BR112016028955B1 - métodos para produção de hemocianina de lapa californiana sintética, de imunocianina e de remoção de vírus de uma preparação de hemocianina, hemocianina de lapa californiana sintética, e, imunocianina sintética - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE HEMOCIANINA DE LAPA CALIFORNIANA SINTÉTICA, DE IMUNOCIANINA E DE REMOÇÃO DE VÍRUS DE UMA PREPARAÇÃO DE HEMOCIANINA, HEMOCIANINA DE LAPA CALIFORNIANA SINTÉTICA, E, IMUNOCIANINA SINTÉTICA A presente invenção se refere à provisão de soros de hemolinfa biologicamente seguros, preferivelmente hemocianina, mais preferivelmente KLH (Hemocianina de Lapa Californiana). É provido um método para produzir hemocianina livre de vírus.

Description

MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE HEMOCIANINA DE LAPA CALIFORNIANA SINTÉTICA, DE IMUNOCIANINA E DE REMOÇÃO DE VÍRUS DE UMA PREPARAÇÃO DE HEMOCIANINA, HEMOCIANINA DE LAPA CALIFORNIANA SINTÉTICA, E, IMUNOCIANINA SINTÉTICA ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao fornecimento de um soro de hemolinfa biologicamente seguro, preferencialmente hemocianina, mais preferencialmente KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin, hemocianina de lapa californiana).

[002] A hemocianina é uma proteína de cobre azul que ocorre sob uma forma livremente dissolvida no sangue de numerosos moluscos e artrópodes e transporta oxigênio. Dentre os moluscos, os cefalópodes, quítons, a maioria dos gastrópodes e alguns bivalves contêm hemocianina. Dentre os artrópodes, a hemocianina é típica de aracnídeos, xifosuros, Scutigera e crustáceos Malacostraca. Numerosas espécies de insetos contêm proteínas que são derivadas de hemocianina. As hemocianinas estão presentes no meio extracelular e flutuam na hemolinfa.

[003] Embora a hemocianina de artrópodes tenha um diâmetro máximo de 25 nm sob um microscópio eletrônico e uma subunidade tenha um peso molecular médio máximo de 75.000 dáltons (Da), as cianinas de moluscos são muito maiores. Dessa forma, por exemplo, a hemocianina de Megathura tem um diâmetro de 35 nm e é composta de 2 subunidades. Cada subunidade tem um peso molecular médio máximo de aproximadamente 400.000 Da e é dividida em oito domínios de ligação de oxigênio, cada um dos quais tem um peso molecular de aproximadamente 50.000 Da. Os domínios diferem imunologicamente.

[004] A hemocianina de gastrópodes visível sob um microscópio eletrônico tem um peso molecular médio de aproximadamente 8 milhões Da e é um didecâmero. Em contraste com esta, a hemocianina de cefalópodes está arranjada como um decâmero isolado, que também difere significativamente da hemocianina de gastrópodes em estrutura quaternária.

[005] Tradicionalmente, a hemocianina era obtida de hemolinfa da Megathura crenulata. Mais recentemente, o mercado de hemocianinas de gastrópodes tem-se expandido para incluir hemocianina de Haliotis tuberculata e de Concholepus concholepus. A hemolinfa de outros moluscos gastrópodes também está sob investigação para propriedades úteis.

[006] A hemocianina da lapa californiana Megathura crenulata é de interesse imunológico específico. A hemocianina é, portanto, também, chamada de hemocianina de lapa californiana (KLH). As hemocianinas são antígenos muito potentes. A imunização de um vertebrado resulta em uma ativação inespecífica do sistema imune que até o presente não está muito bem entendida. Pela ativação geral do sistema imune, é então possível realizar uma reação imune com outras estruturas estranhas que têm sido previamente toleradas. A KLH é usada, sobretudo, como uma carreadora de hapteno a fim de, dessa forma, realizar a formação de anticorpos contra o hapteno.

[007] Além de Megathura crenulata, o abalone Haliotis tuberculata pertence, outrossim, ao grupo Archaegastropoda, que é relativamente antigo com respeito à evolução. É sabido que Haliotis também produz hemocianina.

[008] A KLH nativa é encontrada na hemolinfa (pH 6,0 a 8,0) em solução coloidal como um didecâmero (peso molecular: cerca de 8 milhões Da) e como multidecâmeros (peso molecular: 12 milhões Da a cerca de 32 milhões Da). A distribuição quantitativa destes agregados varia. Os didecâmeros e multidecâmeros de KLH são compostos de 2 tipos de subunidades com um peso molecular médio de cerca de 400.000 Da. Os dois tipos diferentes de subunidades e também os dois tipos diferentes de agregação são devido ao fato de que a KLH nativa é uma mistura de dois tipos diferentes KLH1 e KLH2.

[009] A KLH é uma mistura de duas hemocianinas diferentes, que são chamadas de KLH1 e KLH2. A subunidade de KLH1 é um polipeptídeo de 390 kDa que consiste em oito domínios globulares chamados de 1a a 1h de acordo com a sequência deles na subunidade. Por outro lado, a KLH2 tem um peso molecular de 360 kDa e de acordo com os dados mais recentes também contém 8 domínios, chamados de 2a a 2h. Cada tipo in vivo de subunidade forma homo-oligômeros, enquanto que não têm sido observados hetero-oligômeros.

[0010] As hemocianinas podem ser obtidas em fazendas de animais de teste. Os métodos descritos para a coleta de hemolinfa envolvem a inserção de uma agulha em um músculo do pé para penetrar o seio pedal sanguíneo (Harris et al, “Keyhole Limpet Haemocyanin: Negative Staining in the Presence of Trehalose”, Micron, 26 (1): 25-33 (1995). Sistemas semiautomáticos foram estabelecidos para permitir a coleta de grandes quantidades de hemolinfa sem matar os animais. Os procedimentos de fabricação permitem extrair quantidades comerciais de hemocianina dos animais crescidos em um ambiente controlado (WO 02/085389, US2002/192633).

[0011] Há uma variedade de métodos bem conhecidos para purificar as hemocianinas a partir da hemocianina bruta, que é uma fonte biológica de hemocianinas. Estes métodos incluem centrifugação diferencial, cromatografia de permeação em gel, e cromatografia de troca iônica (Patente U.S. n° 5.407.912). As hemocianinas purificadas estão disponíveis para comercialização sob muitas formas.

[0012] A incorporação de hemocianinas em novos produtos terapêuticos promissores (consulte, por exemplo, Jurincic-Winkler et al., “Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocianina (KLH) Treatment in Patients with Superficial Bladder Carcinoma”, Anticancer Res, 16 (4A): 2105-10 (1996); e Biomira, Inc. Company Press Release, Biomira.com, 2001) tem resultado na necessidade de um fornecimento sustentável de quantidades comerciais de hemocianina produzidas sob condições que atendam aos padrões de saúde e de segurança exigidos pela “United States Food and Drug Administration” e outras agências regulatórias.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] Devido à sua origem nativa, as hemocianinas como KLH, apresentam o risco para biocontaminação por patógenos como ingredientes patogênicos do sague, como toxinas, bactérias, incluindo endotoxinas produzidas pelas mesmas, e também vírus.

[0014] Portanto um objetivo da presente invenção é fornecer meios e maneiras a fim de minimizar a biocarga pelos patógenos na hemocianina nativa. Este inclui o objetivo adicional de fornecer um processo com o qual pode ser preparada hemocianina segura e elevadamente pura.

[0015] Os presentes inventores têm identificado que o sangue e a hemolinfa obtidos de moluscos imediatamente coletados do mar podem estar contaminados por vírus, bactérias, toxinas ou endotoxinas. Há, dessa forma, uma necessidade de reduzir a contaminação nos moluscos e no sangue obtido dos mesmos ou na hemolinfa obtida dos mesmos.

[0016] Convencionalmente, para a remoção de vírus há diferentes processos que podem ser usados: inativação de vírus, por exemplo o tratamento da proteína usando o método de detergente/solvente, radiação ionizante, tratamento térmico (ca. 60°C) e a incubação em valores de pH < 3. Estes processos não podem ser utilizados no tratamento de hemocianinas como KLH porque resultam em uma desnaturação da proteína. Devido à estrutura de peso molecular alto da KLH, ela é extremamente sensível a estes métodos inativadores. Também não podem ser utilizadas outras abordagens, como nanofiltração de vírus, que têm sido desenvolvidas nos últimos recentes anos. Estes filtros não permitem uma taxa de remoção viral significativa devido à pequena diferença de tamanho entre a contaminação viral e a proteína alvo. A filtração em gel que funciona pela separação do peso molecular também não é adequada para a remoção de contaminantes virais porque o tamanho dos vírus não varia significativamente daqueles das hemocianinas.

[0017] Dessa forma, há uma necessidade de fornecer meios novos para reduzir a carga viral em hemocianinas e para a separação de vírus das hemocianinas.

[0018] Para solucionar os problemas acima, a presente invenção fornece os métodos e os compostos e as composições apresentados (apresentadas) abaixo.

[0019] Em um primeiro aspecto a presente invenção fornece um método para a preparação de soro de hemolinfa de um molusco, o método compreendendo uma etapa de punctura do seio pedal sanguíneo do molusco sob narcose fria.

[0020] Preferencialmente, o molusco é Megathura crenulata. Outros moluscos são, por exemplo, Haliotis tuberculata (Abalone Europeu), Haliotis rubra (Abalone Australiano).

[0021] Em uma modalidade preferida, durante a punctura o molusco é mantido sob condições de quarentena específicas, nas quais os moluscos após serem obtidos de suas fontes naturais são mantidos em um sistema de aquário de quarentena sob condições, nas quais não é fornecido alimento orgânico e/ou a água no sistema de aquário é purificada pela remoção de contaminantes biológicos. A remoção de contaminantes biológicos pode incluir biofiltração, escumação de proteína, etc.

[0022] O sangue obtido sob punctura pode ser posteriormente esterilizado, preferencialmente pelo uso de uma filtração com membrana de 0,2 μm.

[0023] Em um segundo aspecto a presente invenção fornece um método para isolamento de hemocianina nativa compreendendo a obtenção de soro de hemolinfa, como aquele obtido no método do primeiro aspecto, e o isolamento da hemocianina, como KLH, do soro de hemolinfa, preferencialmente pela utilização de cromatografia direta.

[0024] Em uma modalidade preferida, a cromatografia direta é uma cromatografia de troca iônica.

[0025] O método pode adicionalmente incluir uma etapa de dissociação da hemocianina em subunidades do oligômero de hemocianina. Também é opcionalmente realizada uma etapa de purificação das subunidades de hemocianina. Opcionalmente, é realizada uma etapa de reassociação das subunidades para a forma oligomérica da hemocianina.

[0026] Em uma modalidade preferida a purificação de subunidades de hemocianina é realizada incluindo uma etapa de nanofiltração a fim de remover a contaminação biológica potencial.

[0027] Preferencialmente, a reassociação ocorre compreendendo uma etapa de diafiltração ou uma etapa de diálise.

[0028] A hemocianina reassociada pode ser finalmente purificada por filtração em gel.

[0029] Preferencialmente, a hemocianina é misturada com um sistema tamponante estabilizante para armazenamento de longo prazo.

[0030] Neste aspecto, também é fornecido um método para produção de hemocianina sintética como KLH sintética, compreendendo uma etapa de dissociação da hemocianina, por exemplo KLH nativa, para obter subunidades, nanofiltração das subunidades assim obtidas usando filtros removedores de vírus, preferencialmente nanofiltros com um tamanho de poro entre 15 nm e 35 nm, mais preferencialmente entre 20 nm e 25 nm e reassociação das subunidades obtidas após a nanofiltração para obter a hemocianina sintética, preferencialmente a KLH sintética.

[0031] Em uma modalidade preferida, as subunidades são imunocianina. Mais preferencialmente, as subunidades são menores que 800.000, 500.000, 400.000, 350.000 ou 300.000 dáltons, respectivamente. Com a máxima preferência, as subunidades estão entre 300.000 e 500.000 dáltons.

[0032] Neste aspecto da invenção, a dissociação de hemocianina em subunidades é realizada pela aplicação de um pH entre 8 e 10, preferencialmente entre 9 e 10. Preferencialmente, a dissociação ocorre em um pH alcalino entre 8 e 10, preferencialmente entre 9 e 10 sob a remoção dos cátions bivalentes cálcio (Ca++) e magnésio (Mg++). A remoção de Ca++ e Mg++ pode ser realizada pela adição de um agente formador de quelato, por exemplo EDTA. Sob estas condições, a KLH nativa dissocia-se em subunidades. Tem sido descoberto que a dissociação é reversível, isto é, as subunidades podem ser reassociadas pelo reestabelecimento de um valor de pH neutro (entre 6 e 9, preferencialmente entre 7 e 8) para uma mistura heterogênea de didecâmeros e muldidecâmeros, preferencialmente se os íons Ca++ e Mg++ estiverem adicionados. Uma modalidade de máxima preferência para a dissociação da hemocianina como KLH nativa, é a seguinte: a hemocianina é estabilizada em um tampão estabilizante em um pH neutro incluindo os íons Ca++e Mg++, preferencialmente um tampão incluindo TRIS/HCl em um pH entre 7 e 8. Neste tampão, a hemocianina ainda está em sua forma nativa sem desnaturação. É adicionado um tampão alcalino que está na faixa entre 8 e 10, preferencialmente entre 9 e 10. Com a máxima preferência, a temperatura está abaixo de 10°C, com a máxima preferência abaixo de 5°C, especialmente entre 2°C e 8°C. Os agentes tamponantes alcalinos preferidos compreendem glicina e NaOH. Outros agentes tamponantes preferidos incluem o tampão TRIS/HC1 de pH 8,9, o tampão TRIS/HCl de pH 8,9 mais EDTA, o tampão fosfato de sódio de pH 8,0, o tampão carbonato de amônio de pH 8,0, o tampão bicarbonato de sódio de pH 10,1, o tampão bicarbonato de sódio de pH 9,5, NaCl e/ou EDTA podem ser adicionados aos agentes tamponantes. As concentrações típicas de tampão são de 1 mM a 100 mM, preferencialmente de 2 mM a 50 mM, mais preferencialmente de 10 mM a 20 mM. Se EDTA for adicionado, ele será usado em uma concentração de 1/10 a 1/2 comparada com a concentração do tampão. Se NaCl for adicionado serão consideradas concentrações iguais àquelas do EDTA. O tampão pode incluir EDTA e/ou NaCl.

[0033] A solução de subunidades assim obtida (ou a solução de imunocianina) é mantida no pH alcalino (entre 8 e 10, preferencialmente entre 9 e 10) e pode ser armazenada durante mais que um mês, mais que dois meses, com a máxima preferência mais que três meses, a uma temperatura abaixo de 10°C, mais preferencialmente entre 2°C e 8°C.

[0034] As subunidades, por exemplo a imunocianina, podem estar isentas de uma contaminação viral. Foi previamente comprovado que a nanofiltração efetivamente remove vários vírus das soluções de proteína.

[0035] Entretanto, os presentes inventores descobriram que devido ao tamanho enorme e ao comportamento de agregação dos isômeros de KLH, a nanofiltração não pode ser aplicada para a KLH sob sua forma nativa. O deslocamento do peso molecular de KLH nativa de maior que 8 milhões dáltons para um peso molecular menor que 500.000 dáltons, tipicamente para um peso molecular uniforme de aproximadamente 400.000 dáltons das subunidades de KLH (imunocianina), entretanto, produziu a base para a remoção de vírus realizada pelos presentes inventores. As nanofiltrações podem ser realizadas com nanofiltros disponíveis para comercialização. Tipicamente, estes filtros tem um tamanho de poro de 15 nm a 35 nm, mais preferencialmente entre 20 nm e 25 nm. Tais filtros estão disponíveis para comercialização com cápsulas filtrantes, por exemplo cápsulas filtrantes Planova. Em uma modalidade, tais nanofiltros são uma unidade de uso único. Os nanofiltros podem utilizar uma membrana microporosa de fibras ocas fracamente ligante de proteínas construída de celulose regenerada de cupramônio naturalmente hidrofílica com uma estreita distribuição de poros. Uma faixa ampla de áreas superficiais efetivas pode ser aplicada entre 0,001 m2 e até 4 m2, preferencialmente entre 0,01 m2 e 0,3 m2.

[0036] Os presentes inventores descobriram que a aplicação de nanofiltração nas subunidades de hemocianina (imunocianina) sob condições típicas de nanofiltros comerciais não foi muito efetiva. Tipicamente, as proteínas são nanofiltradas pela utilização de uma suspensão ou solução de proteínas e pelo bombeamento da suspensão ou solução de proteínas com uma taxa de fluxo constante entre 0,01 e 10 mL/minuto, mais preferencialmente entre 0,1 e 1 mL/minuto para dentro do filtro de modo que a superfície do nanofiltro esteja perpendicular à direção de fluxo. Uma tal abordagem é efetiva em remoção de vírus. Infelizmente, devido ao alto peso molecular das subunidades de KLH (imunocianina), os filtros de vírus retêm não apenas vírus, mas também grandes quantidades de proteína. A clássica filtração de vírus com um fluxo perpendicular à superfície do filtro é também conhecida como “filtração de extremidade morta”. Os presentes inventores descobriram que a filtração de extremidade morta não é preferida para a remoção de vírus em imunocianina, ou subunidades de hemocianina. A hemocianina, mesmo após a dissociação, não pode ser nanofiltrada sem uma grande perda de proteína. O Exemplo 2 compara a “filtração de extremidade morta” com o modo preferido de filtração da presente invenção descrito aqui abaixo. A filtração de extremidade morta resulta em uma perda de proteína maior que 40%, maior que 60% ou mesmo maior que 80%.

[0037] Consequentemente, houve uma necessidade para o fornecimento de uma abordagem de filtração de vírus modificada e melhorada. Os presentes inventores descobriram que os mesmos nanofiltros, conforme descritos acima, precisam ser manuseados em uma maneira nova e modificada: a suspensão ou solução de proteínas precisa ser bombeada com um fluxo paralelo à superfície da membrana. A taxa de fluxo pode estar entre 0,01 e 100 mL/minuto, preferível entre 0,1 e 100 mL/minuto, mais preferencialmente entre 1 e 70 mL/minuto. A pressão aplicada na suspensão ou solução de proteínas é menor que 0,1 MPa, preferencialmente menor que 10 kPa. A suspensão ou solução de proteínas é bombeada ou flui sobre a superfície da membrana, preferencialmente em uma maneira repetida, mais preferencialmente, sob a adição de mais suspensão ou solução de proteínas contendo subunidades de hemocianina de modo que seja estabelecido um ciclo incluindo um fluxo de material de partida. A nanofiltração ocorre preferencialmente em um tampão alcalino, com a máxima preferência no tampão alcalino usado para a dissociação. O fluxo de material de partida sobre o filtro está preferencialmente em uma faixa de concentração de entre 0,1 e 10 mg/mL, mais preferencialmente entre 0,1 e 1 mg/mL, com a máxima preferência entre 0,3 e 7 mg/mL. O rendimento de proteína após a filtração é maior que 80%, mais preferencialmente maior que 90%, mais preferencialmente maior que 93%.

[0038] Os presentes inventores têm estabelecido que com esta abordagem de nanofiltração, aqui denominada de filtração de “Fluxo Cruzado” com a direção de fluxo paralela à superfície da membrana do nanofiltro, é possível purificação de proteína quase quantitativa. Consequentemente, a filtração é adequada para a produção de subunidades de hemocianina ou imunocianina comercialmente relevantes.

[0039] Os presentes inventores também estabeleceram que a carga viral pode ser suficientemente reduzida. Com os métodos da presente invenção, preferencialmente com a filtração de fluxo cruzado, pelo menos 99,9% dos vírus são removidos do material de proteína. O denominado fator de redução logarítmica é uma medição da remoção de vírus. O fator de redução logarítmica (FRL) é a quantidade de vírus removida da formulação de solução de proteínas inicial, isto é, proteína ou suspensão de proteína, expressada em uma escala logarítmica (escala logarítmica decimal). Um FRL de 1 significa que 90% dos vírus são removidos, 10% dos vírus são retidos. Um FRL de 2 significa que 99% dos vírus são removidos, 1% dos vírus são retidos. Um FRL de 3 significa 99,9% dos vírus são removidos, 0,01% dos vírus são retidos. Com a filtração de fluxo cruzado da presente invenção, é obtido um FRL de 2 ou maior, mais preferencialmente é obtido um FRL de 3 ou maior. Mais preferencialmente, é obtido um FRL de 4 ou maior.

[0040] A prova de conceito é mostrada no Exemplo 3 (estudo de praticabilidade da filtração de fluxo cruzado). Neste experimento, foi utilizado um filtro Planova de 20 nm com uma superfície de filtro de 0,12 m2. A taxa de fluxo foi 50 mL/minuto. Foi adicionada uma carga de vírus total de 10.620 (0,5% da composição de proteína). O vírus utilizado para propósitos de teste foi PPV, um dos vírus mais diminutos (diâmetro de 20 nm). Foi obtido um rendimento de proteína de 97% (4.662,4 g de proteína purificada em comparação com 4.814,9 g de pré-filtrado). O FRL foi 3,14 ± 0,32.

[0041] O filtrado obtido pode ser usado para propósitos terapêuticos (preparações de imunocianina). Consequentemente, é fornecido pela presente invenção um método para produção de imunocianina compreendendo as etapas de dissociação de hemocianina nativa para obter subunidades e nanofiltração das subunidades assim obtidas através de um filtro com um tamanho de poro entre 15 nm e 35 nm.

[0042] Preferencialmente, a filtração é filtração de fluxo cruzado. Mais preferencialmente, a quantidade de uma proteína obtida é maior que 60%, maior que 70%, preferencialmente maior que 80%, mais preferencialmente maior que 90%, com a máxima preferência maior que 93% de imunocianina ou de subunidades de hemocianina.

[0043] Em uma outra modalidade, a imunocianina ou as subunidades de hemocianina são reassociadas após a nanofiltração para obter uma hemocianina “sintética”, preferencialmente KLH “sintética”. A reassociação é realizada pelo reestabelecimento de um valor de pH neutro. A suspensão de proteínas ou a solução de proteínas é reassociada para uma mistura heterogênea de didecâmeros ou multidecâmeros pelo deslocamento do pH para a faixa de entre 6 e 9, preferencialmente entre 7 e 8. Em uma modalidade mais preferida, a reassociação é realizada pela adição de íons Ca++ e Mg++. Mais preferencialmente, a quantidade de cada um dos íons Ca++ e Mg++ é menor que 0,5 M. Mais preferido, são utilizados agentes tamponantes como TRIS/HCl de 0,05 mM a 0,1 M de pH 7,4, opcionalmente juntos com MgCl2 entre 0,05 M e 0,2 M, e/ou CaCl2 entre 0,05 M e 0,2 M, e/ou NaCl entre 0,15 M e 0,3 M. Outros agentes tamponantes são glicina/NaOH de pH 7,4, ou fosfato de sódio, de pH 7,4.

[0044] Consequentemente, a presente invenção em uma modalidade fornece um método para produção de KLH sintética ou de hemocianina sintética compreendendo as etapas de dissociação de KLH nativa para obter subunidades, nanofiltração das subunidades assim obtidas usando filtros com um tamanho de poro entre 15 nm e 35 nm e reassociação das subunidades obtidas após a nanofiltração para obter a hemocianina sintética ou a KLH sintética. Preferencialmente a filtração é uma filtração de fluxo cruzado, mais preferencialmente uma filtração de fluxo cruzado conforme descrita acima. Tipicamente, a quantidade de proteína obtida é maior que 60% por quantidade de KLH nativa. Mais preferencialmente, a quantidade de proteína obtida (de KLH sintética ou de hemocianina sintética) é maior que 70%, mais preferencialmente maior que 80%, com a máxima preferência maior que 90% ou 93% por quantidade de KLH nativa.

[0045] A presente invenção em um terceiro aspecto fornece a hemolinfa obtida pelo método do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto, a hemolinfa ou as subunidades de hemocianina obtida(s) pelos métodos do segundo aspecto da invenção. Este aspecto inclui o fornecimento de imunocianina, que é uma mistura de subunidades da hemocianina em sua razão de ocorrência na natureza.

[0046] Em um quarto aspecto, são fornecidas a hemolinfa, a hemolinfa ou as subunidades de hemocianina do terceiro aspecto para uso como um medicamento.

[0047] Este aspecto também abrange uma composição farmacêutica compreendendo a hemolinfa, a hemolinfa ou as subunidades de hemocianina do terceiro aspecto.

[0048] As composições farmacêuticas ou os medicamentos são por exemplo para uso no tratamento de câncer, preferencialmente de câncer de bexiga, ou como um imunoestimulante ou carreador.

[0049] De acordo com um quinto aspecto são fornecidas subunidades de hemocianina, que são o resultado de uma dissociação seletiva de hemocianina produzida de acordo com o segundo aspecto.

DETALHES DA INVENÇÃO

[0050] Em um primeiro aspecto da invenção é fornecido um método para a preparação, em quantidades comerciais, de soro de hemolinfa de moluscos como Megathura crenulata, baixo em endotoxina/baixo em biocarga.

[0051] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada ao método para preparação de um material de partida de grau farmacêutico derivado de moluscos, preferencialmente de lapas californiana. A qualidade baixa em endotoxinas/baixa em biocarga de soro de hemolinfa é alcançada pela aplicação de um procedimento de quarentena específico nas lapas provenientes de fonte natural ou de aquacultura. O projeto patenteado do “Sistema de Aquários em Quarentena” [Quarantine Aquaria System] resulta em redução significativa de contaminação biológica, isto é, de bactérias, endotoxinas e vírus.

[0052] Um ponto chave deste primeiro aspecto da invenção é o tratamento de moluscos em um sistema de aquário em quarentena. Os animais são mantidos sob condições de temperatura específicas e/ou os aquários em quarentena incluem meios para a remoção de proteínas como um escumador centrífugo de proteínas e/ou um ou mais biofiltros.

[0053] Preferencialmente, água do mar artificial é usada no aquário e mais preferencialmente, uma circulação rápida da água do mar artificial é utilizada para tratar os moluscos. A corrente dentro do aquário pode imitar uma zona de surfe no mar. Os contaminantes biológicos podem ser removidos por espumação extensiva e/ou biofiltração da água em quarentena.

[0054] O sistema de aquário do primeiro aspecto resulta na redução dos contaminantes biológicos. Ele remove excrementos efetivamente e assim resulta na remoção de bactérias e de endotoxinas bacterianas. Durante o tratamento no aquário, os animais são preferencialmente não alimentados, o que, de novo, minimizou o teor de ingredientes orgânicos e resulta em uma redução de contaminações.

[0055] A condutividade, o valor de pH, e o potencial redox da água do mar são preferencialmente controlados e medidos permanentemente.

[0056] A temperatura da água no ambiente natural das lapas californiana está entre 10°C e 20°C, preferencialmente entre 12°C e 16°C; portanto é exigido o esfriamento da água no aquário. Para este propósito um trocador de calor pode estar localizado dentro do reservatório. A temperatura da água é monitorada por sensores de temperatura no tanque, controlando as unidades de esfriamento para a temperatura alvo de ajuste (14°C±2°C).

[0057] A água no aquário é preferencialmente água do mar artificial, isto é, água que é de condutividade e de pH controlados, e preferencialmente de potencial redox controlado, e mais preferencialmente de teor de sal adicionado controlado para parece-se com a água do mar. Por exemplo, o valor de condutividade está entre 46 e 52 mS/cm e o pH entre 7,5 e 8,5. Em uma modalidade, a densidade pode estar na faixa de 1,020 a 1,030. É preferido um potencial redox >100.

[0058] A liberação dos animais para punctura exige um dia, preferencialmente dois, mais preferencialmente três dias, mais preferencialmente quatro dias, mais preferencialmente cinco dias, mais preferencialmente seis dias, mais preferencialmente sete dias, mais preferencialmente 10 dias, com a máxima preferência 13 dias de manutenção de animais no aquário.

[0059] O procedimento de quarentena de animais da invenção, em nossa instalação, ajuda na redução da biocarga. Por exemplo o teor de coliformes dos animais pode ser reduzido sob cultura sob condições de quarentena.

[0060] Sob quarentena, os animais são puncionados em seu seio pedal sanguíneo sob narcose fria.

[0061] Um segundo ponto chave do primeiro aspecto da presente invenção, consequentemente, é o procedimento para a punctura dos moluscos. Antes da punctura (“extração de hemolinfa”), os moluscos são removidos do aquário, podem ser examinados visualmente, são preferencialmente lavados, e transferidos para dentro de uma instalação em recinto limpo.

[0062] Os animais são preferencialmente transferidos para dentro de uma instalação em recinto limpo, onde os animais são enxaguados usando solução isotônica de hemolinfa (HIS, Hemolymph Isotonic Solution), uma solução de cloreto de sódio patenteada cuja concentração de sal é isotônica com os soros de animais.

[0063] Os animais são pesados, e deixados em prateleiras de punctura pré-ajustadas.

[0064] Durante esta operação é, preferencialmente, tomado o cuidado, para não causar lesões internas, especialmente no sistema intestinal, por causa de dois motivos: primeiro, para evitar a contaminação do produto com a matéria fecal e, segundo, para evitar a morte do animal. Se ocorrer lesão acidental do trato intestinal, conforme indicada pelo soro de hemolinfa fecalmente contaminado, o material é rejeitado.

[0065] Após a desinfecção, uma punctura pode ser realizada no terço traseiro da base do pé com uma agulha que compreende uma cânula lombar. Uma entrada da cânula pode ser inserida dentro do músculo do pé e pode ser empurrada mais para dentro até que o seio pedal seja alcançado. Nem a cavidade bucal nem o seio cardíaco são preferencialmente puncionados.

[0066] Em uma modalidade, após a completitude da extração de sangue, solução isotônica estéril é injetada, preferencialmente através da cânula, e vazamento de líquido é examinado para determinar se o seio sanguíneo foi alcançado, o que é indicado pelo fluido azul.

[0067] Em uma modalidade preferida da presente invenção, 10 a 60 mL, mais preferencialmente 30 a 50 mL ou 10 a 20 %, preferencialmente 12 a 15% do peso corporal do animal, de hemolinfa são coletados em um tubo de centrífuga estéril.

[0068] Em uma modalidade, a hemolinfa que foi coletada é substituída por solução HIS.

[0069] A hemolinfa é preferencialmente refrigerada entre 2°C e 8°C e pode ser combinada.

[0070] Os animais são preferencialmente transferidos de volta, lavados e retornados para os tanques de aquários de recuperação em nossa instalação. Os animais podem ser monitorados durante 1 dia a 4 dias e retornados para seu ambiente natural. Este método permite que os moluscos sejam retornados vivos para o oceano.

[0071] De acordo com um terceiro ponto chave do primeiro aspecto, o sangue obtido pode ser purificado e esterilizado por filtração com membrana de 0,2 μm.

[0072] Antes da combinação, é preciso que as frações de hemolinfa mostrem que correspondem às especificações do IPC (In Process Control, controle em processo) realizado nas amostras individuais. As frações de hemolinfa frias são combinadas em um frasco estéril descartável e bem misturadas, enquanto o espumamento é evitado.

[0073] Em um segundo aspecto da invenção é fornecido um método para a preparação, em quantidades comerciais, de hemocianina ou de subunidades de hemocianina de moluscos como Megathura crenulata, baixa(s) em endotoxinas/baixa(s) em biocarga.

[0074] Preferencialmente, o método é capaz de produzir, em quantidades comerciais, hemocianina estandardizada molecular isenta de vírus, segura, por exemplo KLH, ou subunidades de hemocianina, por exemplo subunidades KLH.

[0075] O método compreende o isolamento de hemocianina de soro de hemolinfa, preferencialmente via cromatografia direta, mais preferencialmente via cromatografia de troca iônica.

[0076] O método preferencialmente compreende uma etapa de dissociação de hemocianina nas subunidades de hemocianina.

[0077] O método pode também compreender uma etapa de purificação de subunidades de hemocianina.

[0078] O método preferencialmente também compreende uma etapa de nanofiltração. Nesta etapa os vírus podem ser separados das subunidades de hemocianina, isto é, a etapa é realizada a fim de remover a contaminação virológica potencial.

[0079] O método preferencialmente também compreende uma etapa de reassociação da hemolinfa a partir das subunidades.

[0080] Soro de hemolinfa baseados em sua origem proveniente de um molusco marinho contém além da hemocianina e outros componentes séricos, teores altos de cloreto de sódio e de outros minerais. A condutividade do soro de hemolinfa baseado em seu alto teor de sal é, em média, cerca de 50 mS/cm. Para realizar a ligação quantitativa de hemocianina, por exemplo de KLH, a condutividade tem que ser reduzida para < 20 mS/cm.

[0081] A fim de reduzir a condutividade, conforme descrito acima, o soro de hemolinfa pode ser parcialmente dessalinizado por métodos adequados com filtração em gel, eletrodiálise, diafiltração ou diluição. A remoção de sais resulta em precipitação dos outros componentes do soro, isto é, proteína e carboidratos. O precipitado pode ser removido por centrifugação em velocidade lenta, filtração profunda ou filtração com membrana (0,8 μm, 0,45 μm).

[0082] Subsequentemente a KLH coloidal de peso molecular alto dissolvida pode ser isolada por procedimentos de cromatografia, isto é, cromatografia de troca iônica, que pode ser, então, seguida por dissociação e purificação de subunidades.

[0083] São possíveis dois métodos preferidos de dissociação de hemocianina nativa, como KLH: dissociação in situ em um coluna de captura de troca iônica ou dissociação por diafiltração.

[0084] As subunidades de hemocianina obtidas podem ser purificada por um etapa adicional de cromatografia de troca iônica e finalmente refinada por filtração em gel.

[0085] A proteína hemocianina nativa ligante de oxigênio, em uma modalidade, é purificada a partir da hemolinfa por cromatografia de troca iônica. A hemolinfa é ligada a um trocador de ânions e então dissociada na coluna para as subunidades de KLH (imunocianina) em tampão alcalino (pH 7 a 10, preferencialmente pH 8,6 a 9,6). A imunocianina é recuperada da coluna por meio de eluição em gradiente salino. A solução de imunocianina resultante pode ser dessalinizada e concentrada por diafiltração/ultrafiltração. A solução de imunocianina concentrada pode ser subsequentemente purificada por uma etapa adicional de cromatografia de troca iônica.

[0086] Em uma outra modalidade, a proteína hemocianina nativa ligante de oxigênio é purificada a partir da hemolinfa por cromatografia de troca iônica. A hemolinfa é ligada a um trocador de ânions e então recuperada da coluna por meio de eluição em gradiente salino. A solução de hemocianina resultante é dessalinizada, concentrada e dissociada em subunidades de KLH (imunocianina) por meio de diafiltração, diálise ou ultrafiltração em tampão alcalino (pH 7 a 10, preferencialmente pH 8,6 a 9,6). Finalmente a solução de imunocianina pode ser concentrada seguida por uma etapa adicional de cromatografia de troca iônica.

[0087] Em uma outra modalidade, a proteína hemocianina nativa ligante de oxigênio é purificada a partir da hemolinfa por Cromatografia de Troca Iônica. A hemolinfa é ligada a um trocador de ânions e então recuperada da coluna por meio de eluição em gradiente salino. A hemolinfa da solução de hemocianina resultante é isolada por meio de ultracentrifugação. Subsequentemente os grânulos de hemocianina resultantes são dissolutos e dissociados em subunidades de KLH (imunocianina) em tampão alcalino (pH 7 a 10, preferencialmente pH 8,6 a 9,6). Finalmente a solução de imunocianina pode ser concentrada seguida por uma etapa adicional de cromatografia de troca iônica.

[0088] A fim de realizar a dissociação de hemocianina, em geral, a hemolinfa pode ser dissolvida em tampão de dissociação (pH 8 a 10, preferencialmente pH 8,6 a 9,6, preferencialmente isento de Ca++ e Mg++). Isto produz condições alcalinas, que resultam na dissociação da molécula de hemolinfa nativa em suas subunidades.

[0089] A solução de imunocianina pode ser concentrada. Antes da purificação final (refino), por exemplo por filtração em gel, a solução de imunocianina pode ser concentrada para um teor de proteína de 20 mg/mL (± 2,5 mg/mL), por exemplo por ultrafiltração. Para este propósito, membranas de poli(éter-sulfona) ou de polissulfona fracamente ligantes de proteína (limite de separação: 30.000 dáltons; área do filtro: > 700 cm2) montadas em uma unidade de ultrafiltração de aço inoxidável são preferencialmente usadas. Após a ultrafiltração, a solução de imunocianina concentrada é filtrada, por exemplo através de um filtro de membrana de 0,22 μm.

[0090] A solução de imunocianina concentrada pode ser então purificada, por exemplo por cromatografia líquida de média pressão através de uma cromatografia de filtração em gel.

[0091] Uma coluna preferida é Superose® 6 (grau preparativo; composta de glóbulos porosos de agarose elevadamente reticulada); tamanho de glóbulo de 20 a 40 μm, faixa de fracionamento de 5.000 a 5.000.000 Da. Como eluente pode ser usado um tampão de eluição (pH 8 a 10, isento de Ca++ e Mg++). A solução de imunocianina concentrada pode ser carregada para a coluna sob condições assépticas. É coletado o pico principal de imunocianina em peso molecular de 400.000 Da. A fração de imunocianina é preferencialmente imediatamente esfriada para de +2 a 8°C e filtrada, por exemplo através de um filtro de membrana de 0,22 μm.

[0092] Devido à origem das hemocianinas nativas como KLH, há um risco virológico por patógenos humanos. Para garantir segurança biológica, o processo a jusante da remoção de contaminantes biológicos preferencialmente contém etapas para inativação ou remoção de contaminação viral potencial. Os métodos de inativação disponíveis foram testados em KLH e foi descoberto que não são adequados para as hemocianinas por causa de seu efeito danoso sobre as preparações de KLH.

[0093] De acordo com a presente invenção a nanofiltração é preferencialmente usada para obter subunidades de hemocianina purificadas, por exemplo subunidades de KLH, isto é para a remoção de contaminação viral potencial.

[0094] Nesta etapa pode ser selecionada uma membrana filtrante de vírus adequada, que não tem influência sobre o teor e as características bioquímicas, químicas e físicas de subunidades de hemocianina, por exemplo de subunidades de KLH. As subunidades de hemocianina filtradas e não filtradas são comparadas em um estudo de comparabilidade a fim de mostrar que as subunidades estão funcionalmente intactas. Estudo de validação de vírus pode ser realizado para mostrar o efeito da filtração de vírus das subunidades de hemocianina sobre a remoção de vírus modelares com tamanhos diferentes.

[0095] A fim de demonstrar a segurança das proteínas farmacêuticas derivadas de fontes biológicas, é obrigatório que o fabricante de tais produtos demonstre a inativação efetiva e/ou a remoção de vírus patogênicos durante o processo de fabricação.

[0096] Habitualmente, isto é realizado pela inoculação deliberada de uma versão em escala reduzida do processo de fabricação com vírus revelantes e/ou modelares.

[0097] De acordo com a presente invenção, é realizada a remoção de pelo menos Vírus da Leucemia Murina, Vírus da Pseudorraiva, Reovírus Tipo 3, e Parvovírus Porcino por nanofiltração. A fim de testar a remoção, uma amostra de teste será inoculada com os vírus em títulos definidos e então submetida à nanofiltração. As amostras podem ser retiradas da amostra de teste pré-filtrada, inoculada, e também do nanofiltrado e monitorada para vírus por titulação de ponto final e por análise da amostra com um todo (bulk analysis), respectivamente.

[0098] A remoção dos vírus é preferencialmente realizada a fim de reduzir o título de vírus em 50%, preferencialmente em 60%, mais preferencialmente em 70%, mais preferencialmente em 80%, mais preferencialmente em 90%, mais preferencialmente em 99%, com a máxima preferência em 99,9%.

[0099] Os vírus relevantes representando contaminantes potenciais de produtos de hemocianina são os seguintes:

Vírus da Hepatite A (HAV) - vírus de RNA de fita única, pequeno (25 a 30 nm), não envelopado (ATCC VR-1402) com uma resistência média a alta à inativação físico-química. O Vírus da Hepatitis A pertence à família Picornaviridae, que também inclui EMCV e Poliovirus. Este vírus é um contaminante potencial de plasma e sangue humanos e, portanto, deve ser usado onde possível em estudos. Entretanto, a presença de anticorpos neutralizadores para este vírus nos produtos de sangue e plasma significa que seu uso é limitado às situações nas quais não ocorre este problema.
Parvovírus Porcino (PPV) - vírus de DNA de fita única, pequeno (~18 a 25 nm), não envelopado, (fornecido pela Octapharma AG, Frankfurt, Alemanha) com uma resistência alta à inativação físico-química. Ele, portanto, fornece um teste rigoroso para a capacidade de depuração e redução do sistema de processo a jusante. O vírus Parvovírus Humano B19 pode estar presente em títulos altos em plasma humano, e, portanto, o PPV pode ser usado como um modelo para B19 na validação de produtos derivados de plasma humano. Há também incidentes relatados de contaminação de produtos recombinantes com Parvovírus como Vírus Minuto Murino, e o PPV pode ser usado com modelo para esta classe de vírus.
Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) - vírus d RNA de fita única, de tamanho médio (~40 a 60 nm), envelopado (ATCC VR-534) com uma resistência média à inativação físico-química. O BVDV pertence à família Flaviviridae que também contém os Vírus da Hepatite C e da Hepatite G. O BVDV é, portanto, um vírus modelar adequado onde o Vírus da Hepatite C ou da Hepatite G é uma preocupação, particularmente em um produto derivado de sangue humano, e também para outros contaminantes Flavivírus e Togavírus, por exemplo se for usado material derivado de bovino.
Vírus Simiano 40 (SV40) - vírus de DNA de fita dupla, pequeno (~40 nm), não envelopado (ATCC VR-305) com alta resistência à inativação físico-química. O SV40 fornece um teste rigoroso do processo a jusante e sua capacidade para remover/inativar vírus. Este vírus atua como um modelo para outros vírus não envelopados, resistentes, que podem estar presentes como contaminantes no material de partida, e é um modelo para os contaminantes papilomavírus e poliomavírus.

[00100] Na presente invenção, pelo menos HAV, BVDV, e SV40 são removidos, preferencialmente com FRL maior que 2, 3, 4, 5 ou 6 para cada vírus. O PPV pode ser removido com FRL maior que 2, 3 ou 4. Alternativa, ou adicionalmente, os seguintes vírus também são removidos da hemolinfa ou imunocianina da presente invenção: Vírus da Leucemia Murina (MuLV), Vírus da Pseudorraiva (PRV) e Reovírus tipo III (Reo III). Estes vírus são também removidos com FRLs de pelo menos 2 ou 3 para cada vírus.

[00101] A estabilização de subunidades de hemocianina filtradas isentas de vírus, pode ser realizada por meio de liofilização. Soluções de proteína (especialmente de proteínas de peso molecular alto) são, em geral, instáveis a longo prazo. Durante o armazenamento ocorre precipitação de proteína juntamente com a perda de atividade. O armazenamento em sistemas tamponantes estabilizantes ou em soluções aplicáveis para uso farmacêutico sob condições refrigeradas não resultou em preparações de KLH que satisfazem à estabilidade exigida para fármacos (2 a 3 anos). A liofilização de proteínas de peso molecular alto sob retenção de sua atividade biológica completa é apenas possível com uma mistura adequada de excipientes. De acordo com a presente invenção, podem ser usados estabilizantes de proteína, por exemplo lactose, manitol, sacarose, etc. Estes estabilizantes podem ser adicionados à solução de imunocianina purificada como soluções com concentrações, de cada, de 100 a 700 mg/mL e com um volume de 0,1 a 1,0 mL por 1 mg de proteína.

[00102] As subunidades de KLH liofilizadas são processadas para a sua atividade biológica completa e sua integridade molecular.

[00103] A estabilização de subunidades de hemocianina filtradas isentas de vírus pode também ser realizada por meio de dessalinização. A dessalinização por diafiltração com água para injeção resulta em uma solução aquosa elevadamente concentrada (20 mg/mL) de subunidades de hemocianina, isenta de sal, com estabilidade de longo prazo surpreendente sob condições refrigeradas (de 1 a 2 anos). A solução de subunidades de hemocianina isenta de sal é o carreador ideal para a fabricação de vacinas conjugadas.

[00104] Meios e métodos para a dessalinização são conhecidos pela pessoa versada na técnica. Tipicamente a dessalinização é realizada desde que a condutividade do filtrado em um processo de filtração iterativa seja ≥ 10 μS/cm ou a condutividade do retentato seja ≥ 150 μS/cm.

[00105] As subunidades de hemocianina isentas de sal são submetidas à prova para sua atividade biológica completa e sua integridade molecular.

[00106] As subunidades de hemocianina podem ser usadas como uma mistura na razão presente em hemocianina nativa (“imunocianina”) ou as subunidades individuais podem ser separadas e utilizadas após isolamento.

[00107] A fim de obter hemocianina “sintética”, a reassociação das subunidades tem que ser realizada, isto é, o redobramento das subunidades de KLH filtradas isentas de vírus.

[00108] O tamanho dos oligômeros de hemocianina, por exemplo de didecâmeros de KLH (de aproximadamente 35 nm), está situado no mesmo tamanho de vírus grandes. Os métodos de isolamento e purificação descritos (cromatografia de troca iônica e filtração em gel) para a KLH nativa não resultam nos fatores de redução exigidos de contaminação virológica potencial de acordo com as diretrizes estabelecidas sobre a segurança virológica de produtos biológicos derivados de fontes animais. A dissociação em subunidades de hemocianina reduz o tamanho, no caso de KLH para aproximadamente 400.000 dáltons, e torna a proteína acessível à nanofiltração. O redobramento é realizado com troca de tampão, por exemplo por diafiltração ou diálise sob condições de reassociação (pH de 7 a 8, Ca++, Mg++). A hemocianina reassociada pode ser adicionalmente purificada por filtração em gel.

[00109] A fim de realizar a reassociação, um tampão para reassociação é adicionado à mistura de subunidades de hemocianina.

[00110] A KLH de peso molecular alto é fabricada a partir de solução de imunocianina concentrada pela troca de tampão para condições de reassociação, pH de 7 a 8, Ca++, Mg++ e preferencialmente por uma etapa de concentração. Ambas podem ser realizadas por uma ou mais até uma série de etapas de ultrafiltração usando uma membrana de polissulfona com um limite de separação nominal de 50.000 Da.

[00111] Outras modalidades da invenção são:
1. Um método para a preparação de soro de hemolinfa de um molusco compreendendo:

• a) punctura do seio pedal sanguíneo do molusco sob narcose fria.

2. O método da modalidade 1, em que o molusco é Megathura crenulata.
3. Um método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que antes da punctura o molusco é mantido sob condições de quarentena específicas, em que alimento orgânico não é fornecido e/ou a água no sistema de aquário é purificada pela remoção de contaminantes biológicos.
4. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o sangue obtido sob punctura é esterilizado por filtração com membrana de 0,2
μm.
5. O método para isolamento de hemocianina nativa ou de uma sua mistura de subunidades compreendendo:

• a) fornecimento de soro de hemolinfa obtido após a realização de qualquer uma das modalidades 1 a 4,
• b) isolamento da hemolinfa do soro de hemolinfa pela utilização de cromatografia direta.

6. O método da modalidade 5, em que a cromatografia direta é uma cromatografia de troca iônica.
7. O método de qualquer uma das modalidades 5 ou 6, incluindo, adicionalmente, uma etapa de dissociação da hemocianina em subunidades do oligômero de hemocianina, purificação das subunidades de KLH e opcionalmente reassociação das subunidades para a forma oligomérica da hemocianina.
8. O método da modalidade 7, em que a purificação é realizada utilizando nanofiltração a fim de remover a contaminação biológica potencial.
9. O método de qualquer uma das modalidades 7 ou 8, em que a reassociação ocorre em uma etapa de diafiltração ou em uma etapa de filtração em gel.
10. O método de qualquer uma das modalidades 5 a 9 em que a hemolinfa é misturada com um sistema tamponante estabilizante para armazenamento de longo prazo.
11. A hemolinfa obtida por qualquer uma das modalidades 1 a 4, a hemolinfa ou a mistura de subunidades de hemocianina obtida por qualquer uma das modalidades 5 a 10.
12. A hemolinfa obtida por qualquer uma das modalidades 1 a 4, a hemolinfa ou a mistura de subunidades de hemocianina obtida por qualquer uma das modalidades 5 a 10 como um medicamento.
14. Uma composição farmacêutica compreendendo a hemolinfa obtida por qualquer uma das modalidades 1 a 4, a hemolinfa ou a mistura de subunidades de hemocianina obtida por qualquer uma das modalidades 5 a 10.
15. A hemolinfa da modalidade 11 ou a hemolinfa da modalidade 12 para uso no tratamento de câncer, preferencialmente câncer de bexiga, ou como um imunoestimulante ou carreador.
16. Um método para fornecimento de uma ou mais subunidades de hemocianina compreendendo a realização do método de qualquer uma das modalidades 1 a 4 e do método de qualquer uma das modalidades 5 a 10 e uma etapa de dissociação seletiva da hemocianina reassociada assim obtida.
17. As uma ou mais subunidades de hemocianina obtidas pelo método da modalidade 16.
18. O fármaco compreendendo as uma ou mais subunidades de hemocianina da modalidade 17. As uma ou mais subunidades de hemocianina da modalidade 17 podem ser para uso no tratamento de câncer ou como um imunoestimulante.
19. O uso de filtração de fluxo cruzado para a remoção de vírus das formulações de proteína.
20. O uso da modalidade 19, em que a formulação de proteína inclui uma proteína de entre 100.000 dáltons e 1.000.000 dáltons.
21. O uso de acordo com as modalidades 19 e 20, em que a filtração de fluxo cruzado utiliza filtros de um tamanho de poro entre 15 nm e 35 nm. EXEMPLOS Exemplo 1: Quarentena de Megathura crenulata

[00112] Deste o início das atividades de produção de nossa instalação em Carlsbad, Califórnia, em fevereiro de 2002, temos coletado 13 bateladas de animais em vários períodos de tempo. A ID do sítio de coleta é o número da zona conforme definido pela “Southern California Fisheries Chart” (SCFC).

[00113] As condições meteorológicas na Califórnia durante a coleta de animais para as bateladas MC-001 a MC-013 foram incomuns. Entretanto, durante a batelada mais recente de animais coletados, MC-014, a Califórnia havia experimentado condições chuvosas incomuns antes da coleta de animais, contudo, no dia do recebimento dos animais, não houve chuvas.

[00114] Pode ser enfatizado que a incorporação de métodos de teste tem sido desenvolvida desde quando iniciamos as atividades em nossa instalação. O teste de coliformes fecais nos animais, o teste de substância tóxica, de DDT e de PCB foram iniciados com o lote de n° MC-002. O teste de pH e de condutividade tem sido realizado em todos os lotes, o teste de nitrato, de nitrito e de amônia foi iniciado nas amostras de água do mar com o lote de n° MC-006.

[00115] O pH e a condutividade da água do mar têm uma faixa de 8,0 a 8,3 e de 45,0 a 52,4 respectivamente. Os teores de nitrato, de nitrito e de amônia estiveram na faixa de 0 a 80 ppm, de 0 a 0,25 ppm e de 0,25 a 1,0 ppm respectivamente, o limite superior da faixa corresponde aos valores para o lote de n° MC-014, que, conforme tem sido observado, foi coletado após chuvas intensas. Os coliformes fecais das amostras de água do mar foram em Número Mais Provável (NMP) < 2/100 mL para as amostras coletadas dos lotes de nos MC-002 até MC-013 e foram em NMP de 29, 11 e 49 para o lote mais recente de n° MC-014 correspondendo às três amostras de água “0”, “50” e “100” respectivamente.

[00116] Os resultados de testes para DDT e PCB indicam que estão abaixo do limite de detecção dos ensaios respectivos. Parece que isto pode não ser um problema no local de coleta nos 718 e 719 de onde os animais foram coletados.

[00117] Os dados de coliformes fecais nos animais sugerem que os coliformes fecais foram, de modo geral, em NMP < 18 e um NMP máximo de 20/100 gramas para o lote de n° MC-002 a MC-013, entretanto para o lote de n° MC-014 os valores foram muito altos, NMP de 3.500/100 gramas. Estes resultados juntamente com os coliformes fecais na água do mar circundante sugerem que estes animais tendem a concentrar os coliformes fecais.

[00118] Após a recepção dos resultados laboratoriais referentes aos coliformes fecais em animais, decidimos enviar amostras de animais provenientes de nossos tanques de quarentena, 3 animais foram coletados do Tanque Q1 e 3 do Tanque Q2, em 19 de janeiro de 2005. Os animais foram recebidos em nossos tanques em 6 de janeiro de 2005 e, portanto, estiveram presentes em nossa água de tanque durante 13 dias antes do teste. Iniciamos este teste para determinar se os procedimentos de quarentena que temos incorporado em nossa programação de fabricação teria um efeito sobre a redução do teor de coliforme fecais de animais. A cópia do relatório de teste está anexada a este relatório como um anexo. Os resultados indicam que os coliformes fecais de animais são de NMP < 18/100 gramas. Estes resultados são muito promissores e sugerem que os procedimentos no local são efetivos na redução do teor de coliformes de animais, se alguns estiverem presentes como com este lote de n° MC-014.

[00119] A análise dos dados relacionados com os animais e a água do mar sugere que:

[00120] O pH e a condutividade da água do mar fornecem informação sobre as condições da água do mar natural e seriam úteis para comparar com nossa água do mar artificial preparada em nossa instalação. Atualmente temos uma especificação para a água do mar artificial como pH de 7,5 a 8,5 e condutividade de 46 a 52 mS/cm. Estas especificações parecem coincidir bem com as faixas relativas à água do mar natural.

[00121] O exame toxicológico da água do mar proveniente do local de coleta foi iniciado com base na recomendação de Dr. Robert Mooney, Merkel & Associates, usado como um inspetor de saúde animal externo para os primeiros três lotes de animais recebidos, a saber MC-001 a MC-004. Os resultados até hoje sugerem que DDT e PCB’s não são um problema para a área onde as lapas são coletadas e liberadas de volta.

[00122] O procedimento de quarentena de animais em nossa instalação parece ajudar na redução do número de coliformes de animais e é um procedimento muito útil. Atualmente, a liberação dos animais para a fabricação exige um mínimo de sete dias desde o início da quarentena, os dados de coliformes fecais de animais para o lote de n° MC-014 foram obtidos em animais após 13 dias de retenção dos animais em nossos tanques. Pode ser necessário iniciar uma investigação mais sistemática sobre a duração da quarentena e a redução de coliformes fecais e determinar se o conjunto atual da especificação de sete dias é suficiente. Tais estudos serão iniciados após a coleta de animais das águas com alto número de coliformes como foi o caso de MC-014.

Exemplo 2: Isolamento cromatográfico direto de hemocianina nativa de soro de hemolinfa

[00123] Soro de hemolinfa baseado em sua origem proveniente de um molusco marinho contém, adicionalmente à hemocianina e aos outros componentes do soro, teores altos de cloreto de sódio e de outros minerais. A condutividade em média é cerca de 50 mS/cm. Sob aquelas presentes condições a KLH não pode ligar-se às resinas trocadoras de íons. Para realizar a ligação quantitativa de KLH, a condutividade tem que ser reduzida para < 20 mS/cm.

[00124] A fim de reduzir a condutividade, conforme descrito acima, o soro de hemolinfa é parcialmente dessalinizado por métodos adequados como filtração em gel, eletrodiálise, diafiltração ou diluição. A remoção de sais resulta em precipitação dos outros componentes do soro, isto é, de proteína e de carboidratos. O precipitado é removido por centrifugação em velocidade baixa, filtração profunda ou filtração com membrana (0,8 μm, 0,45 μm).

[00125] Subsequentemente a KLH de peso molecular alto, coloidal, é isolada por procedimentos de cromatografia, isto é, cromatografia de troca iônica (IEX) seguida pelas dissociação e purificação de subunidades.

Dissociação de hemocianina Método 1:

[00126] A proteína hemocianina nativa ligante de oxigênio é purificada a partir da hemolinfa por cromatografia de troca iônica. A hemolinfa é ligada a um trocador de ânions e então é dissociada na coluna em subunidades de KLH (imunocianina) em tampão alcalino (pH 9,6). A imunocianina é recuperada da coluna por meio de eluição em gradiente salino. A solução de imunocianina resultante é dessalinizada e concentrada por diafiltração/ultrafiltração. A solução de imunocianina concentrada pode ser subsequentemente purificada por uma etapa adicional de cromatografia IEX.

Método 2:

[00127] A proteína hemocianina nativa ligante de oxigênio é purificada a partir da hemolinfa por cromatografia de troca iônica. A hemolinfa é ligada a um trocador de ânions e então recuperada da coluna por meio de eluição em gradiente salino. A solução de hemocianina resultante é dessalinizada, concentrada e dissociada em subunidades de KLH (imunocianina) por meio de diafiltração, diálise ou ultrafiltração tampão alcalino (pH 9,6). Finalmente a solução de imunocianina é concentrada seguido por purificação com uma etapa adicional de cromatografia IEX.

[00128] A hemolinfa obtida a partir do Método 1/Método 2 é dissolvida em tampão de dissociação (pH 9,6, isento de Ca++ e Mg++). Isto produz condições alcalinas, que resultam na dissociação da molécula de hemolinfa nativa em suas subunidades. A entidade destas subunidades é chamada de imunocianina.

Método 3:

[00129] A proteína hemocianina nativa ligante de oxigênio é purificada a partir da hemolinfa por cromatografia de troca iônica. A hemolinfa é ligada a um trocador de ânions e então recuperada da coluna por meio de eluição em gradiente salino. A hemolinfa da solução de hemocianina resultante é isolada por meio de ultracentrifugação. Os grânulos obtidos são dissolvidos em tampão de dissociação. Finalmente, a solução de imunocianina é concentrada e pode ser purificada por uma etapa adicional de cromatografia IEX.

Concentração de solução de imunocianina

[00130] Antes da purificação final (refino) por filtração em gel, a solução de imunocianina é concentrada, por ultrafiltração, para um teor de proteína de 20 mg/mL (± 2,5 mg/mL). Para este propósito, são usadas membranas de poli(éter-sulfona) ou de polissulfona fracamente ligantes de proteína (limite de separação: 30.000 dáltons; área do filtro: ≥ 700 cm2) montadas em uma unidade de ultrafiltração de aço inoxidável. Após a ultrafiltração, a solução de imunocianina concentrada é filtrada através de um filtro de membrana de 0,22 μm.

Purificação (refino)

[00131] A solução de imunocianina concentrada é finalmente purificada por cromatografia líquida de média pressão através de uma cromatografia de filtração em gel.

Exemplo 3: Nanofiltração de subunidades de KLH purificadas (Imunocianina)

[00132] Devido à origem da KLH nativa há um risco virológico por patógenos humanos. Para garantir a segurança biológica, o processo a jusante da remoção de contaminantes biológicos deve conter etapas para inativação ou remoção de contaminação viral potencial. Os métodos de inativação disponíveis foram testados em KLH e foi descoberto que não são adequados para as hemocianinas por causa de seu efeito danoso sobre as preparações de KLH. Os métodos de inativação comercialmente disponíveis foram testados em KLH e foi descoberto que não são adequados por causa de seu efeito danoso sobre as preparações de KLH (redução de pH, tratamento térmico).

[00133] Foi previamente demonstrado que a nanofiltração remove efetivamente os vírus das composições de proteína. Entretanto, a nanofiltração revelou-se inútil para as hemocianinas ou a KLH nativa, devido ao peso molecular de KLH nativa de > 8 milhões dáltons. Os filtros não puderam separar os vírus da proteína, isto é, a proteína é muito grande para atravessar a membrana dos típicos filtros de vírus (tamanho de poro entre 15 nm e 35 nm). Foi realizada uma redução para o peso molecular uniforme de aproximadamente 400.000 dáltons das subunidades de KLH. Vários filtros de vírus com tamanhos de poro diferentes têm sido testados em um processo de escala reduzida.

Exemplo de referência: protocolo de filtração de extremidade morta, filtração de vírus das subunidades de KLH

[00134] Uma proteína de aproximadamente 400 kD em uma concentração de aproximadamente 5 mg/mL, obtida do sangue de caracol do mar da Califórnia tem sido filtrada através de Planova 20N, de 0,001 m2 no modo de Extremidade Morta com pressão constante de 2,0 bar (200 kPa). A taxa de fluxo foi 0,4 mL/min. A formulação de proteína estava em um pH de 9,6 em um tampão de glicina/NaOH. Foi aplicado 1 g de material de partida. Com a filtração de extremidade morta, foi obtido 0,1 g de proteína em uma concentração de 0,5 mg/mL, isto é, um rendimento de proteína de 10%. Também, uma redução das quantidades iniciais da proteína ou da concentração da proteína por um fator de 10 ou maior não resultou em resultados diferentes. Outrossim, a redução da pressão ou o aumento de tamanho não resultou em alterações do rendimento de proteína.

Exemplo de trabalho: protocolo de filtração de fluxo cruzado; filtração de virus das subunidades de KLH

[00135] Uma proteína de aproximadamente 400 kD em uma concentração de aproximadamente 0,45 mg/mL, obtida do sangue de caracol do mar da Califórnia tem sido filtrada através de Planova 20N, de 0,12 m2 no modo de fluxo cruzado com pressão constante de 0,16 bar (16 kPa). A formulação estava em um tampão de glicina e NaOH em um pH de 9,6. A quantidade de material de partida foi 5.000 g em uma concentração de 0,45 mg/mL. A quantidade de proteína obtida após a nanofiltração foi de 4.688 g em uma concentração de 0,42 mg/mL. Isto totaliza um rendimento de 93%.

[00136] Este exemplo demonstra que ao contrário da filtração de extremidade morta, a filtração de fluxo cruzado permite a filtração de quantidades quantitativas de proteína hemocianina após a dissociação em suas subunidades. Podem ser utilizados nanofiltros de um tamanho de poro entre 15 nm e 35 nm os quais são suficientes para remover os vírus mais diminutos conhecidos.

Exemplo 4: Prova de conceito: Estudo de praticabilidade

[00137] Este exemplo demonstra a adequabilidade da filtração de fluxo cruzado para remover vírus pequenos de um diâmetro dos vírus mais diminutos conhecidos. Neste exemplo, foi testado PPV. PPV tem um diâmetro de 20 nm e o vírus foi inoculado em uma concentração de 0,5% por proteína. Imunocianina, uma proteína de peso molecular uniforme de aproximadamente 400.000 dáltons de subunidades de KLH foi inoculada com 0,5% de PPV. A carga viral total no pré-filtrado foi de 10.620. A quantidade de proteína após a inoculação de vírus foi de 4.814,9 g. A nanofiltração foi realizada com nanofiltros Planova 20N, de 0,12 m2 no modo de fluxo cruzado. A taxa de fluxo escolhida foi de 50 mm/min com uma pressão constante de 0,28 bar (28 kPa). 4.662,4 g de proteína foram retidos no filtrado. O FRL para o PPV foi de 3,14 ± 0,32. Consequentemente, a quantidade de proteína foi maior que 93% com uma remoção de vírus maior que 99,9%.

[00138] Este exemplo mostra que a filtração de fluxo cruzado é adequada para a preparação de KLH ou de subunidades de KLH sob uma forma isenta de vírus em uma escala comercialmente relevante com um rendimento maior que 90%.

Exemplo 5: Estabilização, por meio de dessalinização, de subunidades de KLH purificadas Princípio

[00139] LÍQUIDO A GRANEL DE KLH (“KLH BULK LIQUID”) isento de sal é fabricado, por dessalinização e concentração, a partir de imunocianina purificada. Ambas, dessalinização e concentração, são realizadas por uma série de etapas de ultrafiltração usando uma membrana de polissulfona com um limite de separação nominal de 30.000 Da.

Preparação da batelada de dessalinização

[00140] A fim de minimizar as variações de batelada para batelada durante o processo de dessalinização, a solução de imunocianina purificada é concentrada para um teor de entre 10 e 40 mg/mL (± 2 mg/mL) por ultrafiltração. Para este propósito, são usadas membranas de poli(éter-sulfona) ou de polissulfona fracamente ligantes de proteína (limite de separação: 30.000 Da) montadas em uma unidade de ultrafiltração de aço inoxidável. Antes do uso, as membranas são condicionadas por recirculação com tampão alcalino de dissociação em uma temperatura de +2 a 8°C. O fluxo é realizado por uma bomba peristáltica. Finalmente, o condicionamento é testado por um controle em processo de pH, de endotoxinas bacterianas. Antes do início do processo de concentração, é checada a integridade da unidade de ultrafiltração.

Concentração

[00141] A solução de imunocianina é agora transferida para a unidade de ultrafiltração e recirculada a de +2 a 8°C. A concentração é controlada pela pesagem do ultrafiltrado obtido. A pressão de entrada máxima da unidade de ultrafiltração não deve ultrapassar 1 bar (100 kPa), preferencialmente não deve ultrapassar 0,5 bar (50 kPa). A solução de imunocianina é recirculada até que a quantidade calculada de ultrafiltrado tenha sido coletada. Finalmente, o concentrado é testado pelo controle em processo do valor de pH, de osmolalidade, de condutividade, de teor de imunocianina.

Dessalinização

[00142] A solução de imunocianina concentrada (= batelada de dessalinização concentrada) é quer dessalinizada por diluição de 1+1 com água para injeções em cada ciclo de ultrafiltração quer, alternativamente, pela adição da água para injeções utilizando um procedimento de lavagem de volume constante. O processo de dessalinização é controlado pela pesagem do ultrafiltrado, da batelada de dessalinização concentrada e pelo teste da condutividade do ultrafiltrado e da batelada de dessalinização.

[00143] Se a condutividade do ultrafiltrado tiver alcançado <10 μS/cm ou se a condutividade da batelada de dessalinização concentrada for < 150 pS/cm, o processo de dessalinização processo será terminado e o teor de imunocianina da batelada de dessalinização será determinado a fim de preparar a batelada final de LÍQUIDO A GRANEL DE KLH isento de sal.

Preparação da batelada final de LÍQUIDO A GRANEL DE KLH isento de sal

[00144] A batelada final de LÍQUIDO A GRANEL DE KLH isento de sal é preparada a partir do concentrado de imunocianina por diluição para um teor de imunocianina de 20 mg/mL. Para este propósito, o concentrado de imunocianina filtrado é pesado. A quantidade exigida de água para injeções é pesada acuradamente e lentamente adicionada ao concentrado de imunocianina filtrado. A solução é suavemente misturada, e uma amostra para o controle em processo é removida para determinar o valor de pH, a densidade, a osmolalidade, a condutividade, o teor de imunocianina.

[00145] A solução liberada é finalmente esterilizada por filtração através de um filtro de membrana de 0,22 µm diretamente para dentro de bolsas de infusão.

[00146] Elas são armazenadas a de +2 a 8°C.

[00147] Durante a filtração, são removidas amostras para o controle de qualidade.

Exemplo 6: Redobramento de subunidades de KLH filtradas para remoção de vírus e purificação final. Princípio

[00148] KLH de peso molecular alto é fabricada a partir de solução de imunocianina concentrada por diafiltração (troca de tampão para as condições de reassociação, pH de 7 a 8, Ca++, Mg++) e concentração. Ambas são, por exemplo, realizadas por uma série de etapas de ultrafiltração usando uma membrana de polissulfona com um limite de separação nominal de 50.000 Da.

Concentração de solução de imunocianina purificada

[00149] A fim de otimizar as condições de reassociação, a solução de imunocianina purificada é concentrada, por ultrafiltração, para um teor de imunocianina de 20 mg/mL (± 2 mg/mL). Para este propósito, são membranas de poli(éter-sulfona) ou de polissulfona fracamente ligantes de proteína (limite de separação: 30.000 Da) montadas em uma unidade de ultrafiltração de aço inoxidável. Antes do uso, as membranas são condicionadas com tampão de eluição como segue. O sistema de ultrafiltração é primeiro lavado com o tampão de eluição a uma temperatura de a +2 a 8°C, enquanto que as saídas de filtrado são fechadas. O fluxo é realizado por uma bomba peristáltica. Finalmente, o tampão de eluição é completamente removido do sistema. Uma amostra é removida do lado de retentato para o controle em processo do pH, das endotoxinas bacterinas. Antes do início do processo de concentração, é checada a integridade da unidade de ultrafiltração.

[00150] A solução de imunocianina é agora transferida para a bolsa de retentato da unidade de ultrafiltração. A recirculação é iniciada, o ultrafiltrado é coletado em um béquer pesado. A temperatura é mantida a de +2 a +8°C. Conforme durante o condicionamento, a pressão de entrada máxima da unidade de ultrafiltração não deve ultrapassar 1 bar (100 kPa). A solução de imunocianina é recirculada até que a quantidade calculada de ultrafiltrado tenha sido alcançada. O retentato é misturado, enquanto que as saídas de filtrado são fechadas, e uma amostra é removida para o controle em processo de valor de pH, de osmolalidade, de condutividade, de teor de imunocianina.

Reassociação

[00151] A fim de redobrar as subunidades de KLH é usado um segundo sistema de ultrafiltração com membranas de poli(éter-sulfona) ou de polissulfona fracamente ligantes de proteína (limite de separação: 50.000 Da) montadas em uma unidade de ultrafiltração de aço inoxidável. Antes do uso, as membranas são condicionadas com o tampão de reassociação como segue. O sistema de ultrafiltração é primeiro lavado com o tampão de reassociação a uma temperatura a de +2 a 8°C, enquanto que as saídas de filtrado são fechadas. O fluxo é realizado por uma bomba peristáltica. Finalmente, o tampão de reassociação é completamente removido do sistema. Uma amostra é removida do lado de retentato para o controle em processo de pH, de endotoxinas bacterianas. Antes do início do processo de reassociação, é checada a integridade da unidade de ultrafiltração.

[00152] Para a reassociação o sistema de ultrafiltração é recirculado com o tampão de reassociação (entre 2 a 10 vezes o volume de solução de imunocianina concentrada) enquanto que as saídas de filtrado são fechadas. A solução de imunocianina concentrada é lentamente injetada no tampão de reassociação recirculado. A temperatura durante o processo de reassociação inteiro é mantida a uma temperatura de +2 a 8°C. Após a injeção completa da solução de imunocianina concentrada, a batelada de reassociação é diafiltrada contra entre 2 e 10 vezes o tampão de reassociação aplicando um procedimento de lavagem de volume constante. Finalmente a batelada é concentrada para um teor de KLH de 20 mg/mL.

[00153] Após a reassociação, a solução de KLH concentrada, é filtrada através de um filtro de membrana de 0,22 μm.

Purificação, por filtração em gel, de KLH redobrada

[00154] A solução de KLH concentrada é finalmente purificada por cromatografia líquida de média pressão através de uma cromatografia de filtração em gel.

Potência e atividade biológicas - comparabilidade com a KLH nativa

[00155] Foram comparadas a KLH nativa e a KLH sintética obtidas após a reassociação de acordo com o método da presente invenção. A KLH sintética e a KLH nativa foram comparadas via espectroscopia-CD (CD, Circular Dichroism, Dicroísmo Circular). As bandas em espectroscopia-CD foram idênticas.

[00156] As bandas de proteína em SDS-PAGE foram idênticas quando compararam-se as KLH sintética e nativa. Em KLH sintética, não foram encontrados fragmentos de proteína.

[00157] Imunoeletroforese bidimensional foi também realizada para comparar as KLH sintética e nativa. Foram usados soros anti-KLH1 e anti-KLH. Os padrões imunoeletroforéticos foram idênticos para ambas, as KLH sintética e nativa. Dois máximos de precipitação (um para KLH1 e um para KLH2) ocorrem para ambas as KLH sintética e nativa.

[00158] As investigações eletromicroscópicas de ambas, as KLH sintética e nativa, mostram os típicos decâmeros, didecâmeros e tridecâmeros.

[00159] Native-PAGE e testes densiométricos mostram que ambas as KLH sintética e nativa incluem as típicas bandas de proteína. Foi obtida uma razão A entre KLH1 e KLH2 entre 0,9 e 1,0 para ambas, as KLH sintética e nativa.

Claims (16)

1. Método para produção de Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) sintética, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de

   • a) dissociação de KLH nativa para obtenção de subunidades,
   • b) nanofiltração das subunidades obtidas na etapa a) usando filtros com um tamanho de poro entre 15 e 35 nm; e
   • c) reassociação das subunidades obtidas após a nanofiltração para obtenção da KLH sintética.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as subunidades são menores do que 800.000 dálton.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dissociação é efetuada pelo pH entre 9 e 10.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a filtração remove pelo menos 99,9% da quantidade total de vírus presentes na KLH nativa.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a reassociação é efetuada a um pH entre 7 e 8.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a filtração é filtração de fluxo cruzado.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade de proteína obtida é superior a 60% por quantidade de KLH nativa.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade de proteína obtida é superior a 90% por quantidade de KLH nativa.
9. Método para produção de imunocianina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de

   • a) dissociação de KLH nativa para obtenção de subunidades; e
   • b) nanofiltração das subunidades obtidas na etapa a) usando filtros com um tamanho de poro entre 15 e 35 nm.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dissociação é efetuada a um pH entre 9 e 10.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que a filtração remove pelo menos 99,9% da quantidade total de vírus presentes na KLH nativa.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a filtração é uma filtração de fluxo cruzado.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a quantidade de proteína obtida é superior a 90%.
14. Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) sintética obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que possui pelo menos 99,9% da quantidade total de vírus presentes na KLH nativa removida.
15. Imunocianina sintética obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que possui pelo menos 99,9% da quantidade total de vírus presentes na KLH nativa removida.
16. Método para remoção de vírus de uma preparação de hemocianina, caracterizado pelo fato de que compreende:

    • a) dissociação da hemocianina para obtenção de subunidades,
    • b) nanofiltração das subunidades obtidas na etapa a) usando filtros com um tamanho de poro entre 15 e 35 nm; e
    • c) reassociação das subunidades obtidas após a nanofiltração para obtenção da hemocianina purificada.