ES2269791T3 - Biciclo 3.3.1 nonano-2,4,9-triones sustituidos como ingredientes activos farmacologicamente. - Google Patents
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Abstract
Utilización de las biciclo[3.3.1]nonano-2, 4, 9-trionas sustituidas de la fórmula general (I) (Ver fórmula) En la cual: * R1, R2, R4 y R5, iguales o diferentes, representan de forma independiente entre sí a uno de los siguientes grupos: (Ver fórmula) Con la condición sin embargo de que si uno de los radicales R1, R2, R4, o R5 representa un grupo bencilo, ninguno de los demás radicales puede representar entonces un grupo bencilo; * R3 representa un átomo de hidrógeno; * R6 y R7 representan ambos un grupo metilo respectivamente o bien un átomo de hidrógeno respectivamente, y R8 y R9 representan ambos un grupo metilo respectivamente o bien ambos representan un átomo de hidrógeno respectivamente, con la condición sin embargo de que si R6 y R7 representan grupos metilo, R8 y R9 serán entonces átomos de hidrógeno, y de que si R8 y R9 representan grupos metilo, R6 y R7 serán entonces átomos de hidrógeno; y sus derivados fisiológicamente compatibles tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros, e isómeros de constitución, derivados, para la producción de medicamentos para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades de tumor y/o de cáncer.
Description
Biciclo 3.3.1
nonano-2,4,9-triones sustituidos
como ingredientes activos farmacológicamente.
El presente invento se refiere a la utilización
de las
biciclo[3.3.1]nonano-2,4,9-trionas
sustituidas.
Las enfermedades provocadas por tumores y/o
cánceres no son un cuadro clínico uniforme, sino un concepto
superior para numerosas formas distintas de enfermedades malignas.
Casi cualquier tejido de nuestro cuerpo puede producir
degeneraciones cancerígenas, y algunas veces incluso varios tipos
diferentes. Cada una de las enfermedades tiene a su vez sus
características propias. Las causas que conducen hacia estas
enfermedades son frecuentemente muy heterogéneas.
A pesar de estas diferencias, prácticamente
todos los tumores o bien degeneraciones cancerígenas ocurren debido
a procesos básicos moleculares, o bien celulares, muy similares. En
las últimas dos décadas la investigación consiguió avances
sorprendentes en el conocimiento de lo que se refiere a los procesos
fundamentales de los acontecimientos a nivel molecular de un cáncer
o un tumor.
El soporte de la información genética son las
moléculas de DNA de los cromosomas en el núcleo celular. Hay dos
clases de genes que poseen una función elemental para la generación
de un cáncer, los cuales forman en su conjunto tan sólo una pequeña
parte de todo el equipamiento de una célula, y los cuales son
especialmente "proto-oncogenes" (precursores de
genes cancerígenos) y "genes supresores de tumor" (genes
supresores de tumores). En sus formas normales estos genes dirigen
el ciclo vital de la célula, controlando la compleja sucesión de
procesos mediante los cuales una célula crece y si es necesario se
divide. Mientras los proto-oncogenes favorecen el
crecimiento celular, los genes supresores de tumor frenan el
crecimiento celular. Estas dos clases de genes son responsables
conjuntamente de una gran parte de los procesos de multiplicación
celular incontrolados en tumores humanos: si por ejemplo, un
proto-oncogén muta en la región de regulación o en
la región estructural, podría ocurrir que se produzca una cantidad
excesiva de su proteína favoreciendo el crecimiento, o que éste sea
exageradamente activo; el proto-oncogén se convierte
entonces en un oncogén propicio al cáncer, el cual estimula que las
células se multipliquen de manera exagerada. En lo referente a los
genes supresores de tumor pueden favorecer la formación de cáncer si
han sido desactivados debido a una mutación; como consecuencia la
célula pierde las proteínas supresoras capaces de actuar, perdiendo
así consecuentemente los frenos de crecimiento efectivos, los cuales
inhiben normalmente una multiplicación
inadecuada.
inadecuada.
En células normales del cuerpo hay instalado un
mecanismo de emergencia para controlar la multiplicación ilimitada,
se trata de una especie de contador que registra cada una de las
divisiones celulares y que después de una cierta cantidad de
generaciones pone término a la división. El crecimiento de células
normales para una vez que se alcance un número determinado, un
número aproximadamente pronosticable de divisiones celulares o bien
de duplicaciones. A este proceso se le llama envejecimiento celular
o senescencia.
Los segmentos de ADN en las terminaciones de los
cromosomas, los así llamados telómeros, son los responsables para
este proceso de envejecimiento celular o de senescencia a nivel
molecular. Se podría decir que ellos registran el número de ciclos
de multiplicación por el que atraviesa una población de células y
que a partir de un determinado momento darán inicio a la senescencia
o bien a la “crisis”. De esta manera consiguen limitar la capacidad
de una población de células para crecer indefinidamente. En la
mayoría de las células humanas sanas, los telómeros se reducen un
poquito con cada división celular en cuanto los cromosomas son
replicados. Al alcanzar un tamaño crítico determinado, actúan como
una señal para la célula y ésta inicia el estado de senescencia; si
la célula ignorara dicho aviso o señal, los telómeros seguirían
reduciéndose más y más hasta que finalmente se alcanzaría la crisis:
en el caso de telómeros extremadamente cortos los cromosomas se
ligarían entre sí o se romperían, y el caos genético causado sería
entonces mortal para la célula.
El proceso de envejecimiento o bien de
senescencia en células normales, es decir la pérdida de la capacidad
de división al cual están sujetas las células normales, está
condicionado entonces a que los cromosomas pierdan, en células
normales mortales, aproximadamente de 50 a 200 nucleótidos de ADN en
sus terminaciones teloméricas por cada división celular que sufran.
La pérdida de estos nucleótidos finales (telómeros) tiene la función
de actuar como una especie de reloj mitótico, el cual registra el
número de divisiones celulares. La conservación de los telómeros
parece necesaria para la célula para poder escapar del proceso de
senescencia y poder dividirse de forma indefinida.
El proceso de protección anteriormente descrito
está suprimido a lo largo de la degeneración en el caso de la
mayoría de las células de cáncer o bien de tumor, esto ocurre
gracias a la activación de un gen que contiene el
pre-escrito de síntesis para la enzima telomerasa.
Esta enzima completa sistemáticamente las secciones de telómeros que
seguirían reduciéndose en caso de que dicha enzima no estuviera
presente, pero que de esta manera se mantienen de forma duradera y
permitirán a la célula seguir dividiéndose de manera prácticamente
ilimitada. Así, en el caso de la mayoría de las células de cáncer o
bien de tumores la inmortalidad de las células tiene lugar debido a
la conservación de telómeros cortos pero estables gracias al efecto
de la telomerasa. La inmortalidad potencial resultante de las
células sería desfavorable en varios aspectos: por un lado ayudaría
a que un tumor se pueda agrandar muchísimo, y por otro lado le da
tiempo a las células pre-cancerosas, o a las ya
células cancerígenas verdaderas, de acumular otras mutaciones que
aumentarían la capacidad de multiplicarse, de penetrar en otros
tejidos, y en último término de sufrir metástasis.
Se ha descubierto que el crecimiento celular
ilimitado de células degeneradas en el 80% de todas las enfermedades
de tumor se basa en una regulación alterada de la telomerasa. Es por
ello que el tratamiento de enfermedades de tumor o bien de cáncer
por medio de inhibidores de telomerasa parece facilitar una terapia
muy prometedora para estas enfermedades. Por eso se había intentado
ya en numerosas ocasiones el desarrollo de materias activas para la
inhibición de la telomerasa.
Por ejemplo, en la WO 00/74667 A2 se ha
propuesto la utilización de inhibidores de telomerasa (por ejemplo:
AZT) en combinación con una materia activa que induciría la
destrucción de los telómeros (por ejemplo: Paclitaxel) para el
tratamiento de cáncer. La WO 99/65875 A1 y la
US-A-5 863 936 proponen la
utilización de sistemas hetero-bicíclicos especiales
actuando como inhibidores de la telomerasa para la terapia de
enfermedades de cáncer. También los derivados de la catequina, ya
presentados en la descripción de la EP 0 938 897 A1, se deberían de
poder utilizar como inhibidores de telomerasa en el tratamiento del
cáncer.
Además, conforme al estado de la técnica se
intenta intervenir en la multiplicación de células cancerígenas o de
tumor a través de otros mecanismos a nivel molecular o bien celular:
es por ello que se utilizan frecuentemente reactivos de alquilación
para el tratamiento de enfermedades de tumor o bien de cáncer
conforme al estado de la técnica, los cuales inducirían finalmente
un daño directo del DANN de las células de tumor o de cáncer (como
por ejemplo: Ciclofosfamida, Ifosfamida, Carmustina, Clorambucil,
etc.) a través de una alquilación del DANN. De la misma forma otras
sustancias llegan a ser aplicadas en la terapia de tumores o bien de
cáncer, interviniendo en la replicación de las células del tumor o
del cáncer a través de la inhibición de las topoisomerasas (por
ejemplo: Camptotecina, 9-Aminocamptotecina,
Irinotecan, Topotecano, Doxorubicina, etc.)(consúltese por ejemplo:
Clive Page et. al., Integrated Pharmacology, Mosby, 1997).
Pero mientras en clínica ya existen algunos
inhibidores de topoisomerasas -aparte de materias activas
alquilantes- en este momento no hay en clínica materia activa alguna
para el tratamiento de diversos tumores, actuando a través de la
inhibición de la telomerasa o reuniendo incluso las características
de una inhibición de la topoisomerasa y de la telomerasa.
Nonanotrionas (Benzofenonas de Clusia
spp.)son conocidas de DE OLIVEIRA CECILIA M A et al:
"Floral resins of Clusia spp.: Chemical composition and
biological function." TETRAHEDRON LETTERS, volumen 37, nº 36,
1996, páginas 6427-6430, XP002236050 ISSN:
0040-4039''. En dicha publicación se menciona que
algunas de estas sustancias muestran ciertas propiedades gracias a
las cuales pueden actuar como inhibidores del VIH. Es decir, que se
considera su utilización como sustancias
viro-estáticas.
GUSTAFSON KIRK R et al: "The
guttiferones, HIV-Inhibitory benzophenones from
Symphonia globulifera, Garcinia livingstonei, Garcinia
olvalifolia and Clusia rosea." TETRAHEDRON, volumen
48, nº 46, 1992, páginas 10093-10102, XP001146562
ISSN: 0040-4020 presenta la actividad antiviral de
la benzofenona sustituida (3.3.1) Nonanotrionas. También se hace
referencia acerca de la actividad inhibidora de dichas nonanotrionas
sobre los
virus-IH.
virus-IH.
El presente invento tiene como objetivo
encontrar otra utilización para las
biciclo[3.3.1]nonano-2,4,9-trionas
sustituidas mencionadas anteriormente.
Sorprendentemente, el anunciante ha descubierto
que en las
biciclo[3.3.1]-nonano-2,4,9-trionas
sustituidas de la fórmula general (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- \bullet
- R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5}, iguales o diferentes, representan de forma independiente entre sí a uno de los siguientes grupos:
- Sin embargo, se da la condición de que si uno de los radicales R^{1} o R^{2} o R^{4} o R^{5} representa un grupo bencilo, entonces ninguno de los demás radicales podría representar ya un grupo bencilo;
- \bullet
- R^{3} representa un átomo de hidrógeno;
- \bullet
- R^{6} y R^{7} representan ambos un grupo metilo respectivamente, o bien un átomo de hidrógeno respectivamente, y R^{8} y R^{9} representan ambos un grupo metilo respectivamente o bien ambos representan un átomo de hidrógeno respectivamente, con la condición sin embargo de que si R^{6} y R^{7} representan grupos metilo, R^{8} y R^{9} serán átomos de hidrógeno, y que si R^{8} y R^{9} representan grupos metilo, entonces R^{6} y R^{7} serán los átomos de hidrógeno;
y sus derivados fisiológicamente compatibles
tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros,
tautómeros e isómeros de constitución, derivados para la producción
de medicamentos utilizados en el tratamiento profiláctico y/o
terapéutico de enfermedades de tumor y/o de cáncer.
Es por ello que un tema del presente invento es
la utilización de los compuestos de la fórmula general (I)
incluyendo sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos, para
la producción de medicamentos destinados al tratamiento profiláctico
y/o terapéutico de enfermedades de tumor y/o de cáncer, ya sea en el
caso de humanos como de animales, quiere decir tanto en el área de
la medicina humana como de la veterinaria.
Las sales fisiológicamente compatibles o bien
inofensivas de los compuestos de la fórmula general (I) podrían ser
sales con ácidos minerales, ácidos carbónicos, o ácidos sulfónicos;
siendo preferibles especialmente por ejemplo las sales con ácido
clorhídrico, ácido brómico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido
metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido
bencenosulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido ascético, ácido
propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido
fumárico, ácido maleico o ácido benzoico. En el grupo de las sales
fisiológicamente compatibles o bien inofensivas se podrían incluir
también sales con bases habituales, tales como por ejemplo sales de
metales alcalinas (por ejemplo sales de sodio o potasio), sales
alcalino-térreas (por ejemplo: sales de calcio o de
magnesio) o sales de amonio, derivados del amoniaco o de aminas
orgánicas tales como dietilamina, trietilamina,
etildiisopropilamina, procaína, dibenzilamina,
N-metilmorfolina, dihidroabietilamina,
1-efenamina o metilpiperidina.
El presente invento incluye también los hidratos
de los compuestos de la fórmula general (I). Conforme al invento las
formas o compuestos de la fórmula general (I) anteriormente descrita
se denominan hidratos, los cuales en su estado
sólido-líquido forman mediante hidratación con agua
una unión molecular (hidrato). En los hidratos las moléculas de agua
están fijadas a través de fuerzas intermoleculares, y en particular
a través de uniones de puentes hidrogenados. Los hidratos fijos
contienen agua, como el tal llamado agua cristalina en relaciones
estequiométricas o no-estequiométricas, en cuyo caso
las moléculas de agua no tienen que ser equivalentes con respecto a
su estado de unión. Diversos ejemplos de hidratos son los
sesquihidratos, monohidratos, dihidratos, trihidratos, etc. En la
misma medida y conforme al invento se consideran también los
hidratos de sales de los compuestos de la fórmula general (I).
El presente invento incluye además los isómeros
de los compuestos de la fórmula general (I). La denominación de los
isómeros en el sentido del presente invento se utilizará como un
término amplio para todas las formas isoméricas posibles. Ejemplos
no limitantes para isómeros, que están incluidos en el marco del
presente invento, son especialmente los esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución.
De este modo, y dependientemente del patrón de
sustitución, los compuestos de la fórmula general (I) podrían
existir en formas isoméricas, especialmente como esteroisómeros, por
ejemplo como esteroisómeros que se comportan como imágenes
especulares (conocidos como enantiómeros) o como esteroisómeros que
no se comportan como imágenes especulares (denominados
diasteroisómero). El presente invento incluye todas las formas
esteroisómeras de los compuestos de la fórmula general (I), esto
quiere decir tanto los enantiómeros, como los diasteroisómeros, así
como también sus mezclas respectivas. Las formas enantiómeras se
dejarían separar como las formas de diasteroisómeras de manera en el
fondo ya conocida en componentes esteroisómeros uniformes.
Además, los compuestos de la fórmula general (I)
podrían estar presentes en formas tautómeras. Los profesionales
conocen dichas formas y es por ello que estos compuestos han sido
incluidos también en el marco del presente invento. Diversos
ejemplos de formas tautómeras serían los siguientes
ceto-enol tautómeros:
Si R^{5} representa por ejemplo un grupo
bencilo, sería posible otra forma de ceto-enol
tautomería.
Además, los compuestos de la fórmula general (I)
podrían estar presentes como isómeros de constitución, especialmente
isómeros de posición (isómeros de sustitución). Ello es conocido
también por los profesionales de la salud, y es por eso que de la
misma manera estos compuestos estarán incluidos en el marco del
presente invento.
El presente invento incluye además los derivados
de los compuestos de la fórmula general (I)(como por ejemplo: éter
como alquil-éter, como por ejemplo metil-éter, los cuales podrían
obtenerse por ejemplo mediante la alquilación de las formas
tautómeras (I') o bien (I'')). Conforme al invento, los derivados
pegilados son derivados especialmente preferibles de los compuestos
de la fórmula general (I), especialmente los éter de poli alquilen
glicol, y preferiblemente los éter de poli etilen glicol (PEG-éter),
de las formas tautómeras (I') y (I''). Además, diversas
modificaciones químicas serían también posibles, especialmente con
respecto a los grupos sustituibles R^{1} hasta R^{9} (por
ejemplo mediante la derivación de los grupos laterales).
En la misma medida, el presente invento incluye
también las prodrogas y los metabolitos de los compuestos de la
fórmula general (I). Conforme al invento se conocen como prodrogas
especialmente estas formas de los compuestos de la fórmula general
(I) anteriormente mencionada, las cuales pueden ser a su vez
biológicamente activas o inactivas, pudiendo ser conducidas sin
embargo hacia su correspondiente forma biológicamente activa (por
ejemplo metabólica, solvolítica, o de otro tipo). Conforme al
invento los metabolitos son los productos de los compuestos de la
fórmula general (I), especialmente los resultantes del metabolismo,
o bien los productos que sean transformados durante el
metabolismo.
Los compuestos de la fórmula general (I) son
sustancias naturales y se pueden obtener por ejemplo mediante la
separación cromatográfica del extracto de própolis de las abejas
caribeñas. El própolis es una masa de un color que va desde el
amarillo-oscuro hasta el
marrón-claro, tipo resina, que se ablanda entre los
dedos, y que presenta un aroma especiado-balsámico,
que es recogida por las abejas especialmente de los capullos de
flores y la utilizan en la colmena para revestir las paredes y para
fijar las panales. El própolis es una construcción muy compleja
químicamente y su composición exacta depende de la flora local. El
própolis contiene más de doscientas sustancias químicas diferentes y
entre ellas una gran parte son ceras y resinas, aceites estéricos y
aromáticos, así como también numerosas sustancias químicas diversas,
entre ellas por ejemplo flavonoides, derivados del ácido cafeico y
en el caso del própolis caribeño también compuestos de la fórmula
general (I).
Además, los compuestos de la fórmula general (I)
también podrían ser aislados directamente del extracto vegetal o
bien de la resina vegetal (por ejemplo de la resina, del látex, de
las hojas, de las flores, etc.) de diferentes especies de
Clusia, familia de las Clusiaceae o Gutiferae (por ejemplo de
Clusia grandiflora, Clusia rosea o Clusia
renggerioides):
Así, A.J. Marsaioli et al. "The
Ecosystem of Microorganisms, Bees, and Clusia Floral Resin
and Oils, from Chemistry Point of View", Pure Appl. Chem.,
volumen 70, 11, páginas de la 2116 en adelante (1998), C.M.A. de
Oliveira et al. "Two polyisoprenylated benzophenones from
the floral resins of three Clusia species", Phytochemistry
50 (1999), páginas 1073-1079 y A.L.M. Porto et
al. "Polyisopenylated benzophenones from Clusia floral
resins", Phytochemistry 55 (2000), páginas
755-768, describen el aislamiento de diferentes
derivados de clusianona de la fórmula general (I) anteriormente
mencionada, partiendo de las resinas o bien de las sustancias
contenidas de diferentes plantas de la especie Clusia
(familia de Clusiaceae o Gutiferae) a través de métodos
cromatográficos (transformación de las resinas con diazometano en
dietiléter y posterior cromatografía de columna en una columna
cargada de silicagel con hexano etil-acetato o
hexano dietil-éter como agente de elución (columna de gradientes),
seguido por un cromatografía de corte fino preparativa sobre
silicagel/nitrato de plata con benzol/etilacetato como agente de
elución).
El aislamiento mismo de la clusianona partiendo
de la resina de plantas de la familia de las Clusiaceae o Gutiferae,
es decir Clusia congestifolia, y el descubrimiento de su
estructura están descritos por L.E. McCandlish et al. "The
Structures of Two Derivates of
Bicyclo[3.3.1]nonane-2,4,9-trione.
A Natural Product: Clusianone, C_{33}H_{42}O_{4} and
Trimethylated Catechinic Acid, C_{18}H_{20}O_{6}" en Acta
Cryst. (1976). B32, páginas 1793-1801.
M.H. Santos et al. ``Efeito de
constituintes químicos extraídos do fruto Rheedia gardneriana
(bacuparí) sobre bactérias patogénicas (Revista Brasileira de
Ciencias Farmacéuticas), volumen 35, nº 2, Julio/Diciembre 1999,
páginas 297-301 y "Epiclusianon: A New Natural
Product Derivative of
Bicyclo[3.3.1]nonane-2,4,9-trione",
Acta Cryst. (1998), C54, páginas 1990-1992,
describen el aislamiento de epiclusianona del extracto floral de
Rheedia gardneriana (bacuparí), una planta de la familia de
las Clusiaceae.
F. delle Monache et al. "Prenylated
Benzophenones From Clusia sandiensis", Phytochemistry,
volumen 30, nº 6, páginas 2003-2005 (1991) describen
el aislamiento de diferentes derivados de clusianona partiendo de la
resina vegetal de Clusia sandiensis mediante métodos
cromatográficos (cromatografía de columna seguida de cromatografía
preparativa de corte fino).
El contenido del descubrimiento completo de los
documentos anteriormente mencionados del estado de la técnica con
respecto a la producción o bien al aislamiento de compuestos de la
fórmula general (I) se incluye a través de la referencia.
Sorprendentemente, el anunciante ha descubierto
a partir de ellos que los compuestos de la fórmula general (I),
incluyendo sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos,
muestran un espectro de acción valioso farmacológicamente y es por
ello que pueden ser adecuados en la profilaxis y/o tratamiento de
enfermedades, especialmente de enfermedades de cáncer o bien de
tumores de todo tipo, pero también de enfermedades víricas de todo
tipo.
Los compuestos de la fórmula general (I)
incluyendo sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos,
podrían ser entonces aplicados preferiblemente en medicamentos para
la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades, especialmente de
enfermedades de tumor y cáncer (citostática) y de enfermedades
víricas (medicamento antivírico, o bien virostático). De esta manera
otra cuestión del presente invento son también las composiciones
farmacéuticas o los medicamentos, especialmente citostáticos o
medicamentos antivirales (virostáticos), los cuales poseen al menos
un compuesto de la fórmula general (I), como el anteriormente
definido, y/o sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos,
preferiblemente en cantidades terapéuticas efectivas, junto con un
soporte o excipiente, farmacológicamente compatible y en general no
tóxico.
Sorprendentemente, el anunciante ha descubierto
que los compuestos de la fórmula general (I), entre otras cosas,
pueden actuar como inhibidores de la topoisomerasa, especialmente
como inhibidores de la topoisomerasa I. Además, muestran también en
general una actividad inhibidora sobre la telomerasa. Finalmente,
los compuestos de la fórmula general (I) aplicados conformes al
invento pueden inducir la destrucción del ADN en células de tumor o
bien de cáncer.
El efecto inhibidor de la topoisomerasa y la
teloisomerasa de los compuestos de la fórmula general (I) utilizados
conformes al invento es sustancialmente mayor que el de los
compuestos ya conocidos en el estado actual de la técnica. Es por
ello por ejemplo que los compuestos de la fórmula general (I)
muestran en ensayos in-vitro una inhibición
de la topoisomerasa I mucho más fuerte que sustancias terapéuticas
comunes (como por ejemplo Topotecán). Adicionalmente los compuestos
de la fórmula general (I) actúan también como reguladores dentro de
la ruta de transducción de la señal de la
MAP-quinasa.
El hecho de que los compuestos de la fórmula
general (I) reúnan las características de inhibición de la
topoisomerasa y de la teloisomerasa explica sus valiosas propiedades
y su especial aptitud en lo que respecta a su utilización en el
tratamiento profiláctico y terapéutico (tumores primarios,
metástasis, células precancerosas o bien estados previos al cáncer,
tumores benignos o malignos, etc.). Sin embargo, en el estado de la
técnica no se conoce ninguna materia activa o bien preparado, que
reúna dentro de una sola molécula las características de la
inhibición de la topoisomerasa por un lado y de la telomerasa por
otro.
Las materias activas de la fórmula general (I)
utilizadas conforme al invento muestran no solamente un efecto
antitumoral sino también un efecto antimetastásico adicional.
Sorprendentemente, las materias activas de la
fórmula general (I) muestran una buena e inesperada actividad
citostática frente a los carcinomas, los cuales presentan
resistencias definidas contra sustancias quimioterapéuticas ya
establecidas. Además, no se observó ninguna resistencia frente a las
materias activas de la fórmula general (I). Por otro lado, las
materias activas de la fórmula general (I) conforme al invento
poseen la ventaja de que no presentan resistencias cruzadas frente a
medicamentos ya establecidos o bien quimioterapéuticos.
Como ejemplos no limitantes de enfermedades de
tumor o bien de cáncer en las cuales podrían ser aplicados los
compuestos de la fórmula general (I), se podrían mencionar las
siguientes enfermedades: cáncer de intestino (carcinomas de colon),
cáncer de mama (carcinomas de mama), carcinomas de ovarios,
carcinomas de útero, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de
hígado, carcinomas de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de vejiga,
cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de hueso, cáncer de
piel, sarcomas de kaposi, tumores de cerebro, miosarcomas,
neuroblastomas (por ejemplo retinoblastomas), linfomas y
leucemias.
Conforme al invento, es preferible la
utilización de los siguientes compuestos de las fórmulas (Ia), (Ib),
(Ic) y (Id) incluyendo sus derivados fisiológicamente compatibles
tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros,
tautómeros e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y
metabolitos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme al invento, es también especialmente
preferible la utilización de los siguientes compuestos de la fórmula
general (Ic) incluyendo sus derivados fisiológicamente compatibles
tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros,
tautómeros, e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y
metabolitos:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El compuesto de la fórmula general (Ic) es uno
de los múltiples ceto-enol tautómero que están
presentes en equilibrio lado a lado:
Conforme al invento también es especialmente
preferible que el compuesto de la fórmula general (Ic) presente la
siguiente configuración:
\vskip1.000000\baselineskip
El anunciante ha descubierto además, que en
ciertos casos podría resultar ventajoso el hecho de aplicar o bien
de utilizar los compuestos de la fórmula general (I) y/o sus
derivados fisiológicamente compatibles tales como sales, hidratos,
isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros, e isómeros de
constitución, derivados, prodrogas y metabolitos, junto con al menos
otro compuesto quimioterapéutico, especialmente un inhibidor de la
proteinquinasa, en particular un inhibidor de la
MAP-quinasa. En la terapia de enfermedades de tumor
o de cáncer se podrían alcanzar resultados especialmente favorables
mediante la utilización de una combinación de compuestos de la
fórmula general (I) y/o sus derivados fisiológicamente compatibles
tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros,
tautómeros, e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y
metabolitos por un lado, y de un inhibidor de proteinquinasa,
preferiblemente un inhibidor de la MAP-quinasa por
el otro. Dichas combinaciones actúan de forma sorprendentemente
sinérgica.
Una cuestión del presente invento es entonces
también la combinación farmacéutica, especialmente la combinación
citostática, que incluye
- (A)
- al menos un compuesto de la fórmula general (I), como ya se ha definido anteriormente, y/o de sus derivados fisiológicamente compatibles tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros, e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos; y
- (B)
- al menos otro compuesto quimioterapéutico, especialmente un inhibidor de la proteinquinasa, y preferiblemente un inhibidor de la MAP-quinasa
Cada uno de los componentes (A) y (B) de la
combinación conforme al invento podrían ser utilizados o bien al
mismo tiempo o bien en intervalos temporizados. En la combinación
farmacéutica se podrían aplicar los componentes (A) y (B) o como una
unidad funcional, especialmente en forma de una mezcla, o de manera
independiente, separados (espacialmente) entre sí.
Los inhibidores de la proteinquinasa actúan, tal
y como su nombre indica, de forma inhibitoria sobre la actividad de
las proteinquinasas, es decir sobre enzimas que transfieren los
grupos \gamma-fosfato desde el ATP a cadenas
laterales de tirosina, serina, o treonina. Para la combinación
farmacéutica conforme al presente invento y especialmente para la
terapia combinada conforme al invento de enfermedades de tumor o de
cáncer, son apropiados los inhibidores de la proteinquinasa de todo
tipo, como por ejemplo todos los inhibidores de la proteinquinasa
conocidos en el estado actual de la técnica (por ejemplo
determinados inhibidores heterocíclicos de bajo peso molecular tales
como la estaurosporina,
2'-Amino-3'-metoxi-flavona,
1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-[2-aminofeniltio]-butadienol,
SB 203580 de SmithKline Beecham etc.). En este caso se podría
observar un efecto sinérgico.
Para la combinación farmacéutica conforme al
invento, así como para la terapia combinada conforme al presente
invento de enfermedades de tumor o de cáncer es preferible
especialmente la utilización de inhibidores de la
MAP-quinasa. Los inhibidores de la
MAP-quinasa actúan, tal y como su nombre indica,
inhibiendo la actividad de las MAP-quinasas ("MAP
= mitogen activated protein"), es decir
enzimas que están especialmente activas durante la mitosis y que
transfieren los residuos terminales de fosfatos de los
nucleótidos-trifosfatos hacia los sustratos
correspondientes. De esta manera los inhibidores de la
MAP-quinasa evitan la mitosis y de esta manera se
evita también la división celular de células de cáncer o bien de
tumores. Para la combinación farmacéutica conforme al invento y la
terapia combinada conforme al invento especialmente de enfermedades
de tumor o bien de cáncer son adecuados los inhibidores de las
MAP-quinasas de todo tipo, por ejemplo todos los
inhibidores de las MAP-quinasas conocidas dentro del
estado actual de la técnica. Diversos ejemplos de inhibidores de la
MAP-quinasa utilizados conforme al invento son por
ejemplo los mencionados en las siguientes descripciones: WO
99/32111 A, WO 99/64400 A, WO 98/52941 A, WO 98/52937 A, WO 97/44467
A, WO 98/27098 A, WO 98/52558 A, WO 98/52940 A, WO 99/32110 A, WO
99/32463 A, WO 99/58502 A, WO 99/58523 A y WO 99/00357 A.
Sorprendentemente, el anunciante ha descubierto
además que los compuestos ya mencionados de la fórmula general (I)
poseen también una actividad reguladora dentro de la transducción de
la señal de la MAP-quinasa, es decir que actúan como
reguladores dentro de la ruta de transducción de la señal de la
MAP-quinasa.
Además, el presente invento se refiere también a
la utilización de los compuestos de la fórmula general (I)
incluyendo sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos, en
cantidades terapéuticamente efectivas, o bien eventualmente
aplicaciones en combinación con otras materias activas,
especialmente compuestos quimioterapéuticos (como por ejemplo
inhibidores de la proteinquinasa, por ejemplo el inhibidor de la
MAP-quinasa) para la obtención de un
medicamento.
Las materias activas, o bien las combinaciones
de materias activas, aplicadas conforme al invento podrían ser
utilizadas de forma sistémica pero también tópica, especialmente
localizada, según el tipo de la enfermedad a tratar.
Para la aplicación de las materias activas, o
bien de las combinaciones de materias activas, utilizadas conforme
al invento se podrían poner en práctica todas las formas de
aplicación habituales. Por ejemplo, la aplicación podría ser oral,
lingual, sublingual, bucal, rectal o parenteral (es decir, evitando
el tracto intestinal, incluyendo por consiguiente la aplicación
intravenosa, intraarterial, intracardiaca, intracutánea, subcutánea,
transdérmica, intraperitoneal o intramuscular), siendo especialmente
aptas las aplicaciones orales o intravenosas; y siendo especialmente
preferible la aplicación oral. Además también puede ser posible la
aplicación tópica (por ejemplo en el caso del tratamiento de
melanomas).
Para la aplicación conforme al invento las
materias activas, o bien las combinaciones de materias activas son
transformadas en formulaciones comunes de uso habitual, como por
ejemplo pastillas, grageas, píldoras, granulados, aerosoles,
jarabes, emulsiones, suspensiones, soluciones, pomadas, cremas, y
geles de todo tipo, especialmente con la utilización de soportes o
disolventes inertes, principalmente no tóxicos, y fisiológicamente
compatibles. Además, la introducción de las materias activas o bien
de las combinaciones de materias activas utilizadas en
"envoltorios" liposomales, por así decirlo, sería posible, es
decir, prácticamente enquistándolas o introduciéndolas en liposomas,
los cuales podrían estar modificados a su vez (transformados por
ejemplo en éster con PEG). En este caso, las materias activas o bien
las combinaciones de materias activas utilizadas conforme al invento
podrían estar presentes en una concentración terapéuticamente
efectiva, especialmente en concentraciones de aproximadamente desde
el 0,0001 hasta aproximadamente el 99% del peso, y preferiblemente
de manera aproximada desde el 0,01 hasta el 95% del peso de la
mezcla total, es decir en cantidades suficientes como para poder
alcanzar el margen de dosificación especificado o bien deseado. Sin
embargo, podría ser necesario variar eventualmente las cantidades
anteriormente mencionadas, es decir dependiendo del peso corporal o
bien de la vía de aplicación, del comportamiento individual frente
al medicamento, del tipo de formulación y del momento o bien del
intervalo de las aplicaciones. Así, en algunos caso podría ser
suficiente con menos de la cantidad mínima anteriormente mencionada,
mientras en otros casos habría que pasar por encima del límite
superior mencionado. En el caso de que fuera necesaria la aplicación
de cantidades mayores sería recomendable dividir dicha cantidad y
distribuirla a través de varias aplicaciones a lo largo de un
espacio de tiempo determinado, por ejemplo a lo largo de todo un
día.
Las formulaciones se producen por ejemplo
diluyendo las materias activas, o bien las combinaciones de las
materias activas con diluyentes (por ejemplo aceites tales como el
aceite de ricino) y/o con sustancias de soporte, eventualmente con
la ayuda de sustancias de emulgación y/o dispergación, en cuyo caso
si se utiliza por ejemplo agua como medio de dilución se podrían
utilizar eventualmente diluyentes orgánicos como disolventes
adyuvantes.
Según el modo de aplicación resulta ventajoso el
hecho de aplicar las materias activas, o bien las combinaciones de
las materias activas conformes al invento en cantidades que van
desde el 0,0001 hasta aproximadamente los 500 mg/kg de peso
corporal, especialmente desde aproximadamente los 0,0001 hasta los
100 mg/kg, y preferiblemente desde los 0,01 hasta los 50 mg/kg de
peso corporal para alcanzar resultados efectivos. Sin embargo,
podría ser necesario variar eventualmente las cantidades
anteriormente mencionadas, es decir, dependiendo del peso corporal o
bien del tipo de la vía de aplicación, del comportamiento individual
frente al medicamento, del tipo de formulación y del momento, o bien
del intervalo en que ocurre la aplicación. Así es que en algunos
casos podría ser suficiente utilizar menos de la cantidad mínima
mencionada, mientras que en otros casos habrá que superar el límite
máximo mencionado. En el caso de la aplicación de cantidades mayores
podría ser recomendable su distribución a lo largo de un espacio de
tiempo, por ejemplo a lo largo de todo un día, es decir por medio de
por ejemplo varias aplicaciones individuales o de una aplicación
continuada (por ejemplo como infusión continuada). En la misma
medida, la aplicación también sería posible en forma de una terapia
crónica (por ejemplo en forma de pastillas).
El presente invento será ilustrado a través de
los siguientes ejemplos de ejecución, los cuales, sin embargo, no
limitarán el presente invento de ninguna manera.
A continuación se describe el aislamiento del
compuesto de la fórmula (Ic') y su efectividad fisiológica.
El compuesto de la fórmula (Ic') está presente
en equilibrio tautómero con las estructuras de las fórmulas (Ic) y
(Ic''):
Pero a continuación, con el fin de simplificar,
se hablará únicamente del compuesto de la fórmula (Ic').
El própolis, recogido de colmenas en el Caribe,
será disuelto en etanol y las ceras insolubles separadas mediante
filtración. Determinados volúmenes definidos serán secados y el
polvo restante será resuspendido en etanol a una concentración
definida. Las disoluciones serán almacenadas a temperatura ambiente
y en oscuridad.
El fraccionamiento es realizado con un equipo
RP-HPLC de la empresa Waters GMBH (Eschborn,
Alemania) ("Waters the Separator Module Alliance 2690", Waters
PDA 996 Detector, Waters Millennium Chromatography Manager).
El fraccionamiento se consigue mediante una
columna separadora de la empresa Macherey-Nagel
(Nucleosil 100-7 C18, 250 x 21 mm), utilizando un
sistema de gradientes a 40ºC (tabla 1). La fase acuosa consiste de
una dilución 0,001 M de formiato de amonio (pH = 7,00).
| Tiempo | Flujo | Formiato de | Metanol % | Acetonitrilo % |
| (min) | (ml/min) | amonio % | ||
| 0 | 4 | 50 | 30 | 20 |
| 80 | 4 | 10 | 70 | 20 |
| 180 | 4 | 0 | 80 | 20 |
| 190 | 4 | 0 | 80 | 20 |
| 200 | 4 | 50 | 30 | 20 |
| 210 | 4 | 50 | 30 | 20 |
Las fracciones así conseguidas, cada una de 8 ml
respectivamente (2 min), serán secadas y resuspendidas en metanol
para ser almacenadas a continuación a temperatura ambiente y en
oscuridad.
Para comprobar la citotoxicidad de cada una de
las fracciones, volúmenes comparables serán diluidos en un medio y
analizados con el "SRB-Assay", descrito a
continuación. Como célula a tratar (target cell) se utiliza entre
otras una línea de células de cáncer de intestino de origen humano
(HCT8 WT).
La fracción que actuó de forma citotóxica en el
“SRB- test” será sometida a otra limpieza. Para ello se adapta el
sistema de elución de gradientes a la polaridad de la fracción a
limpiar. Después de un nuevo fraccionamiento y de la comprobación
con el SRB-test de la fracción conseguida por
RP-HPLC preparativo se puede aislar una sustancia
uniforme (Ic'). El grado de limpieza de la sustancia (Ic') se
confirma a través de datos espectrográficos de rayos UV (Figura 1b).
Una columna "Waters Symmetry" será elegida como columna
separadora analítica, rellena de una fase C-18
modificada (250 mm x 4,6 mm). El resultado es representado en la
figura 1a.
La figura 1a muestra un cromatograma
representativo de la disolución (Ic') del RP-HPLC
(comprobación de la limpieza) a 254 nm, tasa de flujo = 1 ml/min, T
= 40ºC, sistema de gradientes ya indicado. La línea superior
corresponde a la concentración de metanol (%) y la línea intermedia
a la concentración de la fase acuosa (%, formiato de amonio 0,01 M).
La concentración de acetonitrilo (%) es fijada constantemente al 5%
(línea inferior).
La figura 1b muestra los “datos PDA” de la
analítica presentada en la figura 1a. La sustancia (Ic') es
conseguida como una fracción homogénea. El espectro UV presenta dos
máximos (a 254 y 308 nm) bajo estas condiciones de elución.
El primer aislamiento y caracterización del
compuesto de la fórmula general (Ic') resulta sin la siguiente
formación de derivados (por ejemplo con diazometano). Los extractos
etanólicos del própolis (recogido en el Caribe) podrían ser
limpiados, tal y como ha sido descrito anteriormente, mediante una
analítica de RP-HPLC, gracias a lo cual el compuesto
de la fórmula (Ic') podría estar disponible por primera vez en su
forma no-derivada para otras analíticas de
espectroscopía NMR, es decir con una pureza suficientemente alta
(>98%; LC-MS; analítica espectroscópica UV
mediante LC-PDA; MS).
Para otra confirmación de la estructura el
compuesto de la fórmula (Ic') será transferido en los éter de metilo
correspondientes a través de la transformación con diazometano. Los
compuestos O-metilados serán aislados con la
relación 40/60 (RP-HPLC).
Los resultados de la analítica NMR
(^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, DEPT135,
DEPT90, HMQC, HMBC, H,H-COSY90 (gs),
1D-NOE-espectro de diferencia) están
representados a continuación en forma de tablas:
- \bullet
- DEPT significa "Distortionless Enhancement by Polarization Transfer"
- \bullet
- COSY significa "COrrelated SpectroscopY". En este caso generalmente se refiere a ^{1}H,^{1}H-COSY, el cual también se llama según su “inventor” "Jeener-Experiment" y que representa la primera secuencia 2D de impulso en la historia de los NMR.
- \bullet
- HMQC significa Heteronuclear Multiple Quantum Coherence.
- \bullet
- HMBC significa Heteronuclear Multiple-Bond Correlation.
- \bullet
- NOE significa Nuclear Overhauser Effect.
Las Figuras 1c, 1d y 1e muestran espectros
^{1}H-NMR del compuesto (Ic') (Frecuencia de
medición: 50 MHz, disolvente: CD_{3}OD).
La Figura 1f muestra un espectro
^{13}C-NMR del compuesto (Ic') (Frecuencia de
medición: 125 MHz, disolvente: CD_{3}OD).
La Figura 1g muestra un espectro
^{13}C-DEPT del compuesto (Ic') (Frecuencia de
medición: 50 MHz, disolvente: CD_{3}OD); los CHs y CH_{3}s están
mostrados hacia arriba, mientras los CH_{2}s se indican hacia
abajo.
Las Figuras 1h, 1i, 1j y 1k muestran espectros
H,H-COSY del compuesto (Ic') (Frecuencia de
medición: 500 MHz, disolvente: CD_{3}OD).
Las Figuras 1l hasta 1r muestran espectros de
HMBC del compuesto (Ic') (Frecuencia de medición: 125 MHz,
disolvente: CD_{3}OD).
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Es por ello que el compuesto
no-derivado de la fórmula (Ic'), (Ic''), o bien (Ic)
está presente en un equilibrio ceto-enol, lo cual
sería confirmado tanto por el desplazamiento químico de las señales
así como también por el ancho de las
señales-^{13}C de los átomos-C 2 y
4.
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\vskip1.000000\baselineskip
En referencia a los datos NMR mencionados
anteriormente se le pudo asignar al compuesto de la fórmula general
(Ic), (Ic'), o bien (Ic'') la siguiente configuración absoluta:
Seis líneas de células tumorales de origen
humano, absolutamente caracterizadas (nativas, así como también
líneas celulares transformadas en sub-clones
resistentes), así como también dos líneas celulares
no-tumorales serán utilizadas para otros análisis
(tabla 2).
La sensibilidad de las líneas celulares frente a
la sustancia (Ic') se detecta mediante la llamada "prueba de la
Sulforodamina" (SRB-Test). En este caso se trata
de un procedimiento estándar, robusto y altamente reproducible, tal
y como ha sido así establecido en el Instituto Nacional del Cáncer
(NCI, National Cancer Institute, USA)(Skehan et al.,
1990).
Los resultados de las pruebas están
representados en la tabla 3. Aquí se indica la concentración de
sustancia (Ic') que inhibe el crecimiento celular en un 50%
(IC_{50}, calculado a partir de la dosis
semi-logarítmica frente a las curvas de efectividad.
En la tabla 3 se han representado como resultado los promedios y sus
desviaciones estándares de al menos tres experimentos
independientes. No existe ninguna resistencia cruzada frente a las
citostáticas. Además, la sustancia (Ic') resulta esencialmente menos
citotóxica frente a las líneas celulares
no-tumorales.
Para la investigación del efecto de la sustancia
(Ic') sobre la topoisomerasa I, se realiza la tal llamada prueba
"desenrollamiento de la Topo I". La prueba se basa en el
"desenrollamiento" mediante la topoisomerasa I, independiente
de ATP, de los dímeros de ADN del plásmido pBR322 enrollado. Las dos
formas topológicas diferentes del ADN del plásmido, la forma
enrollada y la forma desenrollada relajada, se separan en esta
prueba mediante un gel de agarosa. Para ello, la enzima
topoisomerasa I es obtenida a partir de extractos de núcleos
celulares de las líneas celulares tumorales.
Los extractos de los núcleos celulares son
obtenidos mediante el método de Sullivan, aplicando las
modificaciones de Danks et al.
Tal y como se ha indicado en la figura 3
(columna 1: controles) se necesitan 160 ng de extracto de núcleos
celulares con la topoisomerasa I contenida en ellos, para
transformar los dímeros de ADN del plásmido pBR322 superenrollados
(control negativo) en la topología relajada (control positivo). La
sustancia (Ic') inhibe la actividad topoisomerasa I al 100% con una
concentración de 100 \mug/ml. Este valor corresponde a una
concentración veinte veces mayor que la necesaria para inhibir en un
50% el crecimiento tumoral de las líneas celulares correspondientes
(IC_{50}, figura 2). Si se comparan estos datos con la actividad
in vitro inhibidora de por ejemplo Topotecano se necesitaría
una concentración que estaría para este compuesto unas 1000 veces
por encima de la IC_{50} ya establecida en clínica para esta
sustancia (Ic'). La figura 3 ilustra la inhibición de la actividad
topoisomerasa I por la sustancia (Ic').
Los efectos de la sustancia (Ic') sobre el
crecimiento celular, descritos hasta ahora, también podrían ser
confirmados mediante la presencia de cambios en el ciclo celular.
Para dicha analítica se llevarán a cabo estudios por medio de la
citometría de flujo según el método adaptado por Tsugita M. et
al.
Células de cáncer de intestino HCT8 WT con un
crecimiento exponencial son tratadas durante 24 h con la sustancia
(Ic') a la concentración IC_{50} anteriormente establecida, para
ser incubadas a continuación con BrdU. Las células fijadas con
metanol son sometidas a un tratamiento con un detergente (Triton
X-100/HCl) para desnaturalizar las cadenas de ADN.
Después de la incubación con el anticuerpo marcador fluorescente
(anti-BrdU mAb, marcador-FITC) se
añade el segundo colorante fluorescente (PI, yoduro de
propidio).
El contenido de ADN (señal de fluorescencia del
yoduro de propidio) y la cantidad de BrdU asimilado (señal de
fluorescencia del FITC) serán determinados mediante un citómetro de
flujo de la empresa Coulter (Coulter EPICS XL). Como ejemplo se
muestran los resultados representativos de las figuras 4a y 4b.
Las figuras 4a y 4b muestran tomas de BrdU y PI
en el ADN de células de HCT8 WT no tratadas (control, figura 4a) y
tratadas con la sustancia (Ic')(IC_{50}, 24 h, figura 4b). Los
resultados presentados son representativos para n=3 experimentos
independientes.
Probablemente, el tratamiento con la sustancia
(Ic') conduce a una inhibición de la fase de síntesis. Esto es lo
que se indica en las figuras acerca del contenido de ADN (figura 4a
y 4b, toma-BrdU).
Las investigaciones acerca de la degradación de
ADN por la sustancia (Ic') se realizan por ejemplo con células
humanas de un carcinoma bronquial (H460 WT) y de un carcinoma
colo-rectal (HT29 WT). Para ello, el ADN aislado
después de haber sido tratado con la sustancia (Ic') a distintos
tiempos, será analizado por medio de electroforesis de geles.
La determinación de las rupturas de los doble
brazos de ADN se consigue mediante ADN marcado con ^{14}C. Para
ello se tratan células, etiquetadas con
[^{14}C]d-timidina, con diferentes
concentraciones de la sustancia (Ic'). El aislamiento del ADN se
realiza por medio de un método adaptado de Chia Chiao et
al.
Posteriormente a la determinación de la cantidad
y pureza del ADN aislado mediante un espectrómetro "GeneQuant"
se separan cantidades comparables de ADN a través de geles de
agarosa. El ADN separado electroforéticamente en geles será entonces
teñido con bromuro de etidio.
En un "transiluminador (302 nm)" el ADN
intacto, que no migra en el campo eléctrico, es separado por
extracción del ADN fragmentado y por lo tanto migrado en el gel. Los
fragmentos aislados de gel, o bien de ADN, serán licuados a +80ºC en
presencia de ácido clorídrico. Después de añadir un escintilador se
puede determinar la radioactividad mediante un medidor de
escintilación líquida (TPI-CARB 2100RT). La
radioactividad medida será indicada en desintegraciones por minuto
(cpm).
En la figura 5 está representada la inducción en
las rupturas del doble brazo de ADN por la sustancia (Ic') después
de la incubación durante 6 h de células de carcinoma bronquial (H480
WT). La figura 5 muestra las rupturas del doble brazo de ADN
demostrado en células H460 WT, etiquetadas con
[^{14}C]d-Thy, que han sido causadas por el
tratamiento durante 6 h con la sustancia (Ic'). Los resultados
presentan los promedios y sus desviaciones estándar de n=3
experimentos independientes.
Debido al tratamiento de las células tumorales
con una concentración diez veces mayor a la concentración IC_{50},
se inducen cantidades significantes de rupturas de dobles cadenas
durante el intervalo de 6 h, y ya con una concentración IC_{50}
dichas rupturas no serán suficientemente reparadas probablemente por
las células tumorales, iniciándose así por lo tanto la muerte
celular.
En la figura 6 se muestra otro ejemplo de la
inducción de rupturas de la doble cadena de ADN de células de tumor,
en este caso de un tumor colo-rectal (HT29 WT). Como
ya se comentó para la línea celular del carcinoma bronquial,
probablemente se inducen cantidades sustanciales de rupturas de
dobles cadenas, las cuales no podrán ser nuevamente corregidas
mediante los mecanismos de reparación de la célula del tumor,
representando finalmente también un factor causante de la apoptosis,
la muerte celular de la célula tumoral programada.
Para determinar el efecto de la sustancia (Ic')
sobre la telomerasa humana se realiza la conocida como prueba
"Telomeric Repeat Amplification Assay"
(TRAP)-ELISA, basándose en el método de N.W. Kim
et al.
Este método está basado en el aprovechamiento de
la reacción en cadena de polimerasas (PCR). En este caso, en un
primer paso se coloca un número determinado de motivos-(GGTTAG)
mediante la actividad telomerasa en la terminación 3' de un
oligonucleótido (TS = Sustrato de telomerasa), marcado con biotina.
En un segundo paso se multiplican los productos, así prolongados,
mediante la técnica del PCR, aprovechando los cebadores (más
conocidos como "primers" en inglés) TS y RP (R = reverso). De
esta manera se genera una "escalera" de productos en
incrementos de 6 bases (tamaño inicial = 50 nucleótidos). Durante la
multiplicación se sitúa dCTP, DNP-marcado, en los
productos del PCR. La detección y cuantificación de los productos de
telomerasa sintetizados mediante el método "Sandwich ELISA" es
una medida de la actividad enzimática de la telomerasa.
Los productos de la telomerasa soportan los
TS-primer, marcados con biotina, y los sujetan en la
superficie de las placas Microtiter, las cuales han sido recubiertas
previamente con estreptavidina. Un anticuerpo
anti-DIG conjugado con POD se acopla a los
nucleótidos marcados con DNP e instalados durante la multiplicación.
Después de añadir el sustrato TMB, la actividad telomerasa se hace
visible por fluorescencia espectroscópica al iniciarse una reacción
colorimétrica gracias a la enzima POD. En este caso la absorción
medida es directamente proporcional a la actividad de la
telomerasa.
Para poder asegurar sin dudas la existencia de
un efecto de la sustancia (Ic') sobre la telomerasa hay que excluir
un efecto de la sustancia (Ic') sobre la polimerasa del ADN. En un
ensayo previo utilizando TSR8 como control interno se excluyó el
efecto de la sustancia (Ic') bajo diferentes niveles de
concentración.
La multiplicación de los moldes o patrones
(conocidos como "templates" en inglés) TSR8 es únicamente
dependiente de la polimerasa de ADN. Cada uno de los inhibidores de
esta enzima puede ser demostrado con este sustrato.
La figura 7 muestra los resultados del ensayo
previo con el template TSR8. El experimento se lleva a cabo por
triplicado. En la figura 7 se puede comprobar que incluso con la
máxima concentración aplicada de 50 \mug/ml de la sustancia (Ic')
no se consiguió en este experimento una inhibición significativa de
la Taq-polimerasa.
El experimento para la investigación de una
inhibición de la actividad telomerasa por medio de la sustancia
(Ic') es indicado en la figura 8. En dicha figura se muestra el área
de concentración entre 10 y 50 \mug/ml. Una inhibición completa de
la telomerasa humana se puede observar con una concentración de 50
\mug/ml. La figura 8 muestra los resultados del ensayo TRAP:
inhibición, mediante el uso de la sustancia (Ic'), de la telomerasa
humana dependiente de la dosis, conseguida a partir de células de un
carcinoma de colon (HCT8 WT). Los resultados muestran los promedios
y desviaciones estándar de tres experimentos independientes.
La fosforilación de ciertas rutas de
transducción de la señal juega un rol esencial en la regulación del
crecimiento celular o bien en la expresión genética. La proteína
ERK1/2 (MAP-quinasa) pertenece a la ruta de la
MAP-quinasa.
El tratamiento de células de carcinoma de colon
humano (HCT8 WT) con la sustancia (Ic') conlleva a la fosforilación
de esta proteína, la cual se comprueba con una analítica
"Western-Blot" (figura 9). La figura 9 muestra
la analítica "Western-Blot" de la proteína
ERK1/2; El control de carga es presentado en la línea inferior.
El tratamiento de las células con la sustancia
(Ic') conlleva a una fosforilación de la proteína ERK1/2 dependiente
de la dosis. Ya a partir de una dosis de IC_{50} se podría
confirmar la correspondiente fosforilación por la sustancia (Ic').
Como resultado de este proceso, interpretado hasta ahora en la
literatura tan sólo como activación, se consigue la parada del ciclo
celular en la célula tumoral, lo que se comprueba mediante los
análisis de ciclo celular realizados (véanse párrafos
anteriores).
Para la comprobación de estos informes, para
saber hasta qué punto los resultados alcanzados con respecto a una
activación ERK1/2 por la sustancia (Ic') pueden ser antagonizados
por la adición de un inhibidor ERK1/2, se realiza un ensayo de
co-incubación con la sustancia (Ic') y con un
inhibidor específico ERK1/2 (inhibidor de la
MAP-quinasa). En este caso, células tumorales, por
ejemplo células de carcinoma de colon (HCT8 WT), serán
co-incubadas respectivamente durante 24 h con ambas
materias activas a diferentes dosificaciones (figura 10). La figura
10 refleja el experimento de co-incubación sobre la
citotoxicidad con la sustancia (Ic') y un ERK1/2 específico
(inhibidor de MAP-quinasa). Se
co-incubaron células HCT8 WT. Los puntos mostrados
representan las relaciones correspondientes (% de las respectivas
concentraciones IC_{50}) de ambas materias activas.
Este experimento realizado de esta manera sin
embargo no conducía a una inhibición de la citotoxicidad medida en
ninguna relación de dosificación. Es más, se pudo registrar sin
embargo una marcada sinergia en el caso de la
co-incubación de ambas materias activas.
Todas las combinaciones de dosificación se
encuentran debajo de la bisectriz, y por lo tanto en el área de una
sinergia inequívoca. La combinación del 30% de la concentración
IC_{50} de la sustancia (Ic') con una concentración del 30% de la
concentración IC_{50} del inhibidor específico ERK1/2 conduce a
una inhibición del crecimiento de las células tumorales aisladas de
un carcinoma de colon (HCT8 WT).
Claims (23)
1. Utilización de las
biciclo[3.3.1]nonano-2,4,9-trionas
sustituidas de la fórmula general (I)
\vskip1.000000\baselineskip
En la cual:
- \bullet
- R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5}, iguales o diferentes, representan de forma independiente entre sí a uno de los siguientes grupos:
\vskip1.000000\baselineskip
- Con la condición sin embargo de que si uno de los radicales R^{1}, R^{2}, R^{4}, o R^{5} representa un grupo bencilo, ninguno de los demás radicales puede representar entonces un grupo bencilo;
- \bullet
- R^{3} representa un átomo de hidrógeno;
- \bullet
- R^{6} y R^{7} representan ambos un grupo metilo respectivamente o bien un átomo de hidrógeno respectivamente, y R^{8} y R^{9} representan ambos un grupo metilo respectivamente o bien ambos representan un átomo de hidrógeno respectivamente, con la condición sin embargo de que si R^{6} y R^{7} representan grupos metilo, R^{8} y R^{9} serán entonces átomos de hidrógeno, y de que si R^{8} y R^{9} representan grupos metilo, R^{6} y R^{7} serán entonces átomos de hidrógeno;
y sus derivados fisiológicamente compatibles
tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros,
tautómeros, e isómeros de constitución, derivados, para la
producción de medicamentos para el tratamiento profiláctico y/o
terapéutico de enfermedades de tumor y/o de cáncer.
2. Utilización conforme a la reivindicación 1,
caracterizada en que los compuestos de la fórmula (I) son
seleccionados del grupo de los siguientes compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
3. Utilización conforme a las reivindicaciones 1
ó 2, caracterizada en que el compuesto de la fórmula (I) sea
el siguiente compuesto de la fórmula (Ic):
4. Utilización conforme a la reivindicación 3,
caracterizada en que el compuesto de la fórmula (Ic) presenta
la siguiente configuración:
5. Utilización conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 4 para el tratamiento profiláctico y/o
terapéutico de enfermedades de tumor y/o de cáncer, especialmente
tumores primarios y metástasis, y/o precancerosas (estados previos
del cáncer).
6. Utilización conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 5 para el tratamiento profiláctico y/o
terapéutico de tumores benignos y malignos.
7. Utilización conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 6 para el tratamiento profiláctico y/o
terapéutico de cáncer de intestino (carcinomas de colon), cáncer de
mama (carcinomas de mama), carcinomas de ovarios, carcinomas de
útero, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de hígado,
carcinomas de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de
próstata, cáncer de testículo, cáncer de hueso, cáncer de piel,
sarcomas de kaposi, tumores cerebrales, miosarcomas, neuroblastomas,
linfomas y leucemias.
8. Utilización conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizada en que los
compuestos de la fórmula general (I) serán aplicados de forma
sistémica y/o tópica.
9. Utilización conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizada en que los
compuestos de la fórmula general (I) inhiben y/o detienen el
crecimiento celular y la división celular de células de tumor y/o de
células de cáncer.
10. Utilización conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizada en que los
compuestos de la fórmula general (I) inducen la destrucción del DANN
de las células de tumor y/o de cáncer.
11. Utilización de compuestos de la fórmula
general (I), como los ya anteriormente definidos, y/o sus derivados
fisiológicamente compatibles tales como sales, hidratos, isómeros,
especialmente esteroisómeros, tautómeros, e isómeros de
constitución, derivados, prodrogas y metabolitos, para la producción
de inhibidores de la topoisomerasa y/o inhibidores de la
telomerasa.
12. Utilización conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizada en que los
compuestos de la fórmula general (I), como los ya anteriormente
definidos, y/o sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos en
combinación con al menos otro agente quimioterapéutico serán
utilizados para la producción de un medicamento, especialmente un
inhibidor de la proteína quinasa, preferiblemente un inhibidor de la
MAP-quinasa.
13. Agente Citostático, conteniendo al menos un
compuesto de la fórmula general (I), como los ya anteriormente
definidos, y/o sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos junto
con un soporte o excipiente, farmacológicamente compatible y en
general no tóxico.
14. Agente Citostático, conteniendo al menos un
compuesto de la fórmula general (I), como los ya anteriormente
definidos, y/o sus derivados fisiológicamente compatibles tales como
sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros,
e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos en
cantidades terapéuticamente efectivas.
15. Composición farmacológica o medicamento
conforme a la reivindicación 13 o 14 para la aplicación sistémica
y/o tópica.
16. Composición farmacológica, especialmente una
combinación citostática que incluye
- (A)
- al menos un compuesto de la fórmula general (I), como los ya anteriormente definidos, y/o sus derivados fisiológicamente compatibles tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente esteroisómeros, tautómeros, e isómeros de constitución, derivados, prodrogas y metabolitos; y
- (B)
- al menos otro compuesto quimioterapéutico, especialmente un inhibidor de la proteína quinasa, preferiblemente un inhibidor de la MAP-quinasa.
17. Combinación farmacológica conforme a la
reivindicación 16, caracterizada en que los componentes (A) y
(B) estarán presentes como una unidad funcional, especialmente en
forma de mezcla, o de manera independiente, separados
(espacialmente) entre sí.
18. Combinación farmacológica conforme a la
reivindicación 16 o 17, en cuyo caso los componentes (A) y (B) serán
utilizables o aplicables al mismo tiempo o a intervalos
temporizados.
19. Combinación farmacológica conforme a una de
las reivindicaciones 16 hasta 18, conteniendo los componentes (A) y
(B), cada uno en cantidades terapéuticamente efectivas
respectivamente.
20. Combinación farmacológica conforme a una de
las reivindicaciones 16 hasta 19 para la aplicación sistémica y/o
tópica.
21. Compuestos de la fórmula general (I), como
los ya anteriormente definidos, y/o sus derivados fisiológicamente
compatibles tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente
esteroisómeros, tautómeros e isómeros de constitución, derivados,
prodrogas y metabolitos para el tratamiento profiláctico y/o
terapéutico de enfermedades cancerígenas, especialmente tumores
primarios y metástasis, y/o precancerosas (estados previos del
cáncer), especialmente cáncer de intestino (carcinomas de colon),
cáncer de mama (carcinomas de mama), carcinomas de ovarios,
carcinomas de útero, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer
de hígado, carcinomas de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de
vejiga, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de hueso,
cáncer de piel, sarcomas de kaposi, tumores cerebrales, miosarcomas,
neuroblastomas, linfomas, y leucemias.
22. Compuestos de la fórmula general (I), como
los ya anteriormente definidos, y/o sus derivados fisiológicamente
compatibles tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente
esteroisómeros, tautómeros e isómeros de constitución, derivados,
prodrogas y metabolitos para la inhibición de topoisomerasas y/o
telomerasas.
23. Compuestos de la fórmula general (I), como
los ya anteriormente definidos, y/o sus derivados fisiológicamente
compatibles tales como sales, hidratos, isómeros, especialmente
esteroisómeros, tautómeros e isómeros de constitución, derivados,
prodrogas y metabolitos, actuando como reguladores dentro de la ruta
de transducción de la señal de la MAP-quinasa.
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