JP2006523189A - メラン−aペプチドアナログ−ウイルス様粒子コンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、2003年3月26日に出願された米国特許仮出願 No. 60/457,348(出典明示により本明細書の一部とする)の利益を享受する。
発明の分野
本発明は、ワクチン学、免疫学および医薬の分野に関する。本発明は、ウイルス様粒子 (VLP) に共役され、融合され、または接着されているメランA ペプチドアナログに対する免疫学的応答を高めるための組成物および方法を提供する。好ましくは、免疫刺激性物質、特に免疫刺激性核酸、さらに特に少なくとも1の非メチル化 CpG 配列を含有するオリゴヌクレオチドを VLP に結合、好ましくは充填することによる。本発明は、特に腫瘍の処置に有用である強力な持続性 T 細胞応答を誘発するのに使用できる。
免疫系の本質は2つの別個の主要な形成でつくられる:ひとつは比較的遅い応答速度と記憶能を特徴とする特異的かつ適応性の免疫であり、いまひとつは速い応答速度を発揮するが記憶を欠く非特異的または先天的免疫である。
本発明は、特定のヒトメランA ペプチドアナログが、本来の反復した組織を有する構造をもつコア粒子に、特に DNA オリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性物質 (ISS) が充填されているウイルス様粒子 (VLP) または VLP のサブユニットに結合しているときに、特異的抗体の誘発のための強い免疫原を提示するという知見に基づいている。本発明はさらに、より免疫原性を付与する VLP 中に DNA オリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性物質を充填できるという知見に基づいている。予想外にも、VLP に存在する核酸またはオリゴヌクレオチドは、CpG モチーフを各々含有する免疫刺激性物質および DNA-オリゴヌクレオチドで具体的に置換し得る。驚くべきことに、これらの充填された免疫刺激性物質、特に、非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性核酸が先天性免疫系の活性化拡大なしに免疫刺激性能を保持した。VLP および本発明の免疫刺激性物質を含む組成物、特に CpG-VLP はその CpG のない対照物に比して劇的に免疫原性であり、高められた B および T 細胞応答を誘導する。さらに、VLP およびメランA ペプチドアナログの両方に対する T 細胞応答が基本的に Th1 タイプに向けられる。従って、CpG-保持 VLP に接着されたヒト・メランA ペプチドアナログは腫瘍に対する予防的または治療的なワクチン形成のための理想的なワクチンであり得る。
特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または均等のすべての方法および材料は本発明の実施および試行に使用できるが、好ましい方法および材料を下記に述べる。
アミノ酸リンカー:本明細書で使用される用語 “アミノ酸リンカー” あるいは単に “リンカー” は、第2接着部位を有する抗原または抗原決定因子に連関するのが好ましく、第2接着部位を、典型的には、しかし必然でないが、1アミノ酸残基、好ましくはシステイン残基として含む、または含有するのがさらに好ましい。しかし、本明細書で使用される用語 “アミノ酸リンカー” は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好まし実施態様であっても、アミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみであるとのことを意味しない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当技術分野で知られる自然界に存在するアミノ酸または非天然のアミノ酸、all-L または all-D またはその混合物で構成されるのが好ましい。しかし、スルフヒドリル基またはシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも本発明に含まれる。かかる分子は、好ましくは C1-C6 アルキル-、シクロアルキル (C5,C6)、アリールまたはヘテロアリール部分である。しかし、アミノ酸リンカーに加えて、C1-C6 アルキル-、シクロアルキル- (C5,C6)、アリール- またはヘテロアリール- 部分を好ましくは含み、いずれのアミノ酸をも欠くリンカーも本発明の範囲に含まれる。抗原または抗原決定因子または選択的に第2接着部位とアミノ酸リンカーとの連関は、好ましくは少なくとも1の共有結合により、さらに好ましくは少なくとも1のペプチド結合による。
非天然:本明細書で使用されるこの用語は、一般的に天然由来でなく、さらに具体的には人工に由来することを意味する。
非天然源:本明細書で使用される用語 “非天然源” は、一般的に合成を意味し、天然由来でなく、さらに具体的には人工に由来することを意味する。
開示された発明は、動物における1以上の抗体に対する免疫応答を高めるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、ウイルス様粒子、少なくとも1の免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸、さらに好ましくは非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および少なくとも1の抗原または抗原決定因子を含む。なお、免疫刺激性物質、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドはウイルス様粒子に結合しており、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該抗原は ヒト 黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。さらに、本発明は、例えば、癌の予防および/または治療を含む治療および予防の目的のために、実施者がかかる組成物をつくるのを可能にする。
5' X1X2CGX3X4 3'
うち、X1、X2、X3 および X4 はなんらかのヌクレオチドである。さらに、このオリゴヌクレオチドは、約 6 〜 約 100,000 ヌクレオチド、好ましくは約 6 〜 約 2000 ヌクレオチド、より好ましくは約 20 〜 約 2000 ヌクレオチド、さらに好ましくは約 20 〜 約 300 ヌクレオチドを含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、100 以上〜 約 2000 ヌクレオチド、好ましくは 100 以上〜 約 1000 ヌクレオチド、より好ましくは 100 以上〜 約 500 ヌクレオチドを含み得る。
RNA ファージから誘導された VLP についての別の利点は、材料の多量の産生を合理的な費用で可能にする細胞中での高い発現量である。
下記の実施例は、例示的なものであり、請求項により定められる本発明の範囲を限定するものではない。当業者に明らかなように、種々の修飾および改変を、本発明の精神および範囲を逸脱することなしになし得る。すなわち、本発明の修飾および改変を、添付の請求項およびその均等の範囲にある限り、包含する。
本明細書で引用されたすべての特許および公表文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
p33-HBcAg VLP の生成
LCMV 由来のペプチド p33 を含有する HBcAg の DNA 配列を配列番号: 15 に示す。p33-HBcAg VLP を下記のように生成せしめた。肝炎 B ウイルスの完全ウイルスゲノムを含有する肝炎 B クローン pEco63 を ATCC から入手した。HBcAg をコードする遺伝子を、発現ベクター pkk223.3 (Pharmacia) の EcoRI/HindIII 制限部位に強力な tac プロモーターの制御下に導入した。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) から誘導された p33 ペプチド (KAVYNFATM) (配列番号: 80) を HBcAg (1-185) の C-末端に、3ロイシン-リンカーを介して標準 PCR 法で融合した。優れた発現について選択された E. coli K802 のクローンをプラスミドでトランスフェクトし、細胞を生育し、5 ml 分解緩衝液 (10 mM Na2HPO4, 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.25 % Tween-20, pH 7.0) 中に再懸濁した。 200 μの リゾチーム 溶液 (20 mg/ml) を加えた。音波破壊の後に, 4 μl ベンゾナーゼおよび 10 mM MgCl2 を加え、懸濁液を 30 分間 RT でインキュベートし、15 分間 15,000 rpm で 4℃ で遠心分離し、上澄みを保持した。
記述を通じて用語 p33-HBcAg VLP、HBcAg-p33 VLP、p33-VLP および HBc33 は互換的に使用する。
GA VLP のクローニング、発現および精製
GA ファージ・コート・タンパク質の cDNA を GA ファージから、逆転写ついで PCR 増幅工程により、RevertAid 第1鎖 cDNA 合成キット (Fermentas) を用いて増幅した。cDNA を酵素 NcoI および HindIII で切断し、同じ酵素で予め切断したベクター pQβ185 中にクローン化し、GA cDNA をもつプラスミド 355.24 に導いた。挿入された cDNA の配列を DNA シーケンシングで調べた。
フルオレセイン標識の CpG-含有オリゴヌクレオチドは BKV、HBcAg および Qβ-VLP 中に充填できる
イースト中につくられた VLP は、VLP を RNase A で容易に消化され、消失され得る少量の RNA を含有する。高度に活性の RNase A 酵素は、分子量約 14 kDa を持ち、VLP に入るのに十分小さく、望ましくないリボ核酸を消失せしめる。組換え的につくられた BKV VLP (配列番号: 12) を 1 mg/ml に PBS 緩衝液、pH7.2 で濃縮し、RNase A (200μg/ml、Roche Diagnostics Ltd, Switzerland) の存在または不存在で 3 時間37℃でインキュベートした。RNase A 消化後、BKV VLP に 75 nmol/ml 5'-フルオレセイン標識ホスホロチオエート CpG-FAM オリゴヌクレオチド (配列番号: 34 からのオリゴヌクレアーゼ) を補充し、3 時間 37℃でインキュベートした。ついで、BKV VLP を DNaseI 消化 に 3 時間 37℃ (40 u/ml AMPD1, Sigma, Division of Fluka AG, Switzerland) かけるか、DNaseI 消化なしで保持した。サンプルに 6-倍濃縮 DNA-保持緩衝液 (10 mM Tris pH 7.5、10% v/v グリセロール、0.4% オレンジ G) を補い、1 時間 65 ボルトで 0.8% 天然トリス-アセテート pH 7.5 アガロースゲルにかける。エチジウムブロマイドでの染色で、核酸を検出し、一方、エチジウムブロマイドなしで、UV 刺激で CpG-FAM におけるフルオレセイン標識の蛍光となる。
大きい二本鎖オリゴヌクレオチドを BKV VLP 中に充填できる
二本鎖 (ds) ヌクレオチド配列を導入するために、RNase A 処置の組換え BKV VLP (実施例 3) に 50μg/ml (ds) DNA フラグメント (246 bp 長、dsDNA、配列番号: 17) を補充し、3 時間37℃でインキュベートした。サンプルに 6-倍濃縮 DNA-保持緩衝液 (10 mM Tris pH 7.5、10% v/v グリセロール、0.4% オレンジ G) を補い、1 時間 65 ボルトで 0.8% 天然トリス-アセテート pH 8.0 アガロースゲルにかける。BKV VLP (15 μg) を天然 0.8% アガロースゲル電気泳動により、コントロール・インキュベーションの後に、または RNase A での消化および続く (ds) DNA とのインキュベーション後に、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーでの染色で、RNA/DNA またはタンパク質の存在を調べるために分析した。充填された DNA 分子は、エチジウムブロマイドの存在で、クーマシーブルーで可視化される VLP バンドと同じ移動を持つバンドして見うる。
CpG-含有のオリゴヌクレオチドを BKV VLP 中に充填できる
免疫刺激性 CpG-オリゴヌクレオチドを導入するために、RNase A 処置組換え BKV VLP (実施例 3) に 150 nmol/ml の CpG-オリゴヌクレオチド、ホスホジエステル骨格を持つ CyCpG またはホスホロチオエート骨格をもつ CyCpGpt を補い、3 時間 37℃でインキュベートした。マウス免疫のための VLP 調製物を 24 時間 PBS に対し、pH7.2 で 300 kDa MWCO 透析膜 (Spectrum Medical industries Inc., Houston, USA) で強く透析し (10,000-倍希釈)、RNase A および過剰の CpG-オリゴヌクレオチドをなくした。サンプルに 6-倍濃縮 DNA-保持緩衝液 (10 mM Tris pH 7.5、10% v/v グリセロール、0.4% オレンジ G) を補い、1 時間 65 ボルトで 0.8% 天然トリス-アセテート pH 8.0 アガロースゲルにかける。BKV VLP (15 μg) を天然 0.8% アガロースゲル電気泳動により、コントロール・インキュベーションの後に、または RNase A での消化および続く CpG-オリゴヌクレオチド (ホスホジエステル-またはホスホロチオエート骨格をもつ) とのインキュベーション後に、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーでの染色で、RNA/DNA またはタンパク質の存在および非結合 CpG-オリゴヌクレオチドの還元を調べるために分析した。非結合 CpG-オリゴヌクレオチドは低分子量エチジウムブロマイド染色のバンドとして可視である。CpG-オリゴヌクレオチドは BKV VLP の移動を回復し、クーマシーブルー染色の VLP と同じ移動をもつ DNA バンドとなる。これは、CpG-オリゴヌクレオチドが BKV VLP 中に充填されたことを明示する。
VLP に含有の CpG-オリゴヌクレオチド (ホスフェート骨格のホスホロチオエート修飾をもつ) は高められた Th1 指向の免疫応答を誘発する
雌 BALB/c マウス (1群3匹) の皮下に 10μg BKV VLP に含有のホスホロチオエート CpG-オリゴヌクレオチド CyCpGpt (配列番号: 34) を注射した。対照として、マウスは、皮下に 10μg の RNase 処置 BKV VLP 単独、または 0.3 nmol もしくは 20 nmol ホスホロチオエート CpG-オリゴヌクレオチドの 200μl PBS pH7.2 との混合された BKV VLP を注射するか、あるいは処置しなかった。BKV VLP を実施例 5 に記載のように調製し、免疫の前に非結合 CpG-オリゴヌクレオチドから透析で精製した。免疫 14 後に血液を採取し、BKV VLP に対する IgG1 および IgG2a 抗体応答を調べた (参照、表 1)。
免疫刺激性核酸を、抗原との融合タンパク質を含む HBcAg VLP 中に充填できる
HBcAg VLP は、E. coli 中で、肝炎 B コア抗原融合タンパク質 p33-HBcAg (HBc33) (参照、実施例 1) またはペプチド P1A に対する融合タンパク質 (HBcP1A) の発現によりつくられたときに、VLP を RNase A とインキュベートすることにより消化され、消失され得る RNA を含有する。
小文字はホスホロチオエート結合を介して結合されるデオキシヌクレオチドを示し、大文字はホスホジエステル結合を介して結合されるデオキシヌクレオチドを示す。
免疫刺激性核酸は、抗原と共役された HBcAg-wt 中に充填できる
組換え的につくられた HBcAg-wt VLP を、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) から誘導されるペプチド p33 (CGG-KAVYNFATM) (配列番号: 81) との共役後に充填した。共役のために、HBcAg-wt VLP (2 mg/ml) を 25x モル過剰の SMPH (スクシニミジル-6-[(β-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート]、Pierce) で 1 時間 25℃、テルモミキサー中で誘導した。誘導された VLP を Mes 緩衝液 (2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸) pH 7.4 で 2 x 2 時間、MWCO 10.000 kD 透析膜を 4℃で用いて、透析した。VLP (50μM) を p33 ペプチド (250μM) の N-末端システインに 2 時間インキュベーションでテルモミキサー中 25℃で共役した。サンプルを (MWCO 300.000) 強く 1x PBS pH 7.4 で透析し、望ましくない遊離のペプチドを消失せしめた。
免疫刺激性核酸を抗原と共役された Qβ VLP 中に充填し得る
p33 ペプチドの Qβ VLP との共役
組換え的につくられたhe RNA-バクテリオファージ Qb のウイルス様粒子 (Qβ VLP) を、未処置で、または N-末端 CGG および/または C-末端 GGC 伸張を含有する p33 ペプチド (CGG-KAVYNFATM (配列番号: 81) および KAVYNFATM-GGC (配列番号: 82)) との共役後に使用した。組換え的につくられた Qβ VLP を 10 モル過剰の SMPH (Pierce) で 0.5 時間 25℃で誘導し、ついで 20 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.2、4℃で透析し、未反応の SMPH を除去した。ペプチドを 5 倍モル過剰で加え、2 時間テルモミキサー中 25℃で、30% アセトニトリルの存在下に反応せしめた。Qb VLP に共役された p33 の分析を SDS-PAGE でクーマシーブルー染色後に行った。下記のサンプルを保持した: (A) 1. NEB 予染色のタンパク質マーカー、広範囲 (# 7708S)、10μl; 2. Qb VLP、14μg; 3. SMPH で誘導された Qb VLP、透析後; 4. CGG-p33 で共役された Qb VLP、上澄み、(B) 1. NEB 予染色のタンパク質マーカー、広範囲 (# 7708S)、10μl; 2. Qb VLP、10μg; 3. CGG-p33 で共役された Qb VLP、上澄み。SDS-PAGE 分析は、Qβ モノマーに共役された1,2または3のペプチドからなる複数の共役バンドを示した。簡便のために、ペプチドの共役を、実施例においては特に、Qbx33 とする。
Qβ VLP を濃度 1.0 mg/ml、20mM Hepes/150mM NaCl 緩衝液 (HBS) 中、pH 7.4 で、RNase A (300μg/ml, Qiagen AG, Switzerland) の添加により直接消化せしめるか、または 4 容量 H2O で最終 0.2 x HBS 濃度に希釈し、ついで RNase A (60μg/ml, Qiagen AG, Switzerland) とともにインキュベートした。インキュベーションは 3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm で行った。低または高イオン強度での Qb VLP からの RNase A による RNA 加水分解を、エチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲル上で行った。下記のサンプルをゲル上に保持した: (A, B) 1. MBI Fermentas 1kb DNA ラダー; 2. 非処置 Qb VLP; 3. RNase A で処置された Qb VLP、1x HBS 緩衝液中 pH7.2、(C, D) 1. MBI Fermentas 1kb DNA ラダー; 2. 非処置 Qb VLP; 3. RNase A で処置された Qb VLP、0.2 x HBS 緩衝液 pH7.2。1xHBS においてのみ RNA 内容物の非常に弱い還元があり、一方、0.2x HBS において RNA の大部分が加水分解されたことが分かった。同様に、キャプシド移動が 1x HBS での RNAse A 付加で変わらず、一方、0.2 x HBS での RNAse の付加で移動が遅くなる。
0.2 x HBS における RNase A 消化後に Qβ VLP を 1 mg/ml に、Millipore Microcon または Centriplus 濃縮器で濃縮し、アリコートを 1x HBS または 0.2 x HBS に対し透析した。Qβ VLP に 130 nmol/ml CpG-オリゴヌクレオチド B-CpG を補い、テルモミキサー中 3 時間 37℃ でインキュベートした。ついで、Qβ VLP をベンゾナーゼ消化 (100 U/ml) に 3 時間 37℃でかけた。サンプルを、1% アガロースゲル上、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーの染色後に分析した。下記のサンプルをゲル上に保持した: 1. 非処置 Qb VLP; 2. RNase A で処置された Qb VLP; 3. RNase A で処置され、B-CpG 0.2x HBS 緩衝液 pH7.2 で充填され、ベンゾナーゼで処置された Qb VLP; 4. RNase A で処置され、B-CpG 0.2x HBS 緩衝液 pH7.2 で充填され、ベンゾナーゼで処置された HBx33 VLP (参照、実施例 12)。1x HBS においてのみ非常に低量のオリゴヌクレオチドを充填でき、一方、0.2 x HBS において強力なエチジウムブロマイド染色のバンドが検出可能であった。これはキャプシドのクーマシーブルー染色で発色している。
0.2 x HBS における RNase A 消化後に Qβ VLP または Qbx33 VLP を 1 mg/ml に、Millipore Microcon または Centriplus 濃縮器で濃縮し、130 nmol/ml CpG-オリゴヌクレオチド B-CpG、g10gacga および 253 マー dsCyCpG-253 (表 2) を補い、テルモミキサー中 3 時間 37℃ でインキュベートした。ついで、Qβ VLP または Qbx33 VLP を DNAse I 消化 (5 U/ml) またはベンゾナーゼ消化 (100 U/ml) に 3 時間 37℃でかけた。サンプルを、1% アガロースゲル上、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーの染色後に分析した。
AP205 解集合-精製-再集合、および免疫刺激性核酸の充填
A. オリゴヌクレオチドの付加なしに再集合できる材料からの AP205 VLP の解集合および再集合
解集合: 40 mg の凍結乾燥の精製 AP205 VLP (配列番号: 80 または 81) を 4 ml 6 M GuHCl に再溶解し、一夜 4℃でインキュベートした。解集合混合物を 8000 rpm で遠心分離した (Eppendorf 5810 R、固定角回転翼 F34-6-38、下記工程のすべてで使用)。ペレットを 7 M 尿素に再溶解し、一方、上澄みを 3 日間 NET 緩衝液 (20 mM Tris-HCl、pH 7.8、5mM EDTA および 150 mM NaCl で) 緩衝液を3回変えて透析した。あるいは、透析を 4 日間連続的に行った。透析溶液を 8000 rpm で 20 分間遠心分離し、ペレットを 7 M 尿素に再溶解し、一方、上澄みを硫酸アンモニウム (60% 飽和) でペレット状にし、ペレットを、10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液で再溶解した。7 M 尿素に再溶解されたすべての前のペレットを合わせ、硫酸アンモニウム (60% 飽和) で沈澱にし、10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液で再溶解した。10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液に再溶解された材料を合わせ、平衡 Sephadex G75 カラムに保持し、10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液で 2ml/h で溶出した。カラムから溶出の1ピーク。フラクション 3 ml を収集した。 AP205 コート・タンパク質を含有するピーク・フラクションを集め、硫酸アンモニウム (60% 飽和) で沈澱せしめた。
1 ml の AP205 コート・タンパク質、核酸なし
1 ml の AP205 コート・タンパク質、rRNA (約 200 OD260 単位、 10 nmol)
9 ml の AP205 コート タンパク質、CyCpG (370 ul の 225 pmol/μl 溶液、すなわち 83 nmol).
解集合: 100 mg の精製かつ乾燥の組換え AP205 VLP を上記のように解集合について使用した。すべての工程をパート A に記載のように基本的に行ったが、硫酸アンモニウムのペレットの溶解のために 8 M 尿素を使用し、再集合の前の CL-4B カラムを用いるゲルろ過工程を省略した。Sephadex G-75 カラムの集めたフラクションは 21 mg のタンパク質を含有した。これは分光法によりパート A に記載の式を用いて決定した。サンプルの 280 nm での吸収の 260 nm での吸収に対する比は 0.16 対 0.125 であった。サンプルは測定のために 50 倍に希釈した。
1. (183 * OD230 nm 75.8 * OD260 nm) * 容量 (ml)-、2. ((OD235 nm OD280 nm)/2.51) x 容量、3. ((OD228.5 nm OD234.5 nm) * 0.37) x 容量、
再集合 VLP のタンパク質の量 6 26 mg を決定した。
解集合材料の EM 解析によると、AP205 VLP の塩化グアニジニウムでの処置が VLP のキャプシド集合を基本的に混乱させた。この解集合材料のオリゴヌクレオチドでの再集合はキャプシドをもたらす。これを精製し、さらにゲルろ過で富化した。2サイズの粒子を得た。約 25 nm 直径の粒子と、より小さい粒子が電子ミクログラフで見える。再集合がオリゴヌクレオチドの不存在でなかった。再集合粒子のアガロース電気泳動上の保持によると、再集合粒子が核酸を含有した。核酸のフェノールによる抽出および続くエチジウムブロマイド染色アガロースゲル上の保持によると、粒子が再集合に使用されたオリゴヌクレオチドを含有した。充填されたオリゴヌクレオチドの同一性を、このオリゴヌクレオチドのサンプルを粒子から抽出された核酸材料の端から端に保持することにより調整した。再集合 AP205 VLP が保持され、前にエチジウムブロマイドで染色されているアガロースゲルを、ついでクーマシーブルーで染色して、オリゴヌクレオチド内容物と粒子のタンパク質内容物との共移動を表し、オリゴヌクレオチドが粒子中に充填されていることを示す。ゲル上に保持されるのは、非処置 AP205 VLP、h CyCpG で再集合された AP205 VLP の異なる量をもつ 3 サンプル、および非処置 Qβ VLP であった。
パートBで記載のように 20 mM Hepes、150 mM NaCl、pH 7.4 で得られた再集合d AP205 VLP を濃度 1.4 mg/ml で、5-倍過剰の橋かけリンカー SMPH と DMSO 中 50 mM ストックから希釈し、30 分間 15 ℃で反応せしめた。得られたいわゆる誘導 AP205 VLP を 2 X 2 時間、少なくとも 1000-倍量の 20 mM Hepes、150 mM NaCl、pH 7.4 緩衝液に対し透析した。誘導された AP205 を濃度 1 mg/ml で 2.5-倍または 5-倍過剰のペプチドと、DMSO 中 20 mM ストックから希釈し、2 時間 15 ℃で反応せしめた。ついでサンプルを貯蔵のために液体窒素で急に凍結した。
VLP の RNA 内容物の非酵素的加水分解および免疫刺激性核酸の充填
VLP の 核酸内容物の ZnSO4 依存性減成:20 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl 中の 5 mg Qβ VLP (Bradford 分析で測定) を、2000 ml の 50 mM TrisHCl pH 8.0、50 mM NaCl、5% グリセロ−ル、10 mM MgCl2 か、2000 ml の 4 mM HEPES、pH 7.4、30 mM NaCl に対し、2 時間 4℃で、SnakeSkin(商標)プリーツ透析チュービング (Pierce, Cat. No. 68035).において透析した、各透析緩衝液を一回交換し、さらに 16 時間 4℃で透析を続けた。透析溶液を 10 分間 14 000 rpm (Eppendorf 5417 R、固定角回転翼 F45-30-11、下記の全工程で使用) で澄明にし、タンパク質濃度を Bradford 分析で再度測定した。50 mM TrisHCl pH 8.0、50 mM NaCl、5% グリセロ−ル、10 mM MgCl2 中の Qβ VLP を対応する緩衝液で最終タンパク質濃度 1 mg/ml に希釈し、4 mM HEPES pH 7.4、30 mM NaCl 中の Qβ VLP を対応する緩衝液で最終タンパク質濃度 0.5 mg/ml に希釈した。このキャプシド含有溶液を再度 10 分間 14 000 rpm 4℃で遠心分離した。上澄みを、最終濃度 2.5 mM に加えられた ZnSO4 とともに 24 時間 60℃で Eppendorf テルモミキサー中 550 rpm でインキュベートした。24 時間後、溶液を 10 分間 14000 rpm で澄明にし、沈澱物を捨てた。
免疫刺激性核酸の VLP への充填後の抗原ペプチドの共役
VLP の核酸内容物の RNaseA および ZnSO4 仲介による減成
Qβ VLP を RNaseA で実施例 9 に記載のように、低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 処置した。同様に、実施例 2、3、7 および 10 に記載の他の VLP、すなわち GA、BKV、HBcAg および AP205 を処置した。あるいは、Qβ VLP および AP205 VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 実施例 11 に記載のように処置した。AP205 VLP (1 mg/ml) を 20 mM Hepes pH 7.4 または 20 mM Hepes、1 mM Tris、pH 7.4 で、48 時間 2.5 mM ZnSO4 50℃で Eppendorf テルモミキサー中 550 rpm で処置した。Qβ および AP205 VLP サンプルを実施例 Example 11 に記載のように澄明にし、上澄みを 10.000 MWCO Spectra/Por(商標)透析チュービング (Spectrum, Cat. nr. 128 118) で第1 2 の l 20 mM Hepes、pH 7.4 で 2 時間 4℃で透析し、緩衝液の交換後、一夜透析した。サンプルを透析後、実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。
RNA 加水分解および透析の後に Qβ および AP205 VLP (1-1.5 mg/ml) を ml の VLP につき 130 μl の CpG オリゴヌクレオチド (NKCpG、G10-PO につき参照、表 2; G3-6、G8-8 につき 表 3; 1 mM オリゴヌクレオチド・ストック、10 mM Tris pH 8) と混合した。サンプルを 3 時間 37℃で熱攪拌機中 650 rpm でインキュベートした。ついで、サンプルを 125 U ベンゾナーゼ/ml VLP (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) で 2 mM MgCl2 の存在下で処置し、3 時間 37℃で透析の前にインキュベートした。サンプルを 300.000 MWCO Spectra/Por(登録商標)透析チュービング (Spectrum, Cat. nr. 131 447) 20 mM Hepes、pH 7.4 で 2 時間 4℃で透析し、緩衝液の交換後、一夜同じ緩衝液に対し透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載ように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。
ISS 充填の Qβ VLP を、C-末端 GGC 伸張 (KAVYNFATM-GGC) (配列番号: 82) を含有する p33 ペプチドと共役して、Qb VLP 中に名称 Qb-ISS-33 VLP を得た。充填 Qβ VLP を 20 mM Hepes、pH 7.4 で、10-倍モル過剰の SMPH (Pierce) で 0.5 時間 25℃で誘導化し、2透析工程各 2 時間 20 mM HEPES pH 7.4、4℃ で透析し、非処置の SMPH を除去した。ペプチドを 5-倍モル過剰の誘導混合物に加え、2 時間テルモミキサー中 25℃で反応せしめた。サンプルを 300.000 MWCO Spectra/Por(登録商標)透析チュービング中 20 mM Hepes pH 7.4、2 時間 4℃で透析し、緩衝液の交換後、一夜同じ緩衝液に対し透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。ペプチド p33 の Qβとの共役を SDS-PAGE で、16% PAGE Tris-グリシンゲル (Novex(登録商標)、Invitrogen、Cat. No. EC64952) で分析した。これには 2% SDS および β-メルカプトエタノール または DTT を含有するサンプル緩衝液を用いた。充填を 1% アガロースゲル上で、およびプロテアーゼ K 消化後に、実施例7に記載のように TBE/尿素ゲル上で分析した。
免疫刺激性グアノシン側有オリゴヌクレオチドの VLP への充填
Qbx33 VLP (ペプチド p33 に共役された Qβ VLP、参照、実施例 9) を RNaseA で低イオン条件で (20 mM Hepes pH 7.4)、実施例 9 に記載のように処置し、Qbx33 VLP の RNA 内容物を加水分解した。20 mM Hepes pH 7.4 での透析後、Qbx33 VLP をグアノシン側有オリゴヌクレオチド (表 2: G10-PO、表 3: G3-6、G7-7、G8-8、G9-9 または G6、10 mM Tris pH 8 中の 1 mM オリゴヌクレオチド・ストック由来) と混合し、実施例 12 に記載のようにインキュベートした。ついで、Qbx33 VLP をベンゾナーゼで処置し、300.000 MWCO チュービング中で透析した。オリゴ G7-7、G8-8 および G9-9 をもつサンプルを、3 日間 4 緩衝液交換して強く透析し遊離のオリゴを除去した。充填を、1% アガロースゲル上で、そしてプロテアーゼ K 消化後に TBE/尿素ゲル上で実施例 7 記載のように分析した。
リボ核酸の VLP への充填
VLP の核酸内容物の ZnSO4 依存性減成
Qβ VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件 (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) で、実施例 11 に記載のように処置した。AP205 VLP (1 mg/ml) を 20 mM Hepes pH 7.4 または 20 mM Hepes、1 mM Tris、pH 7.4 で 48 時間 2.5 mM ZnSO4 で 50℃、Eppendorf テルモミキサー中 550 rpm で処置した。Qβ および AP205 VLP サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、20 mM Hepes、pH 7.4 で実施例 12 のように透析した。
免疫刺激性リボ核酸ポリ (I:C) (Cat. nr. 27-4732-01、ポリ(I)ポリ(C)、Pharmacia Biotech) を PBS (Invitrogen cat. nr. 14040) または水に濃度 4 mg/ml (9μM) まで溶解した。ポリ (I:C) を 10 分間 60℃でインキュベートし、ついで 37℃に冷やした。インキュベート・ポリ (I:C) を 10-倍モル過剰で ZnSO4-処置 Qβまたは AP205 VLP (1-1.5 mg/ml) に加え、混合物を 3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm でインキュベートした。ついで、過剰の遊離ポリ (I:C) を、VLP 混合物 ml 当たり 125 U ベンゾナーゼで、2 mM MgCl2 の存在下、 3 時間 37℃でテルモミキサー中 300 rpm でインキュベートして酵素的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解で、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みを 300.000 MWCO Spectra/Por(登録商標)透析チュービング (Spectrum, Cat. nr. 131 447) で 2 l 20 mM Hepes、pH 7.4 で 2 時間 4℃で透析し、さらに緩衝液交換後、同じ緩衝液に対し透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。
ポリ (I:C) で充填された Qβ VLP (1 mg/ml) を誘導し、実施例12記載の p33 ペプチド (KAVYNFATM-GGC) (配列番号: 82) またはメランA ペプチド (メランA 16-35A/L CGHGHSYTTAEELAGIGILTV) (配列番号: 55) と共役した。これらはそれぞれ Qb-pIC-33 および Qb-pIC-メランA VLP となる。メランA ペプチドとの共役のために、充填される Qβ VLP を 2.1-倍モル過剰の SMPH (Pierce) で 0.5 時間 25℃で誘導し、ついで 20 mM HEPES、pH 7.4、4℃で透析を行って、未反応 SMPH を除いた。ペプチドを 2.1-倍モル過剰で加え、1.5 時間テルモミキサー中 25℃で反応せしめた。サンプルを 300.000 MWCO Spectra/Por(登録商標)CE Dispo Dialyzer により 20 mM Hepes、pH 7.2、3 時間 4℃で透析し、緩衝液を交換後一夜、同じ緩衝液に対して透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。ペプチド p33 およびペプチド・メランA の Qβとの共役を SDS-PAGE により 16% PAGE Tris-グリシンゲルで分析した。充填を、1% アガロースゲル上で、プロテアーゼ K 消化後、TBE/尿素ゲル上で、実施例 7 に記載のように解析した。
免疫刺激性グアノシン側有のオリゴヌクレオチドの HBcAg VLP への充填
HBcAg VLP を RNaseA で低イオン強度条件 (20 mM Hepes pH 7.4) で実施例 9 に記載のように処置し、VLP の RNA 内容物を加水分解した。20 mM Hepes、pH 7.4 での透析後、VLP をグアノシン側有のオリゴヌクレオチド (表 3; G3-6、G7-7、G8-8、G9-9、G10-PO または G6、10 mM Tris pH 8 中の 1 mM ストックより) と混合し、実施例 12 に記載のようにインキュベートした。ついで、VLP をベンゾナーゼで処置し、300.000 MWCO チュービング中で透析した。充填を、1% アガロースゲル上で、プロテアーゼ K 消化後、TBE/尿素ゲル上で、実施例 7 に記載のように解析した。
免疫刺激性グアノシン側有のオリゴヌクレオチドの GA VLP への充填
GA VLP を RNaseA で低イオン条件 (20 mM Hepes pH 7.4) で実施例 9 に記載のように処置し、VLP の RNA 内容物を加水分解した。20 mM Hepes pH 7.4 での透析後、VLP をグアノシン側有のオリゴヌクレオチド (表 3; G3-6、G7-7、G8-8、G9-9、G10-PO または G6、10 mM Tris pH8 中 1 mM ストックから)と混合し、実施例 12 に記載のようにインキュベートした。ついで、VLP をベンゾナーゼで処置し、300.000 MWCO チュービング中で透析した。充填を 1% アガロースゲル上で、プロテアーゼ K 消化後、TBE/尿素ゲル上で、実施例 7 に記載のように解析した。
リボ核酸の HBcAg VLP への充填
HBcAg VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 実施例 11 に記載のように処置し、20 mM Hepes pH 7.4 で実施例 12 のように透析した。ポリ (I:C) を 10-倍モル過剰で HBcAg VLP (1-1.5 mg/ml) に加え、3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm で実施例 14 に記載のようにインキュベートした。ついで、過剰の遊離ポリ (I:C) を、ml VLP 混合物あたり 125 U ベンゾナーゼとのインキュベーションにより 2 mM MgCl2 の存在下、3 時間 37℃でテルモミキサー中 300 rpm で酵素的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、実施例 14 のように透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析により測定した。ポリ (I:C) で充填された HBcAg VLP (1 mg/ml) を誘導し、メランA に共役し、実施例 14 のように透析した。
リボ核酸の GA VLP への充填
GA VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 実施例 11 に記載のように処置し、20 mM Hepes pH 7.4 で実施例 12 のように透析した。ポリ (I:C) を 10-倍モル過剰で GA VLP (1-1.5 mg/ml) に加え、3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm で実施例 14 に記載のようにインキュベートした。ついで、過剰の遊離ポリ (I:C) を、ml VLP 混合物あたり 125 U ベンゾナーゼとのインキュベーションにより 2 mM MgCl2 の存在下、3 時間 37℃でテルモミキサー中 300 rpm で酵素的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、実施例 14 のように透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析により測定した。ポリ (I:C) で充填された GA VLP (1 mg/ml) を誘導し、メランA に共役し、実施例 14 のように透析した。
オリゴデオキシヌクレオチドの Qβ 解集合、再集合および充填
Qβ VLP の解集合および再集合
解集合: 45 mg Qβ VLP (2.5 mg/ml、Bradford 分析により測定) を PBS (20 mM ホスフェート、150 mM NaCl、pH 7.5) 中で、10 mM DTT で 15 分間室温、攪拌条件で還元した。塩化マグネシウムの添加後、最終濃度 700 mM で、第2インキュベーションを 15 分間室温、攪拌条件で行い、被膜に囲まれた宿主細胞 RNA および VLP の付随的非組み込みの沈降を導く。沈降した RNA を溶液から除くために、溶液を 10 分間 4000 rpm、4 ℃ (Eppendorf 5810 R、固定角回転翼 A-4-62、下記の全工程で使用) で遠心分離した。放出ダイマー Qβ コート・タンパク質を含有する上澄みを、クロマトグラフィー精製工程に使用した。
カチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによる Qβ コート・タンパク質:ダイマー・コート・タンパク質、宿主細胞タンパク質および残渣の宿主細胞 RNA を含有する解集合反応の上澄みを SP-Sepharose FF カラム (xk16/20、6 ml、Amersham Bioscience) にかけた。室温で流速 5 ml/min での操作中、吸収 260 nm および 280 nm をモニターした。カラムを 20 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7 で平衡にし、コート・タンパク質のカラムへの適当な結合を達成するために、サンプルを 1:15 水中で伝導性 10 mS/cm 以下に調整した。結合コート・タンパク質の溶出を 20 mM リン酸ナトリウム / 500 mM 塩化ナトリウムの傾斜工程で行い、タンパク質をフラクション量で約 25 ml 収集した。カラムを 0.5 M NaOH で再生成した。
A) 再集合キャプシドの水力学サイズ:オリゴデオキシヌクレオチド G8-8 の存在で再集合された Qβ キャプシドを動的光拡散法 (DLS) により解析し、E.coli から精製された無傷の Qβ VLP と比較した。再集合キャプシドは、無傷 Qβ VLP と同じ水力学サイズ (質量および配座の両方に依存) を示した。
メランA 黒色腫抗原から誘導されたペプチドの Qb との共役
表 4. 下記のメランA ペプチド部分を化学的に合成した:
** リンカー配列からのアミノ酸を小文字で表す。
Qβ メランA 16-35 A/L VLP を樹枝状細胞でプロセスし、それらをインビトロで T 細胞に提示する
インビトロでのメランA-特異的 T 細胞の生成
Qb-メランA 16-35 A/L ワクチンの免疫原性を調べるために、メランA-特異的 T 細胞をインビトロで生成せしめた。HLA-A2 健常ボランティアからの未熟単球-誘導の樹枝状細胞 (DC) を上記 (Salusto, F. et al. 1994, J.Exp. Med.179:1109) のように生成せしめた。DC (0.5x106/ウエル) を擬製かまたは 40 μg/ml Qb-メランA 16-35 A/L とともに 2 時間 37℃でパルスした。メランA-特異的 CTL 前駆体の頻度を増すために、自己 CD8 T 細胞を PBMC から磁気ソーティング (Miltenyi Biotech)により単離した。1x106/ウエル CD8 T 細胞を抗原パルス DC に加えた。IL-2 を細胞培養に日 3、濃度 10 U/ml で補充し、50 U/ml に日 12 までに増加した。
51Cr 放出 アッセイを行って、メランA CTL クローンの機能的活性を解析した。APC を 1.5 時間、10-6M メランA 26-35 A/L ペプチドまたはネガティブ対照としての 10-6M インフルエンザ M1 ペプチドとインキュベートした。APC を Cr51 とインキュベートして、放射ヌクレオチドの非特異的摂取をペプチド・パルス時に測定した。残存の抗原および放射活性を除くために強く洗った後、104/ウエル APC を種々のメンバーのメランA-特異的 T 細胞と 5 時間インキュベートした。上澄みを集め、メランA-特異的 T 細胞によるメランA-提示 APC の特異的分解を下記の式で計算した:
% 特異的分解 = ((cpm 実験値 - cpm 自発値) / (cpm 最大値 cpm 自発値)) x100
式中、実験値は、実験サンプル中で測定された放射活性カウントであり、cpm 自発値は、T 細胞の付加なしに 51Cr でパルスされた APC から得られたカウントであり、cpm 最大値は、1% NP-40 で分解された 51Cr-パルス APC から得られたカウントである。
ヒト細胞をインビトロで活性化する免疫刺激性配列 (ISS) の能力
Qb-メランA ワクチン中に保持される最適の ISS を選択するために、異なるメンバーのフランキング Gs または 二本鎖 RNA、例えば ポリ (I:C) をもつ CpG を、ヒト CD8 T 細胞に対する CD69 を上方調整する能力およびヒト PBMC において IFN α の分泌を誘導する能力について試験した。
メランA-特異的 T 細胞のインビトロ拡大を G10-PO により増加する
メランA 特異的 CTL のインビトロ増殖を誘導する Qb-メランA VLP の能力を G10-PO の存在および不存在で試験した。未熟ヒト単球-誘導 DC (0.5x106/ウエル) を Qb-メランA 16-35 A/L または メランA 26-35 A/L ペプチド または実施例 21 のような擬製でパルスした。ヒト単球-誘導 DC はトル様受容体-9 (TLR-9)-ネガティブであり、従って CpG B 細胞に応答しない、そしてヒト PBMC に存在するプラズマ細胞性 DC は TLR-9 ポジティブであり、CpG 処置 にサイトカインの産生をもって (IFN α、IL-12) 応答する。単球-誘導 DC の抗原提示能に対する G10-PO の役割を調べるために、抗原-パルス DC を洗い、1x106 自己 PBMC と 2 μM G10-PO の存在または不存在で 2 時間インキュベートした。磁気ソーティングにより単離された自己 CD8 T 細胞 (1x106) を APC に加え、12 日間、実施例12に記載のように細胞培養条件を用いてインキュベートした。メランA-特異的 CTL を HLA-A2-メランA-PE テトラマー染色およびフローサイトメトリーで検出した。G10-PO を Qb-メランA-パルス DC に加えると、特異的 CTL の頻度が増加する (10% から 14% に)。これは、CpG 刺激によりつくられたサイトカイン環境が CTL インビトロ拡大に好都合であることを示す。.
G3-6、G6、G10-PO または ポリ (I:C) で保持された Qbx33 VLP は p33-組換えワクシニアウイルス・チャレンジに対する保護を誘導する
B6 マウスの皮下に Qbx33 単独、または G3-6 もしくは G6 もしくは ポリ (I:C) で保持されたに Qbx33 を免疫した (参照、実施例 12 および 14)。8日後マウスを 1.5 x 106 pfu の組換えワクシニアウイルスでチャレンジし、LCMV-p33 抗原を発現する。4 日後、マウスを殺し、卵巣中のウイルス力価を、前に発表されているように (Bachmann et al, Eur. J. Imunol. 1994, 24:2228) 測定した。図 3 に示すように、G3-6 または G6 または ポリ (I:C) で保持される Qbx33 ワクチンを受けたすべてのマウスがウイルス・チャレンジから保護された。これに対し、未処置のマウスおよび Qbx33 単独で免疫されたマウスはウイルスを卵巣から消失せしめなかった。これらのデータからして、VLP 単独は、保護的 CTL 免疫応答を誘導するのに十分でなく、一方、CpG or ポリ (I:C) で保持された VLP はナイーブ CTL を免疫起動するのに非常に効果的である。
Qβ メランA 16-35 A/L VLP をプロセスし、ヒト MHC クラス I アレル HLA-A0201 により提示せしめ、機能性メランA-特異的 CD8+T 細胞の拡大を HLA-A2 形質転換マウスにおいて誘導する
HHD マウスを、キメラ1鎖クラス I 分子を、Db α3 ドメインと融合された A2 α1 および α2 ドメインの N-末端に共有結合されたヒトβ2-マイクログロブリンをもって (Firat, H. et al 1999, Eur.J.Immunol., 29:3112) 発現する。このマウスにおける HLA-A2 形質転換発現で、プロセスされ、CTL エピトープ・メランA 26-35 として提示され、そして CTL をインビボで免疫駆動する QβメランA 16-35 A/L VLP の能力を調べ得る。さらに、ISS としてのアジュバントの作用をインビボで試験できる。
合わせて、これらの知見は、ISS 保持 Qb-ペプチドワクチンの、外来および自己抗原に対する CTL を非常に効率的に駆動する能力を表す。
CpG で保持される Qbx33 を、長く持続するメモリー CD8+ T 細胞応答の誘発についての同族および非定型の駆動強化領域に使用できる
マウスを 150 μg Qbx33/NKCpG で免疫して、8 日後に、p33-特異的 T 細胞がナイーブマウスにおける 0.4 % +/- 0.2 % から免疫動物における 7.5% +/- 2.2% に、抗原特異的 MHC/ペプチド・テトラマーの測定で、増加した。20 日後に、ペプチド特異的 CD8+ T 集団が 1.6% +/-0.7% に低下した。これらのマウスを第1免疫 30 日後、150 μg Qbx33/NKPS で免疫すると、メモリー T 細胞応答が 8.4% +/-1.9% 特異的 T 細胞まで強化された。この応答は、徐々に低下するが、第1強化 4 か月、150 μg Qbx33/NKPS で T 細胞レベル 23.8% +/-5.2 % となった。
Claims (98)
- 下記:
(a) ウイルス様粒子、
(b) 少なくとも1の免疫刺激性物質、および
(c) 少なくとも1の抗原または抗原決定因子、
なお、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合しており、および該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる、
を含む組成物。 - 該少なくとも1の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に、少なくとも1の共有結合により結合しており、および好ましくは該共有結合が非ペプチド結合である、請求項1の組成物。
- 該少なくとも1の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に融合している、請求項1の組成物。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが MHC 分子との効率的な結合を可能にし得る、請求項1−3のいずれかの組成物。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが対応する正常メランA ペプチドに比して、2の、好ましくは1のアミノ酸置換を特徴とする、請求項1−4のいずれかの組成物。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログがプロテアーゼまたはペプチダーゼ仲介の減成から保護されている、請求項1−4のいずれかの組成物。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが下記:
(a) LAGIGILTV (配列番号: 84)、
(b) MAGIGILTV (配列番号: 85)、
(c) EAMGIGILTV (配列番号: 86)、
(d) ELAGIGILTV (配列番号: 50)、
(e) EMAGIGILTV (配列番号: 87)、
(f) YAAGIGILTV (配列番号: 88)、および
(g) FAAGIGILTV (配列番号: 89)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項1−4のいずれかの組成物。 - 該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが配列 ELAGIGILTV (配列番号: 50) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項1−4のいずれかの組成物。
- 該ウイルス様粒子が少なくとも1の第1接着部位を含み、および該抗原または抗原決定因子が下記:
(a) 該抗原または抗原決定因子で自然界に存在しない接着部位および
(b) 該抗原または抗原決定因子で自然界に存在する接着部位、
よりなる群から選ばれる少なくとも1の第2接着部位をさらに含み、
なお、該ウイルス様粒子への該抗原または抗原決定因子の該結合は該第1接着部位と該第2接着部位との連関を介して作用され、および好ましくは該連関は少なくとも1の非ペプチド結合により介される、請求項1−8のいずれかの組成物。 - 該抗原または抗原決定因子と該ウイルス様粒子が該連関を介して相互作用して、規則正しい反復した抗原アレイを形成する、請求項9の組成物。
- 該第1接着部位がアミノ基またはリシン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項9または10の組成物。
- 該第2接着部位がスルフヒドリル基またはシステイン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項9−11のいずれかの組成物。
- 該第1接着部位がリシン残基であり、および該第2接着部位がシステイン残基である、請求項9−12のいずれかの組成物。
- 該第1接着部位がアミノ基であり、および該第2接着部位がスルフヒドリル基である、請求項9−13のいずれかの組成物。
- 該第2接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが下記:
(a) CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55)、
(b) CGGELAGIGILTV (配列番号: 57)、
(c) CSYTTAEELAGIGILTV ILGVL (配列番号: 58)、
(d) CGGELAGIGILTVILGVL (配列番号: 59)、
(e) ELAGIGILTVGGC (配列番号: 60)、
(f) CSPKSLELAGIGILTV (配列番号: 92) および
(g) ELAGIGILTVILGVLGGC (配列番号: 93)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項9−14のいずれかの組成物。 - 該第2接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログがアミノ酸配列 CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55) を有する、請求項9−14のいずれかの組成物。
- 該ウイルス様粒子がリポタンパク質含有の包膜を欠く、請求項1−16のいずれかの組成物。
- 該ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子であり、および好ましくは該ウイルス様粒子が下記:
(a) 肝炎 B ウイルスの組換えタンパク質、
(b) 麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
(c) シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
(d) ロタウイルスの組換えタンパク質、
(e) 口蹄病ウイルスの組換えタンパク質、
(f) レトロウイルスの組換えタンパク質、
(g) ノルウォークウイルスの組換えタンパク質、
(h) ヒト・パピローマウイルスの組換えタンパク質、
(i) BK ウイルスの組換えタンパク質、
(j) バクテリオファージの組換えタンパク質、
(k) RNA-ファージの組換えタンパク質、
(l) Ty の組換えタンパク質および
(m) (a) 〜 (l) のいずれかの組換えタンパク質のフラグメント、
よりなる群から選ばれる、請求項1−17のいずれかの組成物。 - 該ウイルス様粒子が肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質である、請求項1−18のいずれかの組成物。
- 該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質のC末端に、好ましくは連鎖配列でもって融合している、請求項19の組成物。
- 該ウイルス様粒子が RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなり、なお、好ましくは該 RNA-ファージは下記:
(a) バクテリオファージ Qβ、
(b) バクテリオファージ R17、
(c) バクテリオファージ fr、
(d) バクテリオファージ GA、
(e) バクテリオファージ SP、
(f) バクテリオファージ MS2、
(g) バクテリオファージ M11、
(h) バクテリオファージ MX1、
(i) バクテリオファージ NL95、
(j) バクテリオファージ f2、
(k) バクテリオファージ PP7 、および
(l) バクテリオファージ AP205、
よりなる群から選ばれる、請求項1−20のいずれかの組成物。 - 該ウイルス様粒子がバクテリオファージ Qβまたはバクテリオファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる、請求項1−21のいずれかの組成物。
- 該免疫刺激性物質がトル様受容体活性化物質またはサイトカイン分泌誘発物質であり、および好ましくは該トル様受容体活性化物質が下記:
(a) 免疫刺激性核酸、
(b) ペプチドグリカン、
(c) リポポリサッカライド、
(d) リポテイコ酸、
(e) イミダゾキノリン化合物、
(f) フラジェリン、
(g) リポタンパク質、
(h) 免疫刺激性有機分子、
(i) 非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および
(j) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h) および/または (i) の少なくとも1の物質の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項1−22のいずれかの組成物。 - 該免疫刺激性核酸が下記:
(a) リボ核酸、
(b) デオキシリボ核酸、
(c) キメラ核酸、および
(d) (a)、(b) および/または (c) の少なくとも1の核酸の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項23の組成物。 - 該リボ核酸がポリ-(I:C) またはその誘導体である、請求項24の組成物。
- 該デオキシリボ核酸が下記:
(a) 非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドおよび
(b) 非メチル化 CpG モチーフのないオリゴヌクレオチド、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項24の組成物。 - 該免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである、請求項1−24または請求項26のいずれかの組成物。
- 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列:
5' X1X2CGX3X4 3'、うち、X1、X2、X3 および X4 はヌクレオチドである、
を含む、請求項27の組成物。 - 少なくとも1の該ヌクレオチド X1、X2、X3 および X4 がホスフェート骨格修飾を有する、請求項28の組成物。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが回交構造配列を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項1−29のいずれかの組成物。
- 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記:
(a) TCCATGACGTTCCTGAATAAT (配列番号: 35)、
(b) TCCATGACGTTCCTGACGTT (配列番号: 37)、
(c) GGGGTCAACGTTGAGGGGG (配列番号: 39)、
(d) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、および
(e) 表 2 に記載の “dsCyCpG-253” (配列番号: 49)、
を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなり、
および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の1以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項27の組成物。 - 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項27の組成物。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の1以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項1−32のいずれかの組成物。
- 該免疫刺激性物質が該ウイルス様粒子に非共有結合している、請求項1−33のいずれかの組成物。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが該ウイルス様粒子に非共有結合している、請求項1−34のいずれかの組成物。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが約 6 〜 約 100,000 ヌクレオチド、好ましくは約 6 〜約 2000 ヌクレオチド、さらに好ましくは約 20 〜 約 500 ヌクレオチド、およびさらにいっそう好ましくは約 20 〜 約 100 ヌクレオチドを含む、請求項1−35のいずれかの組成物。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが下記:
(a) 組換えオリゴヌクレオチド、
(b) ゲノムオリゴヌクレオチド、
(c) 合成オリゴヌクレオチド、
(d) プラスミド誘導オリゴヌクレオチド、
(e) 一本鎖オリゴヌクレオチド、および
(f) 二本鎖オリゴヌクレオチド
から選ばれる、請求項1−36のいずれかの組成物。 - 該回交構造配列が GACGATCGTC (配列番号: 1) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項30の組成物。
- 該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 3 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項38の組成物。
- 該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 4 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項38の組成物。
- 該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 5 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項38の組成物。
- 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記:
(a) GGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 2)、
(b) GGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 3)、
(c) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 4)、
(d) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 5)、
(e) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (配列番号:6)、
(f) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号: 7)、
(g) GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (配列番号: 8)、
(h) GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG (配列番号: 9)、および
(i) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、
から選ばれる核酸配列を有する、請求項38の組成物。 - 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列番号: 7 または配列番号: 41 の核酸配列を有する、請求項27または38の組成物。
- 該抗原が細胞毒性 T 細胞エピトープ、Th 細胞エピトープまたは少なくとも2の該エピトープの組合せを含み、該少なくとも2のエピトープが直接もしくは連鎖配列により結合しており、および好ましくは該細胞毒性 T 細胞エピトープがウイルスもしくは腫瘍の細胞毒性 T 細胞エピトープである、請求項1−43のいずれかの組成物。
- 該抗原が少なくとも1の細胞毒性 T 細胞エピトープと少なくとも1の Th 細胞エピトープとの組合せを含み、および該組合せがメランA 1-118 A/L (配列番号: 94) である、請求項44の組成物。
- 動物における免疫応答を高めるための方法であって、下記:
(a) ウイルス様粒子、
(b) 少なくとも1の免疫刺激性物質、および
(c) 少なくとも1の抗原または抗原決定因子、
なお、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合しており、および該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる、
を含む組成物を該動物に導入することを含む方法。 - 該少なくとも1の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に、少なくとも1の共有結合により結合しており、および該共有結合が非ペプチド結合である、請求項46の方法。
- 該少なくとも1の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に融合している、請求項46の方法。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが MHC 分子との効率的な結合を可能にし得る、請求項46−48のいずれかの方法。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが対応する正常メランA ペプチドに比して、2の、好ましくは1のアミノ酸置換を特徴とする、請求項46−49のいずれかの方法。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログがプロテアーゼまたはペプチダーゼ仲介の減成から保護されている、請求項46−50のいずれかの方法。
- 該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが下記:
(a) LAGIGILTV (配列番号: 84)、
(b) MAGIGILTV (配列番号: 85)、
(c) EAMGIGILTV (配列番号: 86)、
(d) ELAGIGILTV (配列番号: 50)、
(e) EMAGIGILTV (配列番号: 87)、
(f) YAAGIGILTV (配列番号: 88)、および
(g) FAAGIGILTV (配列番号: 89)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項46−51のいずれかの方法。 - 該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが配列 ELAGIGILTV (配列番号: 50) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項46−51のいずれかの方法。
- 該ウイルス様粒子が少なくとも1の第1接着部位を含み、および該抗原または抗原決定因子が下記:
(a) 該抗原または抗原決定因子で自然界に存在しない接着部位および
(b) 該抗原または抗原決定因子で自然界に存在する接着部位、
よりなる群から選ばれる少なくとも1の第2接着部位をさらに含み、
なお、該ウイルス様粒子への該抗原または抗原決定因子の該結合は該第1接着部位と該第2接着部位との連関を介して作用され、および好ましくは該連関は少なくとも1の非ペプチド結合により介される、請求項46−53のいずれかの方法。 - 該抗原または抗原決定因子と該ウイルス様粒子が該連関を介して相互作用して、規則正しい反復した抗原アレイを形成する、請求項54の方法。
- 該第1接着部位がアミノ基またはリシン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項54または55の方法。
- 該第2接着部位がスルフヒドリル基またはシステイン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項54−56のいずれかの方法。
- 該第1接着部位がリシン残基であり、および該第2接着部位がシステイン残基である、請求項54−57のいずれかの方法。
- 該第1接着部位がアミノ基であり、および該第2接着部位がスルフヒドリル基である、請求項54−58のいずれかの方法。
- 該第2接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが下記:
(a) CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55)、
(b) CGGELAGIGILTV (配列番号: 57)、
(c) CSYTTAEELAGIGILTV ILGVL (配列番号: 58)、
(d) CGGELAGIGILTVILGVL (配列番号: 59)、
(e) ELAGIGILTVGGC (配列番号: 60)、
(f) CSPKSLELAGIGILTV (配列番号: 92) および
(g) ELAGIGILTVILGVLGGC (配列番号: 93)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項54−59のいずれかの方法。 - 該第2接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログがアミノ酸配列 CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55) を有する、請求項54−59のいずれかの方法。
- 該ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子であり、および好ましくは該ウイルス様粒子が下記:
(a) 肝炎 B ウイルスの組換えタンパク質、
(b) 麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
(c) シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
(d) ロタウイルスの組換えタンパク質、
(e) 口蹄病ウイルスの組換えタンパク質、
(f) レトロウイルスの組換えタンパク質、
(g) ノルウォークウイルスの組換えタンパク質、
(h) ヒト・パピローマウイルスの組換えタンパク質、
(i) BK ウイルスの組換えタンパク質、
(j) バクテリオファージの組換えタンパク質、
(k) RNA-ファージの組換えタンパク質、
(l) Ty の組換えタンパク質および
(m) (a) 〜 (l) のいずれかの組換えタンパク質のフラグメント、
よりなる群から選ばれる、請求項46−61のいずれかの方法。 - 該ウイルス様粒子が肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質である、請求項46−62のいずれかの方法。
- 該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質のC末端に、好ましくは連鎖配列でもって融合している、請求項63の方法。
- 該ウイルス様粒子が RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなり、なお、好ましくは該 RNA-ファージは下記:
(a) バクテリオファージ Qβ、
(b) バクテリオファージ R17、
(c) バクテリオファージ fr、
(d) バクテリオファージ GA、
(e) バクテリオファージ SP、
(f) バクテリオファージ MS2、
(g) バクテリオファージ M11、
(h) バクテリオファージ MX1、
(i) バクテリオファージ NL95、
(j) バクテリオファージ f2、
(k) バクテリオファージ PP7 、および
(l) バクテリオファージ AP205、
よりなる群から選ばれる、請求項46−64のいずれかの方法。 - 該ウイルス様粒子がバクテリオファージ Qβまたはバクテリオファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる、請求項46−65のいずれかの方法。
- 該免疫刺激性物質がトル様受容体活性化物質またはサイトカイン分泌誘発物質であり、および好ましくは該トル様受容体活性化物質が下記:
(a) 免疫刺激性核酸、
(b) ペプチドグリカン、
(c) リポポリサッカライド、
(d) リポテイコ酸、
(e) イミダゾキノリン化合物、
(f) フラジェリン、
(g) リポタンパク質、
(h) 免疫刺激性有機分子、
(i) 非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および
(j) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h) および/または (i) の少なくとも1の物質の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項46−66のいずれかの方法。 - 該免疫刺激性核酸が下記:
(a) リボ核酸、
(b) デオキシリボ核酸、
(c) キメラ核酸、および
(d) (a)、(b) および/または (c) の少なくとも1の核酸の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項67の方法。 - 該リボ核酸がポリ-(I:C) またはその誘導体である、請求項68の方法。
- 該デオキシリボ核酸が下記:
(a) 非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドおよび
(b) 非メチル化 CpG モチーフのないオリゴヌクレオチド、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項68の方法。 - 該免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである、請求項46−68または請求項70のいずれかの方法。
- 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列:
5' X1X2CGX3X4 3'、うち、X1、X2、X3 および X4 はヌクレオチドである、
を含む、請求項71の方法。 - 少なくとも1の該ヌクレオチド X1、X2、X3 および X4 がホスフェート骨格修飾を有する、請求項72の方法。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが回交構造配列を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項46−73のいずれかの方法。
- 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記:
(a) TCCATGACGTTCCTGAATAAT (配列番号: 35)、
(b) TCCATGACGTTCCTGACGTT (配列番号: 37)、
(c) GGGGTCAACGTTGAGGGGG (配列番号: 39)、
(d) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、および
(e) 表 2 に記載の “dsCyCpG-253” (配列番号: 49)、
を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなり、
および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の1以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項71の方法。 - 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが回交構造であり、および好ましくは該回交構造の非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項71の方法。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の1以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項46−76のいずれかの方法。
- 該免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが該ウイルス様粒子に非共有結合している、請求項46−77のいずれかの方法。
- 該免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが該ウイルス様粒子に充填され、好ましくは封入されている、請求項46−78のいずれかの方法。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが約 6 〜 約 100,000 ヌクレオチド、好ましくは約 6 〜約 2000 ヌクレオチド、さらに好ましくは約 20 〜 約 500 ヌクレオチド、およびさらにいっそう好ましくは約 20 〜 約 100 ヌクレオチドを含む、請求項46−79のいずれかの方法。
- 該少なくとも1の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが下記:
(a) 組換えオリゴヌクレオチド、
(b) ゲノムオリゴヌクレオチド、
(c) 合成オリゴヌクレオチド、
(d) プラスミド誘導オリゴヌクレオチド、
(e) 一本鎖オリゴヌクレオチド、および
(f) 二本鎖オリゴヌクレオチド
から選ばれる、請求項46−80のいずれかの方法。 - 該回交構造配列が GACGATCGTC (配列番号: 1) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項74の方法。
- 該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 3 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項82の方法。
- 該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 4 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項82の方法。
- 該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 5 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項82の方法。
- 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記:
(a) GGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 2)、
(b) GGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 3)、
(c) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 4)、
(d) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号: 5)、
(e) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (配列番号:6)、
(f) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号: 7)、
(g) GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (配列番号: 8)、
(h) GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG (配列番号: 9)、および
(i) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、
から選ばれる核酸配列を有する、請求項82の方法。 - 該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列番号: 7 または配列番号: 41 の核酸配列を有する、請求項71または82の方法。
- 該抗原が細胞毒性 T 細胞エピトープ、Th 細胞エピトープまたは少なくとも2の該エピトープの組合せを含み、該少なくとも2のエピトープが直接もしくは連鎖配列により結合しており、および好ましくは該細胞毒性 T 細胞エピトープがウイルスもしくは腫瘍の細胞毒性 T 細胞エピトープである、請求項46−87のいずれかの方法。
- 該免疫応答が高められた B 細胞応答または高められた T 細胞応答であり、好ましくは該 T 細胞応答が CTL 応答または Th 細胞応答であり、およびさらに好ましくは該 Th 細胞応答が Th1 細胞応答である、請求項46−87のいずれかの方法。
- 該動物が哺乳類であり、および好ましくは該哺乳類がヒトである、請求項46−89のいずれかの方法。
- 該組成物が該動物に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、鼻孔内にまたは直接的にリンパ節へ投与される、請求項46−90のいずれかの方法。
- 免疫学的有効量の請求項1−45のいずれかの組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むワクチンであって、好ましくはアジュバントをさらに含むワクチン。
- 動物を免疫付加または処置する方法であって、該動物に免疫学的有効量の請求項92のワクチンを投与することを含む方法。
- 該動物が哺乳類であり、および好ましくは該哺乳類がヒトである、請求項93の方法。
- 動物を免疫付加または処置する方法であって、該動物に免疫学的有効量の請求項92のワクチンを投与することにより T 細胞応答を免疫起動することを含む方法。
- 該動物における免疫応答を追加刺激する工程をさらに含み、好ましくは該追加刺激が免疫学的有効量の請求項92のワクチンまたは免疫学的 有効量の非定型ワクチンを投与することにより作用され、さらに好ましくは該非定型ワクチンが DNA ワクチンである、請求項95の方法。
- 動物を免疫付加または処置する方法であって、該動物において T 細胞応答を免疫起動し、そして該動物において T 細胞応答を追加刺激する工程を含み、該追加刺激が免疫学的有効量の請求項92のワクチンを投与することにより作用される方法。
- 該免疫駆動が免疫学的有効量の請求項92のワクチンまたは免疫学的有効量の非定型ワクチンを投与することにより作用され、および好ましくは該非定型ワクチンが DNA ワクチンである、請求項97の方法。
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