JP2005514987A - 自己フィブリン糊を調製するためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、生きている生物の組織を再生させるのに適する自己固体フィブリン網を調製するためのシステムを提供する。このシステムは、分離媒質および低密度高粘性液体を収容している密閉された第１の容器を含む。分離媒質は、容器に血液が入り、遠心分離にかけられると血漿から赤血球を分離することができるものであり、上記第１の容器は、第１の圧力を有する。このシステムはさらに、カルシウム凝固活性化因子を収容している密閉された第２の容器を含む。第２の容器は、第１の圧力よりも小さい第２の圧力を有する。このシステムは、第１の末端および第２の末端を有するカニューレを含む移動装置も含む。第１の末端および第２の末端は、密閉された第１の容器および第２の容器に穴を開けて、第１の容器と第２の容器との間に流体の行き来をもたらすことができる。第１の容器の低密度高粘性液体は、カニューレに侵入した際、それを通る流れを遮断することができる。

Description

本発明は、固体フィブリン網または自己フィブリン糊を調製するためのシステム、キット、および方法に関する。

本出願は、１９９７年６月２４日出願のイタリア国出願第ＭＩ９７Ａ００１４９０号に対する優先権を主張している１９９８年６月２４日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＩＴ９８／００１７３号の米国特許法第３７１条の出願であり、この出願に対する優先権を主張している、米国特許第６，３６８，２９８号Ｂ１明細書として公開された２００１年７月１３日出願の米国特許出願第０９／４４６，７２９号明細書の一部継続出願であり、この出願に対する優先権を主張するものである。本出願は、上述の各出願に対する優先権を主張する。

フィブリン糊は、主に局所の外科用接着剤または止血剤として使用される血液誘導物質であることが知られている。異種性のフィブリン糊を得るには、ドナー由来の濃縮されたフィブリノーゲンと共にトロンビンやバトロキソビンなどのヒトもしくは動物起源のタンパク様（ｐｒｏｔｅｉｃ）活性化因子を含む数種のキットが市販されている。

そのような既知のキットは、ヒトもしくは動物起源の材料を使用するものであるが、その起源のために、ウイルスが混入する可能性を生じ、またフィブリン糊の受容者に重度の危険をもたらしかねない。過去には、当局は、ヒトもしくは動物起源の材料を使用して得た血液誘導物質の取引を強制的に停止し、あるいはそうしたものを禁止しさえもした。さらに、ヒトまたは動物のタンパク質を使用して製造されたフィブリンが患者に再移植された結果として生じる拒絶の症例も文献で知られている。そのような症例は実に、再移植しようとするシーラントタンパク質またはその調製に使用された何らかの成分の起源が、受容者の生物にとって異種であるためである。

自己フィブリン糊、すなわち、患者自身の血液から自家性に得たフィブリン糊は、拒絶および／または感染の危険に関してはより信頼できる。自己フィブリン糊を即座に得ることについてはいくつかの手順がすでに記載されているが、関連した参照文献が特許文献中に若干見られるものの、「すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）」キットは市販されていない。

特許文献１は、血小板糊創傷シーラントを生成するためにフィブリノーゲン活性化因子と組み合わせる血漿バフィーコート濃縮物を開示している。この特許で開示されている方法によって、患者の血液を加工して自己フィブリン糊を得ることが可能になるが、この方法では、フィブリノーゲン活性化因子としてトロンビンまたはバトロキソビンを使用する。これらの活性化因子は、ヒトもしくは動物性であり、したがって、依然として患者に拒絶および／またはウイルス感染の危険が伴う。

特許文献２は、組織シーラントとして使用される濃縮血漿を作製するための方法および装置を開示している。この方法は、全血から血漿を分離し、前記血漿を濃縮器と接触させて血漿から水を除去して濃縮血漿を得ることにあり、その後、トロンビンおよびカルシウムを含有する溶液を用いて濃縮血漿を凝固させることができる。この装置は、第１のチャンバー内の第１の遠心分離機、第１のチャンバーと通じた第２のチャンバーに含まれた濃縮剤（たとえば、デキストラノマーやポリアクリルアミド）、および第２の分離機を含む。この参照文献で開示された方法は、後続の自己フィブリン糊の調製に必要な血漿濃縮物を得るのに長い時間を要し、またこの装置は高価であり、使い捨てができない。この方法は、カルシウム凝固活性化因子の使用を開示しておらず、また予備濃縮ステップを要する。

多くの方法およびシステムでは、流体をある容器から別の容器へと移す必要がある。たとえば、多くの化学装置および医療装置では、後から様々な試薬および特定の容量（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ）アリコートと反応させることになる、必要な体積の液体を移動させる必要がある。一般的な取扱法は、２個の容器の蓋を外し、一方の容器の液体をピペットで他方に移すことである。しかし、この取扱法では、サンプルが周囲の汚染物質に曝される。たとえば、この技術は、血液サンプル中で赤血球から分離された血漿を移すのに使用される。しかし、界面のメニスカスの血漿を取り出すには、特殊な技術が必要である。望ましくない下方画分の高密度な赤血球が、吸引されたサンプルを汚染することはたびたびある。この問題を回避するために、ピペットはしばしば、メニスカス（すなわち、血漿と赤血球の境界線）から安全な距離に保たれ、それによってサンプルの移動が不完全になる。望ましい画分の移動が不完全であると、収量が最適な容量よりも少なくなり、サンプル試薬と第２の容器に入った試薬の比率が化学量論的でなくなる。この２番目の状況は、製品の性能がばらつく深刻な原因になりかねない。事実、反応速度がある化学量論的な比率で最高となり、それよりも高いまたは低い比率で急速に減速する酵素反応は多い。

米国特許第５，７３３，５４５号 米国特許第５，５５５，００７号 米国特許第５，５６０，８３０号 米国特許第５，７３６，０３３号

全体として、生きている生物の組織を再生させることのできる自己フィブリン糊または固体フィブリンを調製するための方法およびシステムが求められている。

本発明の一実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その出願において、以下の記載事項で述べ、または図面に示す細部の構造および成分の取合せに限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態でもよく、様々な方法で取り扱い、または実施することができる。また、本明細書で使用する用語および術語は、説明の目的のためにあり、限定するものではないとみなすべきである。

一態様では、本発明は、生きている生物の組織を再生させるのに適する自己固体フィブリン網を調製するためのシステムを提供する。このシステムは、分離媒質および低密度高粘性液を含む密閉された第１の容器を含む。容器に血液が入って遠心分離にかけられると、分離媒質は血漿から赤血球を分離することができ、第１の容器は第１の圧力を有する。このシステムはさらに、カルシウム凝固活性化因子を含む密閉された第２の容器を含む。第２の容器は、第１の圧力よりも低い第２の圧力を有する。このシステムは、第１の末端および第２の末端を有するカニューレを含む移動装置も含む。第１の末端および第２の末端は、密閉された第１の容器および第２の容器に穴を開けて、第１の容器と第２の容器間に流体の行き来をもたらすことができる。第１の容器の低密度高粘性液は、第１の容器へ侵入すると、そこを通る流れを遮断することができる。

別の態様では、本発明は、生きている生物の組織を再生させることのできる固体フィブリン網を調製するためのもう１つのシステムを提供する。このシステムは、血液をその中に引き込むことのできる第１の圧力を有する密閉された第１の容器を含む。このシステムはさらに、第２の圧力を有し、カルシウム凝固活性化因子を含む密閉された第２の容器を含む。第２の圧力は、第１の圧力よりも低い。このシステムは、第１の末端および第２の末端を有するカニューレを含む移動装置も含む。第１の末端および第２の末端は、密閉された各容器に穴を開けることができ、移動装置は、圧力の差によって、第１の容器に引き込まれた血液の一部を第２の容器に移動させることができる。このシステムは、移動装置によって第１の容器から第２の容器へと移され、カルシウム凝固活性化因子と接触した血液部分の遠心分離と凝固を同時に行って、生きている生物の組織を再生させることのできる固体フィブリン網を形成するための遠心機も含む。

別の態様では、本発明は、生きている生物の体組織を再生させるための固体フィブリン網の調製方法を提供する。この方法は、患者の血液を第１の容器に引き込むステップと、前記第１の容器中の血液から血漿を分離するステップとを含む。第１の末端および第２の末端を有するカニューレを含む移動装置を使用して、第１の容器の血漿を、カルシウム凝固活性化因子を含む第２の容器へと移動させ、血漿とカルシウム凝固活性化因子とを接触させる。血漿およびカルシウム凝固活性化因子は、第２の容器中で凝固反応と遠心分離に同時にかけられて、固体フィブリン網を形成する。その固体フィブリン網は、生きている生物の体組織を再生させるのに適する。

別の態様では、本発明は、生きている生物の組織を再生させるのに適する固体フィブリン網を調製するためのもう１つのシステムを提供する。このシステムは、内腔部を有し、分離媒質を含む密閉された第１の収集装置を含む。第１の収集装置は、血液を内腔部に引き込むことができ、第１の収集装置に血液が入って、遠心分離にかけられると、分離媒質は赤血球から血漿を分離することができる。このシステムはさらに、チャンバーと、それと液体が行き来できる導管とを備えた貯蔵器を含む。チャンバーは、その中にカルシウム凝固活性化因子を含んでおり、導管は、周囲の条件下で活性化因子がチャンバーの外へ流出するのを防ぐために、少なくとも部分的にブロック用媒質で満たされている。

別の態様では、本発明は、生きている生物の組織を再生させることのできる固体フィブリン網のもう１つの調製方法を提供する。この方法は、患者の血液を、シールを備えた第１の収集装置に引き込むステップと、チャンバーと、チャンバーと液体が行き来できる導管とを含む貯蔵器を用意するステップとを含む。チャンバーは、少なくとも部分的にカルシウム凝固活性化因子で満たされており、導管は、この活性化因子が周囲の条件下でチャンバーの外に流出するのを防ぐために、少なくとも部分的にブロック用媒質で満たされている。ブロック用媒質が存在しない場合には、チャンバー、導管、および収集装置は液体が行き来できるように、貯蔵器が第１の収集装置に連結されている。次いで、第１の収集装置を第１の速度で遠心分離にかける。第１の速度は、血液から血漿を分離するのに十分であるが、それでも導管中のブロック用媒質を第１の収集装置に移動させる程でない。次いで、第１の収集装置を第２の速度で遠心分離にかける。第２の速度は、ブロック用媒質の少なくとも一部を導管から第１の収集装置へと移動させるのに十分であり、それによってカルシウム凝固活性化因子が第１の収集装置に流入し、血漿と接触できるようになり、それによって、生きている生物の組織を再生させるのに適する固体フィブリン網が形成される。

本出願は、１９９７年６月２４日出願のイタリア国出願第ＭＩ９７Ａ００１４９０号に対する優先権を主張している１９９８年６月２４日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＩＴ９８／００１７３号の米国特許法第３７１条の出願であり、この出願に対する優先権を主張している、米国特許第６，３６８，２９８号Ｂ１明細書として公開された２００１年７月１３日出願の米国特許出願第０９／４４６，７２９号明細書の一部継続出願であり、この出願に対する優先権を主張するものであり、これらのそれぞれは、参照により全体が本明細書に援用される。

したがって、本発明の目的は、外科手術で使用する際に、自己フィブリン糊を速やかに得ることを可能にし、ウイルス感染および／または拒絶症例をもたらさないすぐに使用できるキットを提供することである。

この目的は、ヒト起源でも動物起源でもなく、無機化合物であり、したがって汚染する可能性もなく、また拒絶をもたらさない凝固活性化因子を使用することによって達成される。

本発明による「すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）」キットは、凝固活性化因子として塩化カルシウムを含む密閉容器を含む。塩化カルシウムは、密閉容器に導入される際に、患者血漿中に存在するフィブリノーゲンを活性化する。

本発明によるシステムおよびキットは、ウイルス感染または拒絶症例の危険を伴わずに使用することのできる自己フィブリン糊の調製を可能にするという大きな利点をもつ。本発明によるキットのもう１つの利点は、患者の血漿から自己フィブリン糊を非常に短時間で調製することに加え、血餅もしくは膜またはスプレーの形態にして調製することも可能にする点である。本発明によるすぐに使用できるキットのさらに別の利点は、自己フィブリン糊を既知のシステムよりも比較的低いコストで得られるようにする点である。

本発明によるキットの更なる利点は、以下で述べるそのいくつかの実施形態の詳細な説明から、当業者に明らかとなろう。

本発明によるキットに適する容器としては、以下の実施例１で記載するように、抗生物質用のガラス製容器が含まれる。ガラスまたはプラスチック製の試験管が使用可能である。容器の好ましい容量は、５ｍｌから１５ｍｌである。試験管は、直径が１２ｍｍから１６ｍｍの範囲であり、高さが７５ｍｍから１００ｍｍの範囲であることが好ましい。容器は、排気されたときにその内側の空間と大気との圧力差によって生じる応力に耐えるために、適切な厚みを持たなければならない。底が半球形または円錐形の管は、厚さ０．７ｍｍであることが好ましく、平底管は厚さ１ｍｍであることが好ましい。プラスチック製容器は、製造後少なくとも１２カ月間確実に真空を保つために、透明なポリエステル樹脂製で、厚さ０．２〜０．８ｍｍであることが好ましい。調製後、プラスチック製試験管は、使用日まで完全な気密性を確実に保つために、ヒートシールされた内側ポリエチレン層を備えたスズ箔製真空気密容器に挿入することが好ましい。

容器または試験管を真空にすることを推奨するが、しかし、本発明を実施する上で必須ではないことを留意されたい。

容器または試験管は、ゴムまたはケイ素製の穴あけ可能なキャップによって密閉されており、容器の完璧な気密性を確実にし、また化学成分の導入後で、かつ蒸気もしくは放射線による滅菌ステップ前の真空施栓を可能にするのに適する。

密閉後、容器は、１２１℃の蒸気中で３０分間滅菌することができる。γ線または電子ビームを照射して滅菌を実施してもよい。

フィブリンの安定剤であるトラネキサム酸を使用することができるが、純粋で結晶性のεアミノカプロン酸も適している。用量は、２０ｍｌの血漿量に適する２５ｍｌ容器を使用するとき、約１ｇとなる。時にはフィブリンの安定剤を使用する必要がないこともある。

凝固活性化因子として、固体のＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏまたは液体のカルシウム含有溶液を本発明によるキットに使用するが、（以下で挙げる）他の凝固活性化因子を使用することもできる。たとえば、汚染性の外来成分が導入されるのを防ぐために、精密な薬量計（最大誤差：１〜２ｍｇ）を使用して、５ｍｌ容器に１１．７６ｍｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏを導入する。

血漿量１２ｍｌ用の１５ｍｌ容器の場合、導入すべき固体の脱水した塩化カルシウムの量は、３５．２８ｍｇ程度の高さとなり、トラネキサム酸の量は、それに比例して結晶３００ｍｇ程度の高さとなる。

血漿量２０ｍｌ用の２５ｍｌ容器の場合、導入すべき脱水した塩化カルシウムの量は、５８．８ｍｇ程度の高さとなり、トラネキサム酸の量は、それに比例して結晶５００ｍｇ程度の高さとなる。

塩化カルシウムは、実施例で使用した脱水した形態以外にも、市販されている他の適切なあらゆる形態、たとえばＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏでもよい。また、実施例１で記載するように、この塩の溶液を使用することもできる。

真空中で密閉可能な、透明な白色ガラス製の、不活性で厚さが１ｍｍの抗生物質用５ｍｌガラス容器に、フィブリンの安定剤として働くトラネキサム酸１００ｍｇを導入した。純度が９８％より高い合成トラネキサム酸が、米国の会社Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．によって市販されている。これとは別に、精密な天秤で同じ米国の会社Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．のＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（純度＞９９％）１４７．０ｇを秤量して、ＣａＣｌ_２の１Ｍ溶液を調製した。

この塩を、ちょうど１リットルの発熱性でない超高純度の蒸留水に、すばやく撹拌しながら室温で数分間かけて溶解させた。分注精密度が±５％である精密なピストン形分注装置（エッペンドルフ様）を使用して、活性化因子の溶液８０μＬをガラス製容器に導入した。この段階では、分注と同時に、０．２２μｍのＭｉｌｌｐｏｒｅ滅菌フィルターを使用して、あらゆる種類の粉体またはフィラメントによる起こり得る汚染を注意深く防ぎながら濾過を行った。最後に、後続の真空施栓、および場合によってはガスを使用する更なる滅菌が可能になるよう、容器に完全に栓をしないように注意しながら、真空中で、ガラス製容器に穴あけ可能かつ施栓可能なゴム製キャップで栓をした。次いで、大気中の固体粒子による起こり得る汚染を防ぎながら、真空施栓に適する装置に容器を導入した（無菌チャンバー中でのＵＬＰＡもしくはＨＥＰＡ濾過）。真空膜ポンプおよび微調整制御装置を使用して、装置の内部大気を４ｍｌ程度の高さの真空にした。内部大気の真空度を制御するために、精密な真空ゲージを使用した（精密度＃１ｍｂａｒ）。最後に、装置を解放せずに真空中で容器に栓をし、その後回収して、以下の実施例に記載するとおりに使用した。

臨床分析のための定性的な基準の規定に従って、たとえば、クエン酸ナトリウムの０．１０６Ｍ溶液を加えたＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）無菌試験管を使用して、患者から１０ｍｌの静脈血を採取した。この目的のために、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムもしくは二カリウムを加えた試験管を使用することもできる。採血の間、サンプルは注意深く無菌状態に保った。最後に、サンプルを穏やかに振盪して、成分を十分に混合して、クエン酸ナトリウムの抗凝固作用を確実なものにした。次いで、遠心機が損傷を受けないようにするため、ローターの重量を慎重に釣り合わせながら、その試験管を適切な遠心機に導入した。蓋にシールをして、サンプルを３５００ｒｐｍで１５分間の遠心分離にかけ、それによってクエン酸処理血漿（上清）から赤血球（より濃厚）を分離した。この場合では、血漿の収率は、主としてドナー血液の特性に応じて変わるが、５５％程であった。分離した血漿を含む試験管は、血漿そのものを回収するために、無菌条件下で栓をしたままにし、試験管立てに垂直に置いたが、この段階では、遠心分離の際に分離した２つの相が混ざるのを防ぐために、試験管を振らないように注意を払った。次いで、変性アルコールを使用して試験管キャップの外側部分を滅菌し、無菌シリンジに連結されている無菌針を試験管キャップに挿入した。針は、２つの相の境界メニスカスから３〜４ｍｍ離れたところまで挿入し、４ｍｌの血漿を引き込んだ。同じ針を使用して、実施例１に記載したように調製しておいた本発明による容器の、アルコールを使用して滅菌しておいたキャップに穴を開けた。針でキャップに穴を開けるとすぐに、シリンジに含まれているクエン酸処理血漿が容器に完全に引き込まれた。これを穏やかに振盪し、３７℃で２分間経過後、いつでも直ちに使用できる一塊の無菌自己フィブリン糊が得られた。

Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの５ｍｌクエン酸ナトリウムＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）試験管を使用して、４９才の健常な（ｎｏｒｍｏｔｙｐｅ）患者から約１８ｍｌの静脈血を採り、サンプル採取直後に穏やかに振盪するようにした。そのように採取した血液を直ちに遠心分離（２５００ｒｐｍで１５分間）にかけて、血漿を分離した。トラネキサム酸を使用しない以外は実施例１に記載のとおりに調製しておいた、１２０μＬのＣａＣｌ_２（１０ｇ／１００ｍｌ）をそれぞれ含む２本の１０ｍｌ容試験管に、血漿（１２ｍｌ）を慎重に移した。血漿と活性化因子を混合した後、試験管を３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離にかけ、最終的に２塊のフィブリンサンプルを得、それを、無菌に保つあらゆる予防措置を取りながら、調製してから２〜３時間以内に、衝撃を与えた左犬歯および右第二門歯を摘出することによって、並びに、門歯の中央部位に存在する嚢胞を切断することによって現れる大きな小胞性の下顎骨の空洞に挿入した。最後に歯肉の縁を８針で閉じた。１５日後のＸ線撮影検査では、フィブリンがまだその位置にあり、見たところ無傷であることが示された。７カ月後の組織像によって、フィブリンが骨組織に完全に入れ替わったことが実証され、同じ結果を得るのに１２カ月以上を要する従来の方法よりも術後経過が良好であった。自己フィブリンの調製に抗線維素溶解剤が使用されていなかったので、この場合では、前記添加剤が特定の目的に有用であったと言うことができる。

接着性のフィブリン糊を作製するために、実施例３のように得た血漿１２ｍｌを、無菌性を保つためのあらゆる処置を施しながら、実施例１に記載のとおりに準備した本発明による２０ｍｌ容器に移した。

慎重に撹拌した後、混ざった血漿を、化学実験室で使用されるような無菌のガラス製スライド上に注ぎ、そこで血漿を無菌かつ非常に純粋なサンゴ炭酸カルシウム（ＢＩＯＣＯＲＡＬ（商標）・ＮＯＴＥＢＳ Ｓ．Ａ．Ｆｒａｎｃｅ）、またはフッ化カルシウム（＞９８％ Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．）と混合した。これらのカルシウム塩は共に、線維芽細胞の刺激因子として当業者によく知られている。

血漿１部と炭酸カルシウム１部とを混合して（たとえば、２ｍｌと５００ｍｇ）、展性のある無菌の接着性ペーストを得、感染した粘液を含む嚢を切断した後の歯肉下の空間または別の空洞の充填剤として使用した。空の空間を埋めるように置かれたペーストは、止血栓として働く固体フィブリン網を数分間で形成し、粘液の縁を正しい位置で支える自己生物基板を生じ、その後結合に適した細胞の遊走が始まった。

フィブリン糊の膜を得るために、実施例３のように得た血漿２０ｍｌを、実施例１のように準備した本発明による２５ｍｌ容平底容器に入れた。通常どおりに慎重に撹拌した後、スイングアウトローターを用い、容器を４０分間にわたり４０００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。遠心分離操作が終了した時点で、白色になった試験管の底から、大きさが試験管の底と同じであり（直径２４ｍｍ）、厚さが３ｍｍの非常に緻密かつ引張り強さのある膜が回収された。この自己由来の膜は、緻密で丈夫であるために、多孔性の合成膜の代用品として、歯科手術および一般手術の保持および分離用の膜として使用した。得られた膜は、４℃で数日間、無菌状態で保蔵することができる。

大きなサイズのフィブリン糊の膜を得るために、約２００ｍｌのクエン酸処理血漿を患者から採血し、収集し、２袋式輸液バッグ内で分離した。−８０℃で１２時間凍結させ、４℃で一晩かけて解凍することによって、血漿を寒冷沈降反応にかけた（この手順は、当業者によく知られている）。その朝、この手順によって得た血漿を４℃で１５分間、５０００ｒｐｍでの遠心分離にかけて、約２０ｍｌの寒冷沈降物を得た。圧縮装置（たとえば、Ｊｏｕａｎ Ｓ．Ａ．Ｆｒａｎｃｅ社のＸＰ１００）を使用して上清を慎重に除去した後、寒冷沈降物を同じ患者の全血漿２０ｍｌと合わせた。実施例１のように適量の活性化因子を含む、本発明による直径３５ｍｍの無菌平底ポリプロピレン容器に、得られた４０ｍｌを入れた。慎重に振盪した後、容器を４０分間５０００ｒｐｍでの遠心分離にかけて、実施例５のようであるが、フィブリン含有量がより多いためにより緻密かつ引張り強さのある膜が得られた。前記の膜も、４℃で数日間、無菌形態で保蔵することができる。

実施例５に記載の方法によって得た膜は、実施例４に記載の利用法と合わせて、非常に深刻な火傷の症例において移植する移植片を得るために、同じ患者の真皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養基質として使用することができる。

上述の目的に有用な良質な膜は、本発明による容器に直接に移された分離された全血漿から得ることもできる。得られた膜は、上述のものよりも薄くなるが、それでも外科用途に、また細胞増殖用培養基質として有用である。

スプレー式フィブリンを得るために、実施例５のように寒冷沈降物から出発して、２０ｍｌの寒冷沈降物を１０ｍｌの全血漿と室温で合わせ、穏やかに振盪して、溶解を完了させた。得られた血漿を実施例１のように調製した本発明による５０ｍｌ容器に慎重に移し、穏やかに振盪して、成分を十分に混合した。室温で１２０秒経過後、試験管を当業者に知られているヴェンツーリ型無菌空気圧縮機に連結して、外科手術（肺、心臓、脾臓、動脈吻合）が施されている出血した臓器の表面に均等に分散させた。濃縮されたフィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムイオン、および他の凝固酵素を含有する濃縮血漿は、組織全体に分散し、防御性の止血機能を有するフィブリンフィルムを生じながら、患者の内皮に存在する組織凝固活性化酵素の力も借りて数秒以内に凝固した。したがって、外科手術は、内出血が低下した状態で終わったので、更なる輸血または合併症が回避された。

本発明は、生きている生物の組織を再生させることのできる固体フィブリン網または自己糊を生成するためのシステムおよび方法も提供する。これらの方法およびシステムでは、血液サンプルを遠心分離にかけて抗凝固血漿を得る。安定で高密度な自己フィブリンと血小板の網目を得るために、本明細書に記載の装置は、血漿がカルシウム凝固剤を含む第２の容器に移され、次いで直ちに遠心分離にかけられるようになっている。本明細書に記載の移動装置は、他の適用例で他の液体を移動させるのに使用してもよい。換言すれば、本明細書に記載の移動装置およびシステムによって、遠心分離と凝固が同時に行えるようになる。このようなシステムおよび方法を使用することによって、いくつかの利点が達成される。すなわち１）無菌性が維持される方式でサンプルが操作され、２）血漿の全体積が移されて、血餅の全収量が最大になり、３）抗凝固因子とカルシウム凝固剤の化学量論比が狭い範囲に保たれて、凝固時間が最小に抑えられ、４）移動がすばやく完了し、５）通常はこのような操作を行っていない医療従事者（たとえば、歯科医師）が、このような方法を容易に実施し、システムを操作し、６）再利用を防止し、血液がもたらす病原による汚染の可能性を防ぐため、装置は使い捨てである。

概して、本発明は、生きている生物の組織を再生させるのに使用できる固体フィブリン網または自己糊を調製するための統合されたシステムおよび方法を提供する。一実施形態（図１に示す）では、このシステムは、第１の容器１０、第２の容器１４、および移動装置１８を含む。好ましくは、第１の容器１０および第２の容器１４は、管、より好ましくは試験管であるが、流体または液体を保持し、遠心分離にかけることのできるどんな容器も、本発明の使用に適する。容器１０および１４は、ガラスまたはプラスチック製であることが好ましい。

第１の容器１０は、標準の静脈穿刺法を用いて、血液をそこに引き込むことができなければならない。第１の容器１０は、汚染を防止するために、血液が引き込まれる間シール２２で密閉されていることが好ましいが、容器１０をそのすぐ後に密閉してもよい。第１の容器１０を密閉するには、様々なシール２２、たとえば、ゴム栓、キャップ、発泡体、エラストマー、または他の複合材を使用することができる。シール２２は、貫通または穴開け可能にすべきであり、したがって、ゴムおよびケイ素樹脂がシールを作製する好ましい材料となるが、シールになり、かつ貫通可能などんな材料も使用できる。第１の容器１０は、抗凝固液２５を含んでいてよい。溶液の抗凝固剤２５は、カルシウム結合剤を含むことが好ましい。より詳細には、抗凝固剤２５は、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩および三カリウム塩、およびこれらの混合物を含んでよい。第１の容器１０は、クエン酸ナトリウムの溶液を含んでいることが好ましい。抗凝固剤２５は、第１の容器１０に集まった血液を薄くして、遠心分離の条件に合わせる傾向がある。さらに、第１の容器は、密度勾配分離媒質２６、空気２７、ならびに高粘性低密度流体２８を含む（以下でさらに述べるキットを示す図１０を参照のこと）。

濃度勾配分離媒質２６は、第１の容器１０中の異なる密度を有する特定の液体または流体の種々の画分を分離することができなければならない。分離媒質２６は、液体の不必要な高密度画分が遠心分離によって分離され、その後除去されるのを可能にする。たとえば、分離媒質２６は、血液サンプルが遠心分離される際、血小板に富む血漿３４から赤血球３０を分離することができる。ある例では、分離媒質２６は、第１の容器１０の底にあってよい。他の例では、分離媒質２６は、第１の容器１０の内側を取り巻く環として適用してもよく、または内側の他の適切などんな位置で適用してもよい。遠心分離の際に異なる密度の液体を分離することができれば、どんな密度勾配分離媒質２６も本発明での使用に適するが、媒質２６はゲル、より好ましくは揺変性のゲルであることが好ましい。図２は、血液サンプルの遠心分離を実施した後の第１の容器１０を図示し、ゲルの分離媒質２６も示す。揺変性ゲルは、ゲルが通常の周囲条件では第１の容器１０中で流動も移動もしないが、遠心分離中に受けるようなより強い遠心力では流動するような、十分な降伏点を有することが好ましい。最も好ましくは、不必要な赤血球画分３０の高い密度よりも低いが、所望の血漿画分３４の密度より高い密度を有するゲルが好ましい。換言すれば、最も好ましいものは、血液サンプルを遠心分離にかけた後、血漿３４から赤血球３０を分離することのできるゲルまたは他の媒質である。そのような媒質２６は、遠心分離中に容器内を移動または流動するが、その後は流動せず、それによって、遠心分離完了時には、分離された画分間に半永久的なバリアが生じる。

図３に示すように、第１の容器１０の中に用いることのできるもう１種の適切な密度勾配媒質２６は、画分の分離に所望される密度を有する多数のプラスチックビーズ２６である。このビーズは、後に移動装置３８に封をするのに必要な高粘性低密度流体に懸濁させてもよい。遠心分離の際、ビーズ２６は、２つの画分３０と３４間の界面に移動し、まさしく焼結のように圧縮されて、密度の異なる画分（すなわち、赤血球３０および血漿３４）間に安定なバリアを形成する。ペレットを覆う残りの高粘性低密度流体は、圧縮された層の安定性に寄与する。

他の適切な密度勾配分離媒質には、参照により本明細書に援用される、Ｃｏｌｅｍａｎの公開された特許文献３および特許文献４に開示されているものなどの高分子浮遊デバイスが含まれる。図４は、高分子浮遊デバイス２６を示す。

第１の容器中の低密度高粘性の不混和性流体２８（「ＬＤＨＶ流体」）は、一般に不活性な油を含む。ＬＤＨＶ流体は、ポリエステル、ケイ素樹脂、または他の不活性な流体であり、置換または圧力ポンプによってゲルの上側位置で、第１の容器に加えることが最も好ましい。ＬＤＨＶ流体は、以下でさらに述べるように、移動装置１８のカニューレ３８に侵入後、そこを通る流れを遮断または除去することができなければならない。

第２の容器１４（特に図１および図１０に示す）は、特定の反応に必要な化学試薬を含んでいる。第２の容器１４は、第１の容器１０と同様の要領でシール２４によって、すなわちゴム栓、キャップ、発泡体、エラストマー、または他の複合材によって密閉する。以下で述べるような本発明の一適用例では、第２の管は、カルシウム凝固活性化因子３６を含んでいてよい。適切なカルシウム凝固活性化因子の例には、それだけに限らずに、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、およびこれらの混合物が含まれるが、しかし、カルシウムを含有するどんな塩もカルシウム凝固活性化因子として十分である。さらに、他の活性化因子として、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、および水溶性であり、かつ人命に適合性のある他の有機カルシウム塩が挙げられる。凝固活性化因子は、血漿との接触時に血漿を凝固させる。第２の容器１４は、完全に真空にして、内圧を実質的に０とした。第２の容器１４を真空にすると、移動装置１８を通した第１の容器１０から第２の容器１４への流体の移動が促進される。移動の間第２の容器１４が満たされるとき、気体分子は存在しないので、結果として生じる圧力の増大によって残留気体が圧縮されることはない。その結果、流速が最大になり、完全な移動が助長され、ガス抜きの必要が省かれて無菌性が保たれ、さらに所望の反応に所望される化学量論比が維持される。

もう１つの実施形態では、第２の容器は、抗生物質、鎮痛剤、癌治療剤、血小板増殖因子、および骨形態形成タンパク質のうちの１種または複数を含んでいてもよい。局所投与することのできる他の治療薬剤が含まれていてもよい。抗生物質の例には、アンピシリン、エリスロマイシン、およびトブラマイシンが含まれるがこれに限らない。鎮痛剤には、アスピリンおよびコデインが含まれるがこれに限らない。癌治療剤には、５−フルオロウラシルが含まれるがこれに限らない。

移動装置１８は、たとえば図１に示すように２部分を含んでいてもよく、あるいは、たとえば図１７〜１８に示すように一体型でもよい。一体型単一成形型の移動装置１８が好ましい。図５〜６および図１７〜１８に最もよく示すように、移動装置１８は、第１の開口部４６を有する第１の末端４２および第２の開口部５４を有する第２の末端５０を備えたカニューレ３８を含む。カニューレ３８の末端４２および５０は、第１の容器１０および第２の容器１４のシール２２または２４に穴を開け、またはそれを貫通できるように、鋭利であるか、または尖っている（またはそこに斜めの面さえもつ）。カニューレ３８は、容器を操作する際に誤って指を刺すのを防ぐために、ハウジング５８内で凹所に隠すか、同軸に取り付ける。ハウジング５８は、カニューレ３８に沿って中央かつ軸方向に配向された、円筒形の２本の対向したガイド６２および６４を有する。ガイド６２および６４は、第１の容器１０および第２の容器１４を移動装置１８の第１の末端４２および第２の末端５０へと誘導する働きをする。図５および図６は、容器１０および１４を第１の末端４２および第２の末端５０に誘導しているガイド６２および６４を示す。

カニューレ３８の末端４２および５０は、気密シールをなしている安全弁、さや、またはエラストマースリーブ６８および７２によって包囲され、または覆われていてよい。安全さや６８および７２は、第１の開口部４６および第２の開口部５４も覆っている。第１の末端４２および第２の末端５０がエラストマースリーブ６８および７２に穴を開けるとき、スリーブ６８および７２はそれに応じて縮む。図５は、第１の容器１０のシール２２に穴を開け始めている第１の末端４２、およびそれに応じて縮んでいるスリーブ６８を示しているが、スリーブ７２は第２の末端５０をまだ完全に覆っている。末端４２および５０は、シール２２および２４に完全に穴を開けるのに大いに足りる長さであるが、容器１０および１４の方へあまり先には及ばない（図６に示すとおり）。これによって、逆さにした第１の容器１０の液体体積の最大限の体積を第２の容器１４へと移動させることができるようになる。図６はまた、第１の容器１０および第２の容器１４のシール２２および２４に完全に穴を開けた第１の末端４２および第２の末端５０、ならびに完全に縮んでいるスリーブ６８および７２を示す。エラストマースリーブ６８および７２は、穴が開いていないとき、気体または液体の流れを妨げる。スリーブ６８および７２に適する材料には、ゴムの類および熱可塑性エラストマーが含まれるがこれに限らない。

ここで、第１の実施形態の操作に移るが、標準の静脈穿刺法を使用して、第１の容器１０に血液を採取したなら、血液は、その中の抗凝固剤２５による抗凝固作用を受ける。通常、第１の容器１０は、密閉された状態で血液が採取されるが、しかし、その後に密閉してもよい。第１の容器１０を密閉すると、その中身の汚染が防止される。その後、第１の容器およびその中身１０（すなわち、血液、抗凝固剤２５、分離媒質２６、およびＬＤＨＶ流体２８）を遠心分離にかける。許容される遠心分離は、９００から３，５００×Ｇの範囲の重力加速度で５から１５分間実施することができる。好ましい実施形態では、第１の容器を、約１，０００×Ｇの重力加速度で約１０分間の遠心分離にかける。この最初の遠心分離によって、第１の容器の中身または画分が分離されて、たとえば図２に示すように複数の層になる。各層は、大気と等しい圧力で、（遠心分離後の第１の容器１０の底から該容器の上部へと順に）赤血球層３０、分離媒質２６、血小板に富む血漿層３４、ＬＤＨＶ流体層２８、および最後に残留気体２７の体積を含む。これらの層の比率は、適用例毎に様々でよく、ここでは例示する目的のためだけの比率で示してある。遠心分離の後、密閉された第１の保持器１０を逆さにしてから、移動装置１８を使用してシール２２に穴を開ける。言い換えれば、図７に示すとおり、密閉された開口部が最も低い垂直位になるように第１の容器１０を逆さにする。第１の容器を逆さにすると、層が配置される順序が変わる。シール２２の上は、底から上部へと順に以下の層、すなわち、血小板に富む血漿３４、不混和性の高粘性低密度流体２８、残りの気体２７、分離媒質２６、および赤血球３０の層となる。

次に、図８に最もよく示すように、その密閉された開口部２４を最上位にして、第２の容器１４を垂直位に置く。これによって、第２の容器１４が、第１の保持器の中身をその中に移すのに適する場所に配置される。図８は、移動に適した位置にある第２の容器１４の上方にある移動装置１８上に逆さに位置する遠心分離済み第１の容器１０を図示する。次いで、移動装置のガイド６４が上に置かれ、第２の容器１４をその中に誘導し、その間に、逆さになった第１の容器１０が他方のガイド６２へとかけられる（またはこの逆）。つまり、カニューレ３８の末端４２および５０のどちらかを使用して、シール２２および２４のどちらかに穴を開けることができる。移動装置１８は、各々の末端について対称であるので、使用者には、ある程度のフールプルーフが働く。次いで、使用者は、容器を同時に押し込んで、両方のシール２２および２４に、それぞれカニューレの各末端４２および５０で穴を開ける。末端４２および５０を覆っている２個の弁スリーブ６８および７２によって、フールプルーフの働きがさらに強化される。第一に、第１の末端４２で第１のシール２２に穴を開けると（ここでも、どちらかのシールに穴を開けるのにどちらの末端も使用できる）、他方の末端５０を覆っている穴の開いていないスリーブ７２が流体を含むことになり、それによって流体のこぼれが防止される。一方、他方の末端５０で他方のシール２４（およびそれに応じてスリーブ７２）に最初に穴を開けると、第１の末端４２を覆うスリーブ６８によって真空が維持される。

図６および９に示すように、末端４２および５０によって両方のスリーブ６８および７２と、シール２２および２４に穴が開けられると、圧力差によって、所望の流体が第１の容器１０から第２の容器１４へと移動する。つまり、第２の容器１４内の圧力は０になっているので、第１の容器１０の中身（より詳細には、血漿３４）が第２の容器１４に流入する。もともとは大気圧である第１の容器１０の圧力は、液面の高さが低下して、気体の体積が膨張するにつれて低下する。しかし、圧力はどの時点でも０に等しくない。第２の容器１４は、０に等しい圧力まで完全に排気されているので、その中の圧力は、圧縮される気体が存在しないために、管が満たされるにつれて増大することはない。したがって、装置１８は、一方の管から別の管へと広範な液体および溶液を移動させるのに使用することができ、血液の移動だけに限定されないと解釈すべきである。

第１の容器１０では各層が連続した特定の配置をとっているために、血小板に富む血漿３４が容易に移動する。さらに、第１の容器１０も真空レベルにあるので、第１の容器は、採血後に部分的にしか満たされない。これによって、移動する間「頭部の空間」中の気体は０を大きく上回ったままとなり、その際その体積が膨張し、それによって第２の容器１４への急速かつ完全な移動が可能になる。これは、理想気体の法則およびポアズイユ−ハーゲンの式によって決まる。

第１の容器の中身または断片（すなわち、血小板に富んだ血漿）の移動は、ＬＤＨＶ流体２８がカニューレ３８に侵入するまで続く。ＬＤＨＶ流体の高い粘性のためにカニューレ３８の狭い管腔が塞がり、それによって流れが停止することになる。このことは、移動装置１８の再利用を妨げるが、これは、汚染された血液移動装置を取り外そうとする際に特に重要であり、以前に別の患者に使用し、または別の患者が使用したことによって、誤って血液由来の病原で汚染されることも防ぐ。

血漿画分３４が第２の容器１４へと移動し終わり、それによって収率が最大になり、試薬が適切な化学量論比に保たれる。次いで、血漿３４が第２の容器１４中で凝固活性化因子３６と接触し、それによって混合物６０が生じ、これを直ちに遠心分離にかけて、固体フィブリン網を生成することができる。第１の容器１０と第２の容器１４の圧力差は、移動する間じゅう実質的に維持され、急速な移動が可能になる。移動装置１８は、管がかみ合っても影響を受けず、このシステムを実質的にフールプルーフにする。最後に、移動がガス抜きなしで行われるので、サンプルが無菌かつ汚染されずに保たれる。

全体として、移動装置１８は、血漿３４とカルシウム凝固活性化因子３６を接触させ、その後直ちに、血漿の凝固および遠心分離を同時に実施して固体フィブリン網を生成する、迅速かつ効率的な方法を提供する。固体フィブリン網は、生きている生物の体組織を再生させるのに適する。このような方法では、血漿をカルシウム凝固活性化因子３６と接触させる前に、水を除去して血漿を最初に予備濃縮する必要性が低まる。さらに、移動装置１８は、様々な種類の適用例で血液または他の流体の移動に使用できる。

本発明は、図１０に示すようなすぐに使用できるキットも提供する。このキットは、第１の容器１０、第２の容器１４、および移動装置１８を含む。キットの一実施形態では、キットは、パッケージの外側へ持ち上げる２枚のトレー７０および７４を備えていてよい。第１のトレー７０は、ステップ１に必要な構成材料をすべて備えており、第２のトレー７４は、ステップ２に必要な構成材料をすべて備えている。当然、部品は、様々な様相で配置することができる。

ステップ１は、血液を第１の容器１０に収集した後、遠心分離にかけて、血小板に富む血漿を得るステップを含む。第１のトレー７０の構成材料は、静脈穿刺部位を清潔にするためのアルコール綿棒７８、多端子のサンプル血液収集針８２（２１ゲージ×１″）、安全保持器８６；抗凝固剤（たとえばクエン酸塩）、ゲル、ＬＤＨＶ流体を含む第１の容器１０、および静脈穿刺部位を覆うための帯具９０を含む。静脈穿刺部位を無菌アルコール綿棒７８で清潔にする。針カートリッジ８４を開け、安全保持器８６にねじ込む。次いで、針８２を患者の静脈に挿入し、容器１０を保持器８６に連結する。次いで、血液が容器を満たしたら、針８２を抜き、保持器８６に引っ込める。保持器の末端を、ヒンジ式フラップで閉じる。静脈を帯具９０で塞ぐ。容器１０を約１０００×Ｇで約１０分間の遠心分離にかけ、赤血球から血漿を分離する。

第２のトレーの構成材料は、ステップ２に使用する構成材料であり、ＡＦＴｕｂｅ（自己フィブリン管）もしくは第２の容器１４と移動装置１８とを含む。ステップ２は、第１の容器１０を逆さにした体勢で移動装置１８に入れるステップを含む。第２の容器１４は凝固剤を含んでおり、移動装置の他方の末端によって穴が開けられる。容器１０および１４をつなぐと、血小板に富む血漿が第１の容器１０から第２の容器１４へと流れる。次いで、第２の容器を直ちに２３００×Ｇで約３０分間の遠心分離にかけて、血小板を含む高密度なフィブリン、または固体フィブリン網を得る。

本発明の第２の実施形態では、図１１〜１４に示すような、固体フィブリン網を調製するためのもう１つの一体型のシステムを提供する。このシステムは、第１の実施形態の第１の容器１０と非常に類似した第１の収集装置１０を含む。収集装置１０は、（上述のような）密度勾配細胞分離媒質２６と抗凝固剤（図示せず）、ならびに第１の収集装置１０に連結し、またはそれと合体させることのできる貯蔵器９４を含んでいてよい。本発明の第１の実施形態、より詳細には分離媒質２６に関係する上記の議論は、本発明の第２の実施形態に当てはまる。つまり、同じ材料を分離媒質２６に使用することができ、同じ材料が好ましい。たとえば、分離媒質２６は、その降伏点によって、もともとの周囲条件でのゲルの流動が妨げられるが、遠心分離中に受けるより強い遠心力ではゲルが流動できるようになる揺変性のゲルを含むことが最も好ましい。分離媒質２６は、図１１に示すように第１の収集装置の底（すなわち、開口部と反対の末端）に配置されていてよい。あるいは、分離媒質は、第１の収集装置の内側を取り巻く環を形成していてもよい。第１の収集装置１０は、第１の収集装置が高密度低粘性流体を含んではいけない点を除き、上述の第１の容器１０と本質的に同じである。第１の収集装置１０は、（上述のように）ゴム栓やキャップなどのシール２２を備えていることが好ましい。

貯蔵器９４は、チャンバー９６と、それと流体が行き来できるカニューレ１００とを含む。チャンバー９６は、液体試薬１０４、最も好ましくはカルシウム凝固活性化因子を含んでいる。カルシウム凝固活性化因子は、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、またはこれらの混合物であることが好ましい。カニューレ９６は、第１の収集装置１０のシール２２に穴を開けることができなければならない。好ましい実施形態では、カニューレは、周囲条件下でチャンバー９６中の試薬１０４がカニューレ１００の外へ流出するのを防ぐ降伏点ゲルなどのブロック用媒質１０８を含んでいる。他の適切なブロック用媒質には、バネに載った球（ｂａｌｌｓ ｏｎ ｓｐｒｉｎｇ）、弁、バネを積んだ弁（ｓｐｒｉｎｇ−ｌｏａｄｅｄ ｖａｌｖｅｓ）、貫通可能な膜、アンプル（すなわち、流体または粉体を満たした中空膜）などの、力によって作動する機械系が含まれるがこれに限らない。ゲル１０８の降伏点は、特に強い重力加速度で遠心分離にかけると、チャンバー９６と第１の収集装置１０がかみ合うときに、ゲル１０８が移動して２者間を行き来できるようになるものである。貯蔵器９４は、貯蔵器を収集装置１０へと誘導するのに使用されるガイドハウジング１１０を備えていてもよい。カニューレ１００は、カニューレ１００の無菌性を保つために、エラストマースリーブ１１２によって包囲され、または覆われていてよい。スリーブ１１２については、第１の実施形態に関して上述してある。

もう１つの実施形態では、チャンバー９６は、抗生物質、鎮痛剤、癌治療剤、血小板増殖因子、および骨形態形成タンパク質のうちの１種または複数を含んでいてもよい。局所投与することのできる他の治療薬剤が含まれていてもよい。抗生物質の例には、アンピシリン、エリスロマイシン、およびトブラマイシンが含まれるがこれに限らない。鎮痛剤には、アスピリンおよびコデインが含まれるがこれに限らない。癌治療剤には、５−フルオロウラシルが含まれるがこれに限らない。

実施に際しては、上述のように従来の静脈穿刺法によって、患者の血液１１６を第１の収集装置１０に収集する。遠心分離の前に、第１の収集装置１０中の抗凝固因子によって血液が薄まる。その次に、図１３および１４に示すように、貯蔵器９４のカニューレ１００を第１の収集装置１０のシール２２に貫通させることによって、貯蔵器９４を第１の収集装置１０に結合させる。スリーブ１１２は、カニューレ１００がシール２２を貫通するときに縮む。カニューレ１００の長さは、シール２２に穴を開けるのに足りているが、カニューレは、それができるとしても、収集装置１０の方へあまり先には及ばないことが好ましい。

次いで、収集装置１０および貯蔵器９４を遠心分離にかける。管に働く遠心力は、式Ｆ＝ωｍｒ^２（式中、Ｆ＝力、ｍ＝システムの質量、ｒ＝ローターの中心からの半径、ω＝角回転速度である）で表される。貯蔵器では、第１の管のゲルよりもｒが小さくなるので、貯蔵器のカニューレ中のゲルは、生じるずれ応力が不十分であるために移動することができない。第１の管１０は、図１３に示すように細胞が分離され、ゲル２６が細胞／血漿の界面に移動するまで、弱い重力加速度で回転させられる。言い換えれば、第１の実施形態と同様に、分離媒質２６が、約１０００×Ｇで約１０分間の最初の遠心分離にかけられた後、血小板に富む血漿３４から赤血球３０を分離する。約９００〜１５００×Ｇの遠心力で約５分から１５分間の遠心分離も、最初の遠心分離向けに許容される。

その後、遠心速度を増大させ、図１４に示すように、カニューレ１００中のブロック用媒質１０８が第１の収集装置１０に移り、液体試薬１０８（たとえば、カルシウム凝固活性化因子）が貯蔵器から残らず出る強さの重力加速度を貯蔵器にかける。その後、中身を約２３００〜６０００×Ｇで約１５〜４０分間の遠心分離にかけることができる。カルシウム凝固活性化因子が第１の収集装置中の血漿と接触すると、サンプルはまだ遠心分離にかけられているので、凝固と遠心分離が即座にかつ同時に行われる。これによって、組織の再生に適する固体フィブリン網が形成されることになる。第１の管の細胞を分離し、その後液体凝固剤を正しい化学量論比で加える操作は、移しかえせずに１本の管で行う。遠心分離の速度および期間をプログラミングすることによって、本発明は、簡単かつフールプルーフな方法を提供する。

代替実施形態では、図１５〜１６に示すように、単一の収集装置１０が内部区画１１９および貯蔵器９４を備えている。貯蔵器９４は、第１の収集装置１０と一体化し、またはそれに連結されており、内部区画と液体が行き来できるようになっている。管、導管、または開口部１２０は、区画１１９と貯蔵器９４間に流体の行き来をもたらすものであり、ブロック用媒質１０８で封じられている。ここでも、ブロック用媒質１０８は、上述のように、特に強い重力加速度に曝されたときに活性化され、移動させる降伏点を有し、貯蔵器９４と第１の収集装置１０間の行き来を可能にする。ゲルまたは媒質の降伏点は、血漿から血液細胞を分離する最初の遠心分離の間にはゲルが移動しないものである。第３実施形態では、この装置の各末端は開口部を有し、また各末端は、ゴム栓、キャップ、発泡体、エラストマー、または他の複合材など、取外し可能または取外し不可能なシール２２または１２２によって密閉されている。栓１２２を備えた貯蔵器９４は、収集装置のシール２２および開口部の反対側の末端に位置する。

もう１つの実施形態では、貯蔵器９４は、抗生物質、鎮痛剤、癌治療剤、血小板増殖因子、および骨形態形成タンパク質のうちの１種または複数を含んでいてもよい。局所投与することのできる他の治療薬剤が含まれていてもよい。抗生物質の例には、アンピシリン、エリスロマイシン、およびトブラマイシンが含まれるがこれに限らない。鎮痛剤には、アスピリンおよびコデインが含まれるがこれに限らない。癌治療剤には、５−フルオロウラシルが含まれるがこれに限らない。

別の実施形態は、第２の実施形態について上で述べたのと同じようにして使用される。すなわち１）赤血球から血漿を分離するのに十分な力を第１の力とし、２）貯蔵器と装置内部の間にある管、導管、または開口部１２０中のブロック用媒質１０８を本体に移動させるのに十分な力を第２の力とする２種の異なる遠心力によって遠心機を制御する。結果として、カルシウム凝固活性化因子が装置の内側に侵入できるようになる。これによって、血漿の遠心分離と凝固が同時に実施できるようになり、第２のより強い重力加速度で遠心分離が続行されているときに固体フィブリン網が生成する。シール１２２は、固体フィブリン網または自己糊を得るために取り外すことができる。好ましい実施形態では、シール１２２は、図１６に示すように、差し込まれており、ひねって装置１０から外すことができる。

本発明の第１の実施形態の透視図である。 図１に示した第１の実施形態の第１の容器の横断面図である。 図２の第１の容器の異なる実施形態の横断面図である。 図２の第１の容器の異なる実施形態の横断面図である。 密閉された第１の容器に穴を開けかかっている移動装置の第１の末端を示す、図１の第１の実施形態の一部の拡大部分横断面図である。 密閉された第１の容器に完全に穴を開けている移動装置の第１の末端および密閉された第２の第１の容器に完全に穴を開けている移動装置の第２の末端を示す、図５に示したものと同様の図である。 逆さにした第１の管およびその中身を示す図２と同様の図である。 図１に示した第１の実施形態の平面図である。 かみ合った第１の容器、第２の容器、および移動装置、ならびに第２の容器に移される第１の容器の中身を示す、図８の部分横断面図である。 本発明の実施形態であるキットの平面図である。 本発明の第２の実施形態の透視図である。 図１１に示した本発明の第２の実施形態の横断面図である。 第１の収集装置に穴を開けている貯蔵器および第１の収集装置を示す、図１２と同様の横断面図である。 第１の収集装置に穴を開け、中身を第１の収集装置に空けている貯蔵器を示す、図１２と同様の横断面図である。 本発明の第３実施形態の透視図である。 図１５に示した本発明の第３実施形態の横断面図である。 本発明の実施形態である移動装置の透視図である。 図１７の線１８−−１８に沿って切った横断面図である。

Claims (41)

1. 生きている生物の組織を再生させるのに適する自己固体フィブリン網を調製するためのシステムであって、
   分離媒質および低密度高粘性液体を含有する密閉された第１の容器であって、前記分離媒質は、前記容器が血液を含み、遠心分離にかけられたときに、血漿から赤血球を分離することができ、前記第１の容器は第１の圧力を有する第１の容器と、
   カルシウム凝固活性化因子を含有する密閉された第２の容器であって、前記第２の容器が前記第１の圧力よりも小さい第２の圧力を有する第２の容器と、
   第１の末端および第２の末端を有するカニューレを含む移動装置であって、前記第１および第２の末端は、前記の密閉された第１の容器および第２の容器に穴を開けて、前記第１の容器と第２の容器との間に流体の行き来をもたらすことができ、前記第１の容器の低密度高粘性液体は、前記カニューレに侵入して、そこを通る流れを遮断することができる移動装置と
   を含むことを特徴とするシステム。
2. 前記分離媒質が、ゲル、ビーズ、および浮遊デバイスのうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
3. 前記第２の容器が排気されることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
4. 前記カルシウム凝固活性化因子が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、およびこれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
5. 前記第１の容器が抗凝固剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
6. 前記第１および第２の末端がそれぞれ、エラストマースリーブによって覆われており、前記エラストマースリーブが、前記第１または第２の末端が前記第１または第２の密閉された容器に穴を開けるときに縮むことができることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
7. 生きている生物の組織を再生させることのできる自己固体フィブリン網を調製するためのシステムであって、前記システムが、
   第１の圧力を有する密閉された第１の容器であって、前記第１の容器は血液をその中に引き込むことのできる第１の容器と、
   第２の圧力を有する密閉された第２の容器であって、前記第２の容器はカルシウム凝固活性化因子を含有しており、前記第２の圧力は前記第１の圧力よりも小さい第２の容器と、
   第１の末端および第２の末端を有するカニューレを含む移動装置であって、前記第１および第２の末端は、前記密閉容器に穴を開けることができ、前記移動装置は、圧力の差によって、前記第１の容器に引き込まれた血液の一部を前記第２の容器に移動させることのできる移動装置と、
   前記移動装置を介して前記第１の容器から前記第２の容器に移され、前記カルシウム凝固活性化因子と接触された血液の部分を遠心分離と凝固を同時に行って、生きている生物の組織を再生させることのできる固体フィブリン網を生成するための遠心機と
   を含むことを特徴とするシステム。
8. 前記移動装置が、前記第１の末端を覆う第１のスリーブと、前記第２の末端を覆う第２のスリーブとをさらに含むことを特徴とする請求項７に記載のシステム。
9. 前記カルシウム凝固活性化因子が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、およびこれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項７に記載のシステム。
10. 前記第１の容器が、分離媒質、高粘性低密度流体、および抗凝固剤を含有することを特徴とする請求項７に記載のシステム。
11. 前記分離媒質が、ゲル、ビーズ、および浮遊物のうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
12. 前記移動装置がハウジングをさらに含み、前記ハウジングは、使用者の指に刺さるのを防ぐために、前記カニューレの長さよりも先に伸びていることを特徴とする請求項７に記載のシステム。
13. 生きている生物の体組織を再生させるのに適する固体フィブリン網を調製するための方法であって、前記方法が、
    患者からの血液を第１の容器に引き込むステップと、
    第１の容器中の前記血液から血漿を分離するステップと、
    第１の末端および第２の末端を有するカニューレを含む移動装置を使用して、前記第１の容器からカルシウム凝固活性化因子を含んでいる第２の容器へ血漿を移動させて、前記血漿と前記カルシウム凝固活性化因子とを接触させるステップと、
    前記第２の容器中で前記血漿およびカルシウム凝固活性化因子の凝固と遠心分離を同時に行って、その中に固体フィブリン網を形成させるステップであり、前記固体フィブリン網が生きている生物の体組織を再生させるのに適しているステップと
    を含むことを特徴とする方法。
14. 前記第１および第２の容器がその中身の汚染を防ぐために密閉されており、前記第１の容器が第１の圧力を有し、前記第２の容器が前記第１の圧力よりも低い第２の圧力を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１の容器から前記第２の容器へ血漿を移動するステップが、特に順序を定めずに、前記の密閉された第１の容器に前記カニューレの末端を貫通させ、前記の密閉された第２の容器に他方の末端を貫通させることによって実施され、それによって血漿が前記第１の容器から前記第２の容器に流出できるようにすることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記第１の容器中の血液から血漿を分離するステップが、分離媒質、粘性の液体、および抗凝固剤を含む前記第１の容器を用意するステップと、前記第１の容器およびその中身を遠心分離にかけるステップとを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
17. 前記第１の容器を遠心分離にかけることが、その中に遠心分離された中身を形成し、前記の遠心分離された中身が、前記第１の容器の底からその容器の上部へと順に以下の層、すなわち、血液、分離媒質、血漿、粘性の液体、空気、およびシールを形成していることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記移動装置をその中に挿入する前に、第１の容器を逆さにして、前記第１の容器中の遠心分離された中身が、逆さの容器中で、順に以下の層、すなわち、前記シール、血漿、粘性の液体、空気、分離媒質、および血液を形成するようにするステップをさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. カニューレの一方の末端が、特に順序を定めずに、逆さになった前記の密閉された第１の容器に挿入され、他方の末端が前記の密閉された第２の容器に挿入されて、前記血漿を、カニューレを通して前記第１の容器から移動させること、ならびに移動中に前記の粘性液体が前記カニューレに侵入して、前記の粘性液体が、前記第１および第２の容器間の行き来を遮断することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 生きている生物の組織を再生させるのに適する固体フィブリン網を調製するためのシステムであって、前記システムが、
    内腔部を有し、分離媒質を含有する密閉された第１の収集装置であって、前記第１の収集装置は前記内腔部に血液を引き込むことができ、前記分離媒質は、前記第１の収集装置が血液を含有し、遠心分離にかけられると、赤血球から血漿を分離することができる収集装置と、
    チャンバーと、それと液体が行き来する導管を有する貯蔵器であって、前記チャンバーは、その中にカルシウム凝固活性化因子を含み、前記導管は、少なくとも部分的にブロック用媒質で満たされて、前記活性化因子が周囲条件下で前記チャンバーの外へ流出しないようになっている貯蔵器と
    を含むことを特徴とするシステム。
21. 前記導管がカニューレであり、前記カニューレが、前記の密閉された第１の収集装置に穴を開けることのできる末端を有することを特徴とする請求項２０に記載のシステム。
22. 前記末端は、この末端が前記の密閉された第１の容器に穴を開けるときに縮むことのできるエラストマースリーブによって覆われていることを特徴とする請求項２１に記載のシステム。
23. 前記ブロック用媒質が、前記システムが約９００から約１５００×Ｇで遠心分離にかけられたときには移動しないが、前記貯蔵器のカニューレが前記貯蔵器のシールを貫通し、前記システムが約２３００から約６０００×Ｇでの遠心分離にかけられたときには前記第１の収集装置へ移動する降伏点を有することを特徴とする請求項２０に記載のシステム。
24. 前記カルシウム凝固活性化因子が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、およびこれらの混合物の少なくとも１種であることを特徴とする請求項２０に記載のシステム。
25. 前記収集装置および前記貯蔵器が一体化しており、前記導管が、唯一前記収集装置内部と前記貯蔵器間の流体の行き来をもたらすことを特徴とする請求項２０に記載のシステム。
26. 生きている生物の組織を再生させることのできる固体フィブリン網の調製方法であって、前記方法が、
    患者からの血液を、シールを有する第１の収集装置に引き込むステップと、
    チャンバーと、このチャンバーと液体の行き来する導管を含む貯蔵器であって、前記チャンバーが少なくとも部分的にカルシウム凝固活性化因子で満たされており、前記活性化因子が周囲条件下で前記チャンバーの外へ流出するのを防ぐために、前記導管が少なくとも部分的にブロック用媒質で満たされている貯蔵器を用意するステップと、
    前記チャンバー、導管、および収集装置が、ブロック用媒質が存在しない場合に液体が行き来するように、前記貯蔵器を前記第１の収集装置に連結するステップと、
    第１の速度で、前記第１の収集装置を遠心分離にかけるステップであって、前記大地の速度が血液から血漿を分離するには十分であるが、それでも前記導管中の前記ブロック用媒質を前記第１の収集装置に移動するには不十分であるステップと、
    第２の速度で前記第１の収集装置を遠心分離にかけるステップであって、前記第２の速度が、前記ブロック用媒質の少なくとも一部を前記導管から前記第１の収集装置に移動させるのに十分であり、それによって前記カルシウム凝固活性化因子が前記収集装置に流入し、前記血漿に接触するのを可能にするステップと、
    前記の第２の速度で前記装置を遠心分離にかけ続け、それによって生きている生物の組織を再生させるのに適する固体フィブリン網を生成するステップと
    を含む方法。
27. 前記第１の収集装置を第２の速度で遠心分離にかけるステップが、前記血漿および活性化因子の遠心分離と凝固とを同時に行ない、前記フィブリン網を形成するのに十分な時間実施されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. 前記カルシウム凝固活性化因子が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、およびこれらの混合物の少なくとも１種であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
29. 前記導管が、鋭利な末端を有するカニューレであることと、前記貯蔵器を前記第１の収集装置へ連結するステップが、前記カニューレの前記末端で前記シールに穴を開けることによって実現されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
30. 前記カニューレの前記末端が、前記末端が前記シールに穴を開けるときに縮むことのできるエラストマースリーブによって覆われていることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
31. 前記第２の容器が、抗生物質、鎮痛剤、癌治療剤、血小板増殖因子、および骨形態形成タンパク質のうちの１種または複数を含んでいることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
32. 前記第２の容器が、抗生物質、鎮痛剤、癌治療剤、血小板増殖因子、および骨形態形成タンパク質のうちの１種または複数を含んでいることを特徴とする請求項７に記載のシステム。
33. 前記チャンバーが、抗生物質、鎮痛剤、癌治療剤、血小板増殖因子、および骨形態形成タンパク質のうちの１種または複数を含んでいることを特徴とする請求項２０に記載のシステム。
34. 前記チャンバーが、抗生物質、鎮痛剤、癌治療剤、血小板増殖因子、および骨形態形成タンパク質のうちの１種または複数を含んでいることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
35. 血漿から赤血球を分離するためのシステムであって、前記システムが、
    分離媒質および低密度高粘性液体を含有する密閉された第１の容器であって、前記分離媒質は前記容器が血液を含有し、遠心分離にかけられたときに、血漿から赤血球を分離することができ、前記第１の容器は第１の圧力を有する第１の容器と、
    前記の第１の圧力よりも小さい第２の圧力を有する密閉された第２の容器と、
    第１および第２の末端を有するカニューレであって、前記第１および第２の末端は、前記の密閉された第１および第２の容器に穴を開けて、前記第１および第２の容器との間に流体の行き来をもたらすことができるカニューレを含む移動装置であり、前記第１の容器の高粘性液体が、前記カニューレの前記第１および第２の末端が前記の密閉された第１の容器および第２の容器に穴を開けるときに、前記カニューレの中に侵入してそれを詰まらせ、それによってそこを通る流れを妨げることができることを含むことを特徴とするシステム。
36. 前記第２の容器がカルシウム凝固活性化因子を含んでいることを特徴とする請求項３５に記載のシステム。
37. 前記カルシウム凝固活性化因子が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、およびこれらの混合物の少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項３５に記載のシステム。
38. 前記の第１および第２の末端がそれぞれ、エラストマースリーブで覆われており、前記エラストマースリーブが、前記の第１または第２の末端が前記の密閉された第１または第２の容器に穴を開けるときに縮むことができることを特徴とする請求項３５に記載のシステム。
39. 血漿から赤血球を分離する方法であって、前記方法が、
    第１の圧力を有する密閉された第１の容器であって、前記第１の容器が分離媒質および高粘性液体を含有する第１の容器を用意するステップと、
    前記第２の圧力よりも小さい第２の圧力を有する密閉された第２の容器を用意するステップと、
    第１および第２の末端を有するカニューレを含み、前記第１および第２の末端が、前記の密閉された第１および第２の容器に穴を開けて、前記第１および第２の容器との間に流体の行き来をもたらすことのできる移動装置を用意するステップと、
    前記第１の容器に血液を引き込むステップと、
    前記血液、分離媒質、および高粘性流体を含有する前記第１の容器を、前記分離媒質が前記血漿から前記赤血球を分離するように遠心分離にかけるステップと、
    前記の密閉された第１および第２の容器に前記移動装置で穴を開け、それによって前記血漿が前記カニューレを通って前記第２の容器に流出できるようにするステップと、
    前記カニューレを前記高粘性液体で詰まらせるステップと
    を含む方法。
40. 前記第２の容器がカルシウム凝固活性化因子を含んでいることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
41. 前記カルシウム凝固活性化因子が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、およびこれらの混合物の少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項４０に記載の方法。

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