JP2009139214A - ポリマー微粒子分散物、それを含む測定用組成物及びそれを用いた被検物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便で高感度かつ検出の定量性に優れた新規な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物及び該測定用組成物に用いるポリマー微粒子分散物を提供することにある。
【解決手段】フルオレンオリゴマー微粒子を内部に含有するポリマー微粒子及び分散媒を含むポリマー微粒子分散物であって、前記ポリマー微粒子が、その表面に被検物質を認識する部位を有することを特徴とするポリマー微粒子分散物。
【選択図】なし

Description

本発明は、簡便で高感度かつ検出の定量性に優れた新規な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物及び該測定用組成物に用いるポリマー微粒子分散物に関する。

癌等の疾患に罹ると、動物の体内では特定の微量タンパク質の量が増減する現象が見られる。従って、疾患の種類や重篤度合いと、増減するタンパク質の種類に相関関係が見出される場合、動物の体内の該タンパク質の量を測定することにより、疾患の識別や悪性度の診断が可能である。このようなタンパク質の分析には迅速かつ高感度な分析方法が求められる。この免疫測定法（イムノアッセイともいう）には様々な分析方法が用いられるが、抗体または抗原を酵素で標識したものを用いるＥＬＩＳＡ法が広く使用されている。一般に、ＥＬＩＳＡ法の感度は概ねタンパク質０．００１〜０．１μｇといわれている。分析ステップとしては被検物質のタンパク質との抗原抗体反応、二次抗体との抗原抗体反応、酵素反応による発色反応の３ステップから構成されており（例えば、特許文献１及び２参照）、高感度化の手法としてはリポソームを利用した感度増幅が知られている（例えば、非特許文献１、特許文献３参照）。

しかし酵素反応が必要であるため、比較的分析時間が長く、ＥＬＩＳＡ法よりさらに短時間で簡便な分析方法が望まれていた。

これを受けて近年では、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法がしばしば使用されている。これは検出手段が蛍光測定であるため、酵素反応に比べ大幅に分析時間を短縮できる。実際に様々な蛍光ラベル化試薬が市販されているが、比較的安価で普及しているもの（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣともいう）等）では感度が充分ではなかった。

これに対し、特許文献４、５では蛍光色素をポリマー粒子表面に多数個結合または内部に含有させることで、一つの検体に対し多数の信号を与える標識を付与することを可能としている。しかしながら、これらの方法では、含有させた色素が凝集して充分な発光強度が得られなくなることが多かった。より簡便に、一つの検体に対し多数の信号を与えるような標識粒子の開発が望まれていた。

一方、非特許文献２では特殊な構造のフルオレンオリゴマーが凝集して微粒子を作ることが報告されている。このフルオレンオリゴマー凝集微粒子は強いエキシマー発光を放つことが知られている。
特開昭６３−５０２９５８号公報 特表２０００−５０９４９４号公報 特開２００３−１４９２４６号公報 特開平５−５２８４８号公報 特開平６−３２２１７６号公報 Ｄａｎｋｅ Ｘｕ，Ｑｕａｎ Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４，１４３１４−１４３１５（２００２） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２８（２８），９０３６−９０３７（２００６）

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、簡便で高感度かつ検出の定量性に優れた新規な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物及び該測定用組成物に用いるポリマー微粒子分散物を提供することにある。

本発明の上記課題は、以下の構成により達成される。

１．フルオレンオリゴマー微粒子を内部に含有するポリマー微粒子及び分散媒を含むポリマー微粒子分散物であって、前記ポリマー微粒子が、その表面に被検物質を認識する部位を有することを特徴とするポリマー微粒子分散物。

２．前記フルオレンオリゴマー微粒子を構成するフルオレンオリゴマーの少なくとも一つが、下記一般式（１）で表されることを特徴とする前記１に記載のポリマー微粒子分散物。

（式中Ｒ₁、Ｒ₂は親水性置換基、Ｒ₃〜Ｒ₆は疎水性置換基、Ｒ₇〜Ｒ₁₂はハロゲン原子または置換基を表し、ａ〜ｄは０〜３の整数、ｅ、ｆは０〜４の整数を表す。）
３．前記１または２に記載のポリマー微粒子分散物を含むことを特徴とする測定用組成物。

４．前記３に記載の測定用組成物を用いることを特徴とする被検物質の検出方法。

５．被検物質が蛋白質であることを特徴とする前記４に記載の被検物質の検出方法。

本発明により、簡便で高感度かつ検出の定量性に優れた新規な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物及び該測定用組成物に用いるポリマー微粒子分散物を提供を提供できた。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、フルオレンオリゴマーから構成される微粒子をポリマーにて被覆し、その表面に被検物質を認識する部位を有するポリマー微粒子の分散物により、簡便で高感度かつ検出の定量性に優れた新規な被検物質の検出方法に用いるポリマー微粒子分散物が得られることを見出し、本発明に至った次第である。

本発明のフルオレンオリゴマーは凝集した状態で強いエキシマー発光を放つため、通常の色素を分散させる場合に起こる凝集による消光の懸念がなく、信号強度を高めることができ、被検物質の検出が高感度に行える。また、自己集合的に微粒子が形成されるため、非常に簡便に微粒子分散物を作成することができる。

また驚くべきことに本発明のポリマー微粒子分散物は、従来の色素、フルオレンオリゴマー粒子そのものに比べ、信号の時間安定性がよく、検出の定量性に優れている。

〔ポリマー微粒子の形態〕
図１は、本発明に用いられるポリマー微粒子の断面を示す模式図である。

図のように、本発明に係るポリマー微粒子２はフルオレンオリゴマー微粒子１を内部に含み、表面に被検物質を認識する部位３を有する。なお、フルオレンオリゴマー微粒子１はポリマー微粒子２中に、分散した形で含有されていてもよいし（図１（ａ））、凝集した状態で含有されていてもよい（図１（ｂ））。また、フルオレンオリゴマー微粒子１はポリマー微粒子２内部ばかりでなく、表面に一部が露出していてもよい。

〔フルオレンオリゴマー微粒子〕
本発明の特徴であるフルオレンオリゴマー微粒子を構成するフルオレンオリゴマーは、フルオレン構造が３〜６連結した構造であることが好ましく、それぞれ従来公知の置換基によって置換されていてもよい。

フルオレンオリゴマーとして特に好ましいのは、前記一般式（１）で表される構造である。

一般式（１）において、Ｒ₁、Ｒ₂は親水性置換基、Ｒ₃〜Ｒ₆は疎水性置換基、Ｒ₇〜Ｒ₁₂はハロゲン原子または置換基を表し、ａ〜ｄは０〜３の整数、ｅ、ｆは０〜４の整数を表す。

Ｒ₁、Ｒ₂で表される親水性置換基とは、下記部分構造式１とした場合のＣｌｏｇＰ値が−５〜４となるような置換基Ｒをいい、好ましくは０〜３である。

Ｒ₃〜Ｒ₆で表される疎水性置換基とは、上記部分構造式１とした場合のＣｌｏｇＰ値が６〜２０となるような置換基Ｒをいい、好ましくは８〜１５である。

親水性置換基を含む部分構造式１（親水性ブロックともいう）としては、例えば以下の部分構造のものが挙げられる。

疎水性置換基を含む部分構造式１（疎水性ブロックともいう）としては、例えば以下の部分構造のものが挙げられる。

一般式（１）で表される化合物としては、化合物を構成する各疎水性ブロックのＣｌｏｇＰ値の合計から親水性ブロックのＣｌｏｇＰ値の合計を差し引いた値が６より大きいことが好ましく、８より大きいことがより好ましい。

Ｒ₇〜Ｒ₁₂はハロゲン原子または置換基を表し、置換基としては従来公知の置換基が特に制限なく挙げられるが、例えばアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、２−エチルヘキシル基、デシル基、ドデシル基等）、シクロアルキル基（シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等）、アルケニル基（ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、２−ブテニル基、アリル基等）、シクロアルケニル基（シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロオクタジエニル基等）、アルキニル基（アセチレニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、２−ブチニル基、プロパルギル基等）、芳香族炭化水素基（フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基等）、芳香族複素環基（フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジル基、ピラジル基、トリアジル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、キナゾリル基、フタラジル基、ピロリル基、２−キノリル基、１−イソキニリル基等）、非芳香族複素環基（ピロリジル基、イミダゾリジル基、モルホリノ基、オキサゾリジル基、２−テトラヒドロフラニル基、２−テトラヒドロチエニル基、２−テトラヒドロピラニル基、３−テトラヒドロピラニル基等）、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、シリルオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、アミノ基、アニリノ基、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、スルファモイル基、スルホ基、アルキル及びアリールスルフィニル基、アルキル及びアリールスルホニル基、アシル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、アリール及びヘテロ環アゾ基、イミド基、シリル基、ヒドラジノ基、ウレイド基、ボロン酸基、ホスファト基、スルファト基等が挙げられる。

ａ〜ｄは０〜３の整数、ｅ、ｆは０〜４の整数を表す。ａ〜ｆが複数の場合、複数のＲ₇〜Ｒ₁₁はそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。ａ〜ｆは０であることが好ましい。

一般式（１）で表される化合物について具体例を挙げるが、本発明はこれらに限定されない。

これらの化合物は従来公知の方法によって合成することが可能であり、例えばＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２８（２８），９０３６−９０３７（２００６）に記載の方法が参考になる。

〔フルオレンオリゴマー微粒子を被覆するポリマー〕
前記フルオレンオリゴマー微粒子を内部に含有するポリマー微粒子の合成方法は後述するが、例えば、フルオレンオリゴマー微粒子をコアとしてシード重合を行い、調製されたポリマー微粒子の表面を被検物質を認識する部位で修飾することで作製することができる。

従って、フルオレンオリゴマー微粒子を被覆するポリマーは一部に被検物質を認識する部位を連結可能な構造を含んでいる必要がある。被検物質を認識する部位を連結可能な構造としては、例えば、水酸基、アミノ基、メルカプト基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、フルオロ基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、アミド基、酸無水物残基、スクシンイミジルオキシ基、ヒドラジド基、グリシジル基、イソシアネート基、チオイソシアネート基等が挙げられる。

フルオレンオリゴマー微粒子を被覆するポリマーとしては、被検物質を認識する部位を修飾できる構造を一部に有していれば特に制限はないが、例えば以下に挙げたモノマーのホモポリマーまたはコポリマーが用いられる。

（メタ）アクリル酸誘導体；
アクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ｔ−ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸イソノニル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸シクロヘキシル、２−フェノキシエチルアクリレート、４−フェノキシブチルアクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、メタクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ベンジル、アセトアセトキシエチルメタクリレート、エトキシトリエチレングリコールメタクリレート、メタクリル酸グリシジル（ブレンマーＧ）、メタクリル酸グリシジル＋大豆油脂肪酸（ブレンマーＧ−ＦＡ）、メタクリル酸フェニル、ジメチルアミノエチルメタアクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、テトラエチレングリコールメタクリレート、オクタエチレングリコールメタクリレート、メトキシジエチレングリコールメタクリレート、メトキシテトラエチレングリコールメタクリレート、メトキシオクタエチレングリコールメタクリレート、
スチレン誘導体；
スチレン、α−メチルスチレン、
アクリルアミド誘導体；
メチルアクリルアミド、エチルアクリルアミド、ｔ−ブチルアクリルアミド、ｔ−オクチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、
その他；
マレイン酸、無水マレイン酸、酢酸ビニル、アクリロニトリル、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、ブタジエン、ＳＴマクロマー（東亜合成）、ＳＴ／ＣＮ＝７／３マクロマー（チッソ）、Ｓｉマクロマー（チッソ）、ＳＴダイマー（ノフマーＭＳＤ）
等であり、これらはハロゲン原子や置換基によってさらに置換されていてもよい。

あるいは、以下のポリマーとのコポリマーでもよい。

ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラール、ポリビニルアセタール、ナイロン６，６、ナイロン６、ポリエチレンテレフタレート
フルオレンオリゴマー微粒子を被覆するポリマーは、以下のモノマーのホモポリマー、あるいは以下のモノマーを含むモノマー群から作られるコポリマーであることが好ましい。

（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアリールエステル、（メタ）アクリル酸アミノアルキルエステル、（メタ）アクリル酸アミノアリールエステル、（メタ）アクリルアミド（ただしＮ−Ｈ構造を含むもの）
あるいは、以下のポリマー構造を含んでいることが好ましい。

ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラール、ポリビニルアセタール
また、フルオレンオリゴマー微粒子を被覆するポリマーの組成を選択するに当たっては、例えば溶解性パラメータ（ＳＰ）を用いて見積もることができる。

溶解性パラメータについては、その値、測定、計算法はＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ第４版（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）６７５頁の記載が参考になる。

本発明に用いられるフルオレンオリゴマーとフルオレンオリゴマー微粒子を被覆するポリマーは、そのＳＰ値の差が小さいほど好ましく、具体的にはフルオレンオリゴマー微粒子を構成するオリゴマーとフルオレンオリゴマー微粒子を被覆するポリマーのＳＰ値の差の絶対値が０〜１であることが好ましく、０〜０．５であることがより好ましい。

また、本発明のポリマー微粒子に用いられるポリマーは、その平均分子量が５００〜１０００００、特に１０００〜３００００であることが、サスペンションの形成性、安定性の点から好ましい。

〔フルオレンオリゴマー微粒子の作製〕
本発明に用いられるフルオレンオリゴマー微粒子は、例えば前記一般式（１）で表される構造を持つフルオレンオリゴマーを適当な溶媒に溶解し、その後、極性溶媒を添加していくことで作製することができる。例えば、テトラヒドロフランに溶解しておき、水やメタノールを添加していくことで微粒子が形成される。極性の高い溶媒が、極性の低い溶媒に対して高い割合で入っていた方が、フルオレンオリゴマー微粒子は作製しやすく、例えばＦＬ１の場合、テトラヒドロフラン：水＝１：１０程度の極性で本発明に好適な微粒子を作成することができる。

〔ポリマー微粒子の作製〕
本発明では、フルオレンオリゴマー微粒子を作製した後に、該微粒子をコアとしてモノマーを重合させ、生成するポリマーによって被覆して微粒子を作る。重合方法としては従来公知の如何なる重合方法をとってもよいが、ラジカル重合を用いることが好ましい。

ラジカル重合は従来公知の方法に従えばよく、用いるラジカル重合開始剤も溶媒組成に合わせ従来公知のものを適宜用いることができるが、水溶性が高いものを用いることが好ましい。例えば過硫酸塩（過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等）、アゾ系化合物（４，４′−アゾビス４−シアノ吉草酸及びその塩、２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）塩等）、パーオキサイド化合物等が挙げられる。

さらに上記水溶性ラジカル重合開始剤は、必要に応じて還元剤と組合せレドックス系開始剤とすることが可能である。レドックス系開始剤を用いることで、重合活性が上昇し重合温度の低下が図れ、さらに重合時間の短縮が期待できる。

重合温度は、重合開始剤の最低ラジカル生成温度以上であればどの温度を選択してもよいが、例えば通常５０〜８０℃の範囲が用いられる。ただし、常温開始の重合開始剤、例えば過酸化水素−還元剤（アスコルビン酸等）の組合せを用いることで室温またはそれ以下の温度で重合することも可能である。

本発明の重合は、臨界モノマー添加量以下のモノマーをフルオレンオリゴマー微粒子の分散液中に添加する工程、添加したモノマーを分散液に均一攪拌する工程、重合温度まで昇温し開始剤を添加、重合する工程、からなっている。必要な粒径の重合体粒子を得るために、上記工程を一回以上繰返すことにより容易に達成される。

〔分散媒〕
本発明のポリマー微粒子分散物は、従来公知の有機溶剤あるいは水を分散媒として有している。フルオレンオリゴマー微粒子を作製する際には、極性の高い有機溶剤あるいは水を分散媒として用いることが有効である。

極性の高い有機溶剤としては、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、セカンダリーブタノール、ターシャリーブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール等）、多価アルコール類（エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキサンジオール、ペンタンジオール、グリセリン、ヘキサントリオール、チオジグリコール等）、多価アルコールエーテル類（エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテル、プロピレングリコールモノフェニルエーテル等）、アミン類（エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、モルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、エチレンジアミン、ジエチレンジアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリエチレンイミン、ペンタメチルジエチレントリアミン、テトラメチルプロピレンジアミン等）、アミド類（ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等）、複素環類（２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、シクロヘキシルピロリドン、２−オキサゾリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、スルホン類（スルホラン等）、尿素、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。

〔被検物質を認識する部位の修飾方法〕
被検物質を認識する部位をポリマーに修飾する方法としては、いかなる方法を用いてもよいが、被覆後に修飾する方法が好ましく、例えば被覆後のポリマー微粒子の分散液に、液に対しては安定で、ポリマー上のある部位に対して反応性を持ち、反応後結合を作るような被検物質を認識する部位の導入剤を反応させる方法が挙げられる。この際、必要に応じて、縮合剤、触媒等を用いてもよい。抗体の修飾については「酵素免疫測定法第３版」（石川栄治等編、医学書院）等が参考になる。

例えば、ポリマー上のアミノ基に被検物質を認識する部位としてビオチンを修飾する場合、ポリマー微粒子の水分散液にビオチン化試薬とＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等の縮合剤を加えて縮合反応を行うことで、ビオチンのカルボン酸部位とシェルポリマー上のアミノ基とをペプチド結合で繋ぐことができる。また、カルボキシル基を有するラジカル重合開始剤（２，２′−Ａｚｏｂｉｓ［Ｎ−（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ］ｈｙｄｒａｔｅ等）も市販されており、これを用いることでポリマー末端にカルボキシル基の導入が可能であり、このカルボキシル基を足がかりに被検物質を認識する部位を修飾することもできる。

〔その他の添加剤〕
本発明のポリマー微粒子分散物は、従来公知の各種添加剤、例えば分散剤、界面活性剤、シリコン系等の消泡剤、クロロメチルフェノール系等の防黴剤またはＥＤＴＡ等のキレート剤、亜硫酸塩等の酸素吸収剤等が含有してもよい。

本発明に係る分散剤としては、水溶性高分子からなる分散剤が好ましく、例えば下記の水溶性樹脂が好ましい例として挙げられる。

スチレン−アクリル酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−アクリル酸−アクリル酸共重合体、スチレン−マレイン酸共重合体、スチレン−マレイン酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−アクリル酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−マレイン酸ハーフエステル共重合体、ビニルナフタレン−アクリル酸共重合体、ビニルナフタレン−マレイン酸共重合体等のような水溶性高分子である。水溶性高分子分散剤のその他の例として、アクリル−スチレン系樹脂であるジョンクリル等（ジョンソン社）が挙げられる。これらの高分子分散剤は、２種以上併用することも可能である。

水溶性高分子の分散液全量に対する含有量は、分散液全量に対し０．１〜１０質量％が好ましく、さらに好ましくは０．３〜１０質量％である。

本発明のポリマー微粒子分散物に好ましく使用される界面活性剤としては、ジアルキルスルホコハク酸塩類、アルキルナフタレンスルホン酸塩類、脂肪酸塩類等のアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル類、アセチレングリコール類、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー類等のノニオン性界面活性剤、アルキルアミン塩類、第４級アンモニウム塩類等のカチオン性界面活性剤が挙げられるが、特にアニオン性界面活性剤を好ましく用いることができる。

本発明のポリマー微粒子分散液には、この他、防腐剤、防黴剤、ｐＨ調整剤、粘度調整剤等を必要に応じて添加することも可能である。

〔ポリマー微粒子分散物の製造〕
本発明のポリマー微粒子分散物の製造に用いられる乳化方法について説明する。

本発明のポリマー微粒子分散物の乳化法としては、各種の方法を用いることができる。それらの例は、例えば、「機能性乳化剤・乳化技術の進歩と応用展開 シー エム シー」の８６ページの記載にまとめられている。本発明においては、特に、染料コアの形成には超音波、高速回転せん断、高圧による乳化分散装置を使用することが好ましい。

超音波による乳化分散では、いわゆるバッチ式と連続式の２通りが使用可能である。バッチ式は、比較的少量のサンプル作製に適し、連続式は大量のサンプル作製に適する。連続式では、例えば、ＵＨ−６００ＳＲ（株式会社エスエムテー製）のような装置を用いることが可能である。このような連続式の場合、超音波の照射時間は、分散室容積／流速×循環回数で求めることができる。超音波照射装置が複数ある場合は、それぞれの照射時間の合計として求められる。超音波の照射時間は実際上は１００００秒以下である。また、１００００秒以上が必要だと、工程の負荷が大きく、実際上は乳化剤の再選択等により乳化分散時間を短くする必要がある。そのため１００００秒以上は必要でない。さらに好ましくは、１０〜２０００秒である。

高速回転せん断による乳化分散装置としては、「機能性乳化剤・乳化技術の進歩と応用展開 シー エム シー」の２５５〜２５６ページに記載されているような、ディスパーミキサーや、２５１ページに記載されているようなホモミキサー、２５６ページに記載されているようなウルトラミキサー等が使用できる。これらの型式は、乳化分散時の液粘度によって使い分けることができる。これらの高速回転せん断による乳化分散機では、攪拌翼の回転数が重要である。ステーターを有する装置の場合、攪拌翼とステーターとのクリアランスは通常０．５ｍｍ程度で、極端に狭くはできないので、せん断力は主として攪拌翼の周速に依存する。周速が５〜１５０ｍ／Ｓであれば本発明の乳化・分散に使用できる。周速が遅い場合、乳化時間を延ばしても小粒径化が達成できない場合が多く、１５０ｍ／Ｓにするにはモーターの性能を極端に上げる必要があるからである。さらに好ましくは、２０〜１００ｍ／Ｓである。

これらの乳化・分散装置は単独で用いてもよいが、必要に応じて組み合わせて使用することが可能である。コロイドミルや、フロージェットミキサ等も単独では本発明の目的を達成できないが、上記装置との組み合わせにより、短時間で乳化・分散を可能にする等、本発明の効果を高めることが可能である。

〔被検物質の検出方法〕
本発明の前記ポリマー微粒子分散物を含む測定用組成物は、被検物質の検出方法に好適に用いることができる。

本発明の被検物質の検出法における被検物質は、該被検物質を認識する物質が存在すれば、特に限定されることはない。被検物質の認識において、特異的な認識であればより好ましい。本発明の被検物質の検出方法は、被検物質が蛋白質である場合に検出感度が極めて高く良好である。

被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質の関係の一例としては、免疫学的な関係にある被検物質が挙げられる。具体的には、抗原と抗体の関係が挙げられる。抗原と抗体の関係において、被検物質が抗原である場合、該抗原を特異的に認識する物質は抗体であり、被検物質が抗体である場合、該抗体を特異的に認識する物質は抗原である。

また、被検物質を特異的に認識する物質は、被検物質を間接的に認識できる物質であってもよい。即ち、被検物質を特異的に認識する物質を認識することのできる物質であってもよい。具体的には、被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識することのできる抗体（二次抗体）が挙げられる。

二次抗体として、被検物質を認識できる一次抗体作製に用いた動物種に特異的な抗体を認識することのできる抗体を用いることにより、該動物種で一次抗体を作製可能な様々な被検物質に対して共通してこの同じ二次抗体を使用することが可能となる。本発明の被検物質の検出法を利用したキットを作製する上で、この二次抗体を表面に有する微粒子は有用である。

上記抗体を作製するために用いる動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等が挙げられる。抗体としては、動物に免疫することによって得られるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマ法から得られるモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体を用いる場合には、動物として取り扱いやすいウサギ抗体が好ましい。

抗原としての被検物質として、例えば血液中等に微量に存在するタンパク質ホルモン、活性ペプチド、オータコイド、腫瘍マーカー、免疫グロブリン等の生体成分や薬剤等が挙げられるが、これらに限定されることはなく、被検物質に対する抗体を作製できるもの等であれば特に制限はない。

その他、本発明の被検物質の検出法における、被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質として、酵素と基質、酵素と阻害剤、ホルモンと受容体、レクチンと糖鎖、ＤＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡとＤＮＡ、血清アルブミンと色素ブルー、酵素と補酵素、タンパク質とコンビナトリアルリガンドペプチド等の、様々な組み合わせのものを挙げることができる。酵素と補酵素の組み合わせの例としては、酸化還元酵素と補酵素ＮＡＤＨの組み合わせ等を挙げることができる。

本発明の被検物質の検出法においては、ＥＬＩＳＡ測定用に調製された被検物質をそのまま使用することができる。また、被検物質を担体に固定化して用いてもよい。被検物質を固定化する担体としては、被検物質を固定化可能な担体であれば、特に限定されることはない。

上記担体の形状としては、膜状、チップ状、アレイ状、ビーズ状のもの等が挙げられる。上記担体の素材例としては、被検物質を固定化可能な素材であれば特に限定されないが、ポリビニリデンフルオリド、ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。

担体の孔径は、ポリマー微粒子の粒子径に合わせて適宜選定すればよい。ポリマー微粒子の粒子径よりも大きい孔径の担体を用いることにより、検出感度を向上させることができる。また、担体として、細胞を用いることもできる。即ち、被検物質を細胞表層に発現している細胞を担体として挙げることができ、該細胞は遺伝子組換えにより被検物質を発現するように改変されたものであってもよい。

本発明の被検物質の検出法は、ドットブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、サザンブロッティング法、ノザンブロッティング法、等の様々な測定法に適用でき、またラボオンアチップ、イムノクロマトチップ等の形で使用することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量％」を表す。

実施例
〔ポリマー微粒子分散液の作製〕
（ポリマー微粒子分散液１の作製）
５００ｍｇの例示化合物ＦＬ１をテトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解した溶液を、９０ｍｌの水へ、メカニカルスターラーで攪拌しながら滴下した。その後、７０℃に温度を上げて、６００ｍｇのスチレン、３４０ｍｇの２−ヒドロキシエチルメタクリレート、６０ｍｇの２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチルメタクリレート、分散剤としてヘキサノール０．１ｍｌを加え、１０ｍｇの２，２′−Ａｚｏｂｉｓ［２−（２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ］ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを１ｍｌの水に溶解した溶液を加えた。６時間反応させてフルオレンオリゴマー微粒子粒子を含有するポリマー微粒子分散液を得た。５０ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン（テクノケミカル社）と１００ｍｇのＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を加え、室温で１２時間反応させた後にゲルろ過し、水を適量加えて１４０ｇに仕上げ、ポリマー微粒子分散液１を作製した。

（ポリマー微粒子分散液２〜１２の作製）
ポリマーの組成及びフルオレンオリゴマーを表１に記載のように変更した以外は、ポリマー微粒子分散液１の作製と同様にして、ポリマー微粒子分散液２〜１２を得た。

（ポリマー微粒子分散液１３の作製）
４０ｍｇの５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン（５，１２−ＢＰＥＮ）をトルエン１０ｇ中に溶解し、次いでアセトン６０ｇを添加し、蛍光色素溶液を調製した。２０％ＮＨ₄ＯＨによって６５ｇ（固形分７．７５％）のラテックス（Ｅｓｔａｐｏｒ Ｋ１−０３０、バッチ３２６ラテックス（登録商標名）、粒径０．３μｍのカルボキシル化ポリスチレンラテックス）のｐＨ値を１０に調節した。次いで、このラテックスにラウリン酸カリウム０．３ｇ（乾燥）を添加し、この全体を数分間撹拌して均質化した。次いで、このラテックスに蛍光色素溶液をゆっくり添加した。得られた懸濁液を５０℃で３時間撹拌した。次いで有機溶液をできる限りゆっくり蒸留することによって除去した。得られた蛍光ラテックスを限外ろ過によって洗浄した。これにＥＺ−Ｌｉｎｋ ５−（Ｂｉｏｔｉｎａｍｏｄｏ）ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ（テクノケミカル社製）５０ｍｇとＷＳＣ１００ｍｇを加えて、室温で１２時間反応を行い、粒子表面にビオチンを修飾した。２０％ＮＨ₄ＯＨを少量加え、１４０ｇのポリマー微粒子分散液１３を得た。

〔ポリマー微粒子分散液の評価〕
（検出感度の評価）
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ストレプトアビジン結合ビーズ（磁気ビーズ）を被検物質とし、該ビーズの分散液を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、その１０倍希釈液、１００倍希釈液もそれぞれ調製した。被検試料５ｍｌに対し、各ポリマー微粒子分散液（合成時に用いたビオチン化試薬が全て使われたと仮定して、ビオチン当量が２００ｐｍｏｌ／ｍｌとなるように水を加えて調液）５ｍｌと混合し、１時間振盪を行った。その後、磁石を利用してビーズを集め、上澄み５ｍｌだけを取り除き、精製水５ｍｌを加えて１５分間振盪し、再び上澄み５ｍｌを取り除いた。この、水を加えて振盪し上澄みを抜く一連の洗浄操作を２回繰り返し、最後に水を加えて１０ｍｌの分散液となるように調製した。その後各試料の蛍光強度を測定し、下記基準で評価した。

○：検出可能
×：検出不可
（時間安定性の評価）
ポリマー微粒子分散物を同一濃度に調製し、１００Ｗ水銀ランプにて光照射後、蛍光光度計にて蛍光強度を測定し、信号の時間安定性を評価した。照射前、照射時間２０秒、照射時間４０秒、照射時間１分の各サンプルについて測定を行い、下記基準で評価した。

○：照射前の蛍光強度に対し蛍光強度比が８０％以上
△：照射前の蛍光強度に対し蛍光強度比が５０％以上、８０％未満
×：照射前の蛍光強度に対し蛍光強度比が５０％未満
評価の結果を表２に示す。

表より、本発明のポリマー微粒子分散物は、比較例に比べ被検物質の検出方法として好適に用いることができ、検出感度が極めて良好であることが分かる。

本発明に用いられるポリマー微粒子の断面を示す模式図である。

符号の説明

１ フルオレンオリゴマー微粒子
２ ポリマー微粒子
３ 被検物質を認識する部位

Claims (5)

1. フルオレンオリゴマー微粒子を内部に含有するポリマー微粒子及び分散媒を含むポリマー微粒子分散物であって、前記ポリマー微粒子が、その表面に被検物質を認識する部位を有することを特徴とするポリマー微粒子分散物。
2. 前記フルオレンオリゴマー微粒子を構成するフルオレンオリゴマーの少なくとも一つが、下記一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１に記載のポリマー微粒子分散物。
   

   

   （式中Ｒ₁、Ｒ₂は親水性置換基、Ｒ₃〜Ｒ₆は疎水性置換基、Ｒ₇〜Ｒ₁₂はハロゲン原子または置換基を表し、ａ〜ｄは０〜３の整数、ｅ、ｆは０〜４の整数を表す。）
3. 請求項１または２に記載のポリマー微粒子分散物を含むことを特徴とする測定用組成物。
4. 請求項３に記載の測定用組成物を用いることを特徴とする被検物質の検出方法。
5. 被検物質が蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の被検物質の検出方法。

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