ES2877848T3 - Composición líquida de fibrinógeno humano - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica líquida que comprende fibrinógeno humano, caracterizada por que comprende: - entre 10 y 300 mM de arginina - entre 10 y 300 mM de glutamato estando el pH de la composición comprendido entre 6 y 8.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición líquida de fibrinógeno humano
La invención se refiere a una formulación de fibrinógeno humano, útil en terapia.
Actualmente, se tratan numerosas patologías mediante composiciones que comprenden fibrinógeno. Se pueden citar, por ejemplo, las hipofibrinogenemias, disfibrinogenemias o a-fibrinogenemias constitucionales en los pacientes que presentan una hemorragia espontánea o post-traumática, el tratamiento complementario en el tratamiento médico de una hemorragia severa incontrolada en el contexto de una hipofibrinogenemia adquirida, etc.
Para el tratamiento de ciertas patologías, puede resultar particularmente ventajoso el uso de composiciones que comprenden fibrinógeno, estables durante el almacenamiento y listas para el uso. Esta forma de administración ofrece, en efecto, más flexibilidad y rapidez de administración para los especialistas, mejorando el tratamiento médico urgente de los pacientes hemorrágicos. Para este fin, se han desarrollado composiciones que comprenden fibrinógeno liofilizadas, estables durante el almacenamiento y adecuadas para una constitución rápida. Sin embargo, la reconstitución de tales composiciones liofilizadas necesita algunos minutos. Además, la reconstitución se debe realizar lentamente para permitir la disolución completa del liofilizado, garantizando así la concentración del producto, y esto sin formación de espuma, de turbidez o de depósito que haría a la composición difícilmente administrable o no administrable. Por lo tanto, el uso de productos liofilizados de este tipo no es óptimo en un contexto de medicina de urgencia intra o perihospitalaria, en la que cada minuto cuenta para el tratamiento de la hemorragia.
En la actualidad, las composiciones que comprenden fibrinógeno no proporcionan una total satisfacción en términos de estabilidad líquida especialmente.
En este contexto, persisten las necesidades de composiciones líquidas que comprenden fibrinógeno de uso fácil. Resumen de la invención:
Al trabajar sobre los problemas de estabilidad propios de las composiciones que comprenden fibrinógeno, la Solicitante ha desarrollado una formulación particular, que combina fibrinógeno, arginina y glutamato, en proporciones particulares que participan en la estabilidad en forma líquida de dicha formulación a lo largo del tiempo. De manera sorprendente y ventajosa, la Solicitante ha puesto en evidencia que es posible obtener composiciones que comprenden fibrinógeno, particularmente estables a lo largo del tiempo en forma líquida, utilizando cantidades equivalentes de arginina y glutamato. Por lo tanto, no es necesario liofilizar las composiciones que comprenden fibrinógeno para asegurar su estabilidad a largo plazo. Además, la Solicitante ha conseguido desarrollar composiciones que comprenden fibrinógeno particularmente adecuadas para las inyecciones, por ejemplo por vía intravenosa, minimizando el número y las cantidades de excipientes. La invención permite, de manera general, racionalizar y simplificar los procedimientos de producción de estas diferentes composiciones, conduciendo a una ganancia de tiempo y a una reducción de los costes de producción considerables. Ventajosamente, dichas composiciones pueden estar exentas de otros excipientes, en particular de excipientes conocidos por sus propiedades de conservación de los liofilizados, para garantizar una estabilidad durante el almacenamiento en forma líquida lista para el uso. Por lo tanto, un objeto de la invención es una composición farmacéutica líquida que comprende:
- entre 10 y 30 g/l de fibrinógeno;
- entre 10 y 300 mM de arginina; y
- entre 10 y 300 mM de glutamato.
estando el pH de la composición comprendido entre 6 y 8.
En una realización particular, la composición está constituida solamente de fibrinógeno, arginina y glutamato.
La composición según la invención comprende entre 10 g/l y 30 g/l de fibrinógeno, preferentemente entre 15 g/l y 25 g/l de fibrinógeno, más preferentemente entre 15 g/l y 20 g/l de fibrinógeno, y aún más preferiblemente 15 g/l o 20 g/l, o 25 g/l de fibrinógeno.
Según una realización preferida, el fibrinógeno es un fibrinógeno humano, obtenido especialmente a partir de plasma. La concentración de arginina y la concentración de glutamato está comprendida entre 10 y 300 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 200 mM, más preferiblemente comprendida entre 30 y 100 mM, aún más preferiblemente entre 50 y 80 mM.
En una realización particular, la concentración de arginina y la concentración de glutamato es de 10-80 mM. Tal concentración de arginina y de glutamato es particularmente adecuada para las composiciones que comprenden fibrinógeno destinadas a inyectarse por vía intravenosa.
En una realización particular, la concentración de arginina está comprendida entre 10 y 300 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 250 mM, más preferiblemente comprendida entre 50 y 250 mM.
En otra realización particular, la concentración de arginina es ventajosamente menor que 300 mM, preferentemente menor que 250 mM, preferentemente menor que 200 mM, aún más preferiblemente menor que 150 mM. Tal concentración de arginina es particularmente adecuada para evitar aumentar demasiado la osmolalidad.
En una realización particular, la concentración de glutamato es ventajosamente menor que 80 mM, preferentemente menor que 70 mM, preferentemente menor que 60 mM, aún más preferiblemente menor que 50 mM. Tal concentración de glutamato es particularmente adecuada para las composiciones que comprenden fibrinógeno destinadas a inyectarse por vía intravenosa a fin de minimizar los efectos secundarios en los pacientes.
En otra realización ventajosa, la concentración de glutamato está comprendida entre 10 y 80 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 70 mM, más preferiblemente comprendida entre 30 y 60 mM. Tal concentración de glutamato es particularmente adecuada para las composiciones que comprenden fibrinógeno destinadas a inyectarse por vía intravenosa a fin de minimizar los efectos secundarios en los pacientes.
En una realización ventajosa, la composición comprende además al menos un aminoácido seleccionado entre alanina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, solos o en combinación, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1-300 mM.
En una realización particular, la composición comprende además un aminoácido elegido ventajosamente entre la serina, la prolina y/o la isoleucina, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1-300 mM.
En una realización particular, la composición comprende además un aminoácido polar tal como la serina, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1-300 mM.
En una realización particular, la composición comprende además un aminoácido hidrófobo tal como la prolina o la isoleucina, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1-300 mM.
En una realización particular, la composición comprende además un surfactante, preferiblemente Pluronic®F68, polisorbato 80 o polisorbato 20 o azúcares alquilados preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1 500 ppm.
En una realización particular, la composición comprende además citrato trisódico, preferiblemente a una concentración de 1-15 mM.
En una realización particular, la composición comprende además albúmina, a una concentración de 5-1000 ppm preferiblemente a una concentración de 5-500 ppm.
La composición según la invención es ventajosamente una composición líquida lista para el uso.
La composición según la invención está ventajosamente en una forma adecuada para una administración ocular, nasal, intra-auricular, oral, sublingual, pulmonar, intraperitoneal, intravenosa, tópica, percutánea, subcutánea, intradérmica, intramuscular, transmucosa, vaginal, rectal, preferentemente una administración intravenosa.
Descripción detallada:
Definiciones
En el ámbito de la invención, se entiende por “fibrinógeno” un fibrinógeno humano. Puede tratarse de fibrinógeno humano funcional, de secuencia similar o idéntica a la secuencia del fibrinógeno humano normal, y cualquier fracción intermedia obtenida durante el procedimiento de fabricación de una composición que comprende fibrinógeno.
El fibrinógeno es una proteína constituida de un dímero de tres cadenas polipeptídicas denominadas alfa, beta y gamma. El fibrinógeno es, por lo tanto, un dímero, y cada monómero está compuesto por tres cadenas (alfa, beta, gamma). La forma principal del fibrinógeno tiene un peso molecular (PM) de 340 kDa. El fibrinógeno está formado por dos subunidades idénticas unidas por puentes disulfuro, que dan a la molécula una forma de fibra que comprende 3 glóbulos: uno central (dominio E) y dos distales (dominios D). La molécula completa contiene 2964 aminoácidos: 610 aminoácidos para la cadena alfa (a), 461 aminoácidos para la cadena beta (b), y 411 aminoácidos para la cadena gamma (g). El fibrinógeno interviene en la hemostasis primaria así como en la coagulación. Lo más frecuentemente,
se prescribe para el tratamiento de las complicaciones asociadas a la afibrinogenemia constitucional o severa y los síndromes hemorrágicos o riesgos de hemorragias asociados a una hipofibrinogenemia.
Según la invención, se pueden usar varias fuentes de materia prima que contienen fibrinógeno. La composición que comprende fibrinógeno según la invención usa por lo tanto una composición de fibrinógeno, especialmente de diferentes fuentes. La composición de fibrinógeno puede así proceder de plasma sanguíneo, de sobrenadante de cultivo celular o de leche de animales transgénicos.
En una realización particular, la composición según la invención es una fracción plasmática, preferentemente una fracción plasmática obtenida a partir de plasma sanguíneo purificado previamente.
Por “fracción plasmática obtenida a partir de plasma sanguíneo purificado previamente” se entiende cualquier parte o subparte del plasma sanguíneo humano que haya sido objeto de una o varias etapas de purificación. Dichas fracciones plasmáticas incluyen, por lo tanto, el criosobrenadante, el crioprecipitado de plasma (vuelto a poner en suspensión), la fracción I obtenida por fraccionamiento etanólico (según el método de Cohn o de Kistler & Nitschmann), los eluatos de cromatografías y las fracciones no adsorbidas de las columnas de cromatografía, incluyendo cromatografías multicolumnas, y filtradas.
En una realización preferida de la invención, la composición según la invención procede de un eluato de cromatografía o de una fracción no adsorbida de columna de cromatografía, incluyendo de cromatografía multicolumnas.
Así, en una realización preferida de la invención, la composición según la invención procede de una fracción plasmática obtenida a partir del criosobrenadante o de crioprecipitado vuelto a poner en suspensión.
Según la invención, el “criosobrenadante” corresponde a la fase líquida obtenida después de la descongelación del plasma congelado (crioprecipitación). Especialmente, el criosobrenadante se puede obtener por congelación de plasma sanguíneo a una temperatura comprendida entre -10°C y -40°C, y después descongelación lenta hasta una temperatura comprendida entre 0°C y 6°C, preferiblemente entre 0°C y 1°C, seguida de una centrifugación del plasma descongelado para separar el crioprecipitado y el criosobrenadante. El crioprecipitado es un concentrado de fibrinógeno, fibronectina, factor von Willebrand y factor VIII, mientras que el criosobrenadante contiene los factores del complemento, los factores de vitamina K dependientes tales como la proteína C, la proteína S, la proteína Z, el factor II, el factor VII, el factor IX y el factor X, del fibrinógeno, las inmunoglobulinas y la albúmina.
En una realización ventajosa de la invención, la composición según la invención se puede obtener según el procedimiento descrito por la Solicitante en la solicitud EP1739093 o en la solicitud WO2015/136217.
En otra realización particular de la invención, la composición según la invención proviene de leche de animales transgénicos, por ejemplo obtenida según el método descrito en el documento WO00/17234 o en el documento WO00/17239.
En una realización, la composición de la invención se puede obtener mediante el procedimiento que comprende las etapas siguientes:
- una etapa de purificación por cromatografía de afinidad;
- al menos una etapa de aseguramiento biológica; y
- una etapa de formulación en forma líquida.
En una realización particular de la invención, la etapa de purificación por cromatografía de afinidad se hace por cromatografía de afinidad usando ligandos de afinidad seleccionados entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos o ligandos químicos tales como péptidos, péptidos miméticos, peptoides, nanofitinas o incluso ligandos oligonucleotídicos tales como aptámeros.
En una realización particular de la invención, la composición líquida, estable y que comprende fibrinógeno se obtiene según el procedimiento que comprende las etapas siguientes:
- obtención de una fracción de criosobrenadante de plasma sanguíneo,
- precipitación del criosobrenadante en un 8% de etanol a fin de obtener una fracción enriquecida en fibrinógeno,
- purificación de la fracción de plasma sanguíneo enriquecida en fibrinógeno después de volver a poner en suspensión por separación sobre gel de cromatografía de afinidad usando preferiblemente ligandos de afinidad seleccionados entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, o ligandos químicos tales como péptidos, péptidos miméticos, peptoides, nanofitinas o incluso ligandos oligonucleotídicos tales como aptámeros,
- recuperación de la fracción adsorbida purificada que comprende fibrinógeno,
- eventualmente, adición de excipientes farmacéuticamente aceptables.
En una realización particular, el procedimiento comprende además una etapa de conservación durante al menos 3 meses a 5°C.
En una realización particular de la invención, la cromatografía de afinidad utilizada es una matriz de afinidad con ligandos de tipo fragmento derivado de anticuerpos de llama, tal como la matriz de Fibrinógeno CaptureSelect (Life Technologies).
De manera particularmente ventajosa, la composición según la invención está desprovista de proteasas y/o de activadores de la fibrinólisis.
Por “composición de fibrinógeno desprovista de proteasas y/o de activadores de la fibrinólisis” se entiende que la composición de fibrinógeno se ha sometido a una o varias etapas que permiten la eliminación de las proteasas tales como la trombina, la protrombina, plasmina, plasminógeno, de tal manera que la cantidad residual de proteasas y/o de activadores de la fibrinólisis sea:
- muy fuertemente reducida en comparación con la disolución de fibrinógeno purificada previamente antes de la etapa de cromatografía, y/o
- nula, y/o
- menor que los umbrales de detección de los métodos comúnmente utilizados por el experto en la materia.
De manera ventajosa, la tasa de protrombina residual es menor que 5 püI/mg de fibrinógeno, la tasa de plasminógeno es menor que 15 ng/mg de fibrinógeno.
En una realización particular de la invención, la composición según la invención está por lo tanto desprovista de proteasas tales como la trombina y/o la plasmina, o sus proenzimas correspondientes, protrombina (factor II de la coagulación) y/o plasminógeno, que son unos zimógenos potencialmente activables.
Por “composición que comprende fibrinógeno” se entiende una composición que comprende
- fibrinógeno humano
- eventualmente una o varias proteínas copurificadas o acompañantes
- unos excipientes farmacéuticamente aceptables
Según la invención, la o las proteínas copurificadas o acompañantes del fibrinógeno pueden consistir en una o varias proteínas plasmáticas. Por “proteína plasmática” se entiende, según la invención, cualquier proteína, y más particularmente cualquier proteína de interés industrial o terapéutico, contenida en el plasma sanguíneo. Las proteínas del plasma sanguíneo incluyen albúmina, alfa/macroglobulina, antiquimotripsina, antitrombina, antitripsina, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta XlIa, inhibidor de C1, proteína C-reactiva, C7, C1r, C1s, c 2 C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, carboxipeptidasa N, ceruloplasmina, factor B, factor D, factor H, factor I, factor IX, factor V, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, fibrinógeno, fibronectina, haptoglobina, hemopexina, cofactor II de heparina, histidina rica en GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, quininasa II, quininógeno HPM, lisozima, PAI 2, PAI I, PCI, plasmina, inhibidor de la plasmina, plasminógeno, prealbúmina, prekalicreína, properdina, proteasa nexina INH, proteína C, proteína S, proteína Z, protrombina, proteína de suero amiloide (SAP), TFPI, tiolproteinasa, trombomodulina, factor tisular (TF), TPA, transcolabamina II, transcortina, transferrina, vitronectina, y el factor de Willebrand. Especialmente, las proteínas plasmáticas abarcan las proteínas de coagulación, es decir, las proteínas plasmáticas implicadas en la cadena de reacciones en cascada que dan lugar a la formación de un coágulo sanguíneo. Las proteínas de coagulación abarcan el factor I (fibrinógeno), el factor II (protrombina), el factor V (proacelerina), el factor VII (proconvertina), el factor VIII (factor antihemofílico A), el factor IX (factor antihemofílico B), el factor X (factor de Stuart), el factor XI (factor de Rosenthal o PTA), el factor XII (factor de Hageman), el factor XIII (factor estabilizante de la fibrina o FSF), la PK (Prekalicreína), el KHPM (quininógeno de alto peso molecular), el factor III (tromboplastina o factor tisular), el cofactor II de heparina (HCII), la proteína C (PC), la trombomodulina (TM), la proteína S (PS), el factor de Willebrand (Wf) y el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), o también los factores tisulares.
En algunas realizaciones, la proteína plasmática consiste en una proteína de coagulación con actividad enzimática. Las proteínas de coagulación con actividad enzimática abarcan las formas activadas del factor II (protrombina), factor
VII (proconvertina), factor IX (factor antihemofílico B), factor X (factor de Stuart), factor XI (Factor de Rosenthal o PTA), factor XII (factor de Hageman), factor XIII (factor estabilizante de la fibrina o FSF) y de la PK (Prekalicreína).
La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” corresponde a cualquier excipiente ventajosamente utilizable para la formulación de proteínas humanas, especialmente para las sustancias seleccionadas entre las sales, los aminoácidos, los azúcares, los surfactantes o cualquier otro excipiente.
El término “equimolar” se refiere a una cantidad idéntica o equivalente en moles/l, o mmoles/l (M o mM) entre varios excipientes, en particular entre dos excipientes, a una proporción entre los dos excipientes comprendida entre 0,8 y 1,2, preferiblemente entre 0,9 y 1,1, aún más preferiblemente aproximadamente igual a 1,0. En particular, la composición según la invención comprende ventajosamente una cantidad equimolar de arginina y de glutamato, con una proporción arginina/glutamato comprendida entre 0,8 y 1,2, preferiblemente entre 0,9 y 1,1, aún más preferiblemente aproximadamente igual a 1,0; o una proporción glutamato/arginina comprendida entre 0,8 y 1,2, preferiblemente entre 0,9 y 1,1, aún más preferiblemente aproximadamente igual a 1,0.
El término “estable” corresponde a la estabilidad física y/o química de la composición que comprende el fibrinógeno. La expresión “estabilidad física” se refiere a la reducción o la ausencia de formación de agregados insolubles o solubles de las formas diméricas, oligoméricas o poliméricas del fibrinógeno, a la reducción o ausencia de formación de precipitado, así como a la reducción o la ausencia de cualquier desnaturalización estructural de la molécula.
La expresión “estabilidad química” se refiere a la reducción o a la ausencia de cualquier modificación química de la composición que comprende el fibrinógeno durante el almacenamiento, en estado líquido, en condiciones aceleradas.
La estabilidad de una composición que comprende fibrinógeno puede evaluarse mediante diferentes métodos, especialmente mediante métodos de prueba de estabilidad acelerada o mediante métodos de puesta en estabilidad a largo plazo.
Los métodos de prueba de estabilidad acelerada comprenden especialmente unos test de estrés mecánico por calentamiento.
En una realización, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se mide después de un estrés térmico (heating stress) por calentamiento en baño termostatizado a 37°C, por ejemplo, mediante la medición a T0, T+7 días y T+14 días. Después, la medición de las partículas en disolución de tamaños superiores al umbral de detección con el ojo humano (aproximadamente 50 pm) se efectúa especialmente por inspección visual con la ayuda, por ejemplo, de una examinadora de la farmacopea europea (opalescencia, formación de partículas), mediante medición de la turbidez por medio de un espectrofotómetro que mide la absorbancia o la densidad óptica a 400 nm.
Una prueba de estabilidad a largo plazo se puede efectuar en diferentes condiciones de temperatura, humedad, y luz. Preferiblemente, en el ámbito de la presente invención, la prueba de estabilidad puede durar como mínimo 1 semana, preferiblemente al menos 1 mes, preferiblemente al menos 2 meses, preferiblemente al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, preferiblemente al menos 5 meses, más preferiblemente al menos 6 meses.
Típicamente, la medición de los parámetros de estabilidad, tal como se definen a continuación, tienen lugar
- antes de la realización de la prueba de estabilidad de una composición que comprende fibrinógeno; se puede hablar entonces de tasa inicial; y
- durante o al final de dicha prueba de estabilidad,
entendiéndose que dicha prueba de estabilidad puede durar como mínimo 1 semana, preferiblemente al menos 1 mes, preferiblemente al menos 2 meses, preferiblemente al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, preferiblemente al menos 5 meses, más preferiblemente al menos 6 meses.
Los métodos de análisis, después de la puesta en estabilidad a largo plazo, comprenden especialmente análisis mediante inspección visual con la ayuda especialmente de una examinadora de la farmacopea europea (opalescencia, formación de partículas), por medición de la turbidez por medio de un espectrofotómetro que mide la absorbancia o la densidad óptica a 400 nm, que permite evaluar la presencia o no de degradación del producto mediante la detección de turbidez en la disolución.
En una realización, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se define mediante la medición de la tasa de monómeros conservados durante la prueba de estabilidad por medio del método Cromatografía de Exclusión por Tamaño de Alta Presión (High Pressure Size Exclusion Chormatography) (HPSEC). Estos métodos son bien conocidos por el experto en la materia.
Una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente como estable si la cantidad de monómeros de fibrinógeno conservados durante la realización de la prueba de estabilidad es mayor que un 50%, preferiblemente
mayor que un 60%, preferiblemente mayor que un 70%, preferiblemente mayor que un 80%, preferiblemente mayor que un 90%, preferiblemente mayor que un 95% de la tasa inicial de monómeros de fibrinógeno.
Más preferiblemente, la cantidad de monómeros de fibrinógeno conservados durante la prueba de estabilidad es mayor que un 70% de la tasa inicial de monómeros de fibrinógeno.
Por “tasa inicial de monómero de fibrinógeno” se entiende la tasa de monómero observada antes de la realización de la prueba de estabilidad. Típicamente, la cantidad de monómero de fibrinógeno se mide antes de la realización de la prueba de estabilidad y durante o al final de dicha prueba de estabilidad.
Alternativamente, una composición de fibrinógeno se considera como estable si la variación de la cantidad de monómeros de fibrinógeno durante la prueba de estabilidad es menor que un 20%, preferiblemente menor que un 10%, preferiblemente menor que un 5%, preferiblemente menor que un 1%.
En otra realización, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se define mediante la medición de la tasa de polímeros de fibrinógeno formados durante la realización de la prueba de estabilidad mediante HPSEC. Los polímeros de fibrinógenos son unos polímeros que comprenden al menos 2 cadenas polipeptídicas alfa, 2 cadenas polipeptídicas beta y 2 cadenas polipeptídicas gamma del fibrinógeno. Este término incluye también los trímeros de fibrinógeno.
Una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente como estable si la cantidad de polímeros de fibrinógeno formados durante la realización de la prueba de estabilidad es menor que un 10%, preferiblemente menor que un 20%, preferiblemente menor que un 30%, preferiblemente menor que un 40%, preferiblemente menor que un 50% con respecto a la tasa inicial de polímeros de fibrinógeno. Típicamente, la tasa inicial de polímeros de fibrinógeno corresponde al conjunto de las formas poliméricas (trímeros y más) del fibrinógeno antes de la realización de la prueba de estabilidad.
Más preferiblemente, la cantidad de polímeros de fibrinógeno formados durante la realización de la prueba de estabilidad es menor que un 30%. Típicamente, la cantidad de polímeros de fibrinógeno se mide antes de la realización de la prueba de estabilidad y durante o al final de dicho ensayo de estabilidad.
Alternativamente, una composición de fibrinógeno se considera como estable si la variación de la cantidad de polímeros de fibrinógeno durante la prueba de estabilidad es menor que un 20%, preferiblemente menor que un 10%, preferiblemente menor que un 5%, preferiblemente menor que un 1%.
En otra realización, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se evalúa mediante la medición de la actividad coagulable del fibrinógeno con respecto a la medición antigénica del fibrinógeno (también denominada actividad específica). De manera particularmente ventajosa, la composición de fibrinógeno estable presenta una proporción fibrinógeno coagulable/fibrinógeno antigénico mayor que 0,5; preferiblemente mayor que 0,6; mayor que 0,7; mayor que 0,8; mayor que 0,9, aún más preferiblemente aproximadamente igual a 1,0.
Por “fibrinógeno coagulable” se entiende la medición del fibrinógeno funcional por una técnica de coagulación, determinada según el método de von Clauss. La actividad coagulable se expresa en g/l de solución de fibrinógeno. Esta técnica es conocida por el experto en la materia que puede referirse a la publicación de Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, 237-246.
Por “fibrinógeno antigénico” se entiende la cantidad de fibrinógeno, activo o no activo, medida por el método nefelométrico. La cantidad de fibrinógeno antigénico se expresa en g/l.
La estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se evalúa también mediante la medición en SDS PAGE de la conservación de las cadenas alfa, beta y gamma de fibrinógeno, preferiblemente antes y después de una prueba de estabilidad tal como se define en el ámbito de la presente invención. Por tanto, una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente como estable si:
- el conjunto de las cadenas alfa se conserva a al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%; más preferiblemente se conserva a aproximadamente un 100%, y/o
- el conjunto de las cadenas beta se conserva a al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%; más preferiblemente se conserva a aproximadamente un 100%, y/o
- el conjunto de las cadenas gamma se conserva a al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%; más preferiblemente se conserva a aproximadamente un 100%.
La estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se define también mediante la medición de la turbidez mediante la espectrofotometría UV a 400 nm. En efecto, la turbidez refleja la cantidad de materia que enturbia la solución. Una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente como estable si la turbidez medida después de la prueba de estabilidad como se define en la presente invención es comparable a la turbidez medida antes de la estabilidad.
Ventajosamente, la turbidez medida después de la realización de la prueba de estabilidad corresponde a menos de un 130%, menos de un 120%, menos de un 110%; ventajosamente corresponde a un 100% de la turbidez medida antes de la estabilidad.
En una realización ventajosa de la invención, la composición que comprende fibrinógeno es estable durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses a entre 2°C y 8°C.
En una realización ventajosa de la invención, la composición que comprende fibrinógeno es estable durante 6 meses a entre 2°C y 8°C.
Por “composición de fibrinógeno en forma líquida” se entiende una composición que comprende fibrinógeno en solución, preferiblemente que no se ha sometido a una etapa de liofilización, desecación, deshidratación, secado por pulverización (spray drying) o secado, y que por lo tanto no necesita ser reconstituida antes de su uso.
En el contexto de la invención, la expresión “comprendido entre x e y” significa que los valores x e y están incluidos.
Formulaciones:
La composición según la invención comprende entre 10 g/l y 30 g/l de fibrinógeno (denominadas en lo sucesivo composiciones de fibrinógeno 10-30 g/l), preferentemente entre 15 g/l y 25 g/l de fibrinógeno, más preferentemente entre 15 g/l y 20 g/l de fibrinógeno, y aún más preferiblemente 15 g/l o 20 g/l o 25 g/l de fibrinógeno.
En el contexto de la presente invención, las concentraciones se entienden a nivel de la composición final, lista para el uso. Las concentraciones se determinan con respecto a composiciones en forma líquida.
De manera particularmente ventajosa, la Solicitante ha puesto en evidencia que es posible obtener composiciones líquidas que comprenden 10-30 g/l de fibrinógeno particularmente estables a lo largo del tiempo usando un mínimo de excipientes. Así, según la invención, las composiciones líquidas de fibrinógeno de 10-30 g/l comprenden ventajosamente entre 10 y 300 mM de arginina, de manera preferida entre 20 y 200 mM, y entre 10 y 300 mM de glutamato, de manera preferida entre 20 y 200 mM.
En una realización particular, la concentración de arginina está comprendida entre 10 y 300 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 250 mM, más preferiblemente comprendida entre 50 y 250 mM.
En otra realización particular, la concentración de arginina es ventajosamente menor que 300 mM, preferentemente menor que 250 mM, preferentemente menor que 200 mM, aún más preferiblemente menor que 150 mM. Tal concentración de arginina es particularmente adecuada para evitar aumentar demasiado la osmolalidad.
En una realización particular, la concentración de glutamato es ventajosamente menor que 80 mM, preferentemente menor que 70 mM, preferentemente menor que 60 mM, aún más preferiblemente menor que 50 mM. Tal concentración de glutamato es particularmente adecuada para las composiciones que comprenden fibrinógeno destinadas a inyectarse por vía intravenosa a fin de minimizar los efectos secundarios en los pacientes.
En otra realización ventajosa, la concentración de glutamato está comprendida entre 10 y 80 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 70 mM, más preferiblemente comprendida entre 30 y 60 mM. Tal concentración de glutamato es particularmente adecuada para las composiciones que comprenden fibrinógeno destinadas a inyectarse por vía intravenosa a fin de minimizar los efectos secundarios en los pacientes.
En otra realización particular, la composición líquida de fibrinógeno 10-30 g/l comprende arginina y glutamato en cantidades equimolares. La Solicitante ha puesto en evidencia de manera sorprendente que la adición en cantidades equimolares de glutamato y de arginina permite ventajosamente estabilizar la formulación en forma líquida manteniendo al mismo tiempo una buena tolerancia con respecto a los pacientes. El efecto de estabilización es proporcional al aumento de las cantidades de glutamato y de arginina. La Solicitante ha puesto en evidencia, sin embargo, un efecto óptimo entre 10 y 80 mM, en efecto, superior a 80 mM, la composición, aunque estable, presenta una tasa de glutamato susceptible de provocar efectos secundarios en los pacientes.
Asimismo, en una realización particular, las composiciones de fibrinógeno de 10-30 g/l comprenden ventajosamente entre 1 y 500 ppm de surfactante, preferiblemente entre 20 y 400 ppm de surfactante, más preferiblemente entre 50 y 400 ppm de surfactante, más preferiblemente entre 150 y 250 ppm. El surfactante utilizado en la composición según la invención se selecciona ventajosamente entre los surfactantes no iónicos, preferentemente los polisorbatos, y
especialmente entre el polisorbato 80 (o Tween®80 que es un monooleato de polioxietilensorbitán), y el polisorbato 20 (o Tween®20 que es un monolaurato de polioxietilensorbitán). Eventualmente, el surfactante se puede seleccionar entre los poloxámeros, polioxietilen alquiléteres, un bloque de copolímeros de etileno/polipropileno, los alquilglucósidos o azúcares alquilados, y el Pluronic®F68 (polietilenpolipropilenglicol). Los surfactantes pueden también combinarse entre sí. De manera ventajosa, el surfactante permite estabilizar las interacciones entre las moléculas en forma líquida.
Según una realización particular de la invención, la composición comprende además al menos un aminoácido seleccionado entre alanina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, solos o en combinación, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1-300 mM.
Según una realización particular de la invención, la composición comprende además un aminoácido seleccionado ventajosamente entre la serina, la prolina y/o la isoleucina, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1 -300 mM. De manera ventajosa, el aminoácido estabiliza la composición según la invención en forma líquida. En una realización particular, la composición comprende además un aminoácido polar tal como la serina, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1-300 mM.
Según una realización particular de la invención, la composición contiene también al menos un aminoácido hidrófobo escogido entre la leucina, la alanina, la fenilalanina, el triptófano, la valina, la metionina, la isoleucina, la prolina, la cisteína y/o la glicina. De manera preferida, el aminoácido hidrófobo se selecciona entre la prolina y/o la isoleucina. De manera ventajosa, el aminoácido hidrófobo estabiliza la composición según la invención en forma líquida.
Según una realización particular de la invención, la composición contiene también un tampón, en particular un tampón de histidina, un tampón fosfato, Tris-HCl o citrato trisódico, preferiblemente citrato trisódico, preferiblemente a una concentración comprendida entre 1 y 15 mM, más preferiblemente a una concentración comprendida entre 7 y 10 mM, aún más preferiblemente a una concentración comprendida entre 8 y 9 mM.
Según una realización particular de la invención, la composición contiene también albúmina a una concentración comprendida entre 5 y 1000 ppm, preferiblemente a una concentración comprendida entre 5 y 500 ppm. De manera ventajosa, la albúmina presente en la composición de la invención es albúmina humana plasmática o recombinante. De manera ventajosa, la Solicitante ha puesto en evidencia que tales composiciones presentan una osmolalidad particularmente adecuada para la administración mediante inyección, especialmente por vía intravenosa, y esto sin adición en número y/o cantidades de excipientes. Por lo tanto, la invención propone unas composiciones de fibrinógeno de 15-25 g/l o 15-20 g/l que presentan una osmolalidad medida comprendida entre 250 y 550 mOsm/kg aproximadamente. En este contexto de la invención, y salvo que se mencione lo contrario, la osmolalidad de la composición se entiende como la osmolalidad medida en dicha composición.
La osmolalidad se mide ventajosamente con la ayuda de un osmómetro calibrado con soluciones patrón, y especialmente según el método recomendado por la Farmacopea Europea, (Pharmacopée Européenne 5.0 de 2005-01/2005:2.2.35.). Por supuesto, se puede utilizar cualquier otro método de medición de la osmolalidad.
En una realización particular, los únicos excipientes de la composición de fibrinógeno según la invención, son la arginina y el glutamato. Tal formulación permite una buena estabilización de las composiciones líquidas de fibrinógeno y una reducción de los tiempos y de los costes de preparación a escala industrial gracias a la presencia de un número y de una cantidad mínimos eficaces de excipientes. Ventajosamente, tal composición presenta una osmolalidad compatible con la administración por inyección, especialmente por vía intravenosa.
En otra realización particular, los únicos excipientes de la composición de fibrinógeno según la invención, son la arginina, el glutamato y el surfactante.
En otra realización particular, los únicos excipientes de la composición de fibrinógeno según la invención, son la arginina, el glutamato y al menos otro aminoácido.
En otra realización particular, los únicos excipientes de la composición de fibrinógeno según la invención, son la arginina, el glutamato y al menos un aminoácido hidrófobo.
En otra realización particular, los únicos excipientes de la composición de fibrinógeno según la invención, son la arginina, el glutamato, el surfactante y al menos otro aminoácido.
En otra realización particular, los únicos excipientes de la composición de fibrinógeno según la invención, son la arginina, el glutamato, el surfactante y al menos un aminoácido hidrófobo.
En otra realización particular, los únicos excipientes de la composición de fibrinógeno según la invención, son la arginina, el glutamato y albúmina humana.
En una realización particular, la composición consiste esencialmente en fibrinógeno, arginina, glutamato, en el sentido que cualquier otro excipiente que pudiera estar presente lo estaría sólo en estado de traza.
En otra realización particular de la invención, la composición según la invención está desprovista de iones divalentes, especialmente de iones metálicos divalentes, en particular de calcio y/o de sodio.
De manera particularmente ventajosa, la composición según la invención está desprovista de excipientes conocidos por su papel de estabilización de los liofilizados tales como el cloruro de sodio, y/o el CarboxiMetilDextrano (CMD). En otra realización particular de la invención, la composición según la invención está desprovista de albúmina. En otra realización particular de la invención, la composición según la invención está desprovista de azúcares. En una realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención está desprovista de inhibidores de proteasas y/o de antifibrinolíticos.
Por “inhibidores de proteasas y/o antifibrinolíticos”, se entiende cualquier molécula con actividad antiproteásica, especialmente cualquier molécula con actividad inhibidora de serina proteasa y/o antifibrinolítica, en particular cualquier molécula con actividad inhibidora de trombina y/o antiplasmina, en particular hirudina, benzamidina, aprotinina, floruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), pepstatina, leupeptina, antitrombina III asociada o no con heparina, alfa 2 macroglobulina, alfa 1 antitripsina, ácido hexanoico o épsilon aminocaproico, ácido tranexámico, alfa 2 antiplasmina, DiosoPropilfluoroFosfato (DSP), antiquimiotripsina.
En una realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención está desprovista de hirudina y/o de benzamidina y/o de aprotinina y/o de PMSF y/o de pepstatina y/o de leupeptina y/o de antitrombina III asociada o no con heparina y/o de alfa 2 macroglobulina y/o de alfa 1 antitripsina y/o de ácido hexanoico y/o épsilon aminocaproico y/o de ácido tranexámico y/o de alfa 2 antiplasmina.
En una realización particular de la invención, la composición según la invención no comprende otras proteínas copurificadas, ventajosamente no comprende FXIII y/o fibronectina.
En otra realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención puede también comprender una o varias proteínas acompañantes, eventualmente copurificadas. En una realización particular de la invención, la composición según la invención comprende ventajosamente FXIII.
Ventajosamente, la composición según la invención está desprovista de fibrina.
En otra realización particular, la composición consiste esencialmente en fibrinógeno, arginina, glutamato, eventualmente un surfactante, preferentemente Tween 80, eventualmente un aminoácido hidrófobo, preferiblemente prolina y/o isoleucina, y eventualmente tampón tal como citrato trisódico, en el sentido que cualquier otro excipiente que pudiera estar presente lo estaría solamente en estado de traza.
Según la invención, el pH final de la composición esta ventajosamente comprendido entre 6 y 8. Preferiblemente, el pH es de aproximadamente 6,0-7,5, aún más preferiblemente entre 6,0-7,0. Un pH de 6,0-7,0 da, en efecto, unos resultados particularmente satisfactorios en términos de estabilidad líquida a lo largo del tiempo, permitiendo al mismo tiempo limitar los fenómenos de agregación y de degradación. El pH final se entiende como el pH de la composición después de la formulación, es decir, en la composición lista para el uso. Salvo que se mencione lo contrario en la presente descripción, el pH de la composición se refiere al pH final.
Una composición de fibrinógeno 10-30 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- eventualmente 1-15 mM de tampón, en particular de citrato trisódico
- eventualmente 1-300 mM de otro aminoácido, en particular 1-300 mM de prolina y/o 1-300 mM de isoleucina y/o 1-300 mM de serina
- eventualmente 1-500 ppm de surfactante, preferiblemente 20-400 ppm, de manera aún más preferida 150-250 ppm
- eventualmente 5-1000 ppm de albúmina humana
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Una composición de fibrinógeno 10-30 g/l preferida según la invención comprende:
- 20-200 mM de arginina
- 20-200 mM de glutamato
- eventualmente 7-10 mM de tampón, en particular de citrato trisódico
- eventualmente 1-100 mM de otro aminoácido, en particular 1-100 mM de prolina y/o 1-100 mM de isoleucina y/o 1-100 mM de serina
- eventualmente 20-400 ppm de surfactante
- eventualmente 5-500 ppm de albúmina humana
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Una composición de fibrinógeno 15-25 g/l preferida según la invención comprende:
- 150 mM de arginina
- 80 mM de glutamato
- 8,5 mM de tampón, en particular de citrato trisódico
- 200 ppm de surfactante, preferiblemente polisorbato80, polisorbato20 o Pluronic®F68
- eventualmente 1-100 mM de otro aminoácido, en particular 1-100 mM de prolina y/o 1-100 mM de isoleucina y/o 1-100 mM de serina
- eventualmente 5-500 ppm de albúmina humana
siendo el pH de la composición de 6,0-7,0.
Una composición de fibrinógeno 15-25 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Una composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-25 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -15 mM de tampón, en particular de citrato trisódico
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -15 mM de citrato trisódico
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-25 g/l preferida según la invención comprende: - 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -300 mM de otro aminoácido
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende: - 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1-300 mM de aminoácido hidrófobo
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-25 g/l preferida según la invención comprende: - 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -300 mM de otro aminoácido
- 1 -15 mM de tampón, en particular de citrato trisódico
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende: - 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1-300 mM de aminoácido hidrófobo
- 1 -15 mM de citrato trisódico
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-25 g/l preferida según la invención comprende: - 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -300 mM de prolina y/o de isoleucina y/o de serina
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende: - 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -300 mM de prolina y/o de isoleucina y/o de serina
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -300 mM de prolina y/o de isoleucina
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1-500 ppm de surfactante, preferiblemente 50-400 ppm, de manera más preferida 150-250 ppm siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1-500 ppm de surfactante, preferiblemente 50-400 ppm, de manera más preferida 150-250 ppm - 1 -15 mM de citrato trisódico
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1-500 ppm de polisorbato 80, preferiblemente 50-400 ppm, de manera más preferida 150-250 ppm siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1-300 mM de aminoácido hidrófobo
- 1-500 ppm de surfactante, preferiblemente 50-400 ppm, de manera más preferida 150-250 ppm - 1 -15 mM de citrato trisódico
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
Otra composición de fibrinógeno 15-20 g/l preferida según la invención comprende:
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- 1 -300 mM de prolina y/o de isoleucina
- 1-500 ppm de polisorbato 80, preferiblemente 50-400 ppm, de manera más preferida 150-250 ppm
- eventualmente 1-15 mM de citrato trisódico
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
La osmolalidad medida de esta composición de fibrinógeno es ventajosamente de aproximadamente 225-715 mOsm/kg.
De manera sorprendente y ventajosa, la Solicitante ha puesto en evidencia que una concentración de arginina de aproximadamente 10-80 mM, /- 10% combinada con una concentración de glutamato de aproximadamente 10-80 mM, /- 10%, es suficiente es suficiente para mantener la composición de fibrinógeno 15-20 g/l líquida estable manteniendo al mismo tiempo una osmolalidad comprendida entre 225 y 500 mOsm/kg en la composición, mientras que se tendrían que haber alcanzado concentraciones mayores para garantizar la estabilidad líquida, aumentando paralelamente la osmolalidad de dichas composiciones. Sin embargo, una osmolalidad demasiado elevada puede ser el origen de una deshidratación de las células (salida de agua intracelular hacia el medio extracelular) perjudicial para el paciente.
De manera ventajosa, la composición según la invención posee una pureza mayor o igual a un 70%, de manera preferida mayor o igual a un 75%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98%, un 99%.
La composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida y después de un almacenamiento durante al menos un periodo de 6 meses entre 2°C y 8°C presenta ventajosamente una cantidad de monómeros de fibrinógeno conservados durante la realización del de la prueba de estabilidad mayor que un 50%, preferiblemente mayor que un 60%, preferiblemente mayor que un 70%, preferiblemente mayor que un 80%, preferiblemente mayor que un 90%, preferiblemente mayor que un 95% de la tasa inicial de monómeros de fibrinógeno.
Más preferiblemente, la composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida y después de un almacenamiento durante al menos un periodo de 6 meses a 5°C ± 3°C presenta ventajosamente una cantidad de monómeros de fibrinógeno conservados durante la realización de la prueba de estabilidad mayor que un 70% de la tasa inicial de monómeros de fibrinógeno.
Alternativamente, la composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida, presenta ventajosamente una variación de la cantidad de monómeros de fibrinógeno durante la prueba de estabilidad menor que un 20%, preferiblemente menor que un 10%, preferiblemente menor que un 5%, preferiblemente menor que un 1%.
La composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida y después de un almacenamiento durante al menos un periodo de 6 meses entre 2°C y 8°C presenta ventajosamente una cantidad de polímeros de fibrinógeno formados durante la realización de la prueba de estabilidad menor que un 10%, preferiblemente menor que un 20%, preferiblemente menor que un 30%, preferiblemente menor que un 40%, preferiblemente menor que un 50% con respecto a la tasa inicial de polímeros de fibrinógeno. Típicamente, la tasa inicial de polímeros de fibrinógeno corresponde al conjunto de las formas poliméricas (trímeros y más) del fibrinógeno antes de la realización de la prueba de estabilidad.
Más preferiblemente, la composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida y después de un almacenamiento durante al menos un periodo de 6 meses entre 2°C y 8°C presenta ventajosamente una cantidad de polímeros de fibrinógeno formados durante la realización del ensayo de estabilidad menor que un 30%. Típicamente, la cantidad de polímeros de fibrinógeno se mide antes de la realización de la prueba de estabilidad y durante o al final de dicha prueba de estabilidad. Alternativamente, la composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida, presenta ventajosamente una variación de la cantidad de polímeros de fibrinógeno durante la prueba de estabilidad menor que un 20%, preferiblemente menor que un 10%, preferiblemente menor que un 5%, preferiblemente menor que un 1%.
La composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida y después de un almacenamiento durante al menos un periodo de 6 meses entre 2°C y 8°C presenta ventajosamente una proporción fibrinógeno coagulable/fibrinógeno antigénico mayor que 0,5; preferiblemente mayor que 0,6; mayor que 0,7; mayor que 0,8; mayor que 0,9; aún más preferiblemente aproximadamente igual a 1,0.
La composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida y después de un almacenamiento durante al menos un periodo de 6 meses entre 2°C y 8°C presenta ventajosamente
- una conservación del conjunto de las cadenas alfa a al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%; más preferiblemente conservado a aproximadamente un 100%, y/o
- una conservación del conjunto de las cadenas beta a al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%; más preferiblemente conservado a aproximadamente un 100%, y/o
- una conservación del conjunto de las cadenas gamma a al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%; más preferiblemente conservado a aproximadamente un 100%.
La composición de fibrinógeno según la invención, en forma líquida y después de un almacenamiento durante al menos un periodo de 6 meses entre 2°C y 8°C presenta ventajosamente una turbidez medida después de la realización de la prueba de estabilidad que corresponde a menos de un 130%, menos de un 120%, menos de un 110%; ventajosamente que corresponde al 100% de la turbidez medida antes de la estabilidad.
Las composiciones de la invención pueden ser unas composiciones farmacéuticas, es decir adecuadas para un uso terapéutico. Las composiciones farmacéuticas de la invención son así útiles como medicamentos, especialmente a fin de tratar las hipofibrinogenemias, disfibrinogenemias o a-fibrinogenemias constitucionales en los pacientes que presentan una hemorragia espontánea o post-traumática, o como tratamiento complementario en el tratamiento médico de una hemorragia severa incontrolada en el contexto de una hipofibrinogenemia adquirida.
Según la invención, se pueden utilizar varias fuentes de materia prima que contienen fibrinógeno. La composición de fibrinógeno puede así proceder de plasma sanguíneo denominado de otra manera fracciones plasmáticas, de sobrenadante de cultivo celular o de leche de animales transgénicos.
En una realización preferida, la composición de la invención no se ha sometido a ninguna etapa de liofilización, desecación, deshidratación o secado.
En una realización preferida, la composición de la invención no se ha sometido a ninguna etapa previa de reconstitución de un liofilizado.
Las composiciones según la invención pueden someterse ventajosamente a al menos un método de eliminación o de inactivación de los agentes infecciosos.
Una inactivación vírica comprende frecuentemente un tratamiento con productos químicos, por ejemplo con disolvente, y/o detergente y/o por calor (pasteurización y/o calentamiento) y/o por irradiación (Gamma y/o por UVC) y/o mediante tratamiento con pH (tratamiento con pH ácido).
Preferentemente, la inactivación vírica consiste en una etapa de tratamiento por calentamiento o por un tratamiento con disolvente y detergente. El tratamiento con disolvente y detergente (denominado generalmente tratamiento Disolvente/Detergente o S/D) comprende especialmente el tratamiento con fosfato de tri-n-butilo (TnBP) y/o un detergente que se selecciona entre Triton X-100, Tween (preferentemente Tween 80), el colato de sodio, y el 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol (Octoxinol).
Preferentemente, la etapa de eliminación vírica consiste en una nanofiltración que se puede utilizar para eliminar los agentes infecciosos, especialmente los virus y los ATNC. En el caso de proteínas plasmáticas, la nanofiltración se refiere generalmente a la filtración del concentrado de proteínas de interés a través de un filtro con un tamaño de poros menor que 80 nm. Los filtros disponibles son, por ejemplo, los filtros Planova BioEx, Planova® 75N, Planova® 35N, Planova® 20N o Planova® 15N (Asahi corporation), Pegasus SV4, Ultipor DV 50 o Dv 20 (Pall corporation), Virosart CPV, Virosart HC o Virosart HF (Sartorius), Viresolve® NFR, Pro o NFP (Millipore). La nanofiltración se puede efectuar ventajosamente sobre un filtro único o sobre varios filtros en serie de porosidad idéntica o decreciente.
La eliminación de los agentes infecciosos se puede realizar también mediante una filtración en profundidad. Los filtros disponibles son, por ejemplo, filtros compuestos de celulosa regenerada, en los que se puede haber añadido unos adyuvantes de filtración (tales como Celite, perlita o tierras de Kieselguhr) comercializados por Cuno (filtros Zeta+ de serie VR), Pall-Seitz (Depth Filter de serie P) o Sartorius (Virosart CPV, Sartoclear P depth filters).
Después de la purificación y al menos una etapa de eliminación o de inactivación de los agentes infecciosos, la composición según la invención se somete directamente a las etapas de formación farmacéutica en forma líquida: formulación, filtración esterilizante y distribución en recipientes (frasco u otro dispositivo de conservación/administración).
De manera particularmente ventajosa, la composición según la invención no se somete a ninguna etapa de liofilización, desecación, deshidratación o secado.
De manera particularmente ventajosa, la composición según la invención está, por lo tanto, en forma líquida sin que se haya sometido a una etapa de reconstitución de un liofilizado.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin limitar su alcance.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Composición de fibrinógeno líquida estable
El fibrinógeno se obtiene según el método descrito en la patente FR 0506640.
El producto final se dializa después frente a un tampón citrato trisódico dihidratado 8,5 mM: (0,175 mM de ácido cítrico 8,325 mM de citrato de sodio) a pH 7,0 ± 0,2 a fin de obtener un fibrinógeno desformulado.
Ejemplo 2: Composición de fibrinógeno líquida estable
Material y método
Fracción plasmática
La materia prima de partida es una combinación de plasma humano previamente sometido a una etapa de crioprecipitación, y después sometido a una etapa de precipitación con un 8% de etanol.
La solución de fibrinógeno plasmática purificada previamente así obtenida se diluye con 2 volúmenes de tampón de equilibración del gel antes de la inyección sobre la columna de cromatografía equilibrada previamente en pH y en conductividad.
Características de la fracción plasmática: fibrinógeno antigénico ajustado por dilución a 4,7-4,8 g/l.
Soluciones tampón
La composición de las disoluciones tampón utilizadas durante diferentes etapas del procedimiento de cromatografía se resume en la tabla 1 siguiente.
Tabla 1: Soluciones tampón para la cromatografía de afinidad.
Geles de cromatografía de afinidad
Para la cromatografía, se utiliza un gel de afinidad CaptureSelect Fibrinogen (Life Technologies ref. 191291050, lotes 171013-01 y 171013-05).
Columnas
Se utilizó una columna de 50 mm de diámetro (Referencia XK 50/30 GE Healthcare), volumen de gel empaquetado de 67 ml; para una altura de columna de 3,4 cm
Purificación por afinidad
La solución de fibrinógeno ajustada a aproximadamente 5 g/l se inyecta sin otro ajuste sobre la columna de afinidad Fibrinógeno CaptureSelect equilibrada. Se aplicó una carga de aproximadamente 10 g/l.
El eluato de cromatografía se ultrafiltró y se formuló previamente después sobre una membrana de umbral de corte 100 kDa (referencia Pall Oméga OS100C10)
Al final del procedimiento, el producto obtenido tiene una concentración de fibrinógeno coagulable de 15,2 g/l y en fibrinógeno antigénico de 15,2 mg/ml.
Ejemplo 3: estabilidad de una composición de fibrinógeno líquida mediante prueba de estabilidad acelerada Composiciones de fibrinógeno
La composición obtenida en el ejemplo 1 o en el ejemplo 2 se formula con diferentes excipientes.
Las formulaciones se resumen en la tabla 2 siguiente:
Protocolos de análisis
Las composiciones se someten a un estrés térmico (heating stress) por calentamiento en un recinto termostizado a 37°C y después se sacan del recinto termostatizado para análisis a T0, T+7 días y T+14 días.
Los diferentes análisis efectuados son los siguientes:
- inspección visual: la opalescencia y formación de partículas visibles se determinan por inspección visual efectuada con una examinadora de la Farmacopea Europea
- turbidez
- análisis de las diferentes cadenas del fibrinógeno por SDS PAGE
- análisis DLS
- fibrinógeno antigénico y actividad de fibrinógeno coagulable
Resultados
Los resultados obtenidos son los siguientes:
Tabla 3: Inspección visual y turbidez antes y después del estrés térmico
Tabla 4a y 4b: resultados SDS PAGE a T0
Tabla 5a y 5b: resultados SDS PAGE a T+7 días
Tabla 6a y 6b: resultados SDS PAGE a T+14 días
Tabla 7: resultados DLS a T0, T+ 7 días y T+14 días
Tabla 8: resultados de fibrinógeno antigénico y de actividad de fibrinógeno coagulable a T0, T+ 7 días y T+14 días
Los resultados muestran que las formulaciones F1 -F13 a pH 7,0 que comprenden entre 10 y 300mM de arginina y de glutamato, y especialmente en cantidades equimolares, son estables.
Ejemplo 4: estabilidad de una composición de fibrinógeno líquida mediante prueba de estabilidad a largo plazo Composición de fibrinógeno
Las composiciones son las mismas que las del ejemplo 3.
Estabilidad de la composición de fibrinógeno
La composición se lleva a estabilidad a 5°C bajo aire.
Se extraen muestras a T0, T+1 meses, T+2 meses, T+3 meses y T+6 meses para análisis.
Ejemplo 5: estabilidad de una composición de fibrinógeno líquida mediante prueba de estabilidad acelerada Composiciones de fibrinógeno
La composición obtenida en el ejemplo 1 se formula con diferentes excipientes.
Las formulaciones se resumen en la tabla 11 siguiente:
Protocolos de análisis
Las composiciones se someten a un estrés térmico (heating stress) por calentamiento en un recinto termostatizado a 37°C y después se sacan del recinto termostatizado para análisis a T0, T+7días y T+14días.
Los diferentes análisis efectuados son los siguientes:
- Inspección visual: la opalescencia y la formación de partículas visibles se determinan mediante inspección visual efectuada con una examinadora de la Farmacopea Europea
- Turbidez
- pH
- Osmolalidad
- Análisis de las diferentes cadenas del fibrinógeno por SDS PAGE
- Análisis DLS
Resultados
Los resultados obtenidos son los siguientes:
• Inspección visual:
Turbidez
M ni riz i n l H
Osmolalidad
Análisis DLS
A T0
A T+7d
AT+14d
Los resultados muestran que las formulaciones F16-F26 a pH 6,0-8,0 que comprenden entre 50 y 200 mM de arginina y de glutamato son estables.
Ejemplo 6: estabilidad de una composición de fibrinógeno líquida mediante prueba de estabilidad a largo plazo Composiciones de fibrinógeno
La composición obtenida en el ejemplo 2 se formula con diferentes excipientes.
Las formulaciones se resumen en la tabla 11 siguiente:
Protocolos de análisis
Las composiciones se conservan en un recinto termostizado a 5°C, 25°C y 37°C, después se sacan del recinto termostatizado para análisis a T0, T+14días y T+1mes.
Los diferentes análisis efectuados son los siguientes:
- Inspección visual: la opalescencia y la formación de partículas visibles se determinan por inspección visual efectuada con una examinadora de la Farmacopea Europea
- Turbidez
- pH
- Osmolalidad
- Análisis DLS
- Fibrinógeno coagulable y fibrinógeno antigénico
Análisis de las diferentes cadenas del fibrinógeno por SDS PAGE
Resultados
Los resultados obtenidos son los siguientes:
• Inspección visual:
• Turbidez
• pH y osmolalidad
Análisis DLS
Fibrinógeno coagulable y fibrinógeno antigénico
Análisis de las diferentes cadenas del fibrinógeno por SDS PAGE en condiciones reductoras
Los resultados muestran que las formulaciones F27-F28 a pH 6,0-7,0 que comprenden 80mM de glutamato y 150mM de arginina, en presencia de surfactante, de tampón y de un aminoácido suplementario, son estables.
Claims (24)
1. Composición farmacéutica líquida que comprende fibrinógeno humano, caracterizada por que comprende:
- entre 10 y 300 mM de arginina
- entre 10 y 300 mM de glutamato
estando el pH de la composición comprendido entre 6 y 8.
2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada por que la concentración de arginina y la concentración de glutamato está comprendida entre 10 y 300 mM, preferiblemente entre 20 y 200 mM, más preferiblemente entre 30 y 100 mM, aún más preferiblemente entre 50 y 80 mM.
3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada por que la concentración de arginina y la concentración de glutamato está comprendida entre 10 y 80 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 70 mM, más preferiblemente comprendida entre 30 y 60 mM.
4. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la concentración de glutamato es menor que 80 mM, preferiblemente menor que 70 mM, más preferiblemente menor que 60 mM, aún más preferiblemente menor que 50 mM.
5. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la concentración de glutamato está comprendida entre 10 y 80 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 70 mM, más preferiblemente comprendida entre 30 y 60 mM.
6. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la concentración de arginina está comprendida entre 10 y 300 mM, preferiblemente comprendida entre 20 y 250 mM, más preferiblemente comprendida entre 50 y 250 mM.
7. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la arginina y el glutamato están presentes en cantidades equimolares a una proporción comprendida entre 0,8 y 1,2, preferiblemente entre 0,9 y 1,1, aún más preferiblemente aproximadamente igual a 1,0.
8. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la concentración de fibrinógeno está comprendida entre 10 y 30 g/l, preferiblemente entre 15 y 25 g/l, aún más preferiblemente entre 15 y 20 g/l.
9. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende también al menos un aminoácido seleccionado entre la alanina, la asparagina, el aspartato, la cisteína, la glutamina, la glicina, la histidina, la isoleucina, la leucina, la lisina, la metionina, la fenilalanina, la prolina, la serina, la treonina, el triptófano, la tirosina, la valina, o una combinación de los mismos.
10. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende también al menos un aminoácido hidrófobo seleccionado entre leucina, alanina, fenilalanina, triptófano, valina, metionina, isoleucina, prolina, cisteína y/o glicina, o una combinación de los mismos.
11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, caracterizada por que el aminoácido se selecciona entre la prolina y/o la isoleucina y/o la serina.
12. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada por que la concentración de aminoácido está comprendida entre 1 y 300 mM, preferiblemente entre 10 y 200 mM, más preferiblemente entre 20 y 100 mM.
13. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende también un surfactante, preferiblemente polisorbato 80 o polisorbato 20, o Pluronic®F68.
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, caracterizada por que la concentración de surfactante está comprendida entre 1 y 500 ppm, preferiblemente entre 50 y 400 ppm, más preferiblemente entre 150 y 250 ppm.
15. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende también un tampón.
16. Composición farmacéutica la reivindicación 15, caracterizada por que el tampón consiste en citrato trisódico.
17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, caracterizada por que la concentración de citrato trisódico está comprendida entre 1 y 15 mM, preferiblemente entre 7 y 10 mM
18. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que el pH está comprendido entre 6 y 7,5, preferiblemente entre 6 y 7.
19. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que está desprovista de cloruro de sodio y/o de albúmina.
20. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que presenta una osmolalidad comprendida entre 250 y 650 mOsm/kg, preferiblemente entre 300 y 550 mOsm/kg.
21. Composición farmacéutica líquida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende:
- 10-30 g/l de fibrinógeno
- 10-300 mM de arginina
- 10-300 mM de glutamato
- eventualmente 1-15 mM de tampón, en particular de citrato trisódico
- eventualmente 1 -300 mM de otro aminoácido, en particular 1 -300 mM de prolina y/o 1 -300 mM de isoleucina y/o 1-300 mM de serina
- eventualmente 1-500 ppm de surfactante, preferiblemente 20-400 ppm, de manera más preferida 150-250 ppm - eventualmente 5-1000 ppm de albúmina humana
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
22. Composición farmacéutica líquida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende:
- 10-30 g/l de fibrinógeno
- 20-200 mM de arginina
- 20-200 mM de glutamato
- eventualmente 7-10 mM de tampón, en particular de citrato trisódico
- eventualmente 1 -100 mM de otro aminoácido, en particular 1 -100 mM de prolina y/o 1 -100 mM de isoleucina y/o 1-100 mM de serina
- eventualmente 20-400 ppm de surfactante
- eventualmente 5-500 ppm de albúmina humana
siendo el pH de la composición de 6,0-8,0.
23. Composición farmacéutica líquida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende:
- 15-25 g/l de fibrinógeno
- 150 mM de arginina
- 80 mM de glutamato
- 8,5 mM de citrato trisódico
- 200 ppm de surfactante, preferiblemente polisorbato80, polisorbato20, o Pluronic®F68
- eventualmente 1-100 mM de otro aminoácido, en particular 1-100 mM de prolina y/o 1-100 mM de isoleucina y/o 1-100 mM de serina
- eventualmente 5-1000 ppm de albúmina humana
siendo el pH de la composición de 6,0-7,0.
24. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que el fibrinógeno se obtiene por fraccionamiento de plasma sanguíneo.
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