JP2004163104A5

JP2004163104A5 -

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Publication number: JP2004163104A5
Application number: JP2002302692A
Authority: JP
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2022-10-17

Description

本発明の微量液体秤取構造を用いて各種のタンパク質の結晶化方法を実施することができる。例えば、第１のタンパク質の結晶化方法は、
（ａ）上記流路構造の上記第１の流路にタンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記タンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記タンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積で作成されたタンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を第４の流路を介して前記第２の流路に流出させる工程と、
（ｂ）第１の流路に沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積で作成された沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を第４の流路を介して前記第２の流路に流出させ、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第２の流路中で接触・合一させる工程と、
（ｃ）第２の流路中で合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶を析出させる工程を含む。
また、前記第１の方法の別法として、合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶の析出を、該溶液と離れた流路構造中に沈殿剤溶液が配置されている状態で行わせることもできる。この第２の方法において、沈殿剤溶液の配置は、例えば、予め適当な流路、例えば第２の流路に導入して配置しておいてもよいし、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを接触・合一させた後に、沈殿剤溶液を第１の流路に導入し、第３の流路に引き込まれた状態で配置してもよい。
これらの第１又は第２の方法において、タンパク質溶液と沈殿剤溶液の第２の流路への導入は、どちらを先に行ってもよいし、別に形成された２組の流路構造を用いて同時に第２の流路へ導入してもよい。
また、例えば、別の第３のタンパク質の結晶化方法は、
（ａ）上記微量液体秤取構造の上記第１の流路にタンパク質溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記タンパク質溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記タンパク質溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積でタンパク質溶液を作成する工程と、
（ｂ）第１の流路に沈殿剤溶液を導入し、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第３の流路の開口部において接触させ、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを合一させる工程と、
（ｃ）合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶を析出させる工程を含む。
この方法においては、第１および／または第３の流路内でタンパク質結晶の析出が起こるので、必要に応じて合一させた溶液を適当な時間静置後、結晶析出の有無を確認する。
結晶析出の確認手段は、それ自体既知の適当な検出手段、例えば目視、顕微鏡観察などにより行えばよい。また、析出したタンパク質結晶は、それ自体既知の適当な方法、例えば適当な液体を導入して流出させる等して、採取することもできる。
ここで、上記のタンパク質結晶化方法に用いるタンパク質溶液の物性は、本発明の微量液体秤取構造で用いることができるものであれば特に限定されない。具体的には、例えば溶媒としては水、塩の溶液、バッファ溶液、アルコールあるいはグリセロールとその溶液、合成あるいは天然高分子溶液などが挙げられる。
用いられる沈殿剤溶液とは、タンパク質の結晶形成を促す溶液を意味するこの溶液の物性は、上記と同様に本発明の微量液体秤取構造で用いることができるものであれば特に限定されない。具体的には、例えば水、塩の溶液、バッファ溶液、アルコールあるいはグリセロールとその溶液、合成あるいは天然高分子溶液などである。また、結晶形成を促す物質として、タンパク質や高分子のゲル、多孔質シリコン（Chayenら、Journal of Molecular Biology, (2001) 312, 591-595参照）などが知られているが、それらを含んでもよい。
また、上記の方法において、封止や蒸気圧の調整が必要な時は、溶液と接する気相の体積が小さい方が好ましい。この場合、例えば第２の流路が２つの狭隘流路部分により挟まれることにより形成された容積限定区画を有する微量液体秤取構造（図５参照）を有するマイクロチップを用いることが好ましい。
タンパク質の結晶化を行うための方法として、例えば、バッチ法、蒸気拡散法、界面接触法、ゲル法などが知られている。ここで、本発明の流路構造を有するマイクロチップ内でバッチ法により結晶化を行うためには、例えば、上記のいずれかの方法の通り、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを接触・合一させ、必要に応じ上記方法で流路を封止すればよい。
蒸気拡散法を行うためには、例えば、上記の第１の方法又は第２の方法の通り、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第2の流路内で接触・合一させた後、上記の通り、必要に応じて蒸気圧を調整する液体を第１の流路に導入し、接触・合一させた液体と第３および／または第４の流路を隔てて蒸気拡散を調節すればよい。ただし、蒸気拡散法においては、接触・合一させた液体と蒸気圧を調整する液体（沈殿剤）が、気相を隔てて配置されていればよく、液体の配置は必ずしも前述の形である必要はない。第１の流路の途中まであるいは端部に蒸気圧を調整する液体を導入して、第１、第３および第４の流路を隔てて蒸気圧を調整してもよいし、第２の流路の途中まで、あるいは端部に蒸気圧を調整する液体を導入して、第２の流路を隔てて蒸気圧を調整してもよい。

Claims

それぞれ所定の方向に延長される第１の流路（流路Ａ）ならびに第２の流路（流路Ｂ）と、前記第１の流路（流路Ａ）の流路壁に開口する第３の流路（流路Ｃ）と、前記第２の流路（流路Ｂ）の流路壁に開口して前記第３の流路（流路Ｃ）の一端と前記第２の流路を連結し濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有し他の３本の流路より細い第４の流路（流路Ｄ）を有し、前記第１の流路に導入された液体が、前記第１の流路の流路壁において開口する前記第３の流路の開口部を介して前記第３の流路内に引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記液体を取り除き、前記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取することを特徴とする微量液体秤取構造。
それぞれ所定の方向に延長される第１の流路（流路Ａ）ならびに第２の流路（流路Ｂ）と、前記第１の流路（流路Ａ）の流路壁に開口する第３の流路（流路Ｃ）と、前記第２の流路（流路Ｂ）の流路壁に開口して前記第３の流路（流路Ｃ）の一端と前記第２の流路を連結し濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有し他の３本の流路より細い第４の流路（流路Ｄ）とを有し、前記第１の流路に導入された液体が、前記第１の流路の流路壁において開口する前記第３の流路の開口部を介して前記第３の流路内に引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記液体を取り除き、前記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取する系を少なくとも２つ有し、前記第１の流路または前記第２の流路を共有することを特徴とする微量液体秤取構造。
前記第３の流路（流路Ｃ）に前記第４の流路（流路Ｄ）が２つ以上接続している、あるいは、前記第４の流路（流路Ｄ）が２つ以上に分岐していることを特徴とする請求項１、または請求項２のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造。
前記第３の流路（流路Ｃ）およびこれに接続する第４の流路（流路Ｄ）が複数組形成されていることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造。
前記第４の流路（流路Ｄ）の流路壁に開口し前記第４の流路より細いか同じ太さで濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有する流路壁からなる第５の流路（流路Ｅ）を更に有することを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造。
前記第２の流路は、該流路の一部に、該流路の通常の流路幅よりも狭い流路幅を有する狭隘流路部分を有し、該狭隘流路部分は通常の流路幅部分よりも濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有することを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造。
前記第３の流路（流路Ｃ）の容積に応じた体積で秤取された液体を、前記第４の流路（流路Ｄ）を介して前記第２の流路（流路Ｂ）に流出させる流出手段を更に有することを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造。
前記第４の流路（流路Ｄ）の開口部近傍の前記第２の流路が液体で満たされている場合に、前記第３の流路（流路Ｃ）の容積に応じた体積で秤取された液体を、前記第４の流路（流路Ｄ）を介して前記第２の流路に流出させる流出手段を更に有することを特徴とする請求項７に記載の微量液体秤取構造。
前記第１の流路（流路Ａ）、前記第２の流路（流路Ｂ）、前記第３の流路（流路Ｃ）、前記第４の流路（流路Ｄ）及び前記第５の流路（流路Ｅ）はそれぞれ、基板内に形成されたチャネルであることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造。
前記第３の流路（流路Ｃ）の容積が、ピコリットルからマイクロリットルのオーダーの大きさに形成されていることを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造。
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造を基板内に少なくとも１個有することを特徴とするマイクロチップ。
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の微量液体秤取構造を基板内に複数個有し、各微量液体秤取構造が同一であるか又は異なることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロチップ。
前記基板は上部基板と下部基板とが貼り合わされた２層構造を有することを特徴とする請求項１１又は１２に記載のマイクロチップ。
上部基板（１６）と下部基板（１７）とが貼り合わされた２層構造を有する基板内に、イオン交換クロマトグラフィー用のマイクロチャネル（１４）を有し、溶離バッファー導入用ポート（１１，１２）と該ポートに連通するミキサー（１３）が前記該マイクロチャネル（１４）の途中に連通して接続されており、前記マイクロチャネル（１４）のイオン交換ビーズ堰き止め部（１５）と前記ミキサー（１３）接続部との間に微量液体秤取構造部を有し、前記微量液体秤取構造部は、第１の流路（１９）と、該第１の流路（１９）の流路壁に開口する液体秤取用の第３の流路（２１）と、該第３の流路（２１）と前記マイクロチャネル（１４）を構成する第２の流路（２０）に連通する、前記第１、第２及び第３の各流路よりも幅が狭く、濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有する第４の流路（２２）と、該第４の流路（２２）に交差する該第４の流路（２２）の幅と概ね同一であるか又はこれよりも狭い幅を有する第５の流路（２３）とからなることを特徴とするキャピラリーイオン交換クロマトグラフィー用マイクロチップ。
前記上部基板（１６）及び下部基板（１７）はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成されており、前記下部基板（１７）の表面は硬化処理により疎水性にされていることを特徴とする請求項１４に記載のマイクロチップ。
上部基板（２５）と下部基板（２６）とが貼り合わされた２層構造を有する基板内に、一端に液体入口ポート（２８）と他端にその出口ポート（３０）を有する略環状の第１液体供給チャネル（３３）を有し、該第１液体供給チャネル（３３）はその流路壁に開口する第１秤取チャネル（３６）を複数個有し、各第１秤取チャネル（３６）に対して、混合チャネル（３４）と第２液体供給チャネル（３５）とが一組のセットとして配設されており、前記第１秤取チャネル（３６）は前記混合チャネル（３４）に、濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有する第１狭隘チャネル（３８）を介して連通されており、前記第２液体供給チャネル（３５）はその流路壁に開口する第２秤取チャネル（３７）を１個有し、前記第２秤取チャネル（３７）は前記混合チャネル（３４）に、濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有する第２狭隘チャネル（３９）を介して連通されており、前記第２液体供給チャネル（３５）及び前記混合チャネル（３４）はそれぞれ入口ポート（３１ａ，３２ａ）と出口ポート（３１ｂ，３２ｂ）を有し、前記各ポートは前記上部基板を貫通して設けられていることを特徴とする極微量分析及び合成・分離用マイクロチップ。
前記基板が円盤状であり、前記略環状の第１液体供給チャネル（３３）の半径方向内側に、前記第１秤取チャネル（３６）、第１狭隘チャネル（３８）、混合チャネル（３４）、第２狭隘チャネル（３９）、第２秤取チャネル（３７）及び第２液体供給チャネル（３５）からなるセットが２０セット設けられ、前記略環状の第１液体供給チャネル（３３）の半径方向外側に、前記第１秤取チャネル（３６）、第１狭隘チャネル（３８）、混合チャネル（３４）、第２狭隘チャネル（３９）、第２秤取チャネル（３７）及び第２液体供給チャネル（３５）からなるセットが３０セット設けられていることを特徴とする請求項１６に記載のマイクロチップ。
前記上部基板（２５）及び下部基板（２６）はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成されており、前記下部基板（２６）の表面は硬化処理により疎水性にされていることを特徴とする請求項１６又は１７に記載のマイクロチップ。
請求項１１〜請求項１８のいずれか１項に記載のマイクロチップを作製するために使用されることを特徴とするマスク又はマスターチップ。