279(1991)を参照)、ポリ-ADPリボースポリメラーゼ、「PARP」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
ある実施態様では、アポトーシスのアッセイは、96ウェル組織培養プレートにてコントロール標準物質及び抗DR5抗体の2倍の段階希釈物を作ることを伴う。Apo-2リガンド(アミノ酸114−281、PCT US00/17579に記載)は比較のために試験した。Colo-205(20000細胞個/ウェル)のヒト大腸カルシノーマ細胞(ATCC)を96ウェルプレートに播種した。プレートを24時間、37℃でインキュベートした。AlamarBlue (Trek Diagnostic Systems, Inc.)を、24時間のインキュベーション時間の最後の3時間に加えた。530nmの励起及び590nmの発光で96ウェル蛍光光度計を用いて蛍光発光を読み取った。結果は、相対的な蛍光発光単位(RFU)で表した。
さらに、抗DR5抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導する能力及び/又は炎症性細胞の機能を阻害する能力について選別されうる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、DR5への結合についてApo2Lと競合する能力について選別される。更に他の実施態様では、抗ヒトDR5抗体はネズミ科及び/又はカニクイザルDR5への結合について選別される。生物学的活性を測定するためのアッセイは、DNA断片化(例としてMarsters et al., Curr. Biology, 6: 1669 (1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、DR5結合(例として1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号を参照)などの当分野で公知の方法を用いて行うことができる。アポトーシスは、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失を同定することによって測定されうる。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はMTTアッセイ)、FACS分析、カスパーゼ活性化、DNA断片化(例えば、Nicoletti等, J. Immunol. Methods, 139:271-279(1991)を参照)、ポリ-ADPリボースポリメラーゼ、「PARP」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
ある実施態様では、アポトーシスのアッセイは、96ウェル組織培養プレートにてコントロール標準物質及び抗DR5抗体の2倍の段階希釈物を作ることを伴う。Apo-2リガンド(アミノ酸114−281、PCT US00/17579に記載)は比較のために試験した。Colo-205(20000細胞個/ウェル)のヒト大腸カルシノーマ細胞(ATCC)を96ウェルプレートに播種した。プレートを24時間、37℃でインキュベートした。AlamarBlue (Trek Diagnostic Systems, Inc.)を、24時間のインキュベーション時間の最後の3時間に加えた。530nmの励起及び590nmの発光で96ウェル蛍光光度計を用いて蛍光発光を読み取った。結果は、相対的な蛍光発光単位(RFU)で表した。
結合体が対象抗原への結合、及び/又は機能的アッセイにより同定された後、核酸を抽出することができる。抽出されたDNAは次に大腸菌宿主細胞を形質転換するのに直接用いることができ、あるいは、コード配列を例えばPCRで適当なプライマーを使って増幅し、典型的シークエンシング方法によって配列決定をすることができる。結合体の可変ドメインDNAは制限酵素で消化し、次にタンパク質発現のためにベクターに挿入することができる。
本発明の方法に従って生成した多様性のある制限配列を有するCDRを持つポリペプチドを含む母集団を、図11、15、21A及び24Aに挙げるものを含む様々な標的に対する結合体を単離するために使用することができる。これらの結合体には制限コドンを用いて生成した多様化配列を含む一以上の変異型CDRが含まれるであろう。ある実施態様では、変異型CDRは、長さの異なるCDRH3から生じる制限コドンセットへのアミノ酸置換及び/又はアミノ酸挿入によって生じた配列多様性を含むCDRH3である。本発明の融合ポリペプチドを生成するために有用な例示的オリゴヌクレオチドには図9A−D、図20A−L及び図23に挙げるものが含まれる。一以上の変異型CDRを組み合わせてもよい。ある実施態様では、CDRH3のみが多様化される。他の実施態様では、CDRH3を含む二以上の重鎖CDRが変異型である。他の実施態様では、CDRH3を除く一以上の重鎖CDRが変異型である。ある実施態様では、少なくとも一の重鎖及び少なくとも一の軽鎖CDRが変異型である。ある実施態様では、少なくとも1、2、3、4、5又はすべてのCDR H1、H2、H3、L1、L2及びL3が変異型である。
場合によって、一以上の多様化した軽鎖CDRを一以上の多様化した重鎖CDRを含むポリペプチドの母集団から単離した新規の結合体と組み合わせることが有益であり得る。この過程は2工程プロセスを指す。2工程プロセスの実施例では、まず1つまたは複数のCDRをランダム化することによって作製された1つまたは複数のライブラリー内の結合体(通常、低親和性結合体)を確定するが、各ライブラリーでランダム化されるCDRは異なるか、あるいは、同じCDRがランダム化される場合はこのCDRがランダム化されて異なる配列を生成する。重鎖ライブラリーからの結合体は、次に例えばキュンケルなどの突然変異生成技術により、または新しい軽鎖ライブラリーを定常軽鎖だけを有する既存の重鎖結合体にクローニングすることによって(カットアンドペースト(例えば、異なるCDR配列をライゲーションすることによって))、軽鎖CDRにおけるCDR多様性でCDRをランダム化することができる。プールは次に親和性の向上した結合体を同定するために、一又は複数の対象に対してさらに選別することができる。例えば、H1/H2/H3ライブラリーの選別から得られた結合体(例えば低親和性結合体)は、L1/L2/L3多様性のライブラリーと融合させて元の固定したL1/L2/L3と置き換えることができ、この新しいライブラリーは次に他の結合体セット(例えば高親和性結合体)を得るために対象とする標的に対してさらに選別される。様々な標的抗原の何れかに対してより高い結合親和性を示す新規の抗体配列を同定することができる。
いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドを含んでいるライブラリーは複数回選別され、各選別では前回の選別から得られた結合体を前回の対象抗原とは別の対象抗原と接触させる。望ましくは、しかし必ずしもそうとは限らないが、対象抗原は配列が相同的であり、例えば関連するが異なるポリペプチドのファミリーのメンバーであり、例えばそれには限定されないがサイトカイン(例えばαインターフェロン亜型)が含まれる。
変異型CDR含有ポリペプチドを含むライブラリーの作製
ポリペプチド
抗体可変ドメインの少なくとも1つのCDR内の溶媒と接触しうるかつ/または非常に多様な位置を突然変異させて、変異型CDRポリペプチドのライブラリーを作製することができる。いくつかまたはすべてのCDRは、本発明の方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態では、CDRH1、CDRH2およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはCDRL3およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはCDRL3、CDRH1、CDRH2およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより多様な抗体ライブラリーを作製することが好ましいかもしれない。
ポリペプチド
抗体可変ドメインの少なくとも1つのCDR内の溶媒と接触しうるかつ/または非常に多様な位置を突然変異させて、変異型CDRポリペプチドのライブラリーを作製することができる。いくつかまたはすべてのCDRは、本発明の方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態では、CDRH1、CDRH2およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはCDRL3およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはCDRL3、CDRH1、CDRH2およびCDRH3の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより多様な抗体ライブラリーを作製することが好ましいかもしれない。
例えばCDRH1、CDRH2およびCDRH3の溶媒に露出しかつ/または非常に多様な位置に突然変異を有する、抗体可変ドメインのライブラリーを作製することができる。CDRL1、CDRL2およびCDRL3で突然変異を有する他のライブラリーを作製することができる。所望の親和性の結合体を作製するために、これらのライブラリーを互いに一緒に使うこともできる。例えば、対象抗原への結合により重鎖ライブラリーを1回または複数回選択した後、軽鎖ライブラリーは結合体の親和性を増やすために、さらなる選択のために重鎖結合体の集団に戻すことができる。
一実施形態では、重鎖配列の可変領域のCDRH3領域において、元のアミノ酸を限定した一組の変異型アミノ酸で置換することによってライブラリーは作製される。本発明によると、このライブラリーは複数の抗体配列を含むことができ、その配列多様性は主に重鎖配列のCDRH3領域にある。
一態様では、ライブラリは、ヒト化抗体4D5配列の前後関係又はヒト化抗体4D5配列のフレームワークアミノ酸の配列において作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「YSGR−A」ライブラリについての図8に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52−54、56および58、CDRH3の残基95、96、97、98、99、100、100a、100bおよび100c、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「YSGR−B」ライブラリについての図8に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52−54、56および58、CDRH3の残基95、96、97、98、99、100、100a、100bおよび100c、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「YSGR−C」ライブラリについての図8に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52−54、56および58、CDRH3の残基95、96、97、98、99、100、100a、100bおよび100c、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「YSGR−D」ライブラリについての図8に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52−54、56および58、CDRH3の残基95、96、97、98、99、100、100a、100bおよび100c、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。100bおよび100cのアミノ酸位はCDRH3の長さに従って異なるアルファベットの識別子を有しうるが、これらの位置は位置101の前の最後の2つのCDRH3位置である。好適なオリゴヌクレオチド配列の例には、限定するものではないが、図9A−Dに挙げるものが含まれ、本明細書に記載の定義に従って当分野の技術者によって決定されうる。
ある実施態様では、ライブラリは、「SAH3」ライブラリについての図19Aに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SCH3」ライブラリについての図19Aに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SFH3」ライブラリについての図19Aに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SGH3」ライブラリについての図19Aに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換に作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SIH3」ライブラリについての図19Aに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SLH3」ライブラリについての図19Aに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。CDRH3の長さが変化するので、位置101の前の最後の2つの位置はCDRH3の長さに従って異なるアルファベットの識別子を有しうるが、これらの位置は位置101の前の最後の2つのCDRH3位置である。好適なオリゴヌクレオチド配列の例には、限定するものではないが、図20A−20Lに挙げるものが含まれ、本明細書に記載の定義に従って当分野の技術者によって決定されうる。
ある実施態様では、ライブラリは、「SNH3」ライブラリについての図19Bに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SPH3」ライブラリについての図19Bに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SRH3」ライブラリについての図19Bに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「STH3」ライブラリについての図19Bに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SWH3」ライブラリについての図19Bに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SYH3」ライブラリについての図19Bに示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。CDRH3の長さが変化するので、位置101の前の最後の2つの位置はCDRH3の長さに従って異なるアルファベットの識別子を有しうるが、これらの位置は位置101の前の最後の2つのCDRH3位置である。好適なオリゴヌクレオチド配列の例には、限定するものではないが、図20A−20Lに挙げるものが含まれ、本明細書に記載の定義に従って当分野の技術者によって決定されうる。
ある実施態様では、ライブラリは、「SY」ライブラリについての図22に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SW」ライブラリについての図22に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SR」ライブラリについての図22に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。ある実施態様では、ライブラリは、「SF」ライブラリについての図22に示すアミノ酸セットによる、少なくともCDRH1の残基28および30−33、CDRH2の残基50、52、53、54、56および58、CDRH3の残基95−100m、ならびにCDRL3の残基91−94および96の置換によって作製される。CDRH3の長さが変化するので、位置101の前の最後の2つの位置はCDRH3の長さに従って異なるアルファベットの識別子を有しうるが、これらの位置は位置101の前の最後の2つのCDRH3位置である。好適なオリゴヌクレオチド配列の例には、限定するものではないが、図23に挙げるものが含まれ、本明細書に記載の定義に従って当分野の技術者によって決定されうる。
ある実施態様では、ライブラリは他のライブラリをプールすることによって作製される。一実施態様では、本明細書で用いる「SXH3」ライブラリは、SAH3、SCH3、SFH3、SGH3、SIH3、SLH3、SNH3、SPH3、SRH3、STH3、SWH3およびSYH3ライブラリを含んでなる。他の実施態様では、「SX−表面」ライブラリは、「SY」、「SW」、「SR」および「SF」ライブラリを含んでなる。
他の実施態様では、異なるCDRH3設定を用いて、高親和性結合体を単離し、様々なエピトープに対する結合体を単離する。CDRH3の多様性のために、複数のライブラリを、H3の異なる長さによって別々に構築し、そして組み合わせて標的抗原に対する結合体について選別することができる。このライブラリにおいて生成されるCDRH3の長さの範囲は、10−21,11−21、12−21、13−21、14−21、15−21、16−21、17−21、18−21、19−21、20−21アミノ酸であってもよいが、これとは異なる長さが生成されてもよい。また、上記のように、CDRH1およびCDRH2に多様性が生成されてもよい。ライブラリの一実施態様では、H1およびH2の多様性は、図9A−D、20A−Lおよび図23に例示されるオリゴヌクレオチドを利用して生成される。また、配列が異なる他のオリゴヌクレオチドも用いられうる。実用的な必要性及び実施者の所望に応じて、オリゴヌクレオチドを単独に用いられうるか、様々な組み合わせのいずれかにプールされうる。いくつかの実施態様では、重鎖CDRのランダム化された位置には、図8、9、11、15、19、21、22、23および24に挙げられるものが含まれる。
本明細書中に記載のように、複数のライブラリーをプールして、固体担体選択および溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を使用してもよい。例えば、1つの変更は固体に結合した対象に対する選別、続いて融合ポリペプチド(例えば、抗gDタグ)上に存在しているかもしれないタグに対する選別、続いて固体に結合した対象に対する他の選別を含む。別法として、ライブラリーをまず固体表面に結合した対象上で選別し、次に溶相結合法を濃度を段階的に下げた対象抗原を用いて行うことにより溶出した結合体を選別する。異なる選別方法を組み合わせて利用すると、高発現の配列だけが選択されるのを極小化して、いくつかの異なる高親和性クローンの選択を可能にする。
前述のようなプールしたライブラリから単離した結合体の中から、ある場合では軽鎖内の多様性を限定することによってさらに親和性が改善しうることが明らかとなった。軽鎖の多様性は、必要ではないが、CDRL3のアミノ酸位91−96又はそのサブセットを多様化することによって生成されうる。ある実施態様では、ランダム化した位置は図8、9、11、15、19、21、22、23及び24に挙げるものである。
この実施態様のライブラリから単離した親和性の高い結合体は、細菌及び真核生物の細胞培養において効率よく容易に生成される。gDタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列などの配列を容易に除去したり、又は定常領域配列内に付加するようにベクターを設定して、完全長抗体又は抗原結合断片を効率よく生成することができる。
本発明の方法に従ってコドンセットとCDRの任意の組み合わせを多様化することができる。
本発明の方法に従ってコドンセットとCDRの任意の組み合わせを多様化することができる。
(ベクター、宿主細胞及び組換え方法)
本発明の抗体ポリペプチドの組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。
本発明の抗体ポリペプチドの組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。
(原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成)
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はPCR法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はPCR法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322を用いて形質転換する。pBR322はアンピシリン(Amp)及びテトラサイクリン(Tet)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。pBR322、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるpBR322誘導体の例はCarter等の米国特許第5648237号に詳細に記載されている。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λGEM.TM.-11のようなバクテリオファージを、大腸菌LE392のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする2又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(5')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源DNAからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンDNAに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び/又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、PhoAプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばtac又はtrcプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドDNAの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ippあるいは熱安定性エンテロトキシンII(STII)リーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpA及びMBPからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はSTIIシグナル配列又はその変異体である。
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌trxB−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
本発明は、発現されるポリペプチド成分の量的割合を本発明の抗体の分泌及び好適な集積効率が最大となるように調節することができる発現系を提供する。ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくともある程度その調節が達成される。
翻訳強度を調節する一つの方法は、Simmons等の米国特許第5840523号に開示されている。このアプローチはシストロン内の翻訳開始領域(TIR)の変異体を利用する。与えられたTIRに対して、ある範囲の翻訳強さを持つ一群のアミノ酸又は核酸配列変異体をつくり出すことができ、それによって、所望の発現レベルの特異的鎖に対してこの因子を調節するための簡便な手段を提供する。TIR変異体はアミノ酸配列を改変することができるコドン変化を生じる一般的な突然変異誘発法によって産生することができるが、ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましい。TIRの変異には、例えばシグナル配列の変更と共に、シャイン-ダルガーノ配列の数又は間隔の変更が含まれうる。変異体シグナル配列を作成するためのある方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させない(つまり変化がサイレントである)コード配列の最初での「コドンバンク」の産生である。これは、各コドンの第三のヌクレオチド位置を変化させることによって、達成できる;加えて、幾つかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンはバンクの作製に複雑さを付加し得る複数の第一及び第二の位置を有している。この突然変異誘発の方法はYansura等(1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。
ある実施態様では、そこの各シストロンに対してある範囲のTIR強さを有する一群のベクターが産生される。この制限された群は各鎖の発現レベルと様々なTIR強さの組合せ下で所望の抗体産物の収量の比較をもたらす。TIR強さはSimmons等の米国特許第5840523号に記載されているレポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定することができる。翻訳強度を比較することによって、所望の個々のTIRsが選択されて、本発明の発現ベクターコンストラクト中で組み合わされる。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する33D3株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁;ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bassら., Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。pBR322、pBR325、pACYC177、又はpKN410のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、DNAを原核生物宿主中に導入し、そのDNAを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(LB)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、DNAを原核生物宿主中に導入し、そのDNAを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(LB)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約20℃から約39℃、約25℃から約37℃の範囲、約30℃である。培地のpHは、主として宿主生物に応じて、約5から約9の範囲の任意のpHでありうる。大腸菌に対しては、pHは約6.8から約7.4、約7.0である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにPhoAプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はC.R.A.P培地である(例として、Simmonsら., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約20℃から約39℃、約25℃から約37℃の範囲、約30℃である。培地のpHは、主として宿主生物に応じて、約5から約9の範囲の任意のpHでありうる。大腸菌に対しては、pHは約6.8から約7.4、約7.0である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにPhoAプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はC.R.A.P培地である(例として、Simmonsら., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模流加発酵は少なくとも1000リットルの容量、ある実施態様では、大規模発酵は約1000から100000リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(一般的な炭素/エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ100リットル以下の容積で、約1リットルから約100リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約180−220のOD550まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約12−50時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約180−220のOD550まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約12−50時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばDsbタンパク質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及び/又はDsbG)又はFkpA(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605;Georgiou等, 米国特許第6083715号;Georgiou等, 米国特許第6027888号;Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105;Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113;Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼIII、OmpT、DegP、Tsp、プロテアーゼI、プロテアーゼMi、プロテアーゼV、プロテアーゼVI及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998);Georgiou等, 米国特許第5264365号;Georgiou等, 米国特許第5508192号;Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼIII、OmpT、DegP、Tsp、プロテアーゼI、プロテアーゼMi、プロテアーゼV、プロテアーゼVI及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998);Georgiou等, 米国特許第5264365号;Georgiou等, 米国特許第5508192号;Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
抗体精製
ある実施態様では、本明細書に記載の生成した抗体タンパク質をさらに精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である:免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカ又はDEAEなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G−75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインAを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインAは抗体のFc領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した41kDの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。ある実施態様では、プロテインAを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面を含むカラムである。ある実施態様では、プロテインAを固定した固形層は、孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムである。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインA固定固形層に適応し、プロテインAに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
ある実施態様では、本明細書に記載の生成した抗体タンパク質をさらに精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である:免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカ又はDEAEなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G−75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインAを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインAは抗体のFc領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した41kDの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。ある実施態様では、プロテインAを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面を含むカラムである。ある実施態様では、プロテインAを固定した固形層は、孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムである。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインA固定固形層に適応し、プロテインAに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む:シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
(i)シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。ある実施態様では、異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、多価抗体をコードするDNAに読み枠を一致させて結合される。
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む:シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
(i)シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。ある実施態様では、異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、多価抗体をコードするDNAに読み枠を一致させて結合される。
(ii)複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
(iii)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばDHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネインI及びII(例えば霊長類メタロチオネイン遺伝子)、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばDHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネインI及びII(例えば霊長類メタロチオネイン遺伝子)、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
(iv)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25から30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70から80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT(配列番号:585)領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA(配列番号:586)配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンcDNAの発現について、Reyes等, Nature, 297:598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25から30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70から80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT(配列番号:585)領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA(配列番号:586)配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンcDNAの発現について、Reyes等, Nature, 297:598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
(v)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうる。ある実施態様では、エンハンサーはプロモーターから5'位に位置している。
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうる。ある実施態様では、エンハンサーはプロモーターから5'位に位置している。
(vi)転写終結成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
(vii)宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34); バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34); バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
(viii)宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
(ix)抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンFc領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、γ2、又はγ4重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ3に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのSEPHAROSETMクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。ある実施態様では、低pH疎水性作用クロマトグラフィは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)で行う。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。ある実施態様では、低pH疎水性作用クロマトグラフィは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)で行う。
活性のアッセイ
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的/化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、N末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
特定の実施態様では、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、エライザ(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインAイムノアッセイのような技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。
抗体又は抗原結合断片は、さらに、例えばアンタゴニスト又はアゴニスト活性などの機能的な活性について選別されうる。例えば、抗HER2抗体は、HER2のチロシンリン酸化を阻害、癌細胞の増殖を阻害する能力、又は癌細胞のアポトーシスを誘導する能力について選別されうる。これら活性を同定し測定するためのアッセイは例えば国際公開98/17797に記載される。
さらに、抗DR5抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導する能力及び/又は炎症性細胞の機能を阻害する能力について選別されうる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、DR5への結合についてApo2Lと競合する能力について選別される。更に他の実施態様では、抗ヒトDR5抗体はネズミ科及び/又はカニクイザルDR5への結合について選別される。生物学的活性を測定するためのアッセイは、DNA断片化(例としてMarsters et al., Curr. Biology, 6: 1669 (1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、DR5結合(例として1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号を参照)などの当分野で公知の方法を用いて行うことができる。アポトーシスは、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失を同定することによって測定されうる。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はMTTアッセイ)、FACS分析、カスパーゼ活性化、DNA断片化(例えば、Nicoletti等, J. Immunol. Methods, 139:271-279(1991)を参照)、ポリ-ADPリボースポリメラーゼ、「PARP」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
ある実施態様では、アポトーシスのアッセイは、96ウェル組織培養プレートにてコントロール標準物質及び抗DR5抗体の2倍の段階希釈物を作ることを伴う。Apo-2リガンド(アミノ酸114−281、PCT US00/17579に記載)は比較のために試験した。Colo-205(20000細胞個/ウェル)のヒト大腸カルシノーマ細胞(ATCC)を96ウェルプレートに播種した。プレートを24時間、37℃でインキュベートした。AlamarBlue (Trek Diagnostic Systems, Inc.)を、24時間のインキュベーション時間の最後の3時間に加えた。530nmの励起及び590nmの発光で96ウェル蛍光光度計を用いて蛍光発光を読み取った。結果は、相対的な蛍光発光単位(RFU)で表した。
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的/化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、N末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
特定の実施態様では、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、エライザ(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインAイムノアッセイのような技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。
抗体又は抗原結合断片は、さらに、例えばアンタゴニスト又はアゴニスト活性などの機能的な活性について選別されうる。例えば、抗HER2抗体は、HER2のチロシンリン酸化を阻害、癌細胞の増殖を阻害する能力、又は癌細胞のアポトーシスを誘導する能力について選別されうる。これら活性を同定し測定するためのアッセイは例えば国際公開98/17797に記載される。
さらに、抗DR5抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導する能力及び/又は炎症性細胞の機能を阻害する能力について選別されうる。他の実施態様では、抗DR5抗体は、DR5への結合についてApo2Lと競合する能力について選別される。更に他の実施態様では、抗ヒトDR5抗体はネズミ科及び/又はカニクイザルDR5への結合について選別される。生物学的活性を測定するためのアッセイは、DNA断片化(例としてMarsters et al., Curr. Biology, 6: 1669 (1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、DR5結合(例として1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号を参照)などの当分野で公知の方法を用いて行うことができる。アポトーシスは、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失を同定することによって測定されうる。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はMTTアッセイ)、FACS分析、カスパーゼ活性化、DNA断片化(例えば、Nicoletti等, J. Immunol. Methods, 139:271-279(1991)を参照)、ポリ-ADPリボースポリメラーゼ、「PARP」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
ある実施態様では、アポトーシスのアッセイは、96ウェル組織培養プレートにてコントロール標準物質及び抗DR5抗体の2倍の段階希釈物を作ることを伴う。Apo-2リガンド(アミノ酸114−281、PCT US00/17579に記載)は比較のために試験した。Colo-205(20000細胞個/ウェル)のヒト大腸カルシノーマ細胞(ATCC)を96ウェルプレートに播種した。プレートを24時間、37℃でインキュベートした。AlamarBlue (Trek Diagnostic Systems, Inc.)を、24時間のインキュベーション時間の最後の3時間に加えた。530nmの励起及び590nmの発光で96ウェル蛍光光度計を用いて蛍光発光を読み取った。結果は、相対的な蛍光発光単位(RFU)で表した。
一実施態様では、本発明はすべてではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体を考慮し、このことによって抗体のインビボ半減期が重要なある種のエフェクター機能(補体又はADCCなど)が不要で有害である多くの手法の所望する候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのFc活性を測定して、所望の特性が維持されていることを確認する。インビボ及び/又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、CDC及び/又はADCC活性の減少/枯渇を確認することができる。例えば、Fcレセプター(FcR)結合アッセイを行って、抗体がFcγR結合を欠損している(すなわちADCC活性をほとんど欠損している)が、FcRn結合能は維持していることを確認することができる。ADCCに関与している第一細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現しており、その一方で単核細胞はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現している。造血系細胞でのFcR発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のADCC活性は、例えばClynes ら. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、C1q結合アッセイを行って、抗体がC1qに結合できない、つまりCDC活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro ら., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、CDCアッセイを行ってもよい。また、FcRn結合及びインビボクリアランス/半減期測定を、当分野で公知の方法、例えば実施例の項目で示す方法を用いて行うことができる。
ヒト化抗体
本発明は、ヒト抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
本発明は、ヒト抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、一方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
抗体変異体
一態様では、本発明は、Fc領域を含むFcポリペプチドの作用面内に修飾を有する抗体断片を提供するものであり、ここでいう修飾によって異種性二量体化を容易にする及び/又は促進される。この修飾は、第一Fcポリペプチド内への隆起と第二Fcポリペプチド内への腔の導入を含むものであり、ここでいう隆起は第一Fcポリペプチドと第二Fcポリペプチドの複合体化を促進するために腔内に位置する。これらの修飾を有する抗体の生成方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第5,731,168号に記載されている。
ある実施態様では、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせをその最終コンストラクトに達するまでなされることによって最終コンストラクトが所望の特徴を有する。配列を作製すると同時に目的の抗体アミノ酸配列にアミノ酸修飾を導入するのがよい。
一態様では、本発明は、Fc領域を含むFcポリペプチドの作用面内に修飾を有する抗体断片を提供するものであり、ここでいう修飾によって異種性二量体化を容易にする及び/又は促進される。この修飾は、第一Fcポリペプチド内への隆起と第二Fcポリペプチド内への腔の導入を含むものであり、ここでいう隆起は第一Fcポリペプチドと第二Fcポリペプチドの複合体化を促進するために腔内に位置する。これらの修飾を有する抗体の生成方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第5,731,168号に記載されている。
ある実施態様では、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせをその最終コンストラクトに達するまでなされることによって最終コンストラクトが所望の特徴を有する。配列を作製すると同時に目的の抗体アミノ酸配列にアミノ酸修飾を導入するのがよい。
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第5739277号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープ接着させることができる。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、IgG分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)のFc領域のエピトープを意味する(例えば、Ghetie, Vら., (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表1)。Fc領域内に置換を有する抗体及び血清半減期が増大した抗体については、WO00/42072 (Presta, L.)、WO 02/060919; Shields, R.L., ら., (2001) JBC 276(9):6591-6604;Hinton, P.R., (2004) JBC 279(8):6213-6216)にも記載されている。他の実施態様では、例えば他のポリペプチド配列に接着させることによっても血清半減期が増大しうる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、本発明の抗体又は本発明のアミノ酸配列を含む他のポリペプチドをFcRnレセプター又は血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に接着させることができ、例としてこのようなポリペプチド配列はWO01/45746に開示されている。一実施態様では、接着した血清アルブミンペプチドはアミノ酸配列DICLPRWGCLWを含む。他の実施態様では、本発明によるFabの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S., ら., (2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
突然変異誘発の好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び/又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、N末端メチオニル残基を持つ抗体ないし細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばADEPT)又はポリペプチドへの、抗体のN又はC末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、FR変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表2に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、FR変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表2に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる:
(1) 非極性:Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 荷電のない極性:Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 酸性:Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性:Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる:
(1) 疎水性:ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 中性親水性:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 酸性:Asp, Glu;
(4) 塩基性:His, Lys, Arg;
(5) 鎖配向に影響する残基:Gly, Pro;
(6) 芳香族:Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、保存的置換部位又はより好ましくは残りの(非保存的)部位内に置換された残基を導入してもよい。
(1) 非極性:Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 荷電のない極性:Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 酸性:Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性:Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる:
(1) 疎水性:ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 中性親水性:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 酸性:Asp, Glu;
(4) 塩基性:His, Lys, Arg;
(5) 鎖配向に影響する残基:Gly, Pro;
(6) 芳香族:Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、保存的置換部位又はより好ましくは残りの(非保存的)部位内に置換された残基を導入してもよい。
ある型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば6−7部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたM13の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのFc領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してFc領域変異型を生成することが望ましい。Fc領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾(例えば、置換)を有するヒトFc領域配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4 Fc領域)を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばFc領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、WO99/51642などに記載のようにC1q結合及び/又は補体依存性細胞障害(CDC)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるFc領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Fc領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;及びWO94/29351を参照。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばFc領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、WO99/51642などに記載のようにC1q結合及び/又は補体依存性細胞障害(CDC)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるFc領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Fc領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;及びWO94/29351を参照。
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)に関する。
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)に関する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172;米国特許第4,975,278号)、論理的に腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581;Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028;Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213;Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928;Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、DNA結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のBリンパ球の細胞表面上にみられるCD20抗原に対するマウスIgG1κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77;Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42;Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63;Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはB細胞非ホジキン性リンパ球(NHL)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したhuCD33抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686;米国特許第4970198号;同第5079233号;同第5585089号;同第5606040号;同第5693762号;同第5739116号;同第5767285号;同第5773001号)。ジスルフィドリンカーSPPを介してメイタンシノイド薬剤分子DM1と連結しているhuC242抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、CanAgを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第II相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子DM1と連結している抗前立腺特異的膜抗原(PSMA)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるMLN−2704(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンE(AE)及びモノメチルアウリスタチン(MMAE)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体cBR96(癌細胞上のルイスYに特異的)及びcAC10(血液系悪性腫瘍上のCD30に特異的)(Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
このような免疫複合体(免疫コンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、限定するものではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオナート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-14-標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開94/11026参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
メイタンシン及びメイタンシノイド
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4137230号;同4248870号;同4256746号;同4260608号;同4265814号;同4294757号;同4307016号;同4308268号;同4308269号;同4309428号;同4313946号;同4315929号;同4317821号;同4322348号;同4331598号;同4361650号;同4364866号;同4424219号;同4450254号;同4362663号;及び同4371533号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4137230号;同4248870号;同4256746号;同4260608号;同4265814号;同4294757号;同4307016号;同4308268号;同4308269号;同4309428号;同4313946号;同4315929号;同4317821号;同4322348号;同4331598号;同4361650号;同4364866号;同4424219号;同4450254号;同4362663号;及び同4371533号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体C242に結合するDM1と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体A7、又はHER-2/neuオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。TA.1-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞SK-BR-3におけるインビトロで試験され、細胞当たり3×105HER-2表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。A7-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体C242に結合するDM1と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体A7、又はHER-2/neuオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。TA.1-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞SK-BR-3におけるインビトロで試験され、細胞当たり3×105HER-2表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。A7-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。1分子の毒素/抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均3−4のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5208020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。ある実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235B1号、及びChari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。1分子の毒素/抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均3−4のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5208020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。ある実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235B1号、及びChari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。ある実施態様では、カップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるN-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノアート(SPP)及びN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)(Carlsson等, Biochem. J. 173:723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)より)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)より)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(MX-DTPA)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992);米国特許第5208020号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤:市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したADCが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467−498頁を参照。
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる:(1)共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2)共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ab−(L−D)p I
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む:(i)N末端アミン基、(ii)側鎖アミン基、例えばリシン、(iii)側鎖チオール基、例えばシステイン、および(iv)抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる:(i)活性エステル、例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物;(ii)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;(iii)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばDTT(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、2の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる2-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる:(1)共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2)共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ab−(L−D)p I
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む:(i)N末端アミン基、(ii)側鎖アミン基、例えばリシン、(iii)側鎖チオール基、例えばシステイン、および(iv)抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる:(i)活性エステル、例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物;(ii)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;(iii)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばDTT(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、2の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる2-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基を用いて反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒドおよびケトン)基が生じうる。他の実施態様では、N末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146;US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む:反応して、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基:(i)活性エステル(例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物);(ii)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;(iii)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。ある実施態様では、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。ある実施態様では、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
医薬製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A. 編 (1980))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A. 編 (1980))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物を含んでもよい。ある実施態様では、化合物は互いに悪影響を与えない相補的活性を持つ。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を100日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、37℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間S-S結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
使用
例えば、本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法で用いてもよい。本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及び/又はインビボで特異的抗原活性を部分的に又は完全にブロック(遮断)するアンタゴニストとして用いることができる。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種から抗原活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含んでいる細胞培養物中、患者、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類対象動物(例えばチンパンジ、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよび赤毛猿、ブタ又はマウス)の特異的抗原活性を阻害するために用いることができる。一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように抗原と抗体とを接触させることによって抗原活性を阻害するために用いることができる。ある実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子である。
例えば、本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法で用いてもよい。本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及び/又はインビボで特異的抗原活性を部分的に又は完全にブロック(遮断)するアンタゴニストとして用いることができる。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種から抗原活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含んでいる細胞培養物中、患者、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類対象動物(例えばチンパンジ、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよび赤毛猿、ブタ又はマウス)の特異的抗原活性を阻害するために用いることができる。一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように抗原と抗体とを接触させることによって抗原活性を阻害するために用いることができる。ある実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子である。
一実施態様において、本発明の抗体を抗原活性が有害である疾患に罹患している対象体の抗原を阻害する方法に用いることができ、その方法は対象体の抗原活性が阻害されるように本発明の抗体を対象体に投与することを含む。ある実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子であり、対象体は患者である。あるいは、対象体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳動物でありうる。また更に、対象体は、抗原が導入された哺乳動物でありえる(例えば、抗原の投与や、抗原導入遺伝子の発現による)。本発明の抗体は、治療的目的のために患者に投与することができる。さらに、本発明の抗体は、免疫グロブリンが獣医学の分野で、又はヒト疾患の動物モデルとして交差反応する抗原を発現する人間以外の哺乳動物(例えば霊長類、ブタ又はマウス)に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性(例えば用量および投与の時間経過の試験)を評価するために有効であるかもしれない。
治療的に有効である本発明の遮断又はアンタゴニスト抗体には、例えば、限定するものではなく、抗HER2抗体が含まれる。例えば、本発明の抗HER-2抗体は一以上の抗原分子の異常発現及び/又は活性が関与する疾患、疾病又は症状、の治療、阻害、経過を遅延、再発を予防/遅延、寛解、又は予防に用いることができる。この疾患、疾病又は症状には、限定するものではないが、悪性及び良性の腫瘍;非白血病及びリンパ系の悪性腫瘍;神経系、神経膠、星状膠、視床下部、他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性の疾患;及び炎症性、血管形成性、免疫系の疾患が含まれる。
治療的に有効である本発明の遮断又はアンタゴニスト抗体には、例えば、限定するものではなく、抗HER2抗体が含まれる。例えば、本発明の抗HER-2抗体は一以上の抗原分子の異常発現及び/又は活性が関与する疾患、疾病又は症状、の治療、阻害、経過を遅延、再発を予防/遅延、寛解、又は予防に用いることができる。この疾患、疾病又は症状には、限定するものではないが、悪性及び良性の腫瘍;非白血病及びリンパ系の悪性腫瘍;神経系、神経膠、星状膠、視床下部、他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性の疾患;及び炎症性、血管形成性、免疫系の疾患が含まれる。
一態様では、本発明の遮断抗体はリガンド抗原に特異的で、リガンド抗原を伴うリガンド-レセプタ相互作用をブロックするかまたは妨げることによって、対応するシグナル経路および他の分子又は細胞性の現象を阻害することによって抗原活性を阻害する。また、本発明は必ずしもリガンド結合を阻害するというわけではなくて、レセプター活性化を妨ぐレセプター特異的な抗体を特徴とし、それによって通常リガンド結合によって開始する任意の応答を阻害する。ある実施態様では、また、本発明は、リガンド-レセプター複合体と結合する抗体を包含する。また、本発明の抗体は、特定の抗原レセプターのアゴニストとして作用し、それによって、リガンド媒介性のレセプター活性の活性化を完全に又は部分的に潜在化、亢進又は活性化する。
HER-2関連の疾患又は症状及び診断用アッセイは、出典明記によって本明細書中に援用される米国特許第6387371号に記載される。また、国際公開第98/17797号を参照。治療的有効量の抗HER-2レセプター抗体の患者への投与により腫瘍細胞の増殖が抑制され、癌の治療に有用である。トラスツズマブ(Genentech, Inc.)は、HER-2過剰発現/HER-2遺伝子増幅癌、特に転移性乳癌(MBC)の治療のための、HER-2細胞外ドメインに対する組み換えヒト化モノクローナル抗体である。このような抗体は、他の癌、特にHER-2を過剰発現するものの治療に有用である。また、前記抗体は、他の治療剤、例えばパクリタキセル又はTarceva(登録商標)と組み合わせて患者に投与されうる。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は癌細胞のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はDR5のアゴニストである。他の実施態様では、抗体はDR5のApo-2Lとの結合について競合する。
いくつかの実施態様では、抗DR5抗体は癌細胞のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施態様では、抗DR5抗体はDR5のアゴニストである。他の実施態様では、抗体はDR5のApo-2Lとの結合について競合する。
上記のように、本発明のDR5抗体は様々な有用性がある。例えば、DR5アゴニスト抗体は、癌や免疫関連の疾患などのヒトの病理学的状態を治療するための方法に用いられうる。免疫関連の状態には、関節リウマチ、全身エリテマトーデス、強皮症、特発性炎症性ミオパシ、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫溶血性貧血、甲状腺炎、免疫関連の腎疾患、例として糸球体腎炎、脱髄性疾患、例として多発性硬化症、自己免疫性皮膚病、例として乾癬、炎症性および濾過肺疾患、およびアレルギー性疾患、例えば喘息が含まれる。
本明細書に記載の様々な病理学的状態の哺乳動物の診断は当業者によってなされうる。診断用技術は、例えば、哺乳動物の癌や免疫関連の疾患の診断又は検出を行う技術に利用できる。例えば、癌は、限定するものではないが触診、血液分析、X線、NMRなどを含む技術により同定されうる。免疫性関連の疾患もまた、容易に同定することができる。例えば、全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心的メディエータは、自己タンパク質/組織に対する自己応答性抗体の産生とその後の免疫が媒介する炎症の生成である。腎臓、肺、筋骨格システム、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄、および血液を含む複数の臓器及びシステムは、臨床的に影響を受ける。医師は、免疫および/または炎症性応答の介入が利点を有する多くの疾患に詳しい。
本明細書に記載の様々な病理学的状態の哺乳動物の診断は当業者によってなされうる。診断用技術は、例えば、哺乳動物の癌や免疫関連の疾患の診断又は検出を行う技術に利用できる。例えば、癌は、限定するものではないが触診、血液分析、X線、NMRなどを含む技術により同定されうる。免疫性関連の疾患もまた、容易に同定することができる。例えば、全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心的メディエータは、自己タンパク質/組織に対する自己応答性抗体の産生とその後の免疫が媒介する炎症の生成である。腎臓、肺、筋骨格システム、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄、および血液を含む複数の臓器及びシステムは、臨床的に影響を受ける。医師は、免疫および/または炎症性応答の介入が利点を有する多くの疾患に詳しい。
ある実施態様では、細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを患者に投与する。ある実施態様では、免疫コンジュゲート及び/又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤(例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン)、放射性同位元素、又はRNA分解酵素ないしDNAエンドヌクレアーゼが含まれる。
本発明の抗体は、単独で、または、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤(一又は複数)(化学療法剤の混合を含む)、他の細胞障害性剤(一又は複数)、抗血管形成剤(一又は複数)、サイトカインおよび/または増殖阻害性剤(一又は複数)と同時に投与してもよい。本発明の抗体が腫瘍成長を阻害する場合、腫瘍成長を阻害する一つ以上の他の治療薬と組み合わせることが特に望ましい。例えば、本発明の抗体は、処置、例えば結腸直腸癌、転移性乳癌および腎臓癌を含む本明細書中に記載の何れかの疾患の治療に、抗VEGF抗体(例えばアバスチン)及び/又は抗ErbB抗体(例えばハーセプチン(登録商標)抗HER2抗体)を組み合わせてもよい。あるいは又は加えて、放射線療法(例えば、外部光線照射、又は放射性標識した抗体などの作用剤を用いた治療)を患者に併用してもよい。上記の併用治療には、併用投与(2以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される)及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体は補助治療(一又は複数)の前及び/又はその後に投与することができる。
本発明の抗体(及び補助治療薬)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、好適な任意の方法投与することができる。
本発明の抗体(及び補助治療薬)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、好適な任意の方法投与することができる。
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、1回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の1〜99%で用いる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0.1mg/kg〜10mg/kg)の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な1日量は、上記の要因に応じて、約1μg/kg〜100mg/kg以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲であろう。ゆえに、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg又は10mg/kgの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は3週ごとに投与してもよい(例えば患者に約2〜約20、例えば約6用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約4mg/kgの初期負荷投与量の後、約2mg/kgの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0.1mg/kg〜10mg/kg)の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な1日量は、上記の要因に応じて、約1μg/kg〜100mg/kg以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲であろう。ゆえに、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg又は10mg/kgの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は3週ごとに投与してもよい(例えば患者に約2〜約20、例えば約6用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約4mg/kgの初期負荷投与量の後、約2mg/kgの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と;(b)組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞毒性剤を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二抗体組成物を特定の症状、例えば癌の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と;(b)組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞毒性剤を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二抗体組成物を特定の症状、例えば癌の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
一般的に本発明を記載したものであって、同様に、限定を意図するのではなく例としてあげる以下の実施例を参照することによって容易に理解しうるであろう。
実施例1 Tyr、Ser、Gly及びArgでランダム化したCDR残基を有するファージディスプレイFabライブラリの構築
Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。このベクターは、米国公開特許第20050119455号及びLee et al., J. Immunol. Meth. 284: 119-132 (2004)に記載されるように構築した。前記ベクター(図5に概略的に示す)はIPTG誘導性Ptacプロモーターの制御下にヒト化抗体4D5可変ドメインを含む。ヒト化抗体4D5は、主に重鎖及び軽鎖のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域と、HER-2に特異的なマウスモノクローナル抗体のCDR領域を有する。抗HER-2抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同定は、米国特許第5821337号及び同第6054297号に示される。
Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。このベクターは、米国公開特許第20050119455号及びLee et al., J. Immunol. Meth. 284: 119-132 (2004)に記載されるように構築した。前記ベクター(図5に概略的に示す)はIPTG誘導性Ptacプロモーターの制御下にヒト化抗体4D5可変ドメインを含む。ヒト化抗体4D5は、主に重鎖及び軽鎖のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域と、HER-2に特異的なマウスモノクローナル抗体のCDR領域を有する。抗HER-2抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同定は、米国特許第5821337号及び同第6054297号に示される。
4つのライブラリ:YSGR-A、YSGR-B、YSGR-CおよびYSGR-Dが構築された。ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3のランダム化した残基により構築した。各ライブラリは、CDRL3の位置91−94および96、CDRH1の位置28および30−33、CDRH2の位置50、52−54、56および58、およびCDRH3の位置95−100、100a、100bおよび100cでランダム化した。各々のランダム化した位置で得られるアミノ酸の種類および比率を図8に記載する。さらに、位置95−100aの7つの野生型コドンを6〜17のコドンと置換したオリゴヌクレオチドを用いることによってCDRH3の長さを変えた。したがって、場合によって、重鎖の位置100aに対応するコドンは存在しない(例えば、以下に示すように、突然変異誘発オリゴヌクレオチドH3-A6 (配列番号:35)、H3-B6 (配列番号:47)、H3-C6 (配列番号:59)又はH3-D6 (配列番号:71)により突然変異を行った場合)。図9A−Dを参照。これらの位置にあるアミノ酸の種類と比率は、CDRH3の位置95−100aに関して図8に示したものと同じであった。
ライブラリは、既に記載のある方法(Sidhu, S.S., Lowman, H.B., Cunningham, B. C. & Wells, J.A., Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363)とともにKunkel (Kunkel, T.A., Roberts, J.D. & Zakour, R.A., Methods Enzymol. (1987), 154, 367-382)の方法を用いて構築した。FabディスプレイベクターFab-Cの特定の「停止鋳型」バージョンを用いて、実施例1に記載のように4つすべのライブラリを作製した。
多様化させる位置の縮重TMTコドンでの突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、(a) CDR多様化の導入と(b) 停止コドンの修復を同時に行った。これらの突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列を図9A−9Dに示す。すべてのライブラリについて、オリゴヌクレオチドH1、H2およびL3(配列番号:)にてそれぞれCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3に多様性を導入した。ライブラリYSGR−Aでは、オリゴヌクレオチドH3−A6、H3−A7、H3−A8、H3−A9、H3−A10、H3−A11、H3−A12、H3−A13、H3−A14、H3−A15、H3−A16およびH3−A17(配列番号:35−46)の等モル混合物にてCDR−H3に多様性を導入した。ライブラリYSGR−Bでは、オリゴヌクレオチドH3−B6、H3−B7、H3−B8、H3−B9、H3−B10、H3−B11、H3−B12、H3−B13、H3−B14、H3−B15、H3−B16およびH3−B17(配列番号:47−58)の等モル混合物にてCDR−H3に多様性を導入した。ライブラリYSGR−Cでは、オリゴヌクレオチドH3−ヘキサメソニウム、H3−C7、H3−C8、H3−C9、H3−C10、H3−C11、H3−C12、H3−C13、H3−C14、H3−C15、H3−C16およびH3−C17(配列番号:59−70)の等モル混合物にてCDR−H3に多様性を導入した。ライブラリYSGR−Dでは、オリゴヌクレオチドH3−D6、H3−D7、H3−D8、H3−D9、H3−D10、H3−D11、H3−D12、H3−D13、H3−D14、H3−D15、H3−D16およびH3−D17(配列番号:71−82)の等モル混合物にてCDR−H3に多様性を導入した。各々の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドのH3−A6からH3−A17(配列番号:35−46)、H3−B6からH3−B17(配列番号:47−58)、H3−C6からH3−C17(配列番号:59−70)およびH3−D6からH3−D17(配列番号:71−82)は、重鎖の位置93にアラニンをコードした。ランダム化するすべてのCDRの突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを単一の突然変異誘発反応に同時に入れて、すべての突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの同時移入により各々の位置を所望のように多様化すると同時にすべてのTAA停止コドンを修復させた。このようにして、ホモ二量体化したシステイン架橋とP3Cに融合したFabライブラリメンバーをコードするオープンリーディングフレームを生成した。突然変異誘発後、4つのライブラリを組み合わせて、ライブラリYSGR−AからDと称する単一のライブラリを作製した。
突然変異誘発反応物を大腸菌SS320内に電気穿孔した(上掲のSidhu等)。形質転換細胞をM13-KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて終夜生育させて、前記ファジミドDNAを包含し、その細胞表面上にFab断片をディスプレイしたファージ粒子を生成した。組み合わせたライブラリは3×1010の異なるメンバーを含有した。
実施例2 ナイーブライブラリYSGR-A−Dからの特異的抗体の選別
ライブラリYSGR-A−D(実施例1に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトDR5又はHER-2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
ヒトDR5配列を表1に示す。表1に示すようにDR5の細胞外ドメインを結合選別に用いた。同様に、ヒトのHER-2配列の細胞外ドメインは、Franklin MC. Carey KD. Vajdos FF. Leahy DJ. de Vos AM. Sliwkowski MX. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex.. Cancer Cell. 5(4): 317-28, 2004に記載のように調製する。ヒトHER-2 ECD(アミノ酸23−646)の配列は、タンパク質データバンク記録1S78(2004)に示される。
ライブラリYSGR-A−D(実施例1に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトDR5又はHER-2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
ヒトDR5配列を表1に示す。表1に示すようにDR5の細胞外ドメインを結合選別に用いた。同様に、ヒトのHER-2配列の細胞外ドメインは、Franklin MC. Carey KD. Vajdos FF. Leahy DJ. de Vos AM. Sliwkowski MX. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex.. Cancer Cell. 5(4): 317-28, 2004に記載のように調製する。ヒトHER-2 ECD(アミノ酸23−646)の配列は、タンパク質データバンク記録1S78(2004)に示される。
5μg/mLの標的タンパク質(ヒトDR5又はヒトHER-2)にてNUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを4℃で終夜をかけてコートし、PBTの溶液(付加的に0.2% BSAと0.05% トゥイーン20(Sigma)を含むリン酸緩衝生理食塩水)にて2時間かけて反応を止めた。既に記載したように(上掲のSidhu等)、ファージを終夜37℃で生育させた後、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、PBTに再懸濁した。コートしたイムノプレートにファージ溶液(およそ1012ファージ/mL)を加えた。2時間インキュベートしてファージを結合させた後、PBSにてプレートを10回洗浄した。0.1M HClにて結合したファージを10分間溶出し、1.0M トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌XL1-ブルーで増幅し、さらなる選別ラウンドに用いた。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して5回の選別ラウンドを行った。各回の選別ラウンドから得た個々のクローンをカルベニシリンとM13−K07を添加した500μLの2YT培養液を含む96ウェルフォーマットにて生育させた。培養物上清をファージELISA(上掲のSidhu等)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがBSAでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイFabを検出した。BSAコートプレートと比較して標的コートプレート上で少なくとも10倍より大きなELISAシグナルを呈するファージクローンを特異的結合体として定義した。ヒトDR5又はヒトHER-2への結合について4及び5回の選別ラウンドの後に個々のクローンをスクリーニングした。特定の結合体を用いて配列分析を行った。また、スポットアフィニティELISA、特異性ELISA及び本明細書中に記載の方法を用いたHER2についての親和性を用いて特定の結合体を分析した。(図11Bを参照)。図10に示すように、YSGR-A−Dライブラリは、両方の標的タンパク質に対して特異的な結合体を生産した。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して5回の選別ラウンドを行った。各回の選別ラウンドから得た個々のクローンをカルベニシリンとM13−K07を添加した500μLの2YT培養液を含む96ウェルフォーマットにて生育させた。培養物上清をファージELISA(上掲のSidhu等)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがBSAでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイFabを検出した。BSAコートプレートと比較して標的コートプレート上で少なくとも10倍より大きなELISAシグナルを呈するファージクローンを特異的結合体として定義した。ヒトDR5又はヒトHER-2への結合について4及び5回の選別ラウンドの後に個々のクローンをスクリーニングした。特定の結合体を用いて配列分析を行った。また、スポットアフィニティELISA、特異性ELISA及び本明細書中に記載の方法を用いたHER2についての親和性を用いて特定の結合体を分析した。(図11Bを参照)。図10に示すように、YSGR-A−Dライブラリは、両方の標的タンパク質に対して特異的な結合体を生産した。
ヒトHER-2に特異的に結合することが同定された240クローンのうち、106クローンは他とは異なるCDR配列を有した(図11を参照)。固有の配列は3つの種類に分類される:1) 6〜7残基のCDRH3配列;2) 8残基のCDRH3配列;そして、3) 配列にチロシン、セリンおよびグリシンを有する中程度の長さのCDR配列。
抗HER-2重鎖可変ドメインは、オリゴライブラリに含まれない短いCDRH3(例えば、95−100aに対応する位置の6〜7アミノ酸)配列の優先度を示す。(図12を参照)。CDRH3は、位置95のN末端に保存されたチロシン残基を示す。他の保存された位置は主にグリシンである位置99に見られる。コンセンサス配列は、CDRL3:QQSYYX4PST(配列番号:587);CDRH1:GFSIX2X3SYIH(配列番号:588);及びCDRH2:SIYPX3SGYTSYADSKVG (配列番号:589)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、各CDRのX位置はY又はSである。
抗HER-2重鎖可変ドメインは、オリゴライブラリに含まれない短いCDRH3(例えば、95−100aに対応する位置の6〜7アミノ酸)配列の優先度を示す。(図12を参照)。CDRH3は、位置95のN末端に保存されたチロシン残基を示す。他の保存された位置は主にグリシンである位置99に見られる。コンセンサス配列は、CDRL3:QQSYYX4PST(配列番号:587);CDRH1:GFSIX2X3SYIH(配列番号:588);及びCDRH2:SIYPX3SGYTSYADSKVG (配列番号:589)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、各CDRのX位置はY又はSである。
8アミノ酸のCDRH3を有する重鎖可変ドメインは、CDRH3のNおよびC末端に(位置95および100aに)保存されたグリシンを有する。また、位置98はチロシンによって保存される。8アミノ酸のCDRH3の位置99は、小さいアミノ酸、例えばG、S、A又はTの優先度を示す。この位置の後に、位置100の大きなアミノ酸、例としてR、H、YおよびWが続く。コンセンサス配列は、CDRH1:GFX1ISYSSIH(配列番号:590);及びCDRH2:SIYPX3YGX5TX6YADSKVG(配列番号:591)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、Y又はSである。
中程度の長さ(例えばおよそ12〜14アミノ酸)のCDRH3領域を有する重鎖可変ドメインの分析により、CDRH3コンセンサス配列X1X2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY (配列番号:592)が示され、このXはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、X1はY、S及びRから選択され、X2はYおよびSから選択され、X3はG、YおよびSから選択され、X4はY、S、RおよびGから選択され、X10はY、SおよびGから選択され、X12はY、S、GおよびRから選択され、X13はGおよびAから選択され、そして、X14はI、F、F及びLから選択される(図14を参照)。CDRH3はループを形成するので、CDRH3のコンセンサスは2アミノ酸に対していくつかのクローンで配列を変えることによって作製し、配列の位置95は、この場合クローン52の配列であった参照配列の位置97と配列比較を行う。また、コンセンサス配列も、CDRH1:GFX1ISSSSIH(配列番号:593)とCDRH2:X1IX2PSSGYTX6YADSKVG(配列番号:594)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、Y又はSである。
中程度の長さ(例えばおよそ12〜14アミノ酸)のCDRH3領域を有する重鎖可変ドメインの分析により、CDRH3コンセンサス配列X1X2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY (配列番号:592)が示され、このXはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、X1はY、S及びRから選択され、X2はYおよびSから選択され、X3はG、YおよびSから選択され、X4はY、S、RおよびGから選択され、X10はY、SおよびGから選択され、X12はY、S、GおよびRから選択され、X13はGおよびAから選択され、そして、X14はI、F、F及びLから選択される(図14を参照)。CDRH3はループを形成するので、CDRH3のコンセンサスは2アミノ酸に対していくつかのクローンで配列を変えることによって作製し、配列の位置95は、この場合クローン52の配列であった参照配列の位置97と配列比較を行う。また、コンセンサス配列も、CDRH1:GFX1ISSSSIH(配列番号:593)とCDRH2:X1IX2PSSGYTX6YADSKVG(配列番号:594)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、Y又はSである。
図11Bに示すように、様々なクローンが0.1〜10nmのIC50でHER2に結合した。多くの場合、これら高親和性結合体は、VEGF、DR5、インスリン、ニュートラビジン、ヒト成長ホルモン、ヒト又はIGF-1といった他の抗原とほとんどないしは全く交差反応しなかった。
図10に示すように、ヒトDR5に対して特異的な結合体であったFabを発現したクローンが144同定された。図15に示す144のクローンから配列分析により18の異なるアミノ酸配列を同定した。
図10に示すように、ヒトDR5に対して特異的な結合体であったFabを発現したクローンが144同定された。図15に示す144のクローンから配列分析により18の異なるアミノ酸配列を同定した。
以下のように、各々のこれら結合体のIC50は、競合的ファージELISAによって決定した。NUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートをhDR5-ECD(5μg/ml)にて4℃で終夜をかけてコートし、BSAにて反応を止めた。Fabをディスプレイするファージを大腸菌XL1-ブルーにて繁殖させ、M13-KO7ヘルパーファージを添加した。2YT培地中で37℃で終夜生育させ、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.5%(w/v)BSA、0.1%(v/v)トゥイーン20(PBTバッファ)に再懸濁した。ファージをPBTバッファにて段階的に希釈し、結合を測定して、飽和状態で50%以下のシグナルとなるファージ濃度を決定した。固定した、飽和以下の濃度のファージをhDR5-ECDの階段希釈液とともに2時間予めインキュベートし、そして、hDR5-ECDによってコートしたプレートをアッセイするために移した。15分間のインキュベートの後、プレートをPBS、0.05%Tween20にて洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ/抗M13抗体コンジュゲート(PBTバッファにて1:5000希釈)とともに30分間インキュベートした。プレートを洗浄して、TMB基質と反応させ、1.0MのH3PO4にて消光して、450nmの分光光度を読んだ。固定したhDR5-ECDへのファージ結合を50%抑制したhDR5-ECDの濃度として定義されるIC50値として、抗hDR5リガンドの結合親和性を決定した。
クローンは、ヒトDR5の細胞外ドメイン(配列番号:595)への結合について分析した。最も低いIC50を有する結合体は、位置96および99で、主にCDRH1ではセリンおよびCDRH3ではアルギニンを有する。重鎖可変ドメインCDRH3領域の分析により、CDRH3コンセンサス配列YRX3YRYGX8X9X10GSYX14X15DY (SEQ ID NO: 596)が示され、このときX3はY、S、R、P及びGから選択され、X8はR、YおよびSから選択され、X9はGおよびYから選択され、X10はS、YおよびRから選択され、X14はGおよびAから選択され、X15はL及びFから選択され、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表す(図16を参照)。また、コンセンサス配列は、X1、X2およびX3がY又はSであるCDRL3:QQX1X2X3SPST(配列番号:597);CDRH1:GFX1IX2SSSIH(配列番号:598);及びCDRH2:X1ISPX3X4GYTX6YADSKVG (配列番号:599)を示し、Xはコンセンサス残基が同定されなかったアミノ酸位置を表し、Y又はSである。コンセンサス配列は、とりわけ、抗体可変ドメインの新規なライブラリを形成するために利用してもよい。CDRH3では、位置97、100b、100c、100hおよび100iのアミノ酸は、より高い親和性に関与しうる。
また、クローンは、上記の競合的ファージELISAを用いてマウスDR5への結合について分析した。ヒトDR5とマウスDR5の両方に結合したいくつかのクローンはYSGR A−Dライブラリから単離したが、マウスDR5への結合はより低い親和性であった。(図17を参照)。このライブラリは、すべてのランダムなCDRH3(20すべてのアミノ酸)およびYS CDRH3ライブラリと比較して同定した結合体は他と異なることを示すマウス及びヒトのDR5に結合することができる抗体の単離を提供した。各々の位置で得られるアミノ酸の多様性を変えることは、異なるエピトープに結合して、固有の生物学的機能を有する抗体を提供しうる。マウス及びヒトのCDRに結合する抗DR5抗体は、既に開発されたライブラリからの抗DR5抗体とは異なるエピトープに結合しうる。
実施例3 DR5に対する結合体の分析
ヒトDR5に対するApo 2Lリガンドの結合部位は既にマッピングされており、結合部位の結晶構造が決定された(Hymowitz et al, Molecular Cell 4:564 (1999);WO01/19861を参照)。結晶構造とモデルは、抗DR5抗体の結合をマッピングするために用いることができる。
以前の研究で、ヒトDR5に結合する抗体が同定されている。これらの抗体はBDF1およびYSD1と称される。抗体BDF1は、CDRが20すべてのアミノ酸によってランダム化されたライブラリから単離され、以下のCDR配列を有する:1) IGKSGIH(配列番号:600)のCDRH1配列;2) VAVIYPHDGNTAYA(配列番号:601)のCDR2配列;そして、3) RLALVRMWMD(配列番号:602)のCDRH3配列。YSD1抗体は、CDR位置がチロシンおよびセリンによって変化していたライブラリから単離して、YSSYYSYYYSSSSYSYのCDRH3配列を有する(配列番号:603)。ヒトDR5に対するこれら抗体の結合部位は分子のN末端に位置し、Apo 2Lリガンドの結合部位とほとんどオーバーラップしていない。これは主にC末端に見られる(50sループのアミノ酸、例えばアミノ酸50−65、90sループのアミノ酸、例えばDR5のアミノ酸91−104)。各々のこれら抗体のCDRH3領域の結合を示すモデルを図18に示す。BDF1とYSD1のCDRH3はオーバーラップしており、DR5への結合のためのホットスポットを形成する。YSD1 CDRH3の結合はチロシンによって媒介され、BFD1の結合はLAL配列によって媒介される。DR5に対するYSD1の結合は、DR5ロイシン、グルタミン、アラニン、フェニルアラニンおよびアルギニン残基を伴う。
ヒトDR5に対するApo 2Lリガンドの結合部位は既にマッピングされており、結合部位の結晶構造が決定された(Hymowitz et al, Molecular Cell 4:564 (1999);WO01/19861を参照)。結晶構造とモデルは、抗DR5抗体の結合をマッピングするために用いることができる。
以前の研究で、ヒトDR5に結合する抗体が同定されている。これらの抗体はBDF1およびYSD1と称される。抗体BDF1は、CDRが20すべてのアミノ酸によってランダム化されたライブラリから単離され、以下のCDR配列を有する:1) IGKSGIH(配列番号:600)のCDRH1配列;2) VAVIYPHDGNTAYA(配列番号:601)のCDR2配列;そして、3) RLALVRMWMD(配列番号:602)のCDRH3配列。YSD1抗体は、CDR位置がチロシンおよびセリンによって変化していたライブラリから単離して、YSSYYSYYYSSSSYSYのCDRH3配列を有する(配列番号:603)。ヒトDR5に対するこれら抗体の結合部位は分子のN末端に位置し、Apo 2Lリガンドの結合部位とほとんどオーバーラップしていない。これは主にC末端に見られる(50sループのアミノ酸、例えばアミノ酸50−65、90sループのアミノ酸、例えばDR5のアミノ酸91−104)。各々のこれら抗体のCDRH3領域の結合を示すモデルを図18に示す。BDF1とYSD1のCDRH3はオーバーラップしており、DR5への結合のためのホットスポットを形成する。YSD1 CDRH3の結合はチロシンによって媒介され、BFD1の結合はLAL配列によって媒介される。DR5に対するYSD1の結合は、DR5ロイシン、グルタミン、アラニン、フェニルアラニンおよびアルギニン残基を伴う。
実施例4 Tyrおよびセリン豊富なCDRH1、H2およびL3残基と、SerとAla、Cys、Phe、Gly、Ile、Leu、Asn、Pro、Arg、Thr、Trp又はTyr豊富なCDRH3残基を有するファージディスプレイFabライブラリの構築。
既に実施例1に記載したように、Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。
12のライブラリ:SAH3、SCH3、SFH3、SGH3、SLH3、SNH3、SPH3、SRH3、STH3、SWH3およびSYH3が構築された。ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3のランダム化した残基により構築した。各ライブラリは、CDRL3の位置91−94および96、CDRH1の位置28および30−33、CDRH2の位置50、52−54、56および58、およびCDRH3の位置95−100、100aから100mでランダム化した。各々のランダム化した位置で得られるアミノ酸の種類と比率を図19A−19Bに記載する。さらに、位置95と100の間の6つの野生型コドンを4〜17のコドンと置換したオリゴヌクレオチドを用いることによってCDRH3の長さを変えた。これらの位置にあるアミノ酸の種類と比率は、CDRH3の位置95−100に関して図19A−19Bに示したものと同じであった。
既に実施例1に記載したように、Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。
12のライブラリ:SAH3、SCH3、SFH3、SGH3、SLH3、SNH3、SPH3、SRH3、STH3、SWH3およびSYH3が構築された。ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3のランダム化した残基により構築した。各ライブラリは、CDRL3の位置91−94および96、CDRH1の位置28および30−33、CDRH2の位置50、52−54、56および58、およびCDRH3の位置95−100、100aから100mでランダム化した。各々のランダム化した位置で得られるアミノ酸の種類と比率を図19A−19Bに記載する。さらに、位置95と100の間の6つの野生型コドンを4〜17のコドンと置換したオリゴヌクレオチドを用いることによってCDRH3の長さを変えた。これらの位置にあるアミノ酸の種類と比率は、CDRH3の位置95−100に関して図19A−19Bに示したものと同じであった。
ライブラリは、既に記載のある方法(Sidhu et al., Methods Enzymol. (2000) 328: 333-363)とともにKunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol. (1987) 154: 367-382)の方法を用いて構築した。FabディスプレイベクターFab-Cの特定の「停止鋳型」バージョンを用いて、実施例1に記載のように4つすべのライブラリを作製した。
多様化させる位置の縮重コドンでの突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、(a) CDR多様化の導入と(b) 停止コドンの修復を同時に行った。これらの突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列を図20A−20Lに示す。すべてのライブラリについて、オリゴヌクレオチドH1、H2およびL3(配列番号:)にてそれぞれCDRH1、CDRH2およびCDRL3に多様性を導入した。
多様化させる位置の縮重コドンでの突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、(a) CDR多様化の導入と(b) 停止コドンの修復を同時に行った。これらの突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列を図20A−20Lに示す。すべてのライブラリについて、オリゴヌクレオチドH1、H2およびL3(配列番号:)にてそれぞれCDRH1、CDRH2およびCDRL3に多様性を導入した。
ライブラリSAH3では、オリゴヌクレオチドH3−SA4、H3−SA5、H3−SA6、H3−SA7、H3−SA8、H3−SA9、H3−SA10、H3−SA11、H3−SA12、H3−SA13、H3−SA14、H3−SA15、H3−SA16およびH3−SA17(配列番号:621−634)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSCH3では、オリゴヌクレオチドH3−SC4、H3−SC5、H3−SC6、H3−SC7、H3−SC8、H3−SC9、H3−SC10、H3−SC11、H3−SC12、H3−SC13、H3−SC14、H3−SC15、H3−SC16およびH3−SC17(配列番号:635−648)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSCH3では、オリゴヌクレオチドH3−SC4、H3−SC5、H3−SC6、H3−SC7、H3−SC8、H3−SC9、H3−SC10、H3−SC11、H3−SC12、H3−SC13、H3−SC14、H3−SC15、H3−SC16およびH3−SC17(配列番号:635−648)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSFH3では、オリゴヌクレオチドH3−SF4、H3−SF5、H3−SF6、H3−SF7、H3−SF8、H3−SF9、H3−SF10、H3−SF11、H3−SF12、H3−SF13、H3−SF14、H3−SF15、H3−SF16およびH3−SF17(配列番号:649−662)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSGH3では、オリゴヌクレオチドH3−SG4、H3−SG5、H3−SG6、H3−SG7、H3−SG8、H3−SG9、H3−SG10、H3−SG11、H3−SG12、H3−SG13、H3−SG14、H3−SG15、H3−SG16およびH3−SG17(配列番号:663−676)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSGH3では、オリゴヌクレオチドH3−SG4、H3−SG5、H3−SG6、H3−SG7、H3−SG8、H3−SG9、H3−SG10、H3−SG11、H3−SG12、H3−SG13、H3−SG14、H3−SG15、H3−SG16およびH3−SG17(配列番号:663−676)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSIH3では、オリゴヌクレオチドH3−SI4、H3−SI5、H3−SI6、H3−SI7、H3−SI8、H3−SI9、H3−SI10、H3−SI11、H3−SI12、H3−SI13、H3−SI14、H3−SI15、H3−SI16およびH3−SI17(配列番号:677−690)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSLH3では、オリゴヌクレオチドH3−SL4、H3−SL5、H3−SL6、H3−SL7、H3−SL8、H3−SL9、H3−SL10、H3−SL11、H3−SL12、H3−SL13、H3−SL14、H3−SL15、H3−SL16およびH3−SL17(配列番号:691−704)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSLH3では、オリゴヌクレオチドH3−SL4、H3−SL5、H3−SL6、H3−SL7、H3−SL8、H3−SL9、H3−SL10、H3−SL11、H3−SL12、H3−SL13、H3−SL14、H3−SL15、H3−SL16およびH3−SL17(配列番号:691−704)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSNH3では、オリゴヌクレオチドH3−SN4、H3−SN5、H3−SN6、H3−SN7、H3−SN8、H3−SN9、H3−SN10、H3−SN11、H3−SN12、H3−SN13、H3−SN14、H3−SN15、H3−SN16およびH3−SN17(配列番号:705−718)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSPH3では、オリゴヌクレオチドH3−SP4、H3−SP5、H3−SP6、H3−SP7、H3−SP8、H3−SP9、H3−SP10、H3−SP11、H3−SP12、H3−SP13、H3−SP14、H3−SP15、H3−SP16およびH3−SP17(配列番号:719−732)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSPH3では、オリゴヌクレオチドH3−SP4、H3−SP5、H3−SP6、H3−SP7、H3−SP8、H3−SP9、H3−SP10、H3−SP11、H3−SP12、H3−SP13、H3−SP14、H3−SP15、H3−SP16およびH3−SP17(配列番号:719−732)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSRH3では、オリゴヌクレオチドH3−SR4、H3−SR5、H3−SR6、H3−SR7、H3−SR8、H3−SR9、H3−SR10、H3−SR11、H3−SR12、H3−SR13、H3−SR14、H3−SR15、H3−SR16およびH3−SR17(配列番号:733−746)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSTH3では、オリゴヌクレオチドH3−ST4、H3−ST5、H3−ST6、H3−ST7、H3−ST8、H3−ST9、H3−ST10、H3−ST11、H3−ST12、H3−ST13、H3−ST14、H3−ST15、H3−ST16およびH3−ST17(配列番号:747−760)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSTH3では、オリゴヌクレオチドH3−ST4、H3−ST5、H3−ST6、H3−ST7、H3−ST8、H3−ST9、H3−ST10、H3−ST11、H3−ST12、H3−ST13、H3−ST14、H3−ST15、H3−ST16およびH3−ST17(配列番号:747−760)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSWH3では、オリゴヌクレオチドH3−SW4、H3−SW5、H3−SW6、H3−SW7、H3−SW8、H3−SW9、H3−SW10、H3−SW11、H3−SW12、H3−SW13、H3−SW14、H3−SW15、H3−SW16およびH3−SW17(配列番号:761−774)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSYH3では、オリゴヌクレオチドH3−SY4、H3−SY5、H3−SY6、H3−SY7、H3−SY8、H3−SY9、H3−SY10、H3−SY11、H3−SY12、H3−SY13、H3−SY14、H3−SY15、H3−SY16およびH3−SY17(配列番号:775−788)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSYH3では、オリゴヌクレオチドH3−SY4、H3−SY5、H3−SY6、H3−SY7、H3−SY8、H3−SY9、H3−SY10、H3−SY11、H3−SY12、H3−SY13、H3−SY14、H3−SY15、H3−SY16およびH3−SY17(配列番号:775−788)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ランダム化するすべてのCDRの突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを単一の突然変異誘発反応に入れて、すべての突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの同時移入により各々の位置を所望のように多様化すると同時にすべてのTAA停止コドンを修復させた。このようにして、ホモ二量体化したシステイン架橋とP3Cに融合したFabライブラリメンバーをコードするオープンリーディングフレームを生成した。突然変異誘発後、12のライブラリを組み合わせて、ライブラリSXH3と称する単一のライブラリを作製した。
突然変異誘発反応物を大腸菌SS320内に電気穿孔した(上掲のSidhu等)。形質転換細胞をM13-KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて終夜生育させて、前記ファジミドDNAを包含し、その細胞表面上にFab断片をディスプレイしたファージ粒子を生成した。組み合わせたライブラリは3×1010の異なるメンバーを含有した。
実施例5 ナイーブライブラリSXH3からの特異的抗体の選別
ライブラリSXH3(上記実施例4に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトHER2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
5μg/mLの標的タンパク質(HER2)にてNUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを4℃で終夜をかけてコートし、PBTの溶液(Sigma)にて2時間かけて反応を止めた。既に記載したように(上掲のSidhu等)、ファージを終夜37℃で生育させた後、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、PBTに再懸濁した。コートしたイムノプレートにファージ溶液(およそ1012ファージ/mL)を加えた。2時間インキュベートしてファージを結合させた後、PBSにてプレートを10回洗浄した。0.1M HClにて結合したファージを10分間溶出し、1.0M トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌XL1-ブルーで増幅し、さらなる選別ラウンドに用いた。
ライブラリSXH3(上記実施例4に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトHER2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
5μg/mLの標的タンパク質(HER2)にてNUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを4℃で終夜をかけてコートし、PBTの溶液(Sigma)にて2時間かけて反応を止めた。既に記載したように(上掲のSidhu等)、ファージを終夜37℃で生育させた後、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、PBTに再懸濁した。コートしたイムノプレートにファージ溶液(およそ1012ファージ/mL)を加えた。2時間インキュベートしてファージを結合させた後、PBSにてプレートを10回洗浄した。0.1M HClにて結合したファージを10分間溶出し、1.0M トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌XL1-ブルーで増幅し、さらなる選別ラウンドに用いた。
ライブラリーを標的タンパク質に対して6回の選別ラウンドを行った。各回の選別ラウンドから得た個々のクローンをカルベニシリンとM13−K07を添加した500μLの2YT培養液を含む96ウェルフォーマットにて生育させた。培養物上清をファージELISA(上掲のSidhu等)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがBSAでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイFabを検出した。BSAコートプレートと比較して標的コートプレート上で少なくとも10倍より大きなELISAシグナルを呈するファージクローンを特異的結合体として定義した。ヒトHER2への結合についての4、5及び6回の選別ラウンドの後に個々のクローンをスクリーニングした。特定の結合体を用いて配列分析を行った。図21に示すように、SXH3ライブラリは、標的タンパク質に特異的な結合体を生産した。
HER2に特異的に結合することが同定された72クローンのうち、27クローンは他とは異なるCDR配列を有した(図21Aを参照)。固有の配列は3つの種類に分類される:(a) 2成分Tyr/Serに限定したランダム化した位置を有するCDR配列(クローン番号B1-5及びB28);(b) 2成分Trp/Serに限定したランダム化した位置を有するCDR配列(クローン番号B6-24);(c) 2成分Phe/Serに限定したランダム化した位置を有するCDR配列(クローン番号B25-27)。また、これらのクローンはHER2に非常に特異的であって、5つの他のコントロールタンパク質、ヒトVEGF、ヒトDR5、ヒトインスリン、ニュートラビジン、ヒトIGF-1又はHGHに交差反応を示さなかった(図21Bを参照)。各クローンの阻害性濃度を図21Bに示す。
ファージELISAを用いて、標的抗原以外の6つの抗原のパネルと交差反応するすべてのクローンの能力を試験した。記載したように96ウェルフォーマットにおいてファージを産生させ、ファージ上清をPBTバッファにて3倍に希釈した。希釈したファージ上清を、ヒトVEGF、HER2、ヒトDR5、ヒトインスリン、ニュートラビジン、ヒトIGF-1、HGF又はBSAにてコートしたプレートに移し、室温でゆっくり撹拌しながら1時間インキュベートした。プレートを0.05%Tween20を含むPBSにて洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ/抗M13抗体コンジュゲート(PTバッファにて1:5000希釈)(Pharmacia)とともに30分間インキュベートした。プレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Laboratories)と反応させ、1.0MのH3PO4にて消光した。分光光度法にて450nmの吸光度を決定した。弱い交差反応を0.2−2.0のシグナルとして定義し、強い交差反応をおよそ2.0のシグナルとして定義した。HER2結合クローンの結果を図21Bに示す。図25に示すように、単離したSXH3クローンのうち、S:Rクローンは最も大きな平均非特異的結合(ELISAアッセイによる450nmで0.5−0.6OD)を示したのに対して、S:W、S:Y及びS:Fクローンはそれぞれ同様に低いレベルの平均非特異的結合(ELISAアッセイによる450nmで0−0.1OD)を示した。
競合ファージELISAを用いて、HER2-結合ファージディスプレイFabの結合親和性を推定した。記載したように96ウェルフォーマットにおいてファージを産生させ、ファージ上清をPBTバッファにて段階的に希釈し、そしてHER2でコートしたプレート上で15分間インキュベートした。プレートを0.05%Tween20を含むPBSにて洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ/抗M13抗体コンジュゲート(PTバッファにて1:5000希釈)(Pharmacia)とともに30分間インキュベートした。プレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Laboratories)と反応させ、1.0MのH3PO4にて消光した。分光光度法にて450nmの吸光度を測定して、飽和状態でおよそ50%以下のシグナルとなるファージ濃度を決定した。固定した、飽和以下の濃度のファージを、PBTバッファ又は250nM HER2から0.12nM HER2のHER2タンパク質の2倍階段希釈物を含むPBTバッファにて2倍希釈した。混合物をゆっくりと撹拌しながら室温で1時間インキュベートし、HER2でコートしたプレートに移し、プレートを15分間インキュベートした。プレートを洗浄し、上記のように正確に処理した。結合親和性をIC50値として推定した(固定した抗原へのファージ結合を50%抑制した抗原の濃度として定義される)。結果を図21Bに示す。
実施例6 SerとPhe、Arg、Trp又はTyr豊富なCDR残基を有するファージディスプレイFabライブラリの構築
既に実施例1に記載したように、Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。
4つのライブラリ:SFH3、SRH3、SWH3およびSYH3が構築された。ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3のランダム化した残基により構築した。各ライブラリは、CDRL3の位置91−94および96、CDRH1の位置28および30−33、CDRH2の位置50、52−54、56および58、およびCDRH3の位置95−100、100aから100mでランダム化した。各々のランダム化した位置で得られるアミノ酸の種類と比率を図22に記載する。さらに、位置95と100の間の6つの野生型コドンを4〜17のコドンと置換したオリゴヌクレオチドを用いることによってCDRH3の長さを変えた。これらの位置にあるアミノ酸の種類と比率は、CDRH3の位置95−100に関して図22に示したものと同じであった。
既に実施例1に記載したように、Fab重鎖と遺伝子3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入したフリーシステインによって二量体化した二価のFab分子をディスプレイするファジミドベクターであるFab-Cを用いて、ファージディスプレイFabライブラリを構築した。
4つのライブラリ:SFH3、SRH3、SWH3およびSYH3が構築された。ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3のランダム化した残基により構築した。各ライブラリは、CDRL3の位置91−94および96、CDRH1の位置28および30−33、CDRH2の位置50、52−54、56および58、およびCDRH3の位置95−100、100aから100mでランダム化した。各々のランダム化した位置で得られるアミノ酸の種類と比率を図22に記載する。さらに、位置95と100の間の6つの野生型コドンを4〜17のコドンと置換したオリゴヌクレオチドを用いることによってCDRH3の長さを変えた。これらの位置にあるアミノ酸の種類と比率は、CDRH3の位置95−100に関して図22に示したものと同じであった。
ライブラリは、既に記載のある方法(Sidhu, S.S., Lowman, H.B., Cunningham, B. C. & Wells, J.A., Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363)とともにKunkel (Kunkel, T.A., Roberts, J.D. & Zakour, R.A., Methods Enzymol. (1987), 154, 367-382)の方法を用いて構築した。FabディスプレイベクターFab-Cの特定の「停止鋳型」バージョンを用いて、実施例1に記載のように4つすべのライブラリを作製した。
多様化させる位置の縮重コドンでの突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、(a) CDR多様化の導入と(b) 停止コドンの修復を同時に行った。これらの突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列を図20と23に示す。ライブラリSF-表面では、オリゴヌクレオチドL3-SF、H1-SFおよびH2-SF(配列番号:)にてそれぞれCDR-L3、CDR-H1およびCDR-H2に多様性を導入し(図23)、オリゴヌクレオチドH3-SF4、H3-SF5、H3-SF6、H3-SF7、H3-SF8、H3-SF9、H3-SF10、H3-SF11、H3-SF12、H3-SF13、H3-SF14、H3-SF15、H3-SF16およびH3-SF17(配列番号:649−662)(図20C)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSR-表面では、オリゴヌクレオチドL3-SR、H1-SRおよびH2-SR(配列番号:)にてそれぞれCDR-L3、CDR-H1およびCDR-H2に多様性を導入し(図23)、オリゴヌクレオチドH3-SR4、H3-SR5、H3-SR6、H3-SR7、H3-SR8、H3-SR9、H3-SR10、H3-SR11、H3-SR12、H3-SR13、H3-SR14、H3−SR15、H3−SR16およびH3−SR17(配列番号:733−746)(図20I)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSW−表面では、オリゴヌクレオチドL3−SW、H1−SWおよびH2−SW(配列番号:747−760)にてそれぞれCDR−L3、CDR−H1およびCDR−H2に多様性を導入し(図23)、オリゴヌクレオチドH3−SW4、H3−SW5、H3−SW6、H3−SW7、H3−SW8、H3−SW9、H3−SW10、H3−SW11、H3−SW12、H3−SW13、H3−SW14、H3−SW15、H3−SW16およびH3−SW17(配列番号:761−774)(図20K)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSY−表面では、オリゴヌクレオチドL3、H1およびH2(配列番号:)にてそれぞれCDR−L3、CDR−H1およびCDR−H2に多様性を導入し(図20A)、オリゴヌクレオチドH3−SY4、H3−SY5、H3−SY6、H3−SY7、H3−SY8、H3−SY9、H3−SY10、H3−SY11、H3−SY12、H3−SY13、H3−SY14、H3−SY15、H3−SY16およびH3−SY17(配列番号:775−788)(図20L)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSW−表面では、オリゴヌクレオチドL3−SW、H1−SWおよびH2−SW(配列番号:747−760)にてそれぞれCDR−L3、CDR−H1およびCDR−H2に多様性を導入し(図23)、オリゴヌクレオチドH3−SW4、H3−SW5、H3−SW6、H3−SW7、H3−SW8、H3−SW9、H3−SW10、H3−SW11、H3−SW12、H3−SW13、H3−SW14、H3−SW15、H3−SW16およびH3−SW17(配列番号:761−774)(図20K)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ライブラリSY−表面では、オリゴヌクレオチドL3、H1およびH2(配列番号:)にてそれぞれCDR−L3、CDR−H1およびCDR−H2に多様性を導入し(図20A)、オリゴヌクレオチドH3−SY4、H3−SY5、H3−SY6、H3−SY7、H3−SY8、H3−SY9、H3−SY10、H3−SY11、H3−SY12、H3−SY13、H3−SY14、H3−SY15、H3−SY16およびH3−SY17(配列番号:775−788)(図20L)の等モル混合物にてCDRH3に多様性を導入した。
ランダム化するすべてのCDRの突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを単一の突然変異誘発反応に入れて、すべての突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの同時移入により各々の位置を所望のように多様化すると同時にすべてのTAA停止コドンを修復させた。このようにして、ホモ二量体化したシステイン架橋とP3Cに融合したFabライブラリメンバーをコードするオープンリーディングフレームを生成した。突然変異誘発後、4つのライブラリを組み合わせて、ライブラリSX-表面と称する単一のライブラリを作製した。
突然変異誘発反応物を大腸菌SS320内に電気穿孔した(上掲のSidhu等)。形質転換細胞をM13-KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて終夜生育させて、前記ファジミドDNAを包含し、その細胞表面上にFab断片をディスプレイしたファージ粒子を生成した。組み合わせたライブラリは3×1010の異なるメンバーを含有した。
突然変異誘発反応物を大腸菌SS320内に電気穿孔した(上掲のSidhu等)。形質転換細胞をM13-KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて終夜生育させて、前記ファジミドDNAを包含し、その細胞表面上にFab断片をディスプレイしたファージ粒子を生成した。組み合わせたライブラリは3×1010の異なるメンバーを含有した。
実施例7 ナイーブライブラリSX表面からの特異的抗体の選別
ライブラリSX-表面(上記実施例6に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトHER2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
5μg/mLの標的タンパク質(ヒトHER2)にてNUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを4℃で終夜をかけてコートし、PBTの溶液(Sigma)にて2時間かけて反応を止めた。既に記載したように(上掲のSidhu等)、ファージを終夜37℃で生育させた後、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、PBTに再懸濁した。コートしたイムノプレートにファージ溶液(およそ1012ファージ/mL)を加えた。2時間インキュベートしてファージを結合させた後、PBSにてプレートを10回洗浄した。0.1M HClにて結合したファージを10分間溶出し、1.0M トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌XL1-ブルーで増幅し、さらなる選別ラウンドに用いた。
ライブラリSX-表面(上記実施例6に記載)のファージについて結合選別ラウンドを繰り返して、ヒトHER2に結合するクローンについて濃縮した。この結合選別は既に記載の方法(上掲のSidhu等)を用いて行った。
5μg/mLの標的タンパク質(ヒトHER2)にてNUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを4℃で終夜をかけてコートし、PBTの溶液(Sigma)にて2時間かけて反応を止めた。既に記載したように(上掲のSidhu等)、ファージを終夜37℃で生育させた後、PEG/NaClにて沈殿させて濃縮し、PBTに再懸濁した。コートしたイムノプレートにファージ溶液(およそ1012ファージ/mL)を加えた。2時間インキュベートしてファージを結合させた後、PBSにてプレートを10回洗浄した。0.1M HClにて結合したファージを10分間溶出し、1.0M トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌XL1-ブルーで増幅し、さらなる選別ラウンドに用いた。
ライブラリーを標的タンパク質に対して6回の選別ラウンドを行った。各回の選別ラウンドから得た個々のクローンをカルベニシリンとM13−K07を添加した500μLの2YT培養液を含む96ウェルフォーマットにて生育させた。培養物上清をファージELISA(上掲のSidhu等)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがBSAでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイFabを検出した。BSAコートプレートと比較して標的コートプレート上で少なくとも10倍より大きなELISAシグナルを呈するファージクローンを特異的結合体として定義した。ヒトHER2への結合についての4、5及び6回の選別ラウンドの後に個々のクローンをスクリーニングした。特定の結合体を用いて配列分析を行った。図24に示すように、SX-表面ライブラリは、標的タンパク質に特異的な結合体を生産した。
HER2に特異的に結合することが同定された81クローンのうち、27クローンは他とは異なるCDR配列を有した(図24Aを参照)。固有の配列は2つの種類に分類される:(a) 2成分Tyr/Serに限定したランダム化した位置を有するCDR配列(クローン番号G49-61);(b) 2成分Trp/Serに限定したランダム化した位置を有するCDR配列(クローン番号G29-48)。Tyr/SerクローンはHER2に非常に特異的であって、5つの他のコントロールタンパク質、ヒトVEGF、ヒトDR5、ヒトインスリン、ニュートラビジン、ヒトIGF-1又はHGHに交差反応を示さなかった(図24Bを参照)。しかしながら、いくつかのTrp/Serクローンは、交差反応した(図24Bを参照)。各クローンの阻害性濃度を図24Bに示す。
ファージELISAを用いて、標的抗原以外の6つの抗原のパネルと交差反応するすべてのクローンの能力を試験した。記載したように96ウェルフォーマットにおいてファージを産生させ、ファージ上清をPBTバッファにて3倍に希釈した。希釈したファージ上清を、ヒトVEGF、HER2、ヒトDR5、ヒトインスリン、ニュートラビジン、ヒトIGF-1、HGF又はBSAにてコートしたプレートに移し、室温でゆっくり撹拌しながら1時間インキュベートした。プレートを0.05%Tween20を含むPBSにて洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ/抗M13抗体コンジュゲート(PTバッファにて1:5000希釈)(Pharmacia)とともに30分間インキュベートした。プレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Laboratories)と反応させ、1.0MのH3PO4にて消光した。分光光度法にて450nmの吸光度を決定した。弱い交差反応を0.2−2.0のシグナルとして定義し、強い交差反応をおよそ2.0のシグナルとして定義した。SX-表面クローンの結果を図24Bに示す。図27に示すように、単離したSX-表面クローンのうち、S:R及びS:Wクローンは最も大きな平均非特異的結合(ELISAアッセイによる450nmでそれぞれ0.5−0.6OD及びおよそ4.0OD)を示したのに対して、S:Y及びS:Fクローンはそれぞれ同様に低いレベルの平均非特異的結合(ELISAアッセイによる450nmで0−0.1OD)を示した。
競合ファージELISAを用いて、HER2-結合ファージディスプレイFabの結合親和性を推定した。記載したように96ウェルフォーマットにおいてファージを産生させ、ファージ上清をPBTバッファにて段階的に希釈し、そしてHER2でコートしたプレート上で15分間インキュベートした。プレートを0.05%Tween20を含むPBSにて洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ/抗M13抗体コンジュゲート(PTバッファにて1:5000希釈)(Pharmacia)とともに30分間インキュベートした。プレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Laboratories)と反応させ、1.0MのH3PO4にて消光した。分光光度法にて450nmの吸光度を測定して、飽和状態でおよそ50%以下のシグナルとなるファージ濃度を決定した。固定した、飽和以下の濃度のファージを、PBTバッファ又は250nM HER2から0.12nM HER2のHER2タンパク質の2倍階段希釈物を含むPBTバッファにて2倍希釈した。混合物をゆっくりと撹拌しながら室温で1時間インキュベートし、HER2でコートしたプレートに移し、プレートを15分間インキュベートした。プレートを洗浄し、上記のように正確に処理した。結合親和性をIC50値として推定した(固定した抗原へのファージ結合を50%抑制した抗原の濃度として定義される)。結果を図24Bに示す。
この、SXH3ライブラリ(実施例6)及びYSGR-A−Dライブラリ(実施例1)からのHER2結合クローンの分析に基づいて、3つのクローン(クローン番号42(YSGR-A)及びB11(SXH3)及びG54(SX-表面))の可溶性Fabタンパク質を精製して、ヒトHER2への結合について表面プラスモン共鳴分析を行った。Chen等, J Mol Biol. (1999), 293(4):865-81に従ってBIAcore(登録商標)データを得た。簡単に言うと、BIAcore(登録商標)-A100表面プラズモン共鳴システム(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いて測定した会合速度と解離速度の定数からヒトHER2に対する精製したFabの結合親和性を算出した。提供者(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)の指示に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN-ヒドロキシスクシニミド(NHS)を用いて、HER2を2つの異なる濃度でバイオセンサーチップに共有的にカップリングさせた。HER2のバッファを10mM 酢酸ナトリウム、pH5.0に置き換え、およそ2.5又は5.0μg/mlに希釈した。カップリングしたタンパク質の反応単位(RU)がおよそ50−170になるように5μL/分の流速で一定量のHER2を注入した。ブロック試薬として1Mのエタノールアミン溶液を注入した。動力学的な測定のために、2倍の段階希釈した各Fabを25℃、各フローセルに対して10μl/分の流速でHBTに注入した。2点包括的フィッティング(two-spot global fitting)を用い、両フローセルからのデータを組み合わせて、BIAevaluationソフトウェアパッケージを用いて、結合曲線からKonとKoff値を決定した。平衡解離定数(KD)をKoff/Konとして算出した。BIAcore(登録商標)データを図26AおよびBにまとめる。クローンB11は、1.9×106M−1s−1のka、1.7×10−3s−1のkd、および890pMのKDであった。クローンB11実験ではRmax1は19RUであり、クローンB11実験ではRmax2は29RUであった。(図26A)。クローンG54は、2.0×105 M−1s−1のka、2.2×10−3 s−1のkd、及び11nMのKDであった。クローンG54実験ではRmax1は21RUであり、クローンG54実験ではRmax2は34RUであった。(図26A)。クローンYSGR−A−42は、2.7×106M−1s−1のka、1.5×10−3s−1のkd、および570pMのKDであった。クローン42実験ではRmax1は25RUであり、クローン42実験ではRmax2は38RUであった。(図26B)。トリプトファン含有クローン(B11)は、チロシン含有クローン(G54)より速いkonを有すると同時により小さいKDを有した。
哺乳動物細胞上に発現するHER2への抗HER2抗体の結合を調べるために、クローン42(YSGR−A)、B11(SXH3)、G54(SX−表面)及びG37(SX−表面)の精製したFabタンパク質の、HER2を過剰発現するNR6線維芽細胞(NR6−HER2)への結合をフローサイトメトリーによって試験した。100万個のNR6−HER2細胞を10μg/mlのFabとともに1時間インキュベートした後、Alexa488−コンジュゲートマウス抗ヒトIgG抗体とともに1時間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、NR6を発現していない細胞へのFab結合を調べた。ポジティブコントロールとして、4D5 Fabを用いた。図27に示すように、クローン42、B11、G54及びG37はNR6細胞上のHer2に特異的に結合する。
競合的ELISAを用いて、ハーセプチンとオムニタルグ(Omnitarg)とIgG形式の様々なHER2クローン間の結合競合を調べた(関係するクローンのCDR配列については図28を参照)。ビオチン化HER2タンパク質をPBTバッファにて200nMから0.39nMに段階希釈し、そして精製したIgGタンパク質にてコートしたプレート上で15分間インキュベートした。プレートを0.05%Tween20を含むPBSにて洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ/抗M13抗体コンジュゲート(PTバッファにて1:5000希釈)(Pharmacia)とともに30分間インキュベートした。プレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Laboratories)と反応させ、1.0MのH3PO4にて消光した。分光光度法にて450nmの吸光度を測定して、飽和状態でおよそ50%のシグナルとなるビオチン化HER2濃度を決定した。固定した、飽和以下の濃度のビオチン化HER2を、PBTバッファ又は100nMの精製したIgGタンパク質を含むPBTバッファにて2倍希釈した。混合物をゆっくりと撹拌しながら室温で1時間インキュベートし、IgGタンパク質でコートしたプレートに移し、プレートを15分間インキュベートした。プレートを洗浄し、上記のように処理した。図29に示すように、HER2結合IgGは、オムニタルグとハーセプチンのいずれへのビオチン化HER2の結合も阻害しなかった。IgGは2群の互いの間の結合は阻害した。クローンB11、G37、G54及びYSGR-A-42から構成されたグループ1は、同じエピトープについて競合し、これらのクローンのいずれかと予めインキュベートしたビオチン化HER2への結合を阻害した。クローンYSGR-A-27、B27、G43及びYSGR-D-104から構成されたグループ2は、HER2上の同じエピトープについて競合し、ビオチン化HER2への結合を阻害した。グループ1のクローンはグループ2のクローンよりもすべて高い親和性の結合体である。
Claims (20)
- 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がS及びYから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−H(配列番号:22)を含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号:23)を含み、
(iii) CDRH3配列を含む、ポリペプチド。 - CDRH3配列が、
(a) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:24)、
(b) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S、及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が25% Y、50% S及び25% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:26)、
(c) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が38% Y、25% S、25% G及び12% Rのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:27)、
(d) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が20% Y、26% S、26% G、13% R、1% A、1% D、1% E、1% F、1% H、1% I、1% K、1% L、1% M、1% N、1% P、1% Q、1% T、1% V及び1% Wのモル比のアミノ酸のプールから選択されされるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そして、X19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y(配列番号:28)、
(e) アミノ酸配列X1−R−S−Y−R−Y−G−S−Y−X10−G−S−Y−X14−F−D−Y(配列番号:575)、
(f) カバット番号付けに従ってX1が位置95にあって、Y及びRから選択され、X2がY、S及びRから選択され、X3がS、G、Y及びHから選択され、X4がS、G、Y及びRから選択され、X5がG及びAから選択され、X6がF、M、L及びAから選択され、そして、X7がF、M及びLから選択されるかないしは欠失している、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−D−Y(配列番号:582)、
(g) カバット番号付けに従ってX1がアミノ酸位95にあって、Y、S及びGから選択され、X2がY、S、G、R、A及びMから選択され、X3がG、Y、S及びRから選択され、X4がG、Y及びFから選択され、X5がY、S、N及びGから選択され、X6がY、R、H及びWから選択され、X7がG及びAから選択され、そして、X8がF、M、L及びIから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−D−Y(配列番号:583)、
(h) X1がアミノ酸位95であって、Y、S、R、G及びEから選択され、X2がY、S、R及びGから選択され、X3がS、Y、G及びWから選択され、X4がS、Y、G及びQから選択され、X5がG、Y及びSから選択され、X6がG、Y、S、R及びVから選択され、X7がS、Y、G及びRから選択され、X8がY、S、G、R、P及びVから選択され、X9がG、A,Y、S及びRから選択され、X10がM、F、G、Y、S及びRから選択され、X11がA、Y、S、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X12がI、M、F、L、A、G、S、Y、R及びTから選択されるかないしは存在せず、X13がF、M、L、G、A、Y、T及びSから選択されるかないしは存在せず、X14がL、M、F、I、G、Y、A及びTから選択されるかないしは存在せず、X15がM、L、Y、G及びRから選択されるかないしは存在せず、X16がY及びGから選択されるかないしは存在せず、X17がR、M及びGから選択されるかないしは存在せず、X18がP及びAから選択されるかないしは存在せず、そして、X18がLであるかないしは存在しない、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Y (配列番号:584)、又は
(i) カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、位置X1−X17のそれぞれのアミノ酸がSと、A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W又はYのいずれか一とから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19
を含む、請求項1に記載のポリペプチド。 - ポリペプチドがヒトのDR5に結合する、請求項1から2のいずれか一に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが抗体である、請求項3に記載のポリペプチド。
- さらに、軽鎖可変ドメインを含んでなり、このとき
(i) CDRL3が、X1が位置91にあって、Y、H及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY、S及びTから選択され、X4がY、S及びTから選択され、そして、X5がS、P及びYから選択される、アミノ酸配列Q−Q−X1−X2−X3−X4−P−X5−T (配列番号:25)を含むか、又は、
位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R又はFのいずれか一とから選択される、請求項1から4のいずれか一に記載のポリペプチド。 - 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1−X5がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX6が位置50であり、このときX6−X11がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X6−I−X7−P−X8−X9−G−X10−T−X11−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX12が位置95であって、このときnが重鎖可変ドメインの機能的活性を保持しうる適切な数であり、X12−X19がシステイン以外の天然に生じるアミノ酸である、アミノ酸配列X12−X13−X14−X15−X16−(X17)n−X18−X19−D−Yを含む、ポリペプチド。 - 免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなるポリペプチドであって、
(i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このとき位置X1−X5のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R又はFのいずれか一とから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R又はFのいずれか一とから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であって、このとき位置X1−X19のそれぞれのアミノ酸がSと、Y、W、R又はFのいずれか一とから選択されるかないしは存在せず、このときX18がG及びAから選択され、そして、X19がF、L、I及びMから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19を含む、ポリペプチド。 - ポリペプチドがヒトのHER-2を結合する、請求項1から7のいずれか一に記載のポリペプチド。
- さらに、変異体CDRH1、CDRH2、CDRH3及び/又はCDRL3に対応するポリペプチド可変ドメインについてフレームワーク領域FR1、FR2、FR3及び/又はFR4を含んでなり、該フレームワーク領域が単一ポリペプチド鋳型から得られる、請求項1から8のいずれか一に記載のポリペプチド。
- さらに、重鎖ポリペプチド可変ドメインのC末端領域に連結される二量体化ドメインを含んでなる、請求項1から9のいずれか一に記載のポリペプチド。
- ポリペプチド可変ドメインがウイルスコートタンパク質の少なくとも一部に融合される、請求項1から10のいずれか一に記載のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチド。
- 請求項1から11のいずれか一に記載のポリペプチドと担体を含んでなる組成物。
- 請求項1から11のいずれか一に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- ポリペプチドの産生に適切な条件下で請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を培養して、ポリペプチド又はその抗原結合断片を回収することを含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
- 少なくとも1×104の異なる抗体可変ドメイン配列を有する、請求項1から11のいずれか一に記載のポリペプチドの複数を含んでなるライブラリ。
- 複数のポリペプチドを含んでなる組成物の製造方法であって、
(a) (i) CDRH1は、カバット番号付けシステムに従ってGが位置26であり、X1が位置28であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、そしてX5がY及びSから選択される、アミノ酸配列G−F−X1−I−X2−X3−X4−X5−I−Hを含み、
(ii) CDRH2は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置50であり、このときX1がY及びSから選択され、X2がY及びSから選択され、X3がY及びSから選択され、X4がY及びSから選択され、X5がY及びSから選択され、そしてX6がY及びSから選択される、アミノ酸配列X1−I−X2−P−X3−X4−G−X5−T−X6−Y−A−D−S−V−K−Gを含み、
(iii) CDRH3は、カバット番号付けシステムに従ってX1が位置95であり、このとき位置X1−X6のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S、及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択され、位置X7−X17のそれぞれのアミノ酸が50% Y、25% S及び25% Gのモル比のアミノ酸のプールから選択されるかないしは存在せず、X18がG及びAから選択され、そしてX19がI、M、L及びFから選択される、アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−D−Yを含む、複数のポリペプチドを製造することを含んでなる方法。 - ポリペプチドのライブラリから標的抗原に結合するポリペプチドを選別する方法であって、
(a) 請求項1から11のいずれか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを単離し、
(b) 標的抗原に特異的に結合しないポリペプチドから標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを分離し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドを回収し、標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を得て、そして、
(c) 場合によって、前の選別ラウンドから得られた標的抗原に特異的に結合する一又は複数のポリペプチドについて濃縮されたサブ集団を用いて(a)−(b)の工程を少なくとも2度繰り返す、
ことを含んでなる方法。 - 請求項1から11のいずれか一に記載のポリペプチドを含有してなる、哺乳動物の癌を治療するための医薬。
- 請求項1から11のいずれか一に記載のポリペプチドを含有してなる、炎症性又は免疫性の疾患に罹患しているか又は該疾患を発達させるリスクにある哺乳動物を治療するための医薬。
- ポリペプチドが抗DR5抗体である、請求項18又は19に記載の医薬。
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