BRPI0400375B1

BRPI0400375B1 - processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica

Info

Publication number: BRPI0400375B1
Application number: BRPI0400375A
Authority: BR
Inventors: Fernandez Rodrigues Jesús; Ristol Debart Pere
Original assignee: Grifols Sa; Probitas Pharma Sa
Priority date: 2003-03-06
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2018-05-08
Also published as: PL1457497T3; JP2004269529A; BRPI0400375A; NZ531328A; AU2004200745B2; AR043238A1; US20040173527A1; EP1457497A1; DE602004016900D1; ATE410438T1; AU2004200745B8; AU2004200745A1; MXPA04001829A; ES2214967A1; CL2004000261A1; US7442308B2; EP1457497B1; ES2214967B1; CA2459690A1; BRPI0400375B8

Abstract

"processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica e fibrinogênio obtido pelo dito processo". o processo inicia-se com uma solução de fibrinogênio purificada ajustada, a solução purificada ajustada é congelada e, então, descongelada para uma temperatura entre 5 e 20<198>c, os materiais não dissolvidos associados com o fibrinogênio são subseqüentemente separados, a temperatura é ajustada e a solução resultante é finalmente submetida a nanofiltragem utilizando-se filtros para uma dimensão de poro menor do que 35 nm.

Description

(54) Título: PROCESSO PARA REMOVER VÍRUS EM SOLUÇÕES DE FIBRINOGÊNIO PARA APLICAÇÃO TERAPÊUTICA (73) Titular: GRIFOLS, S.A.. Endereço: Calle Jesús y Maria, n° 6, 08022, Barcelona, ESPANHA(ES) (72) Inventor: PERE RISTOL DEBART; JESÚS FERNANDEZ RODRIGUES

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 08/05/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 08/05/2018

Assinado digitalmente por:

Júlio César Castelo Branco Reis Moreira

Diretor de Patente

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PROCESSO PARA REMOVER VÍRUS EM SOLUÇÕES DE FIBRINOGÊNIO PARA APLICAÇÃO TERAPÊUTICA

Refere-se a presente invenção a um processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio por meio de nanofi1tragem e também se relaciona com fibrinogênio para aplicação terapêutica obtido pelo dito processo.

Técnica Anterior

O fibrinogênio de plasma, uma glicoproteína que tem um peso molecular de 340.000 Daltons, é o fator de coagulação estimulado ao final da cascata de coagulação durante hemóstase. Este fibrinogênio está envolvido na hemóstase primária, durante a agregação de plaquetas, e hemóstase secundária, durante a formação do coágulo de fibrina.

O fibrinogênio como um produto terapêutico, o qual é uma proteína purificada a partir do plasma humano, é usado para terapia de substituição em situações onde existe um déficit desta proteína e, como um componente de adesivos de fibrina, em hemóstase e no fechamento de ferimentos, reconstituição de tecido, cola biológica e veículo para a liberação de medicamentos e hormônios, entre outras aplicações.

Para utilização comercial, o fibrinogênio é preparado a partir de plasma humano proveniente de numerosos doadores (um fundo comum). Apesar dos controles realizados nos doadores e doações nos bancos de sangue, unidades de plasma, mini fundos comuns e fundos comuns industriais para fracionamento, a possibilidade de contaminação por vírus hemáticos não pode ser regulamentada. Portanto, estágios de eliminação de vírus específicos são introduzidos nos processos de purificação de proteína de plasma. Isto é de grande importância para esta proteína que pode ser purificada em uma escala industrial partindo do crioprecipitado ou do FrI (primeira fração) utilizando-se o método Cohn [Cohn J. et al. ; J Am Chem Soc (1946) 68, 459-475] uma vez que potencialmente um maior teor de vírus é arrastado, uma vez quer o material de partida fica localizado no início do fracionamento do plasma e, além disso, ele não tem o efeito redutor no fracionamento subseqüente com etanol.

A partir dos métodos de redução do teor virótico, utilizados em processos de purificação de proteína de plasma, os seguintes deverão ser salientados uma vez que são amplamente utilizados e têm uma eficiência comprovada:

- tratamentos térmicos. Estes têm o potencial de reduzir o teor virótico efetivo com relação aos vírus envolvidos e aos vírus não envolvidos. A sua eficiência está diretamente relacionada com a estabilidade térmica da proteína e com o estabilizador adicionado. Portanto, eles têm o inconveniente de que a molécula da proteína está sujeita a variações que conduzem à formação de neoantigenecidade [CPMP/Nota para o3 rientação nos produtos derivados de plasma (CPMP/BWP/269/95rev. 3) Janeiro 2001) .

tratamentos com solventes orgânicos (OSD) . Devido à sua alta eficiência na desativação de virus que têm um envoltório de lipides, este constitui um tratamento amplamente usado que pode ser considerado como uma referência para os virus destes tipos. Por outro lado, ele não tem efeito em virus sem um envoltório de lipides, tais como o virus Parvovirus e da Hepatite A [Burnouf T. Blood Reviews (2000) 14, 94-110; Martinowitz U. Curr. Opin. Hematol (1996) 3, 395-402) .

Por outro lado, existe uma tendência atualmente para incluir pelo menos dois estágios complementares da remoção de virus.

- a filtragem de soluções através de filtros que têm uma dimensão de poro capaz de reter partículas viróticas é um método que tem sido mais amplamente usado nos últimos anos. É um processo físico o qual, em princípio, não é capaz de afetar a estrutura das proteínas e tem uma eficiente capacidade de remover o conteúdo virótico, na dependência da dimensão de poro usada. Esta dimensão de poro é particularmente condicional na dimensão espacial da molécula de proteína a ser filtrada (que tem de passar através do filtro). A filtragem através de filtros de 2 0 nm ou menores pode assegurar uma redução significativa nos vírus não envolvidos de pequena dimensão, tais como o vírus da Hepatite A e do Parvovirus que estão entre 20 e 30 nm.

Por outro lado, a filtragem através de filtros que têm uma dimensão de poro maior (35 nm ou maior) não assegurará um nível de segurança suficiente contra estes vírus. A dificuldade deste método obviamente parece insolúvel quando as diferenças de dimensões entre vírus e proteína tendem a desaparecer (J. J. Morgenthaler, Vox Sang (2000) 78 (supl 2), 217-221).

A aplicação industrial de nanofiltragem de soluções de fibrinogênio através de filtros de 35 nm têm sido descrita, mas não através de filtros que têm uma dimensão de poro menor. Devido às suas características de dimensão molecular e estabilidade, o fibrinogênio é uma proteína que apresenta problemas de filtragem, mesmo quando se tentou esterilização por filtragem através de filtros dotados de uma dimensão de poro de 0,2 pm.

A patente do PCT WO 99/23111 descreve e reivindica a filtragem de uma solução de fibrinogênio através de um filtro que é dotado de uma dimensão de poro de 35 nm, pela adição de um detergente que permite a referida filtragem, ao mesmo tempo em que evita uma substancial perda de proteína que tornaria inviável esta aplicação industrial.

A patente WO 98/37086 constata que a presença de proteínas dotadas de um alto peso molecular (mais alto do que 150 kD), que inclui fibrinogênio, complica a filtragem de proteínas menores através de nanofiltros de 15 nm. Esta patente descreve um proces5 so de remoção das ditas proteínas de alto peso molecular (incluindo fibrinogênio) com o objetivo de permitir a nanofiltragem. Portanto, este não é o objetivo da presente invenção, mas demonstra o problema com a nanofiltragem de moléculas de alto peso molecular.

O pedido de patente EP 1 161 958 Al descreve um processo para desativar vírus em líquidos biológicos. No processo descrito, a dimensão de poro do nanofiltro é dependente da dimensão da proteína a ser filtrada, com os exemplos mostrando filtragem através de 35 nm e envolvendo a cromatografia anterior da solução a ser filtrada com o objeto de facilitar a dita nanofiltragem. Isto demonstra a dificuldade de realizar nanofiltragem, mesmo através de 35 nm, quando a proteína é de uma dimensão considerável.

O pedido de patente US 2001/0051154 Al descreve a estabilização de proteínas, incluindo fibrinogênio, com o objetivo de proteger as mesmas da perda de atividade ou desnaturação durante o tratamento para reduzir o teor virótico por pasteurização e por nanofiltragem. Ela envolve a adição de uma grande quantidade de açúcares (= 0,5 g/ml) e um ou mais aminoácidos (> 0,5 mol/1) . Entretanto, esta patente sequer descreve ou proporciona exemplos da nanofiltragem de fibrinogênio, de forma que não se pode deduzir que a nanofiltragem de fibrinogênio pode ser realizada através de filtros que são dotados de uma dimensão de poro menor do que 35 nm.

As preparações de fibrinogênio, como um componente de adesivos de fibrina, que se encontram comercialmente disponíveis atualmente [M. R. Jackson, The American Journal of Surgery (2001) 182, 1S-7S], emprega métodos para reduzir-se o teor virótico que basicamente consiste de tratamentos térmicos e tratamentos com OSD.

A nanofiltragem não parece ser um método de opção, provavelmente levando-se em consideração o fato de que a filtragem através de 35 nm (ou uma dimensão de poro maior) não é efetiva para pequenos vírus que não têm sido removidos por OSD ou pelo tratamento térmico. Sumário da invenção

A presente invenção proporciona a filtragem de uma solução de fibrinogênio através de filtros que são dotados de uma dimensão de poro nominal menor do que 35 nm sob condições de tempo de processamento, área de filtragem e recuperação de proteínas que permite a sua aplicação industrial na produção de fibrinogênio purificado como um produto terapêutico. Esta fil20 tragem é conseguida através do congelamento e descongelamentos anteriores da solução de fibrinogênio purificada sob condições controladas. Os inventores descobriram surpreendentemente que, com este congelamento e descongelamento controlados, material insolúvel, agre25 gado ou parcialmente desnaturado é precipitado o qual, na prática, impediría a filtragem da solução através de dimensões de poro menores do que 35 nm. A separação do material precipitado permite a nanofiltragem para uma dimensão de poro menor do que 35 nm.

Descrição detalhada da invenção crioprecipitado, a primeira fração (FrI) do método Cohn ou uma fração que contém fibrinogênio equivalente, pode ser usado como o material de partida para a purificação de fibrinogênio originário de plasma humano a partir do qual um precipitado de fibrinogênio purificado é obtido por meio de precipitação, de preferência com glicina.

A fração de partida, antes do dissolvimento e clarificação, pode ser submetida a um tratamento com um solvente orgânico e detergente (OSD) com o objetivo de desativar os possíveis vírus com um envoltório de lipídeo que possa estar presente. 0 OSD pode ser removido por meio de qualquer processo conhecido, tal como cromatografía ou, preferentemente neste caso, por meio de precipitação com glicina.

A fração purificada rica em fibrinogênio pode ser dissolvida, clarificada por filtragem ou centrifugação e ajustada com estabilizantes, preferentemente aminoácidos (arginina, glicina ou equivalente) e carboidratos (sacarina), com um pH preferencialmente entre 6,0 e 8,0 e teor de íons preferentemente ajustado por cloreto de sódio sob concentrações fisiologicamente aceitáveis.

Começando-se a partir da solução de fibrinogênio mencionada anteriormente ajustada e purificada com pureza preferentemente mais alta ou igual a 80%, os

- 8 inventores descobriram surpreendentemente que, pelo congelamento e descongelamento da solução sob uma temperatura controlada entre 5 e 20°C, e preferentemente entre 8 e 13°C, os componentes instáveis facilmente a5 gregados ou desnaturados associados com o fibrinogênio são levados à condição insolúvel. Estes materiais podem ser facilmente separados por meio de clarificação através de uma malha de nylon ou metal, ou preferentemente por decantação, centrifugação ou filtragem dire10 ta, preferentemente com um gradiente de filtros, ou por meio de combinação de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente. O material resultante pode ser surpreendentemente submetido à nanofiltragem mesmo através de poros menores do que 35 nm, com produtividade e re15 cuperação muito aceitáveis.

Um processo preferido para a realização da presente invenção será descrito mais adiante. O material resultante desta clarificação, diluído para uma concentração mais baixa do que ou igual a 1,5 mg/ml na presença de pelo menos um aminoácido (preferentemente arginina) sob uma concentração entre 0,1 e 8% (peso/volume) e uma temperatura entre 18 e 37°C, preferentemente nos dois casos, e previamente clarificado através de filtros dotados de uma dimensão de poro maior, é filtrado através de um nanofiltro dotado de uma dimensão de poro menor do que 35 nm (preferentemente cerca de 20 nm), com recuperação de proteína maior do qur 80%. A área de filtro requerida para realizar esta na9 nofiltragem situa-se entre 10 e 1.000 cm² por litro de solução a ser filtrada, na dependência da concentração de proteína da solução e da dimensão de poro do nanofiltro utilizado. O tempo de processamento é usualmen5 te menor do que 12 horas.

Os dados obtidos para recuperação de proteína, área de filtro necessária e tempo de processamento requerido, juntamente com a caracterização do produto obtido, mostram a aplicabilidade da invenção em um processo suscetível de ser industrializado.

Exemplos práticos da invengâo Exemplo 1

A fração I precipitada com etanol frio a

8% de acordo com o método de Cohn foi usada como o ma15 terial de partida. Colocaram-se em suspensão 10 kg da referida fração I sob uma relação de 1:9 com uma solução amortecedora que continha citrato-cloreto de sódio, bem um anticoagulante e um antifibrinolítico. A suspensão foi clarificada a 30°C através de filtros de profundidade feitos de ésteres de polipropileno e celulose (ambos de Miliporo) para uma dimensão de partícula de aproximadamente 0,5 micrômetro.

A solução foi então submetida a um tratamento de desativação de vírus com solvente / detergen25 te, utilizando-se tri-n-butil fosfato a 0,3% e polissorbato 80 a 1%, e incubando-se a 27 °C durante não menos do que 6 horas. A solução desativada foi refrigerada para 9°C e foi precipitada mediante a adição de glicina para uma concentração de 1,7 M. 0 precipitado formado foi separado por centrifugação a aproximadamente 15.000 rpm utilizando-se uma centrífuga Sharpels dotada de uma capacidade de 5 kg, e foi então colocado em suspensão em uma solução de cloreto-citrato de sódio, e foi precipitado novamente com glicina para 1,5 M. 0 precipitado formado foi novamente separado mediante centrifugação e foi então reprecipitado da mesma maneira descrita no estágio anterior.

0 precipitado resultante (3° precipitado de glicina) é responsável por 60-80% do peso da fração I de partida e consiste de aproximadamente 15% da proteína seca, consistindo aproximadamente 90% em fibrinogênio. Este material (foi) dissolvido a 30°C com uma relação de 1:3 de uma solução de sacarina a 3,4% e uma concentração isotônica de sais de cloreto-citrato de sódio, e foi subsequentemente filtrado através de filtros de profundidade e clarificação (ambos de Miliporo) para uma dimensão de poro de 1 pm. Obtiveram-se apro20 ximadamente 30 litros da solução.

O material foi diafiltrado através de membranas de 100 kDa (provenientes da Pall-Filtron) contra arginina a 1%, com a finalidade de se removerem os sais excedentes, sacarina e glicina, e uma vez que se alcan25 çou um conteúdo de fibrinogênio de 1,5%, formulado com albumina a 0,5%, foi o mesmo clarificado através de 0,5 micrômetro e filtrado de forma estéril através de 0,2 micrômetro.

Iniciando-se com a solução estéril mencionada anteriormente, realizou-se uma tentativa de filtragem de 0,1 micrômetro através de discos de 47 mm de diâmetro (Pall DVD e DJL), mas o filtro ficou bloqueado quase imediatamente (em aproximadamente 5 a 10 minutos) e menos de cerca de 5 ml da solução foram filtrados, observando-se no filtrado uma redução de 2,1 AU de OD (de 27,2 AU a 25,1 AU) . Estes resultados foram insatisfatórios e demonstraram os problemas com filtragem de fibrinogênio, mesmo através de filtros dotados de dimensão de poro de 0,1 micrômetro.

A solução filtrada através de 0,2 micrômetros foi congelada a -70°C para se realizarem testes de filtragem subsequentes.

Exemplo 2

A solução filtrada através de 0,2 micrômetro no exemplo 1 foi completamente descongelada para

30°C com a finalidade de se realizar testes de nanofiltragem sob várias concentrações de fibrinogênio, investigando-se o possível efeito positivo da susceptibilidade de filtragem pela realização de diluição extrema, como um processo para se dispersarem as moléculas de fibrinogênio na presença de uma solução de aminoácido (arginina).

Submeteu-se uma alíquota da solução filtrada através de 0,2 micrômetro para várias diluições com solução de arginina a 0,66%, citrato de sódio 2,7 mM e cloreto de sódio 62,6 mM, sob pH 7,0 e 30°C, de maneira que as concentrações de fibrinogênio finais foram de aproximadamente 5, 3, 1, 0,7 e 0,5 mg/ml.

Cada solução diluída foi filtrada através 0,1 micrômetro, exatamente antes de se realizar nano5 filtragem através de um cartucho dotado de uma dimensão de poro de 35 nm (BMM-Planova 35N, proveniente da Asahi-Kasei) e uma área de 10 cm². As condições de pressão foram tais como recomendadas pelo fabricante: 0,2 a 1,0 bar; e a temperatura foi de 25 a 30°C durante todos os processos de filtragem.

Os resultados de susceptibilidade de filtragem e recuperação obtidos encontram-se expostos na

Tabela 1.

Fibrinogênio (mg/ml)	Proteína filtrada (g/m²)	Recuperação (%)
5	19	20
3	30	35
1	46/50	61/56
0,7	50	62
0,5	65	69

Pode-se deduzir a partir dos valores precedentes gue a nanofiltragem através de 35 nm somente poderá ser realizada se a concentração de fibrinogênio for muito diluída, de preferência entre 1 e 0,5 mg/ml ou mais baixa, conseguindo-se valores aceitáveis para capacidade de filtragem (g de fibrinogênio/m²) e recu13 peração (> 50% de fibrinogênio) dentro desta faixa.

Obviamente, um dos inconvenientes principais da nanofiltragem em condições muito diluídas reside no volume excessivo a ser filtrado e na concentração final subseqüente do produto antes da dosagem, que é a razão pela qual o ótimo estaria no valor superior da faixa estabelecida.

Mesmo sob as melhores condições de processamento, é óbvio que é difícil submeter o produto a nanofiltragem através de 35 nm pelo procedimento da maneira descrita anteriormente, o qual envolve o descongelamento do produto e dissolvimento completo do fibrinogênio a 30°C.

Exemplo 3

Processou-se um outro lote da maneira descrita no exemplo 1 até obter-se o precipitado III de glicina solubilizado e clarificado, do qual uma parte foi congelada para -70°C para a sua preservação. O restante da solução foi processado da maneira descrita no exemplo 1, para o produto final filtrado através de 0,2 micrômetro.

Um teste de nanofiltragem comparativo foi realizado através de 20 nm (Pall's Ultipor-DV20) com discos de 47 mm de diâmetro, utilizando-se um material fresco (produto final filtrado através de 0,2 micrômetro, sem congelamento) e o material congelado correspondente, os dois com uma concentração de fibrinogênio de 0,73 a 0,74 mg/ml, sendo a pressão aplicada aquela que é recomendada pelo fabricante do filtro (Pall) de 2,2 a 2,8 bar.

No caso do material congelado, realizou-se primeiro o descongelamento total sob temperatura ambi5 ente (temperatura da solução < 20°C) e o material foi clarificado através de 0,5 micrômetro. Tanto o material fresco quanto o material congelado foram convenientemente diluídos com solução de arginina a 2% (p/v), cloreto de sódio 62,6 mM e citrato de sódio 2,7 mM, pH

7,0 e 10°C, e foram filtrados através de 0,1 micrômetro exatamente antes da nanofiltragem escalonada através de 50 nm (DV50) e 20 nm (DV20) sob uma temperatura de aproximadamente 30°C.

Os resultados dos dois processos encon15 tram-se expostos na Tabela 2.

	Volume filtrado (1) através de DV20	Proteína filtrada (9/m2)	Recuperação %	Tempo de filtragem (h)
Material fresco	29,0 (*)	23,7	99,4	5,00
Material congelado	37,0	30,1	99,7	1,42

(*) O filtro ficou bloqueado sob o volume mencionado anteriormente, de maneira que a nanofiltragem não pôde ser completada.

0 teste realizado com material fresco (sem congelamento) proporcionou a recuperação de proteína de

99,4%, mas a quantidade máxima que pôde ser filtrada antes do filtro DV20 ficar bloqueado foi de apenas 23,7 g do fibrinogênio/m², e a velocidade de fluxo média do fibrinogênio foi de 4,74 g/m²/hora (23,7 dividido por

5, 00).

Com o material congelado, por outro lado, a recuperação foi de 99,7% da proteína e o filtro DV20 não ficou bloqueado quando se aplicou uma carga de fibrinogênio de 30,1 g/m², sendo a velocidade de fluxo de fibrinogênio média 21,20 g/m²/hora. Foi possível observar-se claramente que é possível a nanofiltragem de mais de 10,1 g de proteína com o estágio de congelamento e de descongelamento controlados, uma vez que não houve redução anormal na velocidade de fluxo de filtra15 do neste teste, indicando assim a ausência de bloqueio do filtro.

efeito de congelamento / descongelamento foi refletido na nanofiltragem final através de 20 nm, tanto com relação à quantidade máxima de fibrinogênio suscetível de ser filtrado, que podería ser muito mais alta do que 30,1 em oposição a 23,7 g/m², como com relação à velocidade de fluxo de filtragem de 21,20 em oposição a 4,74 g de fibrinogênio/m²/hora, que é 4,5 vezes maior. A área de nanofiltragem através de 20 nm pode, obviamente, ser reduzida pela mesma proporção, sendo que isto permite a otimização dos altos custos de nanofiltragem que, na prática, impediríam a sua introdução industrial para este tipo de proteína de alto pe16 so molecular.

Exemplo 4

Como um resultado do exemplo 3 precedente, as condições ótimas para obtenção de descongelamento do produto foram consideradas, com o objetivo de se remover a maior parte do material insolúvel ou insolubilizável formado principalmente por agregados, e reduzir ao mínimo as perdas de fibrinogênio monodisperso.

Vários lotes, processados como no exemplo 1 para a solução congelada a -70°C, foram descongelados sob condições controladas (temperatura e tempo de fusão) . Uma vez que o material foi descongelado, o material insolúvel foi separado. O dito material foi separado através de uma malha de nylon que tinha uma dimensão de poro de 20 micrômetros e à temperatura sob a qual o material congelado se descongelou. Uma vez que o material insolúvel foi separado, a solução foi aquecida a 30°C e filtrada através de 0,45 micrômetro (filtro CHVL de Millipore).

O peso do material insolúvel separado, da mesma forma que a concentração de proteína (aproximado, através de densidade óptica a 280 nm) da solução foram determinados.

Os valores obtidos encontram-se ilustrados na Tabela 3

Pro-	Tempera-	Peso de	OD (280)	OD (280) de-	Diferen-	% Recupe-
cesso	tura de	material	antes do	pois do con-	ça em	ração de
	descongel	insolúvel	congela-	gelamento e	OD	proteína
	amento	(kg)	mento	filtragem	(AU)
	(°C)		(AU)	(AU)
1	5-10	2,0	ND	ND	NA	NA
2	30,5	0,1	47,8	46,5	1,3	97,5
3	9±1	1,0	45,2	37,5	7,7	83, 0
4	19 ±1	0,5	39,5	34,3	5,2	86,8
5	7 ± 1	1,9	35,0	24,5	10,5	70,0
6	11 +2	0,9	36,0	31,5	4,9	87,5

Os resultados precedentes mostram claramente que a quantidade de resíduo insolúvel formado es5 tá relacionada com a temperatura de descongelamento e corresponde à diminuição na concentração de proteína (densidade óptica) do filtrado com relação à solução inicial antes do congelamento. De forma assemelhada, a temperatura de fusão em torno de 10°C é adequada para recuperar proteína suficiente e remover o material insolúvel. 0,5 a 1,0 kg de material insolúvel separa-se entre 9 e 19°C, e recuperam-se de 83% a 87% de proteína. É significativo que dificilmente se obtém qualquer precipitado a 30,5°C (0,1 kg) e não é detectada uma re15 dução apropriada na proteína presente.

Exemplo 5

Na tabela 4 encontra-se ilustrado o efeito das várias condições de descongelamento provenientes do exemplo 4 na susceptibilidade de filtragem do produto durante a nanofiltragem.

Os lotes processados, descongelados e fil5 trados da forma que foi mencionada no exemplo 4, foram diluídos para uma densidade óptica (280 nm) de 1,2 a 1,3 AU (aproximadamente 0,8 mg/ml de fibrinogênio) com uma solução de arginina a 2% (p/v) que continha cloreto / citrato de sódio, sob pH 7,0 e uma temperatura de

30°C. Realizou-se nanofiltragem em dois estágios através de 0,1 micrômetro (30 CWL) e 50 nm (2 x 30 DV50) e então através de 20 nm (3 x 30 DV20) sob uma pressão de 2,2 a 2,8 bar em cada estágio.

A capacidade de filtragem (g de fibrinogê15 nio/m², filtrado), o volume filtrado, a recuperação de fibrinogênio (por densidade óptica a 280 nm) e o tempo de filtragem foram determinados em cada processo. Os resultados encontram-se ilustrados na Tabela 4.

Processo	Temperatura de descongelamen- to (°C)	Capacidade de produção (kg de solu- ção/m²)	Tempo de filtragem (h)	Velocidade de fluxo de filtragem (kg/m²/h)
1	5-10	>43,8	3,0	14,6
3	9 + 1	>56,3	6,5	8,7
4	19 + 1	>51,7	8,5	6,1
5	7±1	>27,1	3,0	9,0
6	11 ±2	>32,8	3,8	8,6

Observa-se, a partir dos valores obtidos, que é possível realizar-se a nanofiltragem de fibrinogênio através de 20 nm em uma escala industrial. De uma forma assemelhada, os tempos de filtragem (ou melhor, as velocidades de fluxo) podem ser relacionados com a temperatura de descongelamento do material de partida a partir do exemplo 4, demonstrando que, na prática, temperaturas abaixo de 20°C, de preferência entre 7 e 19°C, serão as mais convenientes para a nanofiltragem através de 20 nm, com uma capacidade de produção e tempo de processamento razoáveis e sem redução excessiva no produto em decorrência de perdas durante o descongelamento.

Constata-se, portanto que, por meio da aplicação da presente invenção, é possível purificar soluções de fibrinogênio de plasma por meio de nanofiltragem mediante a utilização de filtros que são dotados de uma dimensão de poro nominal menor do que 35 nm, sob condições que permitem a sua aplicação industrial à produção de fibrinogênio purificado como um produto terapêutico .

Muito embora a presente invenção fosse descrita por meio do conteúdo da descrição e dos exemplos que a acompanham, será apreciado que a mesma não fica estritamente limitada à substância da referida descrição e exemplos, os quais basicamente têm um caráter ilustrativo não limitativo e que as pessoas experimentadas nesta campo, com base no material exposto na presente descrição e exemplos, serão capazes de realizar modificações e variações que estarão plenamente incluídas no escopo da presente invenção, tal como definido nas reivindicações inclusas.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, partindo-se de uma solução de fibrinogênio que se origina de plasma humano previamente purificado, com pureza igual ou superior a 80% de fibrinogênio com relação ao total de proteínas, caracterizado pela estabilização e congelamento da solução e subsequente descongelamento da mesma sob uma temperatura entre 5 e 20°C, na separação dos materiais não dissolvidos e diluição da proteína e nanofiltragem da solução resultante utilizando-se filtros de dimensão de poro menor do que 35 nm, em que o congelamento, descongelamento e nanofiltragem são realizados na presença de pelo menos um aminoácido.
2. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é arginina ou glicina ou combinações dos dois.
3. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material não dissolvido é separado por uma malha depois do congelamento e descongelamento.
4. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material não dissolvido é separado por meio de decantação depois do congelamento e descongelamento.
5. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material não dissolvido é separado por centrifugação depois do congelamento e descongelamento.

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6. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material não dissolvido é separado por filtragem direta ou por meio de um gradiente de filtros depois do congelamento e descongelamento.
7. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o material não dissolvido é separado por meio da combinação dos processos das reivindicações 4 a 7, depois do congelamento e descongelamento.
8. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução resultante da separação do material não dissolvido é diluída para uma concentração mais baixa do que ou igual a 1,5 mg/mL de fibrinogênio.
9. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução é ajustada para uma temperatura entre 18 e 37°C antes da nanofiltragem.
10. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de fibrinogênio é filtrada previamente através de filtros que são dotados de uma dimensão de poro maior do que ou igual a 35 nm antes da nanofiltragem através de filtros que são dotados de uma dimensão de poro menor do que 35 nm.
11. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a área de

3/3 filtro requerida para nanofiltragem através de filtros que são dotados de uma dimensão de poro menor do que 35 nm situa-se entre 10 e 1.000 cm² por litro de solução a ser filtrada.
12. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura de descongelamento situa-se entre 8 e 13°C.
13. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a concentração do aminoácido é maior do que 0,1%.
14. Processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio para aplicação terapêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a concentração de aminoácido situa-se entre 0,1 e 8%.