ES2312944T3 - Procedimiento para la eliminacion de virus en soluciones de fibrinogeno y fibrinogeno obtenido por dicho procedimiento. - Google Patents

Procedimiento para la eliminacion de virus en soluciones de fibrinogeno y fibrinogeno obtenido por dicho procedimiento. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, partiendo de una solución de fibrinógeno procedente de plasma humano previamente purificado, con una pureza igual o superior al 80% de fibrinógeno con respecto al total de proteínas, caracterizado por proceder a la estabilización y congelación de la solución y posterior descongelación de la misma a una temperatura comprendida entre 5 y 20ºC, procediendo después a la separación de los materiales insolubilizados y a la dilución de la proteína y nanofiltración de la solución resultante con filtros hasta un tamaño de poro inferior a 35 nm.

Description

Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno y fibrinógeno obtenido por dicho procedimiento.
La presente invención se refiere a un procedimiento destinado a la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno por nanofiltración y asimismo se refiere al fibrinógeno de aplicación terapéutica obtenido mediante dicho procedimiento.
Antecedentes
El fibrinógeno plasmático, glicoproteína de 340.000 daltons de peso molecular, es el factor de coagulación activado al final de la cascada de la coagulación, durante la hemostasis. Este fibrinógeno interviene tanto en la hemostasis primaria, en la agregación plaquetar, como en la hemostasis secundaria, en la formación del coágulo de fibrina.
El fibrinógeno como producto terapéutico, proteína purificada a partir del plasma humano, tiene utilidad como terapia sustitutiva en situaciones de déficit de esta proteína y, como componente de adhesivos de fibrina, en hemostasis y sellado de heridas, reconstrucciones de tejidos, cola biológica y vehículo de liberación de medicamentos y hormonas, entre otras aplicaciones.
La preparación del fibrinógeno, para su uso comercial, se realiza a partir de plasma humano de numerosos donantes ("pool"). A pesar de los controles realizados sobre los donantes y las donaciones a nivel de banco de sangre y de unidades de plasma, minipooles y pooles industriales para fraccionamiento, no puede excluirse la posibilidad de contaminación por virus hemáticos. Por tanto, en los procesos de purificación de proteínas plasmáticas se introducen etapas específicas de eliminación de virus. Esto es si cabe de mayor importancia en esta proteína, que puede purificarse a escala industrial a partir de crioprecipitado o de la FrI (fracción primera) del método de Cohn [Cohn. J. y otros; J Am Chem Soc (1946) 68, 459-475] ya que al estar el material de partida situado al principio del fraccionamiento del plasma se arrastra potencialmente una mayor carga vírica y además no presenta el efecto reductor del posterior fraccionamiento con etanol.
Entre los métodos de reducción de la carga viral utilizados en los procesos de purificación de proteínas plasmáticas cabe destacar, por su amplia utilización y contrastada eficiencia:
- Tratamientos térmicos. Presentan un potencial reductor de la carga viral efectivo tanto para los virus envueltos como para los no envueltos. Su eficiencia está directamente relacionada con la estabilidad térmica de la proteína y con el estabilizante adicionado. Por tanto, presentan el inconveniente de que pueden darse alteraciones en la molécula proteica que induzcan la formación de neoantigenicidad [CPMP/Note for guidance on plasma derived products (CPMP/BWP/269/95rev. 3) Enero 2001].
- Tratamientos con solventes orgánicos (OSD). Por su gran eficiencia en la inactivación de los virus con cubierta lipídica es un tratamiento de amplia utilización y que puede considerarse de referencia para estos tipos de virus. Por el contrario no tiene ningún efecto sobre los virus sin cubierta lipídica, como los Parvovirus y Virus de la Hepatitis A [Burnouf T. Blood Reviews (2000) 14, 94-110; Martinowitz U. Curr. Opin. Hematol. (1996) 3, 395-402].
Por otra parte la tendencia actual es la inclusión de al menos dos etapas complementarias de eliminación de virus.
- La filtración de soluciones a través de filtros de un tamaño de poro capaz de retener partículas víricas es un método cuya utilización se ha extendido en los últimos años. Se trata de un procedimiento físico que en principio no presenta capacidad de alterar la estructura de las proteínas y si una eficiente capacidad de eliminación de la carga viral, en función del tamaño de poro empleado. Este tamaño de poro vendrá especialmente condicionado por la dimensión espacial de la molécula de proteína a filtrar (que debe atravesar el filtro). La filtración por filtros de 20 nm o inferiores puede garantizar una reducción significativa de los virus no envueltos de pequeño tamaño, como el virus de la Hepatitis A y el Parvovirus, comprendidos entre los 20 y 30 nm. En cambio la filtración por filtros de mayor tamaño de poro (35 nm o superior) no garantizaría un suficiente nivel de seguridad frente a estos virus. Obviamente, la dificultad de esta técnica parece insalvable cuando las diferencias de tamaño entre virus y proteína tienden a desaparecer [J. J. Morgenthaler, Vox Sang (2000) 78 (suppl 2), 217-221].
Hasta el momento se ha descrito la aplicación industrial de la nanofiltración de soluciones de fibrinógeno por filtros de 35 nm pero no por filtros de tamaño de poro menores. Por sus características de tamaño molecular y estabilidad, el fibrinógeno es una proteína que presenta dificultades de filtración, incluso cuando se pretende la esterilización por filtración a través de filtros de 0,2 \mum de poro.
En la patente PCT WO 99/23111 se describe y reivindica la filtración de una solución de fibrinógeno por un filtro de un tamaño de poro de 35 nm, para lo cual debe adicionarse un detergente que posibilita dicha filtración evitando una pérdida sustancial de proteína que haría inviable su aplicación industrial.
La patente WO 98/37086 constata que la presencia de proteínas de elevado peso molecular (superior a 150 kD), entre las que se incluye al fibrinógeno, dificultan la filtración de proteínas de menor tamaño por nanofiltros de 15 nm. Dicha patente describe un método para eliminar dichas proteínas de alto peso molecular (entre ellas el fibrinógeno) con el objeto de permitir la nanofiltración. Desde luego, este no es el objetivo de la presente invención pero ejemplifica la dificultad de nanofiltración de moléculas de elevado peso molecular.
La solicitud de patente EP 1 161 958 A1 describe un método para inactivar virus en líquidos biológicos. En el procedimiento descrito, el poro del nanofiltro está condicionado por el tamaño de la proteína a filtrar, mostrando en los ejemplos la filtración por 35 nm y reivindicando la cromatografía previa de la solución a filtrar con el objeto de facilitar dicha nanofiltración. Esto muestra la dificultad de realización de la nanofiltración, incluso por 35 nm, cuando el tamaño de la proteína es considerable.
La solicitud de patente US 2001/0051154 A1 dice describir la estabilización de proteínas, entre las que se incluye el fibrinógeno, con objeto de preservarlas frente a la pérdida de actividad o desnaturalización durante el tratamiento de reducción de la carga viral, tanto por pasteurización como por nanofiltración. Para ello se adiciona una cantidad importante de azúcares (= 0,5 g/ml) y uno o mas aminoácidos (> 0,5 mol/l). Sin embargo esta patente ni describe ni ejemplifica la nanofiltración de fibrinógeno por lo que no es deducible que pueda realizarse la nanofiltración del fibrinógeno por filtros de tamaño de poro inferior a 35 nm.
Las preparaciones de fibrinógeno, como componente de adhesivos de fibrina, comercializadas en la actualidad [M. R. Jackson, The American Journal of Surgery (2001) 182, 1S-7S], utilizan métodos de reducción de la carga viral que consisten fundamentalmente en tratamientos térmicos y tratamientos con OSD. La nanofiltración no parece ser un método de elección, debido probablemente a que la filtración por 35 nm (o poro superior) no muestra eficiencia para los virus de pequeño tamaño que no han sido eliminados por el OSD o el tratamiento térmico.
Características resumidas de la invención
Por la presente invención se consigue la filtración de una solución de fibrinógeno por filtros de un tamaño de poro nominal inferior a 35 nm, a unas condiciones de tiempo de proceso, superficie filtrante y recuperación proteica que posibilitan su aplicación industrial en la producción de fibrinógeno purificado como producto terapéutico. Esta filtración se consigue en base a una congelación y descongelación previa de la solución de fibrinógeno purificada, en condiciones controladas. Los inventores han descubierto que, sorprendentemente, con esta congelación y descongelación controlada se produce la precipitación de material insoluble, agregado o parcialmente desnaturalizado que impediría, en la práctica, la filtración de la solución por tamaños de poro inferiores a 35 nm. La separación del material precipitado, permite la nanofiltración hasta un tamaño de poro inferior a 35 nm.
Descripción detallada de la invención
Para la purificación del fibrinógeno procedente de plasma humano se puede partir de crioprecipitado, de la Fracción primera (FrI) del método de Cohn o de una fracción equivalente que contenga fibrinógeno, a partir de la cual y por precipitación, preferentemente con glicina, se obtiene un precipitado de fibrinógeno purificado.
La fracción de partida, previa solubilización y clarificación, puede someterse a un tratamiento con un Solvente Orgánico y Detergente (OSD), con objeto de inactivar los posibles virus con cubierta lipídica que pudieran estar presentes. El OSD puede ser eliminado mediante alguno de los métodos conocidos, como la cromatografía o, preferentemente en este caso, por precipitación con glicina.
La fracción purificada rica en fibrinógeno puede ser solubilizada, clarificada por filtración o centrifugación y ajustada de estabilizantes, preferentemente aminoácidos (arginina, glicina o equivalentes) y carbohidratos (sacarosa), pH preferentemente entre 6,0 y 8,0 y fuerza iónica ajustada preferentemente con cloruro sódico a concentraciones fisiológicas.
Sorprendentemente, a partir de la anterior solución purificada y ajustada de Fibrinógeno, con una pureza preferentemente mayor o igual al 80%, los inventores han descubierto que por medio de la congelación y descongelación de la solución a temperatura controlada entre 5 y 20ºC y preferentemente entre 8 y 13ºC se produce una insolubilización de los componentes inestables asociados al fibrinógeno, fácilmente agregables o desnaturalizables. La separación de estos materiales puede realizarse sin dificultad por clarificación por una malla de nylon, metal o mejor aun por decantación o centrifugación o filtración directa preferentemente con gradiente de filtros, o combinación de cualquiera de las anteriores técnicas. El material resultante es, sorprendentemente, nanofiltrable incluso por poros inferiores a 35 nm, con productividades y recuperaciones muy aceptables.
A continuación se describe una forma preferida de aplicación de la presente invención. El material resultante de dicha clarificación, diluido a una concentración inferior o igual 1,5 mg/ml en presencia de al menos un aminoácido (preferentemente arginina), a una concentración comprendida entre el 0,1 y el 8% (p/v) y a una temperatura comprendida entre 18 y 37ºC, preferentemente en ambos casos, y previamente clarificado por filtros de tamaño de poro superior, se filtra por un nanofiltro de poro inferior a 35 nm (preferentemente en torno a 20 nm), con una recuperación de proteína superior al 80%. La superficie filtrante necesaria para la realización de esta nanofiltración está comprendida entre 10 y 1000 cm^{2} por litro de solución a filtrar, según concentración de proteína de la solución y tamaño de poro del nanofiltro empleados. El tiempo de proceso es habitualmente inferior a 12 horas.
Los datos obtenidos de recuperación de proteína, superficie filtrante necesaria y tiempo de proceso requerido, junto con la caracterización del producto obtenido demuestran la aplicabilidad de la invención en un proceso industrializable.
Ejemplos de aplicación de la invención Ejemplo 1
Se partió de la fracción I precipitada de acuerdo al método de Cohn con etanol en frío al 8%. Se tomaron 10 kg de dicha fracción I que se suspendió en relación 1:9 con una solución tampón que contenía cloruro-citrato sódicos, e incluía un anticoagulante y un antifibrinolítico. La suspensión se clarificó a 30ºC por filtros de profundidad de polipropileno y de ésteres celulósicos (ambos de Millipore) hasta un tamaño de partícula de 0,5 micras, aproximadamente.
Seguidamente se efectuó el tratamiento de inactivación vírica con solvente-detergente, utilizando tri-n-butil fosfato al 0,3% y polisorbato 80 al 1%, incubando a 27ºC durante no menos de 6 horas. La solución inactivada se enfrió a 9ºC y se precipitó por adición de glicina hasta una concentración del 1,7 M. El precipitado formado se separó por centrifugación a unas 15000 rpm usando una centrífuga Sharples de 5 kg de capacidad, y luego se suspendió en una solución de cloruro-citrato sódicos, y se precipitó de nuevo con glicina hasta 1,5 M. De nuevo, el precipitado formado se separó por centrifugación y luego se reprecipitó de la misma forma como se ha indicado en el paso anterior.
El precipitado obtenido (precipitado 3º de glicina) representa un 60-80% del peso de fracción I de partida y esta constituido aproximadamente por un 15% de proteína seca, con una pureza de aproximadamente el 90% de fibrinógeno. Este material se solubilizó a 30ºC con una relación 1:3 de una solución de sacarosa 3,4% y una concentración isotónica de sales cloruro-citrato sódicos, filtrándose seguidamente por filtros de profundidad y clarificantes (ambos de Millipore) hasta un tamaño de poro de 1 \mum. Se obtuvieron unos 30 litros de la solución.
El material se diafiltró por membranas de 100 kDa (de Pall-Filtron) frente a arginina 1% para eliminar el exceso de sales, sacarosa y glicina, y una vez al 1,5% de fibrinógeno y formulado con albúmina al 0,5%, se clarificó por 0,5 micras y se filtró estérilmente por 0,2 micras.
A partir de la anterior solución estéril se intentó filtrar por 0,1 micras a través de discos de 47 mm de diámetro (DVD y DJL de Pall) colapsándose casi inmediatamente (en unos 5 - 10 minutos) y filtrando menos de unos 5 ml de la solución, observando una reducción de 2,1 UA de D.O. (de 27,2 UA a 25.1 UA) en el filtrado. Estos resultados fueron insatisfactorios y muestran la dificultad de filtración del fibrinógeno, incluso por filtros de tamaño de poro de 0,1 micras.
La solución filtrada por 0,2 micras se congeló a -70ºC para llevar a cabo pruebas posteriores de filtración.
Ejemplo 2
Se partió de la solución filtrada por 0,2 micras del ejemplo 1, descongelada totalmente a 30ºC, para efectuar pruebas de nanofiltración a diferentes concentraciones de fibrinógeno, investigándose el posible efecto positivo sobre la filtrabilidad al efectuar una dilución extrema, como procedimiento para dispersar las moléculas de fibrinógeno en presencia de una solución de aminoácido (arginina).
Se tomó una parte alícuota de la solución filtrada por 0,2 micras y se efectuaron diferentes diluciones con solución de arginina 0,66%, citrato sódico 2,7 mM y cloruro sódico 62,6 mM, a pH 7,0 y a 30ºC, de forma que las concentraciones finales de fibrinógeno fueron aproximadamente de: 5, 3, 1, 0,7 y 0,5 mg/ml
Cada solución diluida se filtró por 0,1 micras, justo antes de proceder a la nanofiltración por cartucho de 35 nm de poro (BMM-Planova 35N, de Asahi-Kasei) y 10 cm^{2} de área, Las condiciones de presión fueron las recomendadas por el fabricante: 0,2-1,0 bar; y la temperatura de 25-30ºC, en todas las filtraciones.
Los resultados de filtrabilidad y recuperación obtenidos se muestran en la tabla 1.
1
De los anteriores valores se deduce que la nanofiltración por 35 nm sólo es factible si la concentración de fibrinógeno es francamente diluida, preferentemente entre 1 y 0,5 mg/ml o inferior, alcanzándose valores aceptables de capacidad de filtración (g de fibrinógeno/m^{2}) y recuperación (>50% de fibrinógeno) dentro de este rango.
Obviamente, uno de los principales inconvenientes de nanofiltrar en condiciones muy diluidas reside en el excesivo volumen a filtrar y en la posterior concentración final del producto antes de dosificar, por lo que el óptimo se situará en el valor superior del rango establecido.
Incluso en las mejores condiciones de proceso se pone de manifiesto que el producto es nanofiltrable por 35 nm con dificultad, si se procede como se ha descrito, descongelando el producto y solubilizando totalmente el fibrinógeno a 30ºC.
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Ejemplo 3
Se procesó otro lote como se describe en el ejemplo 1 hasta obtener el precipitado III de glicina solubilizado y clarificado, una parte del cual se congeló a -70ºC para su conservación. El resto de la solución se procesó como se indica en el ejemplo 1 hasta producto final filtrado por 0,2 micras.
Se realizó una prueba comparativa de nanofiltración por 20 nm (Ultipor-DV20, de Pall) con discos de 47 mm de diámetro, utilizando material fresco (producto final filtrado por 0,2 micras sin congelar) y el correspondiente congelado, ambos a la concentración de 0,73-0,74 mg/ml de fibrinógeno, siendo la presión aplicada la recomendada por el fabricante de los filtros (Pall) de 2,2-2,8 bar.
En el caso del material congelado, se procedió previamente a la descongelación total a temperatura ambiente (Tª de la solución < 20ºC) y se clarificó por 0,5 micras. En ambos casos, tanto el material fresco como el congelado, se diluyeron convenientemente con solución de arginina al 2% (p/v), cloruro sódico 62,6 mM y citrato sódico 2,7 mM, pH 7,0 y a 30ºC, y se filtraron por 0,1 micras justo antes de nanofiltrar en escalón por 50 nm (DV50) y 20 nm (DV20) a la temperatura de unos 30ºC.
Los resultados de ambos procesos se resumen en la tabla 2.
2 
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La prueba con material fresco (sin congelar) se obtuvo una recuperación del 99,4% de proteína, sin embargo la cantidad máxima filtrable hasta el bloqueo del filtro DV20 fue solo de 23,7 g de fibrinógeno/m^{2}, y el caudal medio de 4,74 g de fibrinógeno/m^{2}/hora (23,7 dividido por 5,00).
En cambio, con el material congelado la recuperación fue del 99,7% de proteína y el filtro DV20 no se bloqueó al aplicar una carga de 30,1 g de fibrinógeno/m^{2}, siendo el caudal medio de 21,20 g de fibrinógeno/m^{2}/hora. Se observa claramente que con la etapa de congelación descongelación controlada es posible la nanofiltración de mas de 30,1 g de proteína, ya que en esta prueba no se detecta disminución anormal del caudal de filtrado, lo cual indicaría la ausencia de bloqueo del filtro.
El efecto de congelación/descongelación, ha quedado reflejado en la nanofiltración final por 20 nm, tanto con respecto a la cantidad máxima de fibrinógeno filtrable, que podría ser mucho mayor que 30,1 frente a 23,7 g/m^{2}, como por el caudal de filtración, de 21,20 frente a 4,74 g de fibrinógeno/m^{2}/hora, resultando 4,5 veces más alto. Obviamente, la superficie de nanofiltración por 20 nm puede ser reducida en la misma proporción, lo cual permite optimizar los elevados costes de nanofiltración que imposibilitarían en la práctica su introducción industrial para este tipo de proteínas de elevado peso molecular.
Ejemplo 4
Como consecuencia del anterior ejemplo 3, se buscaron las condiciones óptimas para llevar a cabo la descongelación del producto, con el fin de eliminar la mayor parte del material insoluble o insolubilizable, formado principalmente por agregados, y minimizar las pérdidas de fibrinógeno monodisperso.
Diferentes lotes procesados como en el ejemplo 1 hasta la solución congelada a -70ºC, se descongelaron en condiciones (temperatura y tiempo de fusión) controladas. Una vez descongelado el material se procedió a separar el material insoluble. La separación de dicho material se efectuó por malla de nylon de 20 micras de poro y a la misma temperatura que se descongeló el material congelado. Una vez separado el material insoluble se calentó la solución a 30ºC y se filtró por 0,45 micras (filtro CHVL de Millipore).
Se determinaron tanto el peso de material insoluble separado como la concentración de proteína (aproximada por densidad óptica a 280 nm) de la solución.
Los valores obtenidos se reflejan en la tabla 3.
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3 
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Los anteriores resultados ponen claramente de manifiesto que la cantidad de residuo insoluble formado esta relacionado con la temperatura de descongelación, correspondiéndose con el descenso de concentración de proteína (densidad óptica) del filtrado respecto a la solución inicial antes de congelar. Asimismo, la temperatura de fusión alrededor de 10ºC resulta adecuada para recuperar suficiente proteína y eliminar el material insoluble. Entre 9 y 19ºC se separan de 0,5 a 1,0 kg de material insoluble y se recupera del 83% al 87% de proteína. Es destacable que apenas se obtiene precipitado a 30,5ºC (0,1 kg) y no se detecta una disminución relevante de la proteína presente.
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Ejemplo 5
El efecto de las diferentes condiciones de descongelación del ejemplo 4 sobre la filtrabilidad del producto durante la nanofiltración se refleja en la tabla 4.
Los lotes procesados, descongelados y filtrados como se indica en el ejemplo 4, se diluyeron hasta una densidad óptica (280 nm) de 1,2-1,3 UA (0,8 mg/ml de fibrinógeno aproximadamente) con una solución de arginina al 2% (p/v) que contenía cloruro y citrato sódicos, a pH 7,0 y a 30ºC de temperatura. Se nanofiltraron en doble etapa, por 0,1 micra (CVVL de 30'') y 50 nm (DV50, 2 x 30''), y luego por 20 nm (DV20, 3 x 30''), a una presión de 2,2-2,8 bar en cada etapa.
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En cada proceso se determinó la capacidad de filtración (g de fibrinógeno/m^{2}, filtrados), el volumen enfrentado, la recuperación de fibrinógeno (por densidad óptica a 280 nm) y el tiempo de filtración. Los resultados se muestran en la tabla 4.
4
De los valores obtenidos se desprende que es posible nanofiltrar el fibrinógeno por 20 nm a escala industrial. Asimismo, los tiempos de filtración (o mejor los caudales) pueden correlacionarse con la temperatura de descongelación del material de partida del ejemplo 4, concluyéndose que, en la práctica, temperaturas inferiores a 20ºC, preferentemente entre 7 y 19ºC, serían las más convenientes para permitir la nanofiltración por 20 nm con una capacidad de producción y tiempo de proceso razonables, y sin excesivas mermas de producto por pérdidas durante la descongelación.
Se observa por lo tanto, que mediante la aplicación de la presente invención resulta posible efectuar la purificación de soluciones de fibrinógeno plasmático por nanofiltración, mediante filtros de un tamaño de poro nominal inferior a 35 nm en condiciones que posibilitan su aplicación industrial a la producción de fibrinógeno purificado como producto terapéutico.

Claims (15)

1. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, partiendo de una solución de fibrinógeno procedente de plasma humano previamente purificado, con una pureza igual o superior al 80% de fibrinógeno con respecto al total de proteínas, caracterizado por proceder a la estabilización y congelación de la solución y posterior descongelación de la misma a una temperatura comprendida entre 5 y 20ºC, procediendo después a la separación de los materiales insolubilizados y a la dilución de la proteína y nanofiltración de la solución resultante con filtros hasta un tamaño de poro inferior a 35 nm.
2. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la congelación, descongelación y nanofiltración se realiza en presencia de al menos un aminoácido.
3. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 2, caracterizado porque el aminoácido es arginina o glicina o combinaciones de ambos.
4. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación del material insolubilizado después de la congelación y descongelación se realiza por una malla.
5. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación del material insolubilizado después de la congelación y descongelación se realiza por decantación.
6. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación del material insolubilizado después de la congelación y descongelación se realiza por centrifugación.
7. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación del material insolubilizado después de la congelación y descongelación se realiza por filtración directa o por gradiente de filtros.
8. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la separación del material insolubilizado después de la congelación y descongelación se realiza por combinación de las técnicas de las reivindicaciones 4 a 7.
9. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución resultante de la separación del material insolubilizado es diluida a una concentración inferior o igual a 1,5 mg/ml de fibrinógeno.
10. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución es ajustada a una temperatura comprendida entre 18 y 37ºC antes de la nanofiltración.
11. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado por proceder a una prefiltración de la solución de fibrinógeno por filtros de tamaño de poro superior o igual a 35 nm antes de la nanofiltración por filtros de poro inferior a 35 nm.
12. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie filtrante necesaria para la nanofiltración por filtros de poro inferior a 35 nm está comprendida entre 10 y 1000 cm^{2} por litro de solución a filtrar.
13. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura de descongelación está comprendida entre 8 y 13ºC.
14. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración del aminoácido es superior a 0,1%.
15. Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la reivindicación 14, caracterizado porque la concentración de aminoácido está comprendida entre 0,1 y 8%.
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