JP2004269529A - フィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法およびこの方法により得られるフィブリノゲン - Google Patents

Abstract

【課題】 フィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法および上記方法により得られるフィブリノゲンを開示する。
【解決手段】 上記方法は調節した精製フィブリノゲン溶液から開始し、調節した精製フィブリノゲン溶液を凍結した後、５〜２０℃の温度で解凍し、続いてフィブリノゲンに関連した非溶解物質を分離し、温度を調節し、得られた溶液を最終的に、３５ｎｍより小さい孔径のフィルターを用いたナノ濾過を行う。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ナノ濾過によりフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法に関し、またこの方法により得られる治療用途のためのフィブリノゲンにも関する。

３４０，０００ダルトンの分子量を有する糖タンパク質である血漿フィブリノゲンは、止血中の凝固カスケードの最後に活性化される凝固因子である。このフィブリノゲンは、血小板凝固中、一次止血に関与し、フィブリンクロットの形成中、二次止血に関与する。

ヒト血漿から精製されるタンパク質である治療用製品としてのフィブリノゲンは、このタンパク質の欠陥が見られる状況における変換療法に、また他の用途の中でもとりわけ、止血および創傷封鎖(sealing of wounds)、組織再構成におけるフィブリン接着剤の構成成分として、生物学的糊(glue)ならびに医薬品およびホルモンの遊離のための媒質として使用される。

商業用途に関して、フィブリノゲンは、数多くのドナー（「プール」）由来のヒト血漿から調製される。血液バンク、血漿装置(plasma units)、ミニプールおよび分画用工業プールにおいて、ドナーおよび献血血液に関して管理が行われているにも関わらず、血液ウイルスによる汚染の可能性は除外することができない。したがって、特定のウイルスを排除する段階が、血漿タンパク質精製プロセスに導入される。出発物質が血漿分画の開始時に配置され、さらにそれは続くエタノールによる分画の減少効果を有さないため、潜在的により多い含有量のウイルスが同調されることから、Cohn法［Cohn J. et al.; J Am Chem Soc (1946) 68, 459-475］を用いて寒冷沈降物またはＦｒＩ（第１の分画）を開始とする工業スケールで精製され得るこのタンパク質にとって非常に重要である。

血漿タンパク質精製プロセスで使用されるウイルス含有量を減少させる方法から、広く使用され、かつ実績のある効率を有するため、以下の事項が強調されるべきである。

熱処理。これらは、エンベロープ型ウイルスおよび非エンベロープ型ウイルスの両方に対して効果的なウイルス含有量を減少させる潜在力を有する。その効率は、タンパク質の熱安定性および添加する安定剤に直接的に関連性を有する。したがって、熱処理は、タンパク質分子が腫瘍抗原性の形成をもたらす変異にさらされるという欠点を有する［ＣＰＭＰ／血漿由来製品に関するガイダンスについての注意書き（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５ｒｅｖ．３）２００１年１月］。

有機溶媒（ＯＳＤ）による処理。脂質エンベロープを有するウイルスの不活性化におけるそれらの高い効率により、これは、これらの型のウイルスに関する言及とみなされ、広く使用される処理である。一方、この処理は、パルボウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスのような脂質エンベロープのないウイルスには効果がない［Burnouf T. Blood Reviews (2000) 14, 94-110; Martinowitz U. Curr. Opin. Hematol (1996) 3, 395-402］。

また一方では、現在ではウイルス除去の少なくとも２つの補足段階を包含する傾向にある。

ウイルス粒子を保持することが可能な孔径を有するフィルターに通した溶液の濾過は、近年より広く使用されている方法である。これは、原則としてタンパク質の構造に影響を及ぼすことが不可能であり、かつ使用する孔径に応じて、ウイルスの含有を除去する効果的な能力を有する物理的プロセスである。この孔径は特に、濾過されるタンパク質分子の空間的寸法（フィルターを通過しなくてはならない）に依存する。２０ｎｍ以下のフィルターを使用した濾過は、２０〜３０ｎｍであるＡ型肝炎ウイルスおよびパルボウイルスのような小さなサイズの非エンベロープ型ウイルスの有意な減少を保証し得る。他方で、より大きな孔径（３５ｎｍ以上）を有するフィルターを使用した濾過は、これらのウイルスに対して十分なレベルの安全性を保証しない。この方法の困難性は明らかに、ウイルスとタンパク質との間のサイズ差が見られない傾向にある場合には未解決のようである［J.J. Morgenthaler, Vox Sang (2000) 78 (suppl 2), 217-221］。

３５ｎｍフィルターを使用したフィブリノゲン溶液ナノ濾過の工業的用途については記載されているが、より小さい孔径を有するフィルターに通したナノ濾過の工業的用途については記載がない。分子サイズおよび安定性といった特徴により、フィブリノゲンは、０．２μｍの孔径を有するフィルターを使用した濾過による滅菌を試みる場合でさえ、濾過に関する問題を有するタンパク質である。

国際公開ＷＯ９９／２３１１１号は、この工業的用途を発展できなくさせているタンパク質のかなりの損失を回避しながら、上記濾過を可能にする洗剤の添加による３５ｎｍの孔径を有するフィルターを使用したフィブリノゲン溶液の濾過について開示しており、それらを特許請求の範囲に記載している。

国際公開ＷＯ９８／３７０８６号は、フィブリノゲンを含む高分子量（１５０ｋＤ超える）を有するタンパク質の存在が、１５ｎｍのナノフィルターを使用したより小さなタンパク質の濾過を複雑にすることを見出している。本公報は、ナノ濾過を可能とする目的で上記高分子量タンパク質（フィブリノゲンを含む）を除去する方法について記載している。したがって、これは本発明の目的ではなく、高分子量分子のナノ濾過に関する問題を開示しているものである。

欧州特許出願公開第１１６１９５８号は、生物学的な液状調製物のウイルスを不活性化する方法について開示している。開示されているプロセスでは、ナノフィルターの孔径は、濾過されるタンパク質のサイズに依存し、実施例では、３５ｎｍの濾過が開示され、上記ナノ濾過を容易とする目的で濾過される溶液に先立ってのクロマトグラフィを含んでいる。これは、タンパク質がかなりのサイズである場合、３５ｎｍに通した場合でさえもナノ濾過を実施する際の困難性を示している。

米国特許出願公開第 ２００１／００５１１５４号は、低温殺菌およびナノ濾過の両方によりウイルス含有量を減少させるための処理中に、活性の損失または変性からタンパク質を保護する目的で、フィブリノゲンを含むタンパク質の安定化について開示している。これは、大量の糖（＝０．５ｇ／ｍｌ）および１つまたは複数のアミノ酸（０．５ｍｏｌ／ｌを超える）の添加を包含する。しかし、この特許出願は、フィブリノゲンのナノ濾過の例を記載も提供もしておらず、したがってフィブリノゲンのナノ濾過が３５ｎｍより小さい孔径を有するフィルターを通して実施できることを推論することができない。

現在市販されているフィブリン接着剤の構成成分としてのフィブリノゲン調製物［M.R. Jackson, The American Journal of Surgery (2001) 182, 1S-7S］は、熱処理およびＯＳＤによる処理から基本的に構成される、ウイルス含有量を減少する方法を使用する。ナノ濾過は、おそらく３５ｎｍ（またはそれ以上の孔径）に通した濾過がＯＳＤまたは熱処理により除去されなかった小さなウイルスにとって効果的ではないという事実から、最適な方法ではないようである。

本発明は、治療用製品としての精製フィブリノゲンの生産において、濾過の工業的用途を可能にする処理時間、濾過面積およびタンパク質回収率の条件下で、３５ｎｍより小さい公称孔径を有するフィルターを使用したフィブリノゲン溶液の濾過を可能にする。この濾過は、コントロールされた条件下で精製フィブリノゲン溶液に先立って凍結および解凍することにより達成される。驚くべきことに、本発明者等は、このコントロールされた凍結および解凍により、３５ｎｍより小さい孔径に通した溶液の濾過を実際に妨げる不溶性凝集物質または部分的変性物質が沈降されることを見出した。沈降した物質の分離により、３５ｎｍより小さい孔径へのナノ濾過が可能となる。

Cohn法の第１の分画（ＦｒＩ）または同等のフィブリノゲン含有分画である寒冷沈降物を、精製フィブリノゲン沈降物が好ましくはグリシンを用いた沈降により得られるヒト血漿に由来するフィブリノゲンの精製のための出発物質として使用してもよい。

溶解および清澄化の前の出発分画は、存在し得る脂質エンベロープを有する考え得るウイルスを不活性化する目的で、有機溶媒および洗剤（ＯＳＤ）による処理を行なってもよい。ＯＳＤは、クロマトグラフィのような任意の既知の方法により、あるいはこの場合好ましくは、グリシンによる沈降により除去され得る。

フィブリノゲンに富んだ精製分画は、溶解され、濾過または遠心分離により清澄化され、安定剤、好ましくはアミノ酸（アルギニン、グリシンまたは等価物）および炭水化物（サッカロース）により、好ましくは６．０〜８．０のｐＨに調節され、イオン濃度は好ましくは、塩化ナトリウムにより生理学的に許容可能な濃度に調節できる。

好ましくは８０％以上の純度を有する上述した調節および精製されたフィブリノゲン溶液から開始して、驚くべきことに、本発明者等は、５〜２０℃、好ましくは８〜１３℃のコントロールされた温度で溶液を凍結および解凍することにより、フィブリノゲンに関連する凝集しやすい構成成分または変性不安定構成成分が不溶化されることを見出した。これらの物質は、ナイロン、金属メッシュによる清澄化により、または好ましくはデカントするか、遠心分離するかもしくは直接濾過すること（好ましくはフィルターの勾配を用いて）により、あるいは上述の方法のいずれかの組合せにより容易に分離され得る。驚くべきことに、得られた物質は、非常に許容可能な生産性および回収率で、３５ｎｍより小さい孔に通した場合でさえのナノ濾過に付すことができる。

本発明を実施する好ましい方法を以下に記載する。０．１〜８％（重量／容量）の濃度および１８〜３７℃の温度で（好ましくは両方の場合で）少なくとも１種のアミノ酸（好ましくは、アルギニン）の存在下で、１．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度に希釈され、かつより大きな孔径を有するフィルターに通してあらかじめ清澄化された、この清澄化から得られる物質は、８０％を上回るタンパク質回収率で、３５ｎｍより小さい孔径（好ましくは、約２０ｎｍ）を有するナノフィルターに通して濾過される。このナノ濾過を実施するのに必要とされるフィルター面積は、溶液のタンパク質濃度および使用するナノフィルターの孔径に応じて、濾過される溶液１リットル当たり１０〜１，０００ｃｍ^２である。処理時間は通常、１２時間より短い。

得られた生成物の特性化と一緒に、タンパク質回収率、必要なフィルター面積および必要とされる処理時間に関して得られたデータは、工業化可能なプロセスにおける本発明の適用可能性を示す。

Cohn法に従って８％冷エタノールで沈降させた分画Ｉを出発物質として使用した。上記分画Ｉ １０ｋｇを、クエン酸ナトリウム−塩化ナトリウム、ならびに抗凝固剤および抗線維素溶解剤を含有する緩衝溶液を用いて１：９の比で懸濁させた。懸濁液を、およそ０．５ミクロンの粒径のポリプロピレンおよびセルロースエステルから作製されたデプスフィルター（ともにMilliporeから）に通して３０℃で清澄化した。

続いて、０．３％リン酸トリ−ｎ−ブチルホスフェートおよび１％ポリソルベート８０を用いて、２７℃で６時間以上インキュベートして、溶媒／洗剤によるウイルス不活性化処理に溶液をさらした。不活性化された溶液を９℃に冷却し、グリシンを添加することにより１．７Ｍ濃度にまで沈降させた。形成された沈降物を、５ｋｇ容量を有するＳｈａｒｐｌｅｓ遠心分離機を用いておよそ１５，０００ｒｐｍで遠心分離することにより分離して、続いて塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム溶液中に懸濁させて、再びグリシンにより１．５Ｍまで沈降させた。形成された沈降物を遠心分離により再び分離して、続いて先の段階と同じ方法で再沈降させた。

得られた沈降物（３番目のグリシン沈降物）は、出発分画Ｉの重量の６０〜８０％を占め、およそ１５％の乾燥タンパク質から構成されており、およそ９０％がフィブリノゲンであった。この物質を１：３の比の３．４％サッカロース溶液および等張濃度の塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム塩を用いて３０℃で溶解し、続いて、孔径１μｍのデプスフィルターおよび清澄化用フィルター（ともにMilliporeから）に通して濾過した。およそ３０リットルの溶液が得られた。

１％アルギニンに対して１００ｋＤａ膜（Pall-Filtronから）に通して、物質をダイアフィルター（diafiltered）して、過剰の塩、サッカロースおよびグリシンを除去し、ひとたび物質が０．５％アルブミンで表わされるフィブリノゲン含有量１．５％に達したら、その物質を０．５ミクロンに通して清澄化し、かつ０．２ミクロンに通して滅菌濾過した。

上述の滅菌溶液から開始して、直径４７ｍｍのディスクに通した０．１ミクロン(Pall製のＤＶＤおよびＤＪＬ)に通して濾過することを試みたが、フィルターは、ほぼすぐに（およそ５〜１０分以内で）つまるようになり、約５ｍｌ未満の溶液が濾過され、２．１ＡＵのＯＤの減少（２７．２ＡＵから２５．１ＡＵまで）が濾液で観察された。これらの結果は不満足であり、０．１ミクロンの孔径を有するフィルターに通した場合でさえもフィブリノゲン濾過に関する問題を示した。

０．２ミクロンに通して濾過した溶液を−７０℃で凍結して、続く濾過試験を実施した。

様々なフィブリノゲン濃度でナノ濾過試験を行うために、実施例１において０．２ミクロンに通して濾過した溶液を３０℃で完全に解凍し、濾過性に対する考え得る陽性効果を、アミノ酸溶液（アルギニン）の存在下で、フィブリノゲン分子を分散させるプロセスとして、超希釈を実施することにより調査した。

０．２ミクロンに通して濾過した溶液の分取量部分を、ｐＨ７．０および３０℃で０．６６％アルギニン溶液、２．７ｍＭクエン酸ナトリウムおよび６２．６ｍＭ塩化ナトリウムによる様々な希釈に付して、最終フィブリノゲン濃度は、およそ５、３、１、０．７および０．５ｍｇ／ｍｌであった。

各希釈溶液を０．１ミクロンに通して濾過した直後に、３５ｎｍの孔径および面積１０ｃｍ^２を有するカートリッジ（Asahi-KaseiからのＢＭＭ−Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎ）に通したナノ濾過を実施した。圧力条件は、製造業者が推奨する通り（０．２〜１．０ｂａｒ）であり、温度はすべての濾過プロセス中２５〜３０℃であった。

得られた濾過性および回収率の結果を表１に示す。

フィブリノゲン濃度が、好ましくは１〜０．５ｍｇ／ｍｌ以下に非常に希釈される場合に、３５ｎｍに通したナノ濾過を実施することができ、濾過容量（フィブリノゲンのｇ／ｃｍ^２）および回収率（フィブリノゲンの５０％を上回る）に関する許容可能な値が、この範囲内で達成されることが上述の値から推論され得る。

明らかに、超希釈条件におけるナノ濾過の主な障害の１つは、濾過される容積が過剰であること、および投与(dosing)前の生成物の最終的な濃度であり、このことが、確立された範囲の上限値に最適条件が存在する理由である。

最良の処理条件下でさえも、生成物の解凍および３０℃でのフィブリノゲンの完全な溶解を包含する上述の様式で進行させることにより、生成物を３５ｎｍに通したナノ濾過に付すことが困難であることは明らかである。

可溶化しかつ清澄化したグリシン沈降物ＩＩＩが得られるまで、実施例１に記載された様式でさらなるバッチを処理し、その一部をそれらの保存のために−７０℃で凍結させた。溶液の残部を実施例１に記載した様式で、０．２ミクロンに通して濾過した最終生成物へと処理した。

ともに０．７３〜０．７４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン濃度で、新鮮な物質（凍結せずに０．２ミクロンに通して濾過した最終生成物）および相当する凍結物質を用いて、直径４７ｍｍのデスクを有する２０ｎｍ（Pall製のＵｌｔｉｐｏｒ−ＤＶ２０）に通して比較ナノ濾過試験を実施した。印加した圧力は、フィルター製造業者(Pall)が推奨する２．２〜２．８ｂａｒであった。

凍結物質の場合、まずすべての解凍が外気温度（２０℃未満の溶液温度）で実施され、物質は、０．５ミクロンに通して清澄化された。新鮮な物質および凍結物質はともに、２％アルギニン溶液（ｗ／ｖ）、６２．６ｍＭ塩化ナトリウムおよび２．７ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および３０℃で都合よく希釈され、０．１ミクロンに通して濾過した直後に、およそ３０℃の温度で５０ｎｍ（ＤＶ５０）および２０ｎｍ（ＤＶ２０）に通した段階的ナノ濾過を行った。２つのプロセスの結果を表２に概要する。

＊フィルターが上記容積でつまるようになり、ナノ濾過を完了させることができなかった。

新鮮な物質（凍結なし）による試験では９９．４％のタンパク質回収率が得られたが、ＤＶ２０フィルターがつまるようになるまでに濾過することができる最大量はたった２３．７ｇのフィブリノゲン／ｍ^２にすぎず、フィブリノゲンの平均流速は、４．７４ｇ／ｍ^２／時間（２３．７を５で除算）であった。

一方、凍結物質の場合、回収率はタンパク質９９．７％であり、フィブリノゲン負荷３０．１ｇ／ｍ^２が適用された場合にＤＶ２０フィルターはつまるようにならず、平均フィブリノゲン流速は２１．２０ｇ／ｍ^２／時間であった。この試験において濾液流速の異常な減少が見られず、フィルターのつまりがないので、凍結および解凍のコントロールされた段階により３０．１ｇを上回るタンパク質のナノ濾過が可能であることが明らかである。

凍結／解凍の効果は、濾過可能なフィブリノゲンの最大量（これは、２３．７ｇ／ｍ^２に対比して３０．１より相当大きくなり得る）、および４．７４ｇのフィブリノゲン／ｍ^２／時間（これは、４．５時間より長い）に対比して２１．２０の濾過流速の両方に関して、２０ｎｍに通した最終ナノ濾過で表われた。２０ｎｍに通したナノ濾過の面積は明らかに、同じ割合で減少させることができ、そしてこのことは、このタイプの高分子量タンパク質に関して実際にナノ濾過を工業的に導入することを妨げる、ナノ濾過の高いコストを最適化することができる。

上述の実施例３の結果として、生成物の解凍を達成するための最適条件は、主として凝集物により形成される不溶性または不溶化可能な物質の大部分を除去すること、および単分散フィブリノゲンの損失を最小限に抑えることにねらいを定めた。

実施例１と同様に−７０℃で凍結させた溶液へと処理した様々なバッチを、コントロールされた条件（温度および溶融時間）下で解凍させた。物質が解凍したら、不溶性物質を分離した。上記物質は、２０ミクロンの孔径を有するナイロンメッシュに通して、かつ凍結物質を解凍した温度で分離した。不溶性物質が分離されたら、溶液を３０℃に加熱して、０．４５ミクロン（Millipore製のＣＨＭＶフィルター）に通して濾過した。

分離された不溶性物質の重量ならびに溶液のタンパク質濃度（概算値、２８０ｎｍでの光学密度による）を測定した。得られた値を表３に示す。

上述の結果は、形成された不溶性残渣の量が解凍温度と関連があり、凍結前の初期溶液に対する濾液のタンパク質濃度（光学密度）の減少に対応していることを明らかに示すものである。同様に、十分なタンパク質を回収し、かつ不溶性物質を除去するためにおよそ１０℃の溶融温度が適当である。０．５〜１．０ｋｇの不溶性物質が９〜１９℃で分離し、タンパク質の８３％〜８７％が回収された。３０．５℃ではほとんど沈降物が得られず（０．１ｋｇ）、存在するタンパク質の適切な減少が検出されないことは重要なことである。

ナノ濾過中の生成物の濾過性に関する実施例４からの様々な解凍条件の影響を表４に示す。

実施例４で言及したように、解凍および濾過した処理バッチを、ｐＨ７．０および温度３０℃で塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムを含有する２％（ｗ／ｖ）アルギニン溶液で１．２〜１．３ＡＵの光学密度（２８０ｎｍ）（フィブリノゲンおよそ０．８ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。各段階において圧力２．２〜２．８ｂａｒで、０．１ミクロン（３０”ＣＶＶＬ）および５０ｎｍ（２ｘ３０”ＤＶ５０）に通して、続いて２０ｎｍ（３ｘ３０”ＤＶ２０）に通して、ナノ濾過を２段階で実施した。

濾過容量（濾過したフィブリノゲンのｇ／ｍ^２）、濾過した容積、フィブリノゲンの回収率（２８０ｎｍでの光学密度による）および濾過時間を各プロセスで測定した。結果を表４に示す。

工業的スケールで２０ｎｍに通してフィブリノゲンにナノ濾過することが可能であることが、得られた結果から理解される。同様に、濾過時間（というよりは流速）は実施例４からの出発物質の解凍温度と相関関係を有し、実際に２０℃以下、好ましくは７〜１９℃の温度が、合理的な生産容量および処理時間で、かつ解凍中の損失に起因した生成物の過剰な減少なしで、２０ｎｍに通したナノ濾過にとって最も都合がよいことを示す。

したがって、本発明を適用することにより、治療用製品としての精製フィブリノゲンの生産へのナノ濾過の工業的用途を可能にする条件下で、３５ｎｍより小さい公称孔径を有するフィルターを用いたナノ濾過により、血漿フィブリノゲン溶液を精製することが可能であることが分かる。

説明および併記の実施例の内容により本発明について説明してきたが、本発明は、上記説明および実施例の趣旨に厳密に限定されるものではなく、上記説明および実施例は基本的に非限定的な説明の性質を有するものであり、この分野の専門家は、本説明および実施例に開示された内容に基づいて、本特許請求の範囲に規定される本発明の範囲に完全に包含される修正および変更をなすことが可能であることが理解されよう。

Claims (16)

1. 総タンパク質に対して８０％以上の高い純度のフィブリノゲンを有する、事前に精製したヒト血漿に由来するフィブリノゲン溶液から始まる、治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法であって、非溶解物質の分離、タンパク質の希釈および３５ｎｍより小さい孔径のフィルターを用いる得られた溶液のナノ濾過において、前記溶液を安定化し、凍結し、ならびにこれらに続く約５〜２０℃の温度で解凍することを特徴とする方法。
2. 前記凍結、解凍およびナノ濾過が、少なくとも１種のアミノ酸の存在下で実施される請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
3. 前記アミノ酸が、アルギニン、グリシンまたはこれら２つの組合せである請求項２記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
4. 前記非溶解物質が、凍結および解凍後にメッシュにより分離される請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
5. 前記非溶解物質が、凍結および解凍後にデカントにより分離される請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
6. 前記非溶解物質が、凍結および解凍後に遠心分離により分離される請求項１に記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
7. 前記非溶解物質が、凍結および解凍後に直接濾過またはフィルターの勾配により分離される請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
8. 前記非溶解物質が、凍結および解凍後に、請求項４〜７の方法を合わせることにより分離される請求項１〜７のいずれかに記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
9. 前記非溶解物質の分離から得られる前記溶液が、１．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度のフィブリノゲンに希釈される請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
10. 前記溶液が、ナノ濾過前に１８〜３７℃の温度に調節される請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
11. 前記フィブリノゲン溶液を、３５ｎｍより小さい孔径を有するフィルターに通したナノ濾過前に、３５ｎｍ以上の孔径を有するフィルターに通して前濾過する請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
12. ３５ｎｍより小さい孔径を有するフィルターに通したナノ濾過に必要とされる前記フィルター面積が、濾過される溶液１リットル当たり１０〜１，０００ｃｍ^２である請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
13. 前記解凍温度が８〜１３℃である請求項１記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
14. 前記アミノ酸濃度が０．１％を上回る請求項３記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
15. 前記アミノ酸濃度が０．１％〜８％である請求項１４記載の治療用途のためのフィブリノゲン溶液中のウイルスを除去する方法。
16. 請求項１〜１５のいずれかに記載の方法の適用により得られる治療用途のためのフィブリノゲン。