JP2005515979A - 活性な薬物成分としてのビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオン置換体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオン置換体、特にクルシアノン及びその誘導体を薬学的あるいは薬剤として活性な成分として、特に腫瘍性あるいはガン性疾患及びウィルス性疾患の予防及び／あるいは治療（治癒）処置用の医薬の生成に利用すること関するものである。上記化合物は細胞増殖抑制剤及び抗ウィルス性剤（ｖｉｒｕｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）にも用いられる。これらの化合物は、特にトポイソメラーゼ抑制剤及びテロメラーゼ抑制剤並びにＭＡＰキナーゼ信号伝達時の調節因子としても用いることができ、腫瘍あるいはガン細胞及びウィルスの増殖機構へ細胞規模で介入できる。

Description

本発明は、ビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオン置換体、特に腫瘍性あるいはガン性疾患及びウィルス性疾患の予防及び／あるいは治療（治癒）処置用の医薬を生成する、特にクルシアノン及びその誘導体を活性な医薬成分として使用することに関するものである。本発明はまた、医薬の医薬的に活性な成分あるいは医薬組成物、特に細胞増殖抑制及び抗ウィルス性組成物（ｖｉｒｕｓｔａｔｉｃｓ）としてのビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオン置換体に関するものである。更に、本発明はトポイソメラーゼ抑制因子及び／あるいはテロメラーゼ抑制因子並びにＭＡＰキナーゼ信号伝達においての調節因子としてのビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオン置換体を使用することに関する。

腫瘍性あるいはガン性疾患は単一の病理学的状態ではなく、多数の異なったタイプの悪性疾患に対する独特の用語である。実質的には体内の組織毎にガン性退化が生じており、時には異なったタイプのものである。各障害にはそれぞれの特徴がある。これら疾患となる原因は時には非常に異質である。

このような多様性にもかかわらず、すべての腫瘍及びガン性退化は極めて似通った基本的な分子あるいは細胞的過程を経て生じている。分子レベルにおける発ガン及び腫瘍発生の最も基本的な過程に関する知識はこの２０年間に驚くべき進歩を遂げている。

遺伝情報は細胞核の染色体のＤＮＡ分子により伝えられる。一細胞の全資性のほんの一部の原因である二種類の遺伝子、即ち特にプロトオンコジーン（ガン遺伝子前駆体）及び腫瘍サプレッサ遺伝子（腫瘍を抑制する遺伝子）、は相俟ってガンの進行に重要な役割を果たす。通常の形態ではこれらの遺伝子は細胞のライフサイクルを司り、細胞の複雑な一連の成長過程、必要に応じて分裂を制御する。プロトオンコジーンは細胞の成長を促進し、腫瘍サプレッサ遺伝子は成長を遅らせている。この二種類の遺伝子は一緒になって人間の腫瘍における制御できない細胞拡散過程の主要な原因となる。例えば、プロトオンコジーンが制御域内あるいは構造域内において突然変異すると、過剰の成長促進タンパク質を生成する可能性があるか、後者（腫瘍サプレッサ遺伝子）は過剰に活性となる。プロトオンコジーンは細胞が過剰に拡散するように働くガン促進オンコジーンとなる。それに対して、腫瘍サプレッサ遺伝子は突然変異で不活性になるとガンの進行に寄与する。その結果、細胞は不適切な拡散を防ぐ成長抑制因子として機能するサプレッサタンパク質を失う。

際限のない拡散に対する緊急の機能が正常な体細胞に組込まれており、その機能はすべての細胞分裂を記録し、何回かの再生後中止を喚起する一種のカウンターを含んで構成されている。ほぼ予測可能な何回かの分裂あるいは複製後、正常な細胞の成長は止まる。この過程は細胞の老化と呼ばれている。

分子レベルにおいてはテロメアと呼ばれる染色体末端のＤＮＡ部分が細胞の老化の役割を担っている。テロメアは細胞の母集団が拡散サイクルを経た回数をそのまま記録し、ある特定の回数後に、老化あるいは発症が始まる。このようにテロメアは細胞の母集団が際限なく成長することを制限している。最も健康な人間の細胞においては、分裂毎に染色体が複製する際、テロメアは少しずつ短くなっていく。テロメアが特定の臨界長さまで縮むことは、細胞が老化の段階に入った信号である。細胞がその信号を無視するとテロメアは更に縮み最後には発症する。テロメアが極端に短くなると、染色体は互いに結合するか分解し、それによる遺伝子の混乱状態は細胞にとって致命的となる。

正常な細胞が従う老化、すなわち分裂する能力の喪失は、正常な死すべき運命にある分裂毎にテロメア末端におけるＤＮＡにおいて５０から２００個のヌクレオチドを失う細胞における染色体に依存する。末端のヌクレオチド（テロメア）の喪失は分裂回数を記録する一種の分裂時計の機能を有している。テロメアを保有することは細胞が老化過程から逃れ無限に分裂するために必要であると思われる。

特にテロメラーゼと呼ばれる酵素を合成する指令を含んでいる遺伝子が活性化すると、上記の防御機能は、大抵のガン及び腫瘍細胞における退化の過程中は不活性となる。この酵素は、短くなっていくテロメアを体系的に補充し、それを維持し細胞が際限なく分裂できるようにする。このように大抵の腫瘍性及びガン性疾患においては、テロメラーゼの作用による短いが安定なテロメアを保持することで細胞が不死となる。下記の点からこの不死は好ましいものではない：第一に、腫瘍が非常に大きくなる可能性があることで、第二に前ガンあるいは真性ガン細胞にその拡散、他の組織への浸透及び最終的には転移する能力を増大させる突然変異が集積する時間を与える。

退化した細胞の際限の無い成長は約８０％の腫瘍性疾患はテロメラーゼの調整障害によることがわかっている。従って、テロメラーゼ抑制物質を介して腫瘍性あるいはガン性疾患を治療することはこれらの疾患に対して期待される療法となるように思われる。

ＷＯ ００／７４６６７ Ａ２公報はガンの治療のためにテロメラーゼ抑制物質（例えば、ＡＺＴ）をテロメラーゼを破壊する活性な薬物成分（例えば、パクリタキセル）と組合せて用いることを提案している。ＷＯ ９９／６５８７５ Ａ１ 公報及び ＵＳ−Ａ−５ ８６３ ９３６ 号公報はガン性疾患の治療のためにテロメラーゼ抑制物質として特定のヘテロビシクリック系の使用を提案している。公開欧州特許明細書 ＥＰ ０ ９３８ ８９７ Ａ１ に記載されているようなカテコール誘導体も同様にガン治療のためのテロメラーゼ抑制物質として用いることができると言われている。

分子あるいは細胞レベルの他の機能によって腫瘍あるいはガン細胞の拡散に介入する試みが為されている。このように、ＤＮＡのアルキル化により同時に腫瘍あるいはガン細胞のＤＮＡに直接、損傷を引き起こすアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、クロラムブシルなど）を用いて最新の技術により腫瘍性あるいはガン性疾患を治療している。同様に、トポイソメラーゼの抑制により、腫瘍あるいはガン細胞の複製に介入する物質（例えば、カンプトセティシン、９−アミノカンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシンなど）（例えば、Ｃｌｉｖｅ Ｐａｇｅ等のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｍｏｓｂｙ， １９９７ を参照）を腫瘍あるいはガン治療に用いている。

一方、アルキル化活性剤以外に幾つかのトポイソメラーゼ抑制物質が臨床的に用いられており、テロメラーゼの抑制に反応する腫瘍あるいはトポイソメラーゼ及びテロメラーゼの抑制の性質の組合わさった腫瘍の治療に臨床的に用いている活性な医薬成分は今のところ見当たらない。

従って、本発明の目的は腫瘍性及びガン性疾患の治療に適した活性な医薬成分及び薬剤を見出して提供することであるが、他の疾患（例えばウィルス性疾患）にも適している。

驚くべきことに、出願人は下記の一般式（Ｉ）で表されるビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオン置換体及びその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物は特に腫瘍及びガン疾患の予防及び／あるいは治療処置に適していることを発見した。

・一般式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は同一か異なったもので、下記に示すそれぞれの基のいずれか一つである。但し、ラジカルＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５のいずれかがベンゾイル基である場合、他のラジカルはベンゾイル基ではない。

・Ｒ^３は水素原子である。

・Ｒ^６及びＲ^７はいずれもメチル基あるいは水素原子であり、Ｒ^８及びＲ^９はいずれもメチル基あるいは水素原子であるが、Ｒ^６及びＲ^７がメチル基の場合はＲ^８及びＲ^９は水素原子であり、Ｒ^８及びＲ^９がメチル基の場合はＲ^６及びＲ^７は水素原子である。

本発明は先ず、特にヒト及び動物、すなわちヒト及び獣医学分野の腫瘍及びガン疾患の予防及び／あるいは治療処置に適している上記一般式（Ｉ）で表される化合物及びその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物の利用に関するものである。

一般式（Ｉ）で表される化合物の生理学的に耐性あるいは受容可能な塩類は例えば鉱酸、カルボン酸あるいはスルホン酸との塩類でもよく、特に塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸あるいは安息香酸との塩類が好ましい例である。しかし、例えばアルカリ金属塩（例えば、ナトリウムあるいはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムあるいはマグネシウム塩）あるいはアンモニアあるいは例えばジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジハイドロアビエチレンアミン、１−エフェナミンあるいはメチルピペリジンなどの塩類等々、通常の塩基との塩類も生理学的に耐性あるいは受容可能な塩類と言える。

本発明には一般式（Ｉ）で表される化合物の水和物も含む。本発明による一般式（Ｉ）で表される水和物は固体あるいは液状で水と共に分子化合物（水和物）を形成する。水和物において水分子は分子間力、特に水素結合により付着している。固体の水和物では水は化学量論的あるいは非化学量論的比率でいわゆる結晶水として含まれており、結合状態とは必ずしも同等でなくてもよい。例えば、三二水和物、一水和物、二水和物などは一般式（Ｉ）で表される化合物の塩類の水和物として適している。

本発明には一般式（Ｉ）で表される化合物の異性体も含まれる。本発明の目的に適う異性体は広汎な呼称で用いられている全ての可能な形態の異性体である。本発明による制限のない異性体の例としては特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体がある。

このように、一般式（Ｉ）で表される化合物は置換の型に応じて、例えば鏡像関係にある（鏡像異性体）あるいは非鏡像関係にある（ジアステレオマー）立体異性体の形態であってもよい。本発明は一般式（Ｉ）で表される化合物の全ての立体異性体、即ち、鏡像異性体、ジアステレオマー及びそれらの混合した異性体を含んでいる。鏡像異性体の形態はジアステレオマーと同様にそれ自体、立体異性的に単一成分に分離できる。

一般式（Ｉ）で表される化合物は互変異性体の形態でもよい。このことは、当業に通じた者には知られており、本発明の範囲に含まれている。例えば、下記のケト−エノール互変異性体がこの互変異性体の例である。

例えば、Ｒ^５がベンゾイル基の場合には、更に別の型のケト−エノール互変異性体が可能となる。

一般式（Ｉ）で表される化合物は特に位置異性体（置換異性体）である構造異性体としても存在することが可能である。このことは、当業に通じた者には知られており、本発明の範囲に含まれている。

本発明は一般式（Ｉ）で表される化合物の誘導体（例えば（Ｉ′）及び（Ｉ″）で表されるアルキル化によって得られる互変異性体メチルエーテル類などのアルキルエーテル類）も含んでいる。

本発明のよる好適な誘導体は好ましくは（Ｉ′）及び（Ｉ″）で表される互変異性体のポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧエーテル）などの特にポリアルキレングリコールエーテルなどのエチレングリコール化された誘導体である。更に、置換基Ｒ^１からＲ^９との関係で化学的に変更することが可能である（例えば、側鎖の誘導化）。

本発明はまた一般式（Ｉ）で表される化合物であるプロドラッグ及び代謝産物を含んでいる。本発明のプロドラッグとしての一般式（Ｉ）で表される化合物の形態それ自身は生物学的に活性あるいは不活性であるが、適切な生物学的に活性な形態（例えば、新陳代謝、加溶媒分解あるいは他の方法により）変換できる。本発明による代謝産物としての一般式（Ｉ）で表される化合物は特に新陳代謝の結果によるかあるいは新陳代謝中の変換によるものである。

一般式（Ｉ）で表される化合物は天然の産物であり、カリブ海の蜂から抽出した蜂蝋からクロマトグラフで分離することにより得られる。蜂蝋は暗黄色から薄褐色で、指の間で軟化する樹脂状の塊で芳香性のバルサンのような匂いであり、蜂は花の蕾から集めて巣の補強をするため、壁の被覆に用いている。蜂蝋は非常に複雑な化学構造を有し、その組成は地域の植物相に依存する。蜂蝋はその大部分を占める蝋及び樹脂、必須芳香油及び例えばフラボノイド、カフェー酸誘導体及びカリブの蜂蝋では一般式（Ｉ）で表される化合物をなど多数の化学物質を含む２００以上の化学物質から構成されている。

一般式（Ｉ）で表される化合物は種々のＣｌｕｓｉａ種、オトギリソウ科の一属（例えば、Ｃｌｕｓｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｃｌｕｓｉａ ｒｏｓｅａ あるいはＣｌｕｓｉａ ｒｅｇｎｎｅｒｉｏｉｄｅｓ）の樹液あるいは樹脂（例えば、樹脂、ラテックス、葉、花など）から直接分離することもできる。

このように、Ａ．Ｊ．Ｍａｒｓａｉｏｌｉ 等（“Ｔｈｅ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｂｅｅｓ，ａｎｄ Ｃｌｕｓｉａ Ｆｌｏｒａｌ Ｒｅｓｉｎ ａｎｄ Ｏｉｌｓ，ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｖｉｅｗ”，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７０，１１，２１１６ ｆｆ．（１９９８））、Ｃ．Ｍ．Ａ．ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ 等（“Ｔｗｏ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｙｌａｔｅｄ ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｌｏｒａｌ ｒｅｓｉｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ Ｃｌｕｓｉａ ｓｐｅｉｃｉｅｓ”，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（１９９９），ｐａｇｅｓ １０７３−１０７９）及びＡ．Ｌ．Ｍ．Ｐｏｒｔｏ等（“Ｐｏｌｙｉｓｏｐｅｎｙｌａｔｅｄ ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｌｕｓｉａ ｆｌｏｒａｌ ｒｅｉｎｓ”，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５（２０００），ｐａｇｅｓ ７５５−７６８）はＣｌｕｓｉａ種（オトギリソウ科の一属）の種々の植物の樹脂あるいは成分から上記の一般式（Ｉ）で表される種々のクルシアノン誘導体をベンゼン／酢酸エチルを溶離剤としシリカゲル／硝酸銀上で薄層クロマトグラフにより予備分離してからクロマトグラフィ法（ジエチルエーテル中でのジアゾメタンと樹脂の反応、次いでヘキサン／酢酸エチルあるいはヘキサン／ジエチルエーテルを溶離剤としてシリカゲルを充填したカラム（勾配カラム）によるカラムクロマトグラフ）による分離について記載している。

オトギリソウ科の一属、すなわちＣｌｕｓｉａ ｃｏｎｇｅｓｔｉｆｌｏｒａ の樹脂からクルシアノン自身の分離及びその構造について、Ｌ．Ｅ．ＭｃＣａｎｄｉｓｈ等の“Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｔｗｏ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｃｙｃｌｏ［３．３．１］ｎｏｎａｎｅ−２，４，９−ｔｒｉｏｎｅ．Ａ ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ：Ｃｌｕｓｉｎｏｎｅ，Ｃ_３３Ｈ_４２Ｏ_４，ａｎｄ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｃａｔｅｃｈｉｎｉｃ Ａｃｉｄ，Ｃ_１８Ｈ_２０Ｏ_６” ｉｎ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｂ３２，ｐａｇｅｓ １７９３−１８０１、によって記載されている。

Ｍ．Ｈ．Ｓａｎｔｏｓ等の“Ｅｆｅｔｉｏ ｄｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｉｎｔｅｓ ｑｕiｍｉｃｏｓ ｅｘｔｒａｉｄｏｓ ｄｏ ｆｒｕｔｏ ｄｅ Ｒｈｅｅｄｉａ ｇａｒｄｎｅｒｉａｎａ（ｂａｃｕｐａｒi）ｓｏｂｒｅ ｂａｃｔeｒｉａｓ ｐａｔｏｇeｎｉｃａ”，ｉｎ Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃeｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｖｉｓｔａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｃｉeｎｃｉａｓ Ｆａｒｍａｃeｕｔｉｃａｓ），Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．２，Ｊｕｌｙ／Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９９，ｐａｇｅｓ ２９７−３０１及び“Ｅｐｉｃｌｕｓｉａｎｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ Ｂｉｃｙｃｌｏ［３．３．１］ｎｏｎａｎｅ−２，４，９−ｔｒｉｏｎｅ”Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．（１９９８），Ｃ５４，ｐａｇｅｓ １９９０−１９９２）はオトギリソウ科の一属であるＲｈｅｅｄｉａ ｇａｒｄｎｅｒｉａｎａ（ｂａｃｕｐａｒｉ）の花からエピクルシアノンの分離について記載している。

Ｆ．ｄｅｌｌｅ Ｍｏｎａｃｈｅ等の“Ｐｒｅｎｙｌａｔｅｄ Ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅｓ Ｆｒｏｍ Ｃｌｕｓｉａ Ｓａｎｄｉｅｎｓｉｓ”，Ｐｈｙｔｏｃｍｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．６，ｐａｇｅｓ ２００３−２００５（１９９１）はクロマトグラフィ法（薄層クロマトグラフィ後にカラムクロマトグラフィ）によりＣｌｕｓｉａ Ｓａｎｄｉｅｎｓｉｓの樹脂から種々のクルシアノン誘導体の分離について記載している。

一般式（Ｉ）で表される化合物の調整及び分離に関して開示している上記の先行技術は全て参考文献に組み込む。

極めて驚くべきことに、生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を含む一般式（Ｉ）で表される化合物は、今まで予測できなかった薬学的に有益な効果の範囲を示しており、従って、特にあらゆるタイプの腫瘍及びガン疾患の予防及び／あるいは治療処置に適しており、あらゆるタイプのウィルス性疾患にも適している。

従って、生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を含む一般式（Ｉ）で表される化合物は、特に腫瘍及びガン疾患の予防及び／あるいは治療用（細胞増殖抑制剤）及びウィルス性疾患の予防及び／あるいは治療用（抗ウィルス組成あるいはウィルス増殖抑制剤）の薬物に用いられる。更に、本発明は上記のあるいは生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を含む一般式（Ｉ）で表される少なくとも一つの化合物を好ましくは治療に有効な量を含み、薬学的に許容される非毒性の担体あるいは賦形剤を伴う化合物は、特に細胞増殖抑制剤あるいは抗ウィルス組成（ウィルス増殖抑制剤）などの薬物に関するものである。

出願人は一般式（Ｉ）で表される化合物は、なかんずくトポイソメラーゼ抑制因子、特にトポイソメラーゼＩの抑制因子として作用することを見出した。更に、これらの化合物はテロメラーゼ抑制効果も示した。最終的には、本発明による一般式（Ｉ）で表される化合物は腫瘍及びガン細胞内のＤＮＡの破壊を誘発する。

本発明による一般式（Ｉ）で表される化合物のトポイソメラーゼ抑制効果及びテロメラーゼ抑制効果は、従来から知られている化合物よりも明らかに高い効果を示す。

例えば一般式（Ｉ）で表される化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では従来の治療薬（例えば、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）よりも相当に強いトポイソメラーゼＩの抑制効果が認められた。更に、一般式（Ｉ）で表される化合物はＭＡＰキナーゼ信号伝達において調節因子として作用する。一般式（Ｉ）で表される化合物がトポイソメラーゼ及びテロメラーゼの抑制の性質が伴っていることにより、有益な性質があり、あらゆるタイプの腫瘍及びガン疾患（原発性腫瘍、転移、前ガンあるいはガンの初期段階、良性及び悪性腫瘍など）の予防及び治療（治癒）処置に用いられる関係において特に適切であることを示している。一方、従来の技術分野では一つの分子がトポイソメラーゼ及びテロメラーゼの抑制を伴っているような活性な成分及び製品は知られていない。

本発明による一般式（Ｉ）で表される活性な成分は抗腫瘍効果、更には抗転移効果を示す。

本発明による活性な成分は、効果が確認されている化学療法薬に対しても抵抗力のあるガンに対してさえも予期せぬ良好な細胞増殖抑制効果を示す。一般式（Ｉ）で表される活性な成分に何らの耐性も認められていない。更に、本発明による一般式（Ｉ）で表される活性な成分は既に認められている薬剤あるいは化学療法薬に対して何らの交差耐性も示さない利点がある。

一般式（Ｉ）で表される化合物を、下記の腫瘍及びガン疾患の非制限的例として述べる疾患の治療に対して用いることができる。：腸ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎ）、乳ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ）、卵巣ガン、子宮ガン、肺ガン、胃ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、前立腺ガン、睾丸ガン、骨ガン、皮膚ガン、Ｋａｐｏｓｉ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽腫（例えば、網膜芽腫）、リンパ腫、白血病。

本発明により、下記の（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）の化合物及びそれらの生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を含む化合物は好適に用いることができる。

特に、本発明により生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を含む式（Ｉｃ）で表される化合物を特に好適に用いることができる。

式（Ｉｃ）で表される化合物は、下記に示すように互い平衡を保って存在する多数のケト／エノール互変異性体の内の一つである。

下記に示す配置の式（Ｉｃ）で表される化合物が特に好適である。

時には、一般式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいは生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を、少なくとも一つの化学療法薬、特にタンパクキナーゼ抑制剤、好ましくはＭＡＰキナーゼ抑制剤と組合せて用いるかあるいは処置することが有利であることが判明した。特に、ガン及び腫瘍性疾患の療法において、一般式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいは生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物と、タンパクキナーゼ抑制剤、好ましくはＭＡＰキナーゼ抑制剤との組合せにより好結果が得られた。この組合せは驚くべきシナジー効果を有している。

本発明は薬学的組合せ、特に下記を含む細胞増殖抑制の組合せに関してもいる。

（Ａ）上記の少なくとも一つの一般式（Ｉ）の化合物及び／あるいは生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物。

（Ｂ）更に、少なくとも一つの化学療法薬、特に、タンパクキナー抑制剤、好ましくはＭＡＰキナーゼ抑制剤。

個々の組合せ要素（Ａ）及び（Ｂ）は同時かあるいは順次用いるかあるいは処置する。薬学的組合せは要素（Ａ）及び（Ｂ）を混合した機能剤としてかあるいは互いに別々でもよい。

その名が示すように、タンパクキナーゼ抑制剤はタンパクキナーザ、すなわちγ燐酸塩類をＡＴＰからチロシンあるいはセリン及びセレオニン側鎖へと転換する酵素の作用との関連において抑制効果を有する。特に腫瘍性及びガン性疾患に適した薬学的組合せは、例えば従来知られている全てのタンパクキナーゼ抑制剤（スタウロスポリン、２´−アミノ−３´−メトキシフラボン、１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノー１，４−［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＢｅｅｃｈａｍのＳＢ ２０３５８０などの低分子複素環抑制剤）などすべてのタイプのタンパクキナーゼ抑制剤である。この場合シナジー効果が認められるかもしれない。

本発明による薬学的組合せのためのＭＡＰキナーゼ抑制剤及び本発明による腫瘍性及びガン性疾患の組合せ治療を用いることが好ましい。ＭＡＰキナーゼ抑制剤は、その名が示すように、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰ＝マイトジェン活性化タンパク）すなわち特に細胞の有糸分裂中に活性でヌクレオチド三燐酸から適当な基質へと末端の燐酸塩残滓を転換する酵素の作用との関連において抑制効果を有している。このように、ＭＡＰキナーゼ抑制剤は有糸分裂を防ぎガン及び腫瘍細胞の分裂を防ぐ。特に腫瘍性及びガン性疾患に適した薬学的組合せは、例えば従来知られているすべてのＭＡＰキナーゼ抑制剤などすべてのタイプのＭＡＰキナーゼ抑制剤である。本発明に用いられるＭＡＰキナーゼ抑制剤の例は下記の公開公報に述べられている。ここに全体の引用文献を示す。ＷＯ ９９／３２１１１ Ａ，ＷＯ ９９／６４４００ Ａ，ＷＯ ９８／５２９４１ Ａ，ＷＯ ９８／５２９３７ Ａ，ＷＯ ９７／４４４６７ Ａ，ＷＯ ９８／２７０９８ Ａ，ＷＯ ９８／５２５５８ Ａ，ＷＯ ９８／５２９４０ Ａ，ＷＯ ９９／３２１１０ Ａ，ＷＯ ９９／３２４６３ Ａ，ＷＯ ９９／５８５０２ Ａ，ＷＯ ９９／５８５２３ Ａ，ＷＯ ９９／００３５７ Ａ．

出願人は一般式（Ｉ）で表される化合物がＭＡＰキナーゼ信号伝達において調整機能すなわちＭＡＰキナーゼ信号伝達において調整因子として作用することを見出した。

一般式（Ｉ）で表される化合物はウィルス性疾患の治療にも適しており、抗ウィルス組成（ｖｉｒｕｓｔａｔｉｃｓ）（例えば、ヘルペス性疾患あるいはＨＩＶ）の薬学的に活性な成分としても適している。上述のように、本発明は一般式（Ｉ）で表される化合物及びあらゆるタイプのウィルス性疾患の予防及び／あるいは治療（治癒）処置のための生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物の使用に関するものである。

更に、本発明は、特に化学療法剤（例えば、ＭＡＰキナーゼ抑制剤などのタンパクキナーゼ抑制剤）などの適切な活性な成分と組合せた治療に効果的な投与において、生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を含む一般式（Ｉ）の化合物を用いて、ヒトあるいは動物の疾患、特にあらゆるタイプの腫瘍性及びガン性疾患あるいはウィルス性疾患の予防及び／あるいは処置の方法に関するものである。

本発明による活性な成分あるいは活性な成分の組合せは、治療する疾患の性質に依存するが、系統的かあるいは一時的、特に局所的に処置してもよい。

本発明で用いる活性な成分あるいは活性な成分の組合せを処置するのに適しているのは全て従来の治療の形態である。可能な処置例は口、舌、舌下、口内、直腸あるいは腸管外（すなわち腸管を避け、いわゆる静脈、心臓内、内皮、皮下、経皮、腹膜内あるいは筋肉内）で、特に口及び静脈は処置に適し、経口処置が好まれている。一時的使用も（例えば、黒色腫の治療に）可能である。

本発明に基づいて活性な成分あるいは活性な成分の組合せは、特に不活性、必ず非毒性で薬学的に適した担体あるいは溶剤を用いて、被覆しない錠剤、被覆錠剤、丸薬、顆粒、エアロゾル、シロップ、乳状液、懸濁液、溶液、軟膏、クリーム及びゲルなどを従来の処方にして用いる。更に、リポソーム包装すなわちリポソーム、あるいは（例えば、ポリエチレングリコールでエステル化などのように）改質したものに、活性な成分あるいは活性な成分の組合せをそのまま埋め込むか包み込んで用いてもよい。この点において本発明による活性な成分あるいは活性な成分の組合せはいずれの場合にも治療的に有効な濃度で、特に０．０００１から約９９重量％の完全な混合物、好ましくは０．０１から約９５重量％の完全な混合物、すなわち指示あるいは所望の投与範囲となる十分な量とすることができる。それにもかかわらず、特に体重あるいは治療の経路、薬剤への個体の反応、処方のタイプ及び治療に要する時間あるいは間隔に応じて上記の量を適切に変えることが必要である。従って、時には上記の最小量よりも少なくて十分なこともあり、一方では最大量を越えなければならないこともある。多量に用いる場合には、所定の期間、例えば一日の投与を複数に分割して行うことが好ましい。

処方は例えば、乳化剤あるいは分散剤で調整した溶媒（例えば、ひまし油などの油）及び／あるいは担体により活性な成分あるいは活性な成分の組合せを混合して生成する。ここで適当な有機溶媒を補助溶媒として水を希釈剤として使用することが可能である。

好結果が得られるように、治療方法に応じて、０．０００１から約５００ｍｇ／ｋｇ体重、特に０．０００１から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１から５０ｍｇ／ｋｇ体重の量の本発明による活性な成分あるいは活性な成分の組合せを用いると治療に有益であることを立証した。それにもかかわらず、特に体重あるいは治療の経路、薬剤への個体の反応、処方のタイプ及び治療に要する時間あるいは間隔に応じて上記の量を適切に変えることが必要である。従って、時には上記の最小量よりも少なくて十分なこともあり、一方では最大量を越えなければならないこともある。多量に用いる場合には、所定の期間、例えば一日の投与を複数に分割して行うことが好ましく、特に例えば、複数の単独投与あるいは連続投与（例えば、連続点滴）することが好ましい。慢性的治療（例えば、錠剤の形状）に使用することも可能である。

本発明の記載を読むことによって、その範囲を逸脱することなく、本発明の更なる精緻化、改良及び変更は当業者によって識別し実行することが可能である。

本発明を下記の実施例に基づき説明するが、その実施例が本発明を限定するものではない。

カリブ蜂の蜂蝋から抽出した式（Ｉｃ′）で表される化合物、１−ベンゾイル−８，８−ジメチル−２−ヒドロキシー３，５，７−トリス−（３−メチル−２−ブテニル）ビシクロ［３．３．１］ノン−２−エン−４，９−ジオン（以下（Ｉｃ′）と略す）の分離及び薬物学的活性について説明する。

（Ｉｃ′）の化合物は式（Ｉｃ）及び（Ｉｃ″）で示される化合物と互変異性平衡関係にある。

しかし、説明を簡単にするため（Ｉｃ′）の化合物についてのみ述べる。

蜂蝋溶液の調整
カリブ蜂から集めた蜂蝋をエタノール中に溶解し、濾過して不溶の蝋を取り除く。規定の容量を乾燥し得られた粉末をエタノールに規定の濃度となるように再懸濁させる。溶液を室温で暗所に保存する。

蜂蝋溶液の高速液体クロマトグラフィによる予備的分別
Ｗａｔｅｒｓ社（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）の逆相高速液体クロマトグラフィシステム（Ｗａｔｅｒｓ ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｍｏｄｕｌｅ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０，Ｗａｔｅｒｓ ＰＤＡ ９９６ Ｄｅｔｅｋｔｏｒ，Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｎａｇｅｒ）により分離を行う。Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社の分離カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−７ Ｃ１８， ２５０ × ２１ｍｍ）において傾斜系を用いて４０℃において分別する（表１）。水相は０．０１Ｍの蟻酸アンモニウム溶液（ｐＨ＝７．００）から構成されている。

このようにして得た各々のフラクション８ｍｌ（２ｍｉｎ）を乾燥しメタノールに再懸濁し、室温で暗所に保存する。

各々のフラクションを同容積の媒体で希釈し下記のＳＲＢ検定において細胞障害を試験する。特に、ヒトを起源とする腸ガン細胞系（ＨＣＴ８ ＷＴ）を標的細胞として用いた。

細胞障害フラクションの精製
ＳＲＢ検定において細胞障害活性を示したフラクションを更に精製する。このために、精製すべき部分の極性に傾斜溶離系を適用する。新たに分別してＳＲＢ検定における予備逆相高速液体クロマトグラフィにより得られたフラクションを試験後、均質な物質（Ｉｃ′）を分離することができる。物質（Ｉｃ′）の精製は紫外線分光分析データ（図１ｂ）により検証される。分析分離用カラムとして調整したＣ１８相を充填したＷａｔｅｒ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を使用した。その結果を図１ａに示す。

図１ａは２５４ｎｍ、流量＝１ｍｌ／ｍｉｎ、４０℃ 傾斜系における逆相高速クロマトグラフィによる物質（Ｉｃ′）の典型的な分析結果を示している。上部の線はエタノールの濃度（％）、中間の線が水相の濃度（％、蟻酸アンモニウム０．０１Ｍ）に相当する。アセトニトリルの濃度は一定で５％とした（下部の線）。

図１ｂは図１ａに示す分析のＰＤＡデータを示す。物質（Ｉｃ′）は均質な分離成分として得られた。この溶離条件下では紫外線スペクトルは２つのピーク（２５４及び３０８ｎｍ）を示している。

構造解析（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ）
更に（例えば、ジアゾメタンによる）誘導体化せずに、式（Ｉｃ′）で示される化合物の初期の分離及び特性の解明を行った。前述のように逆相高速液体クロマトグラフィにより（カリブで採集した）蜂蝋のエタノール抽出分は、前述のように逆相高速液体クロマトグラフィにより純化してＮＭＲ分光分析試験ようとして非誘導体の式（Ｉｃ′）で示される化合物、特に十分に高純度（＞９８％；ＬＣ−ＭＳ；紫外線分光分析試験はＬＣ−ＰＤＡによる；ＭＳ）で提供することが可能となった。

更に構造を確認するため、式（Ｉｃ′）で示される化合物をジアゾメタンによりメチルエーテルへと転化した。Ｏ−メチル化した化合物を４０／６０の比率に（逆相高速液体クロマトグラフィにより）分離した。

ＮＭＲ試験結果（^１Ｈ−ＮＭＲ， ^１３Ｃ−ＮＭＲ，ＤＥＰＴ１３５，ＤＥＰＴ９０，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣ， Ｈ，ＨＣＯＳＹ９０（ｇｓ），１Ｄ−ＮＯＥ 差スペクトル）を下記の表１ａ、１ｂ及び１ｃに示す。

・ＤＥＰＴとは分極転移による無歪みの増進を意味する。

・ＣＯＳＹとは相関分光を意味する。これにより^１Ｈは^１Ｈ−ＣＯＳＹを意味し、発明者の名前に因んでＪｅｅｎｅｒ試験とも言われＮＭＲの歴史において最初の２Ｄパルス系列を表している。

ＨＭＱＣは異核多重量子コヒーレンスを意味する。

ＨＭＢＣは異核多重結合コヒーレンスを意味する。

ＮＯＥは核オーバーハウザー効果を意味する。

図１ｃ、１ｄ及び１ｅは（Ｉｃ′）の化合物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す（測定周波数：５００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤ_３ＯＤ）。

図１ｆは（Ｉｃ′）の化合物の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す（測定周波数：１２５ＭＨｚ、溶媒：ＣＤ_３ＯＤ）。

図１ｇは（Ｉｃ′）の化合物の^１３Ｃ−ＤＥＰＴスペクトルを示し（測定周波数：１２５ＭＨｚ、溶媒：ＣＤ_３ＯＤ）、ＣＨｓ及びＣＨ_３ｓは上方を向き、一方ＣＨ_２ｓは下方を向いている。

図１ｈ、１ｉ、１ｊ及び１ｋは（Ｉｃ′）の化合物のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す（測定周波数：５００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤ_３ＯＤ）。

図１ｌ〜図１ｒは（Ｉｃ′）の化合物のＨＭＢＣスペクトルを示す（測定周波数：１２５ＭＨｚ、溶媒：ＣＤ_３ＯＤ）。

従って、式（Ｉｃ′）、（Ｉｃ″）あるいは（Ｉｃ）で示される化合物は、信号の化学シフト及び炭素原子２及び４の^１３Ｃ信号の幅により示されるように、ケト／エノール平衡の中で存在することを確認した。

絶対構造
上記の詳細なＮＭＲデータにより式（Ｉｃ）、（Ｉｃ′）あるいは（Ｉｃ″）で表される化合物の絶対的配置を決めることが可能である。

細胞培養
ヒト起点の疑いの余地の無い６つの腫瘍細胞系（原細胞系及びそれより転換した耐性サブクローン）及び２つの腫瘍の無い細胞系を試験に用いた（表２）。

ＳＲＢ検定
いわゆるスルホロダミンＢ（ＳＲＢ）検定において（Ｉｃ′）の物質に対する細胞系の感度を測定する。この方法はＮＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＳＡ）でも確立されている耐久性のある再現性の高い標準的な方法である（Ｓｋｅｈａｎ等、１９９０）。

検定結果を表３に示す。（表には）５０％の細胞の成長を阻害する（Ｉｃ′）の物質の濃度（ＩＣ_５０、投与量対効果の片対数曲線により決定される）が示されている。表３の結果は平均値であり、少なくとも３つの独立した実験からその標準偏差を算出した。ここに示した細胞増殖抑制に対する交差耐性は認められなかった。（Ｉｃ′）の物質の腫瘍の無い細胞系（３Ｔ３及びＭＣＲ−５系の線維芽細胞）に対する細胞毒性は極めて低いことが立証された。

トポイソメラーゼＩ抑制の試験
いわゆるＴＯＰＯ Ｉ 巻き戻し検定を行って（Ｉｃ′）の物質のトポイソメラーゼＩへの効果を試験した。検定はトポイソメラーゼＩによりねじられたｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ二量体のＡＴＰに独立な巻き戻しに基づいている。この試験ではプラスミドＤＮＡの二つの異なった形態、すなわち、ねじれた形態及び巻き戻しの弛緩した形態をアガロースゲルにより分離した。この目的の酵素イソメラーゼＩは腫瘍細胞系の細胞核抽出物から得られる。

細胞核抽出物の獲得
Ｄａｎｋｓ等の方法を改造したＳｕｌｌｉｖａｎの方法により細胞核抽出物を獲得した。

（Ｉｃ′）の物質によるトポイソメラーゼＩ活性の抑制
図３の（１欄： Ｋｏｎｔｒｏｌｌｅ欄）に示すように、大きくねじられたｐＢＲ３２２２プラスミドＤＮＡ二量体（ｎｅｇａｔｉｖ Ｋｏｎｔｒｏｌｌｅ）を弛緩した形態（ｐｏｓｉｔｉｖ Ｋｏｎｔｒｏｌｌｅ）へと変換するためにトポイソメラーゼＩを含んでいる１６０ｎｇの細胞核抽出物が必要となる。濃度１００μｇ／ｍｌの（Ｉｃ′）の物質はトポイソメラーゼＩの活性を１００％抑制する。この濃度は相当する５０％の細胞系の腫瘍の成長を抑制する（ＩＣ_５０、表３）のに必要な濃度の２０倍に相当する。例えばインビトロでのトポテカンの抑制活性のデータと比較すると、臨床的に確かめられているこの物質に必要とされるＩＣ_５０の１０００倍となる。図３には（Ｉｃ′）の物質によるトポイソメラーゼＩ活性の抑制を示している。

細胞周期分析
今までに記載されている（Ｉｃ′）の物質の細胞成長へ効果も細胞周期を変化させることにより立証することができる。この分析にはＴｓｕｇｉｔａ Ｍ．等の採用した流動細胞光度測定試験が用いられた。

確定したＩＣ_５０濃度の（Ｉｃ′）の物資により、指数関数的に成長するＨＣＴ８ ＷＴ腸ガン細胞を２４時間処理し、次いでＢｒＤＵで培養する。ＤＮＡ鎖を変性するためメタノールで固定した細胞を洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＨＣｌ）で処理する。蛍光標識抗体（ａｎｔｉ−ＢｒＤＵ ｍＡｂ， ＦＩＴＣで標識）で培養した後、第二の蛍光染料（ＰＩ， ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を添加する。

ＤＮＡの内容物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ 蛍光）及び捕獲されたＢｒＤＵ（ＦＩＴＣ蛍光）をＣｏｕｌｔｅｒの流動細胞光度測定器（Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ ＸＬ）を用いて測定した。図４ａ及び４ｂに典型的な結果を示す。

図４ａ及び４ｂには（Ｉｃ´）の物質で未処理（対照データ、図４ａ）及び処理（ＩＣ_５０、２４時間、図４ｂ）した場合のＨＣＴ８ ＷＴ細胞のＤＮＡへのＢｒＤＵ及びＰＩの取込みを示している。図にはサンプル数３の独立した実験の代表的な結果を示している。

（Ｉｃ′）の物質による処理が合成相の抑制していることは明白である。このことはＤＮＡ内容物に関する図（図４ａ及び４ｂのＢｒＤＵ取込み）から明らかである。

ＤＮＡ分解の分析
ヒトの気管支ガン細胞（Ｈ４６０ ＷＴ）及び結腸直腸ガン細胞（ＨＴ２９ ＷＴ）の例に基づいて（Ｉｃ′）の物質によるＤＮＡの分解を立証する試験を行った。このため、細胞を（Ｉｃ′）の物質により処理し、所定の（複数の）時間経過後にＤＮＡを分離し、ゲル電気泳動により分析した。

ＤＮＡ二本鎖切断の測定は^１４Ｃを標識としたＤＮＡにより行った。このため、^１４Ｃを含んだｄ−チミジンを標識として付した細胞を（Ｉｃ′）の物質の濃度を変えて処理した。Ｃｈｉａ Ｃｈｉａｏ等の方法を用いてＤＮＡを分離した。

ＧｅｎｅＱｕａｎｔの分光光度計を用いて分離したＤＮＡの量及び純度を測定後、アガロースゲルを用いてＤＮＡを分別する。次いで、ゲル電気泳動により分別したＤＮＡを臭化エチジウムで染色する。

電場で移動しなかった手付かずのＤＮＡを透過照明装置（３０２ｎｍ）上でゲルに移動した分断されたＤＮＡから抽出により分離する。分離したゲル及びＤＮＡ切断片は塩酸の存在下で８０℃において液化する。シンチレーターを添加した後、液体シンチレーション計（ＴＰＩ−ＣＡＲＢ ２１００ＲＴ）を用いて放射性を測定することができる。測定した放射性は１分当りの崩壊数（ｃｐｍ）として示される。

気管支ガン細胞（Ｈ４８０ ＷＴ）を（Ｉｃ′）の物質により６時間培養した後の二本鎖切断の誘導を図５に示す。図５は（Ｉｃ′）の物質で６時間処理により誘導された［^１４Ｃ］ｄ−チミジン標識を付したＨ４６０ ＷＴ細胞中に検出されたＤＮＡ二本鎖切断を示す。図にはサンプル数３の独立した実験の平均値及び標準偏差を示している。

測定されたＩＣ_５０の１０倍の濃度まで６時間に渉って、腫瘍細胞を処理すると、腫瘍細胞によって、明らかに十分には修復できない二本鎖切断がＩＣ_５０濃度でさえも相当量誘導され、このようにして細胞死を誘導する。

図６も腫瘍細胞のＤＮＡにおける二本鎖切断の誘導例を示し、この場合は結腸直腸ガン腫瘍（ＨＴ２９ ＷＴ）である。気管支ガン細胞系に関しては明らかに、腫瘍細胞の修復機構では修正できない程の二本鎖切断が誘導され、結果としてアポトーシス、すなわち腫瘍細胞のプログラムされた細胞死を誘導する寄与因子を意味している。

ヒトのテロメラーゼへの（Ｉｃ′）の物質の抑制活量の測定
Ｎ．Ｗ．Ｋｉｍ等の方法に基づいていわゆるテロメア反復増幅検定（ＴＲＡＰ）ＥＬＳＩＡにより（Ｉｃ′）の物質のヒトテロメラーゼへの効果を測定した。

これはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に基づいた方法である。この方法は最初の段階において、ビオチンを標識として付したオリゴヌクレオチドの３′末端にテロメラーゼ活性により付いている幾つかの（ＣＧＴＴＡＧ）モチーフを伴う（ＴＳ＝テロメラーゼ基質）。第二の段階においてＴＳ及びＲＰ（＝ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いたＰＣＲの技法によってこのように伸張した生成物を増幅する。このようにして、６つの塩基（初期サイズ＝５０ヌクレオチド）の増殖における梯子状の生成物が発生する。増幅中ＤＮＰの標識を付したｄＣＴＰはＰＣＲ生成物に組込まれる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、合成したテロメラーゼ生成物の検出及び定量は幾つかのテロメラーゼ酵素活性である。

テロメラーゼ生成物はビオチンを標識として付したＴＳ プライマーを有し、予めストレプトアヴィジンを塗布した微小滴定板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）の表面に結合する。ＰＯＤに結合している抗ＤＩＧ抗体は増幅中に組込まれたＤＮＰ標識ヌクレオチドに結合する。基質ＴＭＢ添加後、酵素ＰＯＤの呈色反応に基づいた蛍光分光により視覚化される。この場合、測定した吸光度はそのままテロメラーゼ活性に比例する。

ヒトのテロメラーゼ活性に及ぼす（Ｉｃ′）の物質の効果
（Ｉｃ′）の物質のテロメラーゼへの効果を確実にするため、（Ｉｃ′）の物質のＤＮＡポリメラーゼへの効果を除外する必要がある。内部対照としてのＴＳＲ８を用いた予備実験では、濃度を変えても（Ｉｃ′）の物質の効果は除外された。

ＴＳＲ８テンプレートの増幅はＤＮＡポリメラーゼのみに依存する。この酵素のあらゆる抑制剤は基質を用いることにより検出することができる。

図７にはＴＳＲ８テンプレートによる予備実験の結果を示す。実験は３回繰り返した。図７により（Ｉｃ′）の物質の最大濃度５０μｇ／ｍｌであってもＴａｑポリメラーゼを著しく抑制しないことが証明された。

（Ｉｃ′）の物質のテロメラーゼ抑制を測定する実験結果を図８に示す。図に示した濃度範囲は１０から５０μｇ／ｍｌである。５０μｇ／ｍｌの濃度においてヒトのテロメラーゼの完全な抑制が認められた。図８はＴＲＡＰ検定の結果であり、腸ガン細胞（ＨＣＴ８ ＷＴ）から得たヒトのテロメラーゼへの（Ｉｃ′）の物質の抑制への投与依存性が示されている。図の結果には３回の実験の平均値及び標準偏差を示している。

ＥＲＫ１／２（ＭＡＰキナーゼ経路）の燐酸化
ある種の情報伝達経路の燐酸化は細胞成長及び遺伝子発現の調節には必要不可欠の役割を果たしている。タンパク質ＥＲＫ１／２（ＭＡＰキナーゼ）はＭＡＰキナーゼ情報伝達経路に属している。

ヒトの腸ガン細胞（ＨＣＴ８ ＷＴ）を（Ｉｃ′）の物質で治療することは、このタンパク質の燐酸化を導き、ウェスタンブロット分析により検出される（図９）。図９はタンパク質ＥＲＫ１／２のウェスタンブロット分析結果であり、下部に負荷対照群の結果も示している。

（Ｉｃ′）の物質による細胞の治療はタンパク質ＥＲＫ１／２の投与に依存する燐酸化へと導く。ＩＣ_５０に相当する投与量であっても（Ｉｃ′）の物質による燐酸化が明らかとなった。現在までのところ文献では活性化と解釈しているこの過程の結果として、腫瘍細胞は細胞周期分析で立証される（上記参照）細胞周期の停止に至る。

ＥＲＫ１／２抑制剤を加え拮抗させることにより、（Ｉｃ′）の物質によるＥＲＫ１／２活性化の程度を確認するため、（Ｉｃ′）の物質及び特定のＥＲＫ１／２抑制剤（ＭＡＰキナーゼ抑制剤）を用いて共培養実験を行った。この場合、腫瘍細胞、すなわち腸ガン細胞（ＨＣＴ８ ＷＴ）は二つの活性な成分のそれぞれ投与量を変えて２４時間共培養した（図１０）。図１０は（Ｉｃ′）の物質及び特定ＥＲＫ１／２抑制剤（ＭＡＰキナーゼ抑制剤）の細胞障害に関する共培養実験の結果を示す。ＨＣＴ８ ＷＴ細胞が共培養された。図中の点は二つの活性な成分の（各ＩＣ_５０％濃度の）比率を示す。

しかし、このように行った実験は、どの投与比率においても測定した細胞障害の廃止へとは導いていない。逆に、二つの活性成分の共培養への共働作用は明白である。

全ての投与の組合せは二等分線角の下で、疑いの余地の無い共働作用の範囲にある。（Ｉｃ′）のＩＣ_５０濃度３０％の物質と特定ＥＲＫ１／２抑制剤のＩＣ_５０濃度３０％の活性成分を組合せが、腸ガン（ＨＣＴ８ ＷＴ）から分離した腫瘍細胞の成長の抑制へと導く。

（Ｉｃ′）の物質のクロマトグラムを示す図 （Ｉｃ′）の物質の紫外線分光分析結果を示す図 （Ｉｃ′）の物質の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質の^１３Ｃ−ＤＥＰＴスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨＭＢＣスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨＭＢＣスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨＭＢＣスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨＭＢＣスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨＭＢＣスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨＭＢＣスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質のＨＭＢＣスペクトルを示す図 （Ｉｃ′）の物質によるトポイソメラーゼ活性の抑制を示す図 ＨＣＴ８ ＷＴ細胞ＤＮＡのＢｒＤＵ及びＰＩの取込みを示す図（（Ｉｃ′）未処理） ＨＣＴ８ ＷＴ細胞ＤＮＡのＢｒＤＵ及びＰＩの取込みを示す図（（Ｉｃ′）の物質で処理） （Ｉｃ′）による二本鎖切断の誘導を示す図 （Ｉｃ′）による二本鎖切断の誘導を示す図 ＴＳＲ８テンプレートによる予備実験の結果を示す図 ＴＲＡＰ検定の結果を示す図 タンパク質ＥＲＫ１／２のウェスタンブロット分析結果を示す図 （Ｉｃ′）の物質及び特定ＥＲＫ１／２抑制剤の細胞障害に関する培養実験の結果を示す図

Claims (29)

1. 下記の一般式（Ｉ）で表されるビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオン置換体であって、
   

   

   ・一般式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は同一か異なったもので、下記に示すそれぞれの基のいずれか一つであり、但し、ラジカルＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５のいずれかがベンゾイル基である場合、他のラジカルはベンゾイル基ではなく、
   

   

   ・Ｒ^３は水素原子であり、
   ・Ｒ^６及びＲ^７はいずれもメチル基あるいは水素原子であり、Ｒ^８及びＲ^９はいずれもメチル基あるいは水素原子であるが、Ｒ^６及びＲ^７がメチル基の場合はＲ^８及びＲ^９は水素原子であり、Ｒ^８及びＲ^９がメチル基の場合はＲ^６及びＲ^７は水素原子であり、
   前記置換体及びその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を、腫瘍性及び／あるいはガン性疾患の予防及び／あるいは治療処置の薬物の生成に用いることを特徴とする薬物成分の利用方法。
2. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、下記の（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）の化合物
   

   

   の中から選択して用いることを特徴とする請求項１記載の薬物成分の利用方法。
3. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物は式（Ｉｃ）
   

   

   で表される化合物であることを特徴とする請求項１あるいは請求項２記載の薬物成分の利用方法。
4. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物は下記の配置
   

   

   を有することを特徴とする請求項３記載の薬物成分の利用方法。
5. 特に原発性腫瘍及び転移並びに／あるいは前ガン（ガンの初期段階）など、腫瘍性及び／あるいはガン性疾患の腫瘍性及び／あるいはガン性疾患の予防及び／あるいは治療処置に用いることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項記載の薬物成分の利用方法。
6. 良性及び悪性腫瘍の予防及び／あるいは治療処置に用いることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項記載の薬物成分の利用方法。
7. 腸ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎ）、乳ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ）、卵巣ガン、子宮ガン、肺ガン、胃ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、前立腺ガン、睾丸ガン、骨ガン、皮膚ガン、Ｋａｐｏｓｉ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽腫、リンパ腫、白血病の予防及び／あるいは治療処置に用いることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項記載の薬物成分の利用方法。
8. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物を体系的及び／あるいは局所的に投与することを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか１項記載の薬物成分の利用方法。
9. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物は腫瘍細胞及び／あるいはガン細胞の成長及び／あるいは分裂の抑制及び／あるいは停止させることを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれか１項記載の薬物成分の利用方法。
10. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物は腫瘍細胞及び／あるいはガン細胞のＤＮＡの破壊を誘発させることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか１項記載の薬物成分の利用方法。
11. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物をトポイソメラーゼ抑制剤及びテロメラーゼ抑制剤として用いることを特徴とする薬物成分の利用方法。
12. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物は少なくとも一つの化学療法用薬剤特にタンパクキナーゼ抑制剤と組合せて用いることを特徴とする請求項１ないし請求項１１のいずれか１項記載の薬物成分の利用方法。
13. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を用いる一方で、少なくとも一つの化学療法用薬剤を同時か、あるいは順次用いるか、あるいは投与することを特徴とする請求項１２記載の薬物成分の利用方法。
14. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物の少なくとも一つの化合物を含み、特に細胞増殖抑制あるいは抗ウィルス組成を薬学的に受容可能で本質的に非毒性の担体あるいは賦形剤と共に構成することを特徴とする薬物学的組成あるいは薬物。
15. 前記一般式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物の少なくとも一つの化合物を薬学的に効果的な量を含んで構成することを特徴とする請求項１４記載の薬物学的組成あるいは薬物。
16. 前記化合物を体系的及び／あるいは局所的に用いることを特徴とする請求項１４あるいは請求項１５記載の薬物学的組成あるいは薬物。
17. 特に下記の構成要素を含む細胞増殖抑制の組合せであって、
    （Ａ）少なくとも一つの上記一般式（Ｉ）の化合物及び／あるいは生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物
    （Ｂ）少なくとも一つの化学療法薬、特に、タンパクキナーゼ抑制剤、好ましくはＭＡＰキナーゼ抑制剤
    を含んで構成する薬物学的組合せ。
18. 前記構成要素（Ａ）及び（Ｂ）は機能単位、特に各構成要素が互いに分離している混合物、混合あるいは混合（ａ ｍｉｘｔｕｒｅ， ａ ｍｉｘ ｏｒ ａ ｂｌｅｎｄ）であることを特徴とする請求項１７記載の薬物学的組合せ。
19. 前記構成要素（Ａ）及び（Ｂ）を同時にあるいは順次、用いるかあるいは投与することを特徴とする請求項１７あるいは請求項１８記載の薬物学的組合せ。
20. 前記構成要素（Ａ）及び（Ｂ）は薬学的に効果的な量を含んで構成することを特徴とする請求項１７ないし請求項１９のいずれか１項記載の薬物学的組合せ。
21. 前記構成要素（Ａ）及び（Ｂ）を体系的及び／あるいは局所的に用いることを特徴とする請求項１７ないし請求項２０のいずれか１項記載の薬物学的組合せ。
22. 前記式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を、疾患の予防及び／あるいは治療処置に用いることを特徴とする化合物。
23. 前記式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を活性な薬学的成分及び／あるいは薬剤の活性な薬学的成分として用いることを特徴とする化合物。
24. 前記式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を、特に原発性腫瘍及び転移並びに／あるいは前ガン（ガンの初期段階）、特に腸ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎ）、乳ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ）、卵巣ガン、子宮ガン、肺ガン、胃ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、前立腺ガン、睾丸ガン、骨ガン、皮膚ガン、Ｋａｐｏｓｉ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽腫、リンパ腫、白血病などガン性疾患の予防及び／あるいは治療処置に用いることを特徴とする化合物。
25. 前記式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物をトポイソメラーゼ及び／あるいはテロメラーゼの抑制に用いることを特徴とする請求項２２ないし請求項２４のいずれか１項記載の化合物。
26. 前記式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物をウィルス性疾患の予防及び／あるいは治療処置に用いることを特徴とする請求項２２あるいは請求項２３に記載の化合物。
27. 前記式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物を体系的及び／あるいは局所的に用いることを特徴とする請求項２２ないし請求項２６のいずれか１項記載の化合物。
28. 前記式（Ｉ）で表される化合物及び／あるいはその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物をＭＡＰキナーゼ信号伝達において調整因子として用いることを特徴とする化合物。
29. 前記式（Ｉ）で表される化合物及びその生理学的に耐性な塩類、水和物、異性体、特に立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物をウィルス性疾患の予防及び／あるいは治療処置に用いる薬剤を生成するのに用いることを特徴とする薬物成分の利用方法。

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