JP2003533980A - 志賀毒素様毒素及び血管内皮成長因子断片を含有する組換えたんぱく質 - Google Patents
志賀毒素様毒素及び血管内皮成長因子断片を含有する組換えたんぱく質Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニットあるいはその切形又は突然変異変換体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異変換体、を含む融合たんぱく質をコードする単離された核酸に向けられており、該融合たんぱく質は、リボソーム不活性化活性を有しており、そして細胞ＶＥＧＦ受容体に結合する能力を有している。本発明はまた、毒素と成長因子との上記組合わせのポリペプチド、並びに発現ベクター、及び上記核酸を導入している形質転換された細胞に向けられている。本発明はまた、血管形成に関連する疾患を患っている患者を治療するための組成物及び方法に向けられている。
Description
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、組換え核酸分子及び組換え融合たんぱく質に関し、さらに特定的に
は志賀毒素様毒素−血管内皮成長因子融合たんぱく質、及びそのような融合たん
ぱく質をコードする組換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた、上記組換え核酸
分子を含有する細菌ベクター、上記融合たんぱく質を製造する方法、及び治療的
処置におけるそれらの使用に関する。
は志賀毒素様毒素−血管内皮成長因子融合たんぱく質、及びそのような融合たん
ぱく質をコードする組換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた、上記組換え核酸
分子を含有する細菌ベクター、上記融合たんぱく質を製造する方法、及び治療的
処置におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
２．関連技術の記載
血管形成は、新しい血管を成長させる厳重に制御された過程である（概説とし
てＦｏｌｋｍａｎ＆Ｓｈｉｎｇ（１９９２）；Ｈａｎａｈａｎ（１９９７）を参
照）。正常な状況下では、血管形成は胚発生、傷の治癒及び黄体の発達中にのみ
起こる。しかしながら、血管形成は充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、
慢性炎症状態、及び虚血性傷害のような多くの症状において起こる（概説として
Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）参照）。したがって、増殖しつつある内皮細胞は幾
つかの主要な症状の治療のためのユニークな標的を提供する。
てＦｏｌｋｍａｎ＆Ｓｈｉｎｇ（１９９２）；Ｈａｎａｈａｎ（１９９７）を参
照）。正常な状況下では、血管形成は胚発生、傷の治癒及び黄体の発達中にのみ
起こる。しかしながら、血管形成は充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、
慢性炎症状態、及び虚血性傷害のような多くの症状において起こる（概説として
Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）参照）。したがって、増殖しつつある内皮細胞は幾
つかの主要な症状の治療のためのユニークな標的を提供する。
【０００３】
血管形成の極めて重要な正のレギュレーターは血管透過性因子としても知られ
ている血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である（概説としてＮｅｕｆｅｌｄ等（１
９９９）を参照）。ＶＥＧＦは選び得るスプライシングの結果として、１２１、
１４５、１６５、１８９及び２０６アミノ酸残基を有するポリペプチド類からな
り得る、分泌された二量体糖たんぱく質である。ＶＥＧＦは正常な細胞及び腫瘍
細胞により発現され、そしてＶＥＧＦ発現の制御は、幾つかの水準で調節される
と思われる（概説としてＣｌａｆｆｅｙ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９９６）、Ｖｅ
ｉｋｋｏｌａ＆Ａｌｉｔａｌｏ（２０００）参照）。ＶＥＧＦの発現は、腫瘍と
転移増殖との間のフィードバックループを示唆する低酸素及び栄養欠如、及び宿
主血管形成応答に対する腫瘍細胞の能力に応じてアプレギュレーションされる（
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。
ている血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である（概説としてＮｅｕｆｅｌｄ等（１
９９９）を参照）。ＶＥＧＦは選び得るスプライシングの結果として、１２１、
１４５、１６５、１８９及び２０６アミノ酸残基を有するポリペプチド類からな
り得る、分泌された二量体糖たんぱく質である。ＶＥＧＦは正常な細胞及び腫瘍
細胞により発現され、そしてＶＥＧＦ発現の制御は、幾つかの水準で調節される
と思われる（概説としてＣｌａｆｆｅｙ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９９６）、Ｖｅ
ｉｋｋｏｌａ＆Ａｌｉｔａｌｏ（２０００）参照）。ＶＥＧＦの発現は、腫瘍と
転移増殖との間のフィードバックループを示唆する低酸素及び栄養欠如、及び宿
主血管形成応答に対する腫瘍細胞の能力に応じてアプレギュレーションされる（
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。
【０００４】
内皮細胞に対するＶＥＧＦの作用はＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２として
また知られている、チロシンキナーゼ−ｆｌｔ−１受容体及びＫＤＲ／ｆｌｋ−
１受容体により仲介される（概説としてＴｅｒｍａｎ＆Ｄｏｕｇｈｅｒ−Ｖｅｒ
ｍａｚｅｎ（１９９６）、Ｖｅｉｋｋｏｌａ等（２０００）参照）。これらの受
容体は内皮細胞上で優先的に発現される。血管形成の部位での内皮細胞が、休止
性（静止性）内皮細胞よりも、有意義に高い数のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を発
現するという報告がある（Ｂｒｏｗｎ等（１９９３）、Ｂｒｏｗｎ等（１９９５
）、Ｐｌａｔｅ等（１９９３）、Ｄｅｔｍａｒ等（１９９４）、Ｃｏｕｆｆｉｎ
ｈａｌ等（１９９７））。それらの受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリ
ーに属し、細胞外領域に７つのＩｇ様ループを含有し、そして血小板由来の成長
因子のための受容体と相同性を共有する単一スパンの膜通過たんぱく質チロシン
キナーゼである。これらの受容体に結合するＶＥＧＦは、受容体二量体化、次の
二量体におけるＳＨ２及びＳＨ３のチロシン燐酸化を誘発する（概説としてＮｅ
ｕｆｅｌｄ等（１９９４）参照）。ＫＤＲ／Ｆｌｋ１−ＶＥＧＦ複合体は受容体
媒介エンドサイトーシス（細胞飲食作用：細胞が外環境から種々の物質を取り込
む機構）を介して取り込まれる（Ｂｉｋｆａｌｖｉ等（１９９１））。
また知られている、チロシンキナーゼ−ｆｌｔ−１受容体及びＫＤＲ／ｆｌｋ−
１受容体により仲介される（概説としてＴｅｒｍａｎ＆Ｄｏｕｇｈｅｒ−Ｖｅｒ
ｍａｚｅｎ（１９９６）、Ｖｅｉｋｋｏｌａ等（２０００）参照）。これらの受
容体は内皮細胞上で優先的に発現される。血管形成の部位での内皮細胞が、休止
性（静止性）内皮細胞よりも、有意義に高い数のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を発
現するという報告がある（Ｂｒｏｗｎ等（１９９３）、Ｂｒｏｗｎ等（１９９５
）、Ｐｌａｔｅ等（１９９３）、Ｄｅｔｍａｒ等（１９９４）、Ｃｏｕｆｆｉｎ
ｈａｌ等（１９９７））。それらの受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリ
ーに属し、細胞外領域に７つのＩｇ様ループを含有し、そして血小板由来の成長
因子のための受容体と相同性を共有する単一スパンの膜通過たんぱく質チロシン
キナーゼである。これらの受容体に結合するＶＥＧＦは、受容体二量体化、次の
二量体におけるＳＨ２及びＳＨ３のチロシン燐酸化を誘発する（概説としてＮｅ
ｕｆｅｌｄ等（１９９４）参照）。ＫＤＲ／Ｆｌｋ１−ＶＥＧＦ複合体は受容体
媒介エンドサイトーシス（細胞飲食作用：細胞が外環境から種々の物質を取り込
む機構）を介して取り込まれる（Ｂｉｋｆａｌｖｉ等（１９９１））。
【０００５】
幾つかのグループは、ＶＥＧＦ又はＫＤＲ／ｆｌｋ−１のいずれかの標的化が
血管形成及び血管形成に依存する過程を阻止することを報告した（Ｋｉｍ等（１
９９３）、Ｍｉｌｌａｕｅｒ等（１９９４）、Ｓａｌｅｈ等（１９９６）、Ａｉ
ｅｌｌｏ等（１９９５））。他方、モデルシテスムにおいて虚血性組織中へのＶ
ＥＧＦ又はＶＥＧＦをコードするプラスミドの直接注入は、微小血管系の発生を
促進し、そして虚血傷害又はバルーン血管形成術後の回復を改良した（Ａｓａｈ
ａｒａ等（１９９６））。一緒に考慮して、これらの結果は、ＶＥＧＦ及びＫＤ
Ｒ／Ｆｌｔ１が血管形成においてきわめて重要な役割を演じていることに、殆ど
疑念を残さない。これらの実験は、ＶＥＧＦ−毒素共役体又は融合たんぱく質が
インビボで働くことができることの原理証明を提供したけれども、ＤＴ含有融合
たんぱく質の腎臓及び肝臓毒性の故に、ＤＴ−ＶＥＧＦの構築物の追加の開発は
疑わしい。
血管形成及び血管形成に依存する過程を阻止することを報告した（Ｋｉｍ等（１
９９３）、Ｍｉｌｌａｕｅｒ等（１９９４）、Ｓａｌｅｈ等（１９９６）、Ａｉ
ｅｌｌｏ等（１９９５））。他方、モデルシテスムにおいて虚血性組織中へのＶ
ＥＧＦ又はＶＥＧＦをコードするプラスミドの直接注入は、微小血管系の発生を
促進し、そして虚血傷害又はバルーン血管形成術後の回復を改良した（Ａｓａｈ
ａｒａ等（１９９６））。一緒に考慮して、これらの結果は、ＶＥＧＦ及びＫＤ
Ｒ／Ｆｌｔ１が血管形成においてきわめて重要な役割を演じていることに、殆ど
疑念を残さない。これらの実験は、ＶＥＧＦ−毒素共役体又は融合たんぱく質が
インビボで働くことができることの原理証明を提供したけれども、ＤＴ含有融合
たんぱく質の腎臓及び肝臓毒性の故に、ＤＴ−ＶＥＧＦの構築物の追加の開発は
疑わしい。
【０００６】
ＶＥＧＦは内皮細胞に特異的に結合するので、この成長因子は、血管形成部位
に標的化医薬送り込みのためのユニークな機会を提供する。組換えＶＥＧＦ１６
５及び／又はＶＥＧＦ１２１に、組換えＤＮＡ技術を介して共有的に結合又は融
合されたジフテリア毒素の触媒作用的に活性な形態がＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体
を発現する細胞に対して選択的に毒性であり、そしてまたインビボで血管形成を
抑制したことが示された（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ等（１９９６）、Ｏｌｓｏ
ｌｏｎ等（１９９７）、Ａｒｏｒａ等（１９９９））。
に標的化医薬送り込みのためのユニークな機会を提供する。組換えＶＥＧＦ１６
５及び／又はＶＥＧＦ１２１に、組換えＤＮＡ技術を介して共有的に結合又は融
合されたジフテリア毒素の触媒作用的に活性な形態がＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体
を発現する細胞に対して選択的に毒性であり、そしてまたインビボで血管形成を
抑制したことが示された（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ等（１９９６）、Ｏｌｓｏ
ｌｏｎ等（１９９７）、Ａｒｏｒａ等（１９９９））。
【０００７】
内皮細胞の“ナチュラルキラー”である毒素を標的化するためにＶＥＧＦを使
用することが有利である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７により生産された志賀
毒素様毒素１は内皮細胞に対するそのような“ナチュラルキラー”である。志賀
毒素様毒素１により起こされた内皮細胞への損傷は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：
Ｈ７により誘発された出血性大腸炎（ＨＣ）及び溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）
の病因において、原因となる役割を演じている（Ｏｂｒｉｇ等（１９８７）、Ｏ
ｂｒｉｇ等（１９９３）、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等（１９８８）、Ｋａｐｌａｎ
等（１９９０））。
用することが有利である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７により生産された志賀
毒素様毒素１は内皮細胞に対するそのような“ナチュラルキラー”である。志賀
毒素様毒素１により起こされた内皮細胞への損傷は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：
Ｈ７により誘発された出血性大腸炎（ＨＣ）及び溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）
の病因において、原因となる役割を演じている（Ｏｂｒｉｇ等（１９８７）、Ｏ
ｂｒｉｇ等（１９９３）、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等（１９８８）、Ｋａｐｌａｎ
等（１９９０））。
【０００８】
志賀毒素様毒素１（ＳＬＴ−１）は受容体結合７ｋＤａＢ−サブユニットの環
状五量体と組合わされた３２ｋＤａＡ−サブユニットの単一コピーから構成され
ている。Ｂ−サブユニットはＧｂ3として知られている細胞受容体グロボトリア
オシルセラミドにＳＬＴ類を結合させる（Ｏｂｒｉｇ等（１９９３））。この受
容体は内皮細胞を包含する多くの細胞のタイプ上に見い出される（Ｏｂｒｉｇ等
（１９９３））。細胞表面受容体に結合後にＳＬＴは細胞内部に取り込まれ、そ
してＡ−サブユニットは、ジスルフィド結合により結合されるＡ1（２７．５ｋ
Ｄａ）型とＡ2（４．５ｋＤａ）型とに開裂される（Ｏｌｓｎｅｓ（１９８１）
）。処理されたＡサブユニットは６０Ｓリボソームサブユニットの２８ＳｒＲＮ
Ａの５’末端から位置４３２４において単一アデニン残基を開裂することにより
リボソーム類を不活性化する特異性Ｎ−グリコシダーゼである（Ｓａｘｅｎａ等
（１９８９））。２８ＳｒＲＮＡからのＡ4324の開裂は、リボソーム類への延長
因子（ＥＦ−１）／アミノアシル−ｔＲＮＡ複合体の結合を阻止して、たんぱく
質合成の抑制を生ずることによりリボソーム類を不活性化する。他のリボソーム
−不活性化剤に関して、後に続く細胞増殖抑制性及び細胞毒性作用はリボ毒性ス
トレス応答により比較的小割合のリボソームの不活性化への細胞の応答として生
ずるだろう（Ｉｏｒｄａｎｏｖ等（１９９７））。あるいは、細胞増殖抑制性及
び細胞毒性作用は、多数のリボソーム類の不活性化に起因するたんぱく質合成の
大きな崩壊への細胞応答として生ずるだろう。処理されていない全長のＡサブユ
ニット並びに種々の切形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ａサブユニットは有意義なＮ−
グリコシダーゼ活性を維持していることは重要である（Ｈａｄｄａｄ等（１９９
３）、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９４）、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９５））。
さらに、処理されていない全長のＡサブユニットを含有する融合たんぱく質なら
びにＣＤ４のＮ−末端に融合された種々の切形ＡサブユニットはＮ−グリコシダ
ーゼ活性を維持し、そしてＨＩＶ−１ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体を発現する細
胞に対して細胞毒性である（Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９４）、Ａｌ−Ｊａｕｆ
ｙ等（１９９５））。
状五量体と組合わされた３２ｋＤａＡ−サブユニットの単一コピーから構成され
ている。Ｂ−サブユニットはＧｂ3として知られている細胞受容体グロボトリア
オシルセラミドにＳＬＴ類を結合させる（Ｏｂｒｉｇ等（１９９３））。この受
容体は内皮細胞を包含する多くの細胞のタイプ上に見い出される（Ｏｂｒｉｇ等
（１９９３））。細胞表面受容体に結合後にＳＬＴは細胞内部に取り込まれ、そ
してＡ−サブユニットは、ジスルフィド結合により結合されるＡ1（２７．５ｋ
Ｄａ）型とＡ2（４．５ｋＤａ）型とに開裂される（Ｏｌｓｎｅｓ（１９８１）
）。処理されたＡサブユニットは６０Ｓリボソームサブユニットの２８ＳｒＲＮ
Ａの５’末端から位置４３２４において単一アデニン残基を開裂することにより
リボソーム類を不活性化する特異性Ｎ−グリコシダーゼである（Ｓａｘｅｎａ等
（１９８９））。２８ＳｒＲＮＡからのＡ4324の開裂は、リボソーム類への延長
因子（ＥＦ−１）／アミノアシル−ｔＲＮＡ複合体の結合を阻止して、たんぱく
質合成の抑制を生ずることによりリボソーム類を不活性化する。他のリボソーム
−不活性化剤に関して、後に続く細胞増殖抑制性及び細胞毒性作用はリボ毒性ス
トレス応答により比較的小割合のリボソームの不活性化への細胞の応答として生
ずるだろう（Ｉｏｒｄａｎｏｖ等（１９９７））。あるいは、細胞増殖抑制性及
び細胞毒性作用は、多数のリボソーム類の不活性化に起因するたんぱく質合成の
大きな崩壊への細胞応答として生ずるだろう。処理されていない全長のＡサブユ
ニット並びに種々の切形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ａサブユニットは有意義なＮ−
グリコシダーゼ活性を維持していることは重要である（Ｈａｄｄａｄ等（１９９
３）、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９４）、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９５））。
さらに、処理されていない全長のＡサブユニットを含有する融合たんぱく質なら
びにＣＤ４のＮ−末端に融合された種々の切形ＡサブユニットはＮ−グリコシダ
ーゼ活性を維持し、そしてＨＩＶ−１ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体を発現する細
胞に対して細胞毒性である（Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９４）、Ａｌ−Ｊａｕｆ
ｙ等（１９９５））。
【０００９】
志賀毒素様毒素は、内皮細胞の“ナチュラル”キラーであるので、内皮細胞の
増殖を阻止し、及び／又は内皮細胞を死滅させるために、酵素的に活性な全長、
切形又は突然変異形Ａサブユニットを内皮細胞に送り込むことは有利である。他
の細胞タイプへの損傷を避けるために、酵素的に活性な全長、切形又は突然変異
形ＡサブユニットはＶＥＧＦのような内皮細胞特異性成長因子により標的細胞に
送り込まれるべきである。それ故に、ＶＥＧＦ受容体に結合するための能力を維
持している、全長、切形又は突然変異形ＶＥＧＦに融合された酵素的に活性な全
長、切形又は突然変異形Ａサブユニットを含有する融合たんぱく質の生産のため
に有効な組換えＤＮＡ方法を提供することが本発明における目的である。
増殖を阻止し、及び／又は内皮細胞を死滅させるために、酵素的に活性な全長、
切形又は突然変異形Ａサブユニットを内皮細胞に送り込むことは有利である。他
の細胞タイプへの損傷を避けるために、酵素的に活性な全長、切形又は突然変異
形ＡサブユニットはＶＥＧＦのような内皮細胞特異性成長因子により標的細胞に
送り込まれるべきである。それ故に、ＶＥＧＦ受容体に結合するための能力を維
持している、全長、切形又は突然変異形ＶＥＧＦに融合された酵素的に活性な全
長、切形又は突然変異形Ａサブユニットを含有する融合たんぱく質の生産のため
に有効な組換えＤＮＡ方法を提供することが本発明における目的である。
【００１０】
発明の概要
１つの面において、本発明は（１）志賀毒素様細菌毒素（Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋ
ｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎ）のＡサブユニット又はその切形若しくは
突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体
、を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融合たんぱ
く質をコードする単離された核酸に向けられている。
ｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎ）のＡサブユニット又はその切形若しくは
突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体
、を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融合たんぱ
く質をコードする単離された核酸に向けられている。
【００１１】
他の面において、本発明は（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切
形若しくは突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは
突然変異体を含む単離されたポリペプチドであって、リボソーム不活性化活性を
有する単離されたポリペプチドに向けられている。
形若しくは突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは
突然変異体を含む単離されたポリペプチドであって、リボソーム不活性化活性を
有する単離されたポリペプチドに向けられている。
【００１２】
他の面において、本発明は（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切
形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変
異体を含む融合たんぱく質をコードする核酸；及び（２）該核酸に操作的に結合
されて、核酸の発現を可能にしているプロモーター配列を含む、発現ベクターに
向けられている。
形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変
異体を含む融合たんぱく質をコードする核酸；及び（２）該核酸に操作的に結合
されて、核酸の発現を可能にしているプロモーター配列を含む、発現ベクターに
向けられている。
【００１３】
他の面において、本発明は上記発現ベクターで形質転換された細菌細胞に向け
られている。
られている。
【００１４】
なお他の面において、本発明は、細胞中のリボソームを不活性化する方法であ
って、（ａ）細胞を、（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若し
くは突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変
異体、を含むポリペプチドと、該ポリペプチドが前記細胞中に取り込まれ、そし
て前記細胞中のリボソームを不活性化することを可能にする条件下で、接触させ
る工程を含む、上記方法に向けられている。
って、（ａ）細胞を、（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若し
くは突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変
異体、を含むポリペプチドと、該ポリペプチドが前記細胞中に取り込まれ、そし
て前記細胞中のリボソームを不活性化することを可能にする条件下で、接触させ
る工程を含む、上記方法に向けられている。
【００１５】
なお他の面において、本発明は、（Ａ）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又は
その切形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは
突然変異体を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融
合たんぱく質；及び（Ｂ）医薬的に許容できる担体を含む、患者における内皮細
胞増殖を阻止するための組成物に向けられている。
その切形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは
突然変異体を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融
合たんぱく質；及び（Ｂ）医薬的に許容できる担体を含む、患者における内皮細
胞増殖を阻止するための組成物に向けられている。
【００１６】
なお他の面において、本発明は、志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切
形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変
異体を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融合たん
ぱく質；及び医薬的に許容できる担体を含む組成物の有効な量を患者に与えるこ
とを含む、血管形成に依存する病理生理学的症状を患っている患者を治療する方
法に向けられている。
形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変
異体を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融合たん
ぱく質；及び医薬的に許容できる担体を含む組成物の有効な量を患者に与えるこ
とを含む、血管形成に依存する病理生理学的症状を患っている患者を治療する方
法に向けられている。
【００１７】
また、本発明のたんぱく質類及び医薬組成物は、単独で用いることができるか
、あるいは血管形成に関連する疾患のための他の治療、特に前記たんぱく質及び
医薬組成物により起こされる内皮に対する損傷から生ずるであろう酸素又は栄養
供給における減少により効能が高められる治療と組み合わせて用いることができ
る。
、あるいは血管形成に関連する疾患のための他の治療、特に前記たんぱく質及び
医薬組成物により起こされる内皮に対する損傷から生ずるであろう酸素又は栄養
供給における減少により効能が高められる治療と組み合わせて用いることができ
る。
【００１８】
これらの及び他の面は、本発明の以下の詳細な記載においてより詳細に記載さ
れるだう。
れるだう。
【００１９】
本発明は添付図面と一緒にして以下の詳細な記載からより十分に理解されるだ
ろう。図面において：
ろう。図面において：
【００２０】
図１は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、触媒作用的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ
ｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の概要表現図である。触媒作用的に不
活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉは、組換えＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質により
誘発されることができる他の作用から、リボソーム不活性化の作用を分離するた
めに構築された。このたんぱく質は、独立してＳＬＴ−１Ａ−サブユニットの酵
素的活性を非常に減少させる一方で、変化していない抗原の性質により判断され
るように、その折りたたみ（フォールディング）に影響しない、Ｙ１１４Ｓ及び
Ｒ１７０Ｌアミノ酸置換基を有する二重突然変異体Ａサブユニットを含有する（
Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚ等（１９９３）、Ｃａｏ等（１９９４））。精製及び定
量化のためのＨｉｓ−標識及びＳ−標識が用いられる。Ａ１−Ａ２二量体に結合
されたジスルフィド結合にＡサブユニットを開裂する細胞間プロテアーゼフリン
についての開裂部位が示される。対照実験において用いられる組換えＶＥＧＦ１
２１たんぱく質はまた、Ｈｉｓ−標識及びＳ−標識を含有する。
ｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の概要表現図である。触媒作用的に不
活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉは、組換えＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質により
誘発されることができる他の作用から、リボソーム不活性化の作用を分離するた
めに構築された。このたんぱく質は、独立してＳＬＴ−１Ａ−サブユニットの酵
素的活性を非常に減少させる一方で、変化していない抗原の性質により判断され
るように、その折りたたみ（フォールディング）に影響しない、Ｙ１１４Ｓ及び
Ｒ１７０Ｌアミノ酸置換基を有する二重突然変異体Ａサブユニットを含有する（
Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚ等（１９９３）、Ｃａｏ等（１９９４））。精製及び定
量化のためのＨｉｓ−標識及びＳ−標識が用いられる。Ａ１−Ａ２二量体に結合
されたジスルフィド結合にＡサブユニットを開裂する細胞間プロテアーゼフリン
についての開裂部位が示される。対照実験において用いられる組換えＶＥＧＦ１
２１たんぱく質はまた、Ｈｉｓ−標識及びＳ−標識を含有する。
【００２１】
図２はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（ＢＬ２１と呼ばれ
る）及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（Ｏｒｉｇａ
ｍｉと呼ばれる）におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓのた
んぱく質の発現、及び各々の宿主から単離された封入体においてのそれらの蓄積
を例示する（図２、パネルＡ及びＢ）。図２はまた、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）
ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株からの精製後に得られたＶＥＧＦ１２１（レーン
Ｖ）、ＳＬＴ−ＶＥＧＥ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｓたんぱく質の最終標品の品質を例示する（図２、パネルＣ）。ＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦ融合たんぱく質の発現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
ＩＰＴＧ）の添加により誘発された。３７℃で、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ
細胞はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬについてＩＰＴＧ誘発の３．５時間後に採取され、
そしてＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＳについてＩＰＴＧ誘発の２時間後に、採取された。
Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は３０℃で両方のたんぱく質について
ＩＰＴＧ誘発の４時間後に採取された。可溶性区分（Ｓ）、封入体（Ｉ）、及び
封入体から精製された再生（リフォールドされた）たんぱく質は１５％ゲル上で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。レーンＭにおける標識の分子量はｋＤａで
示される。
る）及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（Ｏｒｉｇａ
ｍｉと呼ばれる）におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓのた
んぱく質の発現、及び各々の宿主から単離された封入体においてのそれらの蓄積
を例示する（図２、パネルＡ及びＢ）。図２はまた、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）
ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株からの精製後に得られたＶＥＧＦ１２１（レーン
Ｖ）、ＳＬＴ−ＶＥＧＥ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｓたんぱく質の最終標品の品質を例示する（図２、パネルＣ）。ＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦ融合たんぱく質の発現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
ＩＰＴＧ）の添加により誘発された。３７℃で、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ
細胞はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬについてＩＰＴＧ誘発の３．５時間後に採取され、
そしてＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＳについてＩＰＴＧ誘発の２時間後に、採取された。
Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は３０℃で両方のたんぱく質について
ＩＰＴＧ誘発の４時間後に採取された。可溶性区分（Ｓ）、封入体（Ｉ）、及び
封入体から精製された再生（リフォールドされた）たんぱく質は１５％ゲル上で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。レーンＭにおける標識の分子量はｋＤａで
示される。
【００２２】
図３はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質（しかし触
媒的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉなし）が無細胞翻訳系においてたんぱ
く質合成を阻止することを例示する。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｓたんぱく質は１００ｎＭの濃度で、それぞれ９９．９９％及び９９％だけ
蛍ルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳を阻止する（図３、パネルＡ）。ＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦ融合たんぱく質と同じ方法により単離された組換えＶＥＧＦ１２１たんぱく
質は、１，０００ｎＭほどの高さの濃度で〜５０％だけ翻訳を阻止する（図３、
パネルＡ）。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、前者が０．０
４ｎＭの濃度で、後者が２ｎＭの濃度で、適用量依存性様式で、９０％阻止でた
んぱく質合成を阻止し、その一方でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはたんぱく質合成
を阻止しなかった（図３、パネルＢ）。ＶＥＧＦ１２１対照のパーセントで検出
されたルシフェラーゼ活性が示される。
媒的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉなし）が無細胞翻訳系においてたんぱ
く質合成を阻止することを例示する。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｓたんぱく質は１００ｎＭの濃度で、それぞれ９９．９９％及び９９％だけ
蛍ルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳を阻止する（図３、パネルＡ）。ＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦ融合たんぱく質と同じ方法により単離された組換えＶＥＧＦ１２１たんぱく
質は、１，０００ｎＭほどの高さの濃度で〜５０％だけ翻訳を阻止する（図３、
パネルＡ）。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、前者が０．０
４ｎＭの濃度で、後者が２ｎＭの濃度で、適用量依存性様式で、９０％阻止でた
んぱく質合成を阻止し、その一方でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはたんぱく質合成
を阻止しなかった（図３、パネルＢ）。ＶＥＧＦ１２１対照のパーセントで検出
されたルシフェラーゼ活性が示される。
【００２３】
図４は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体（２９３／ＫＤＲ細胞）を過
度に発現する細胞において、ＶＥＧＦのためのＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロ
シン燐酸化を誘発することを例示している。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシ
ン燐酸化は、抗−ホスホチロシン抗体を用いて、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ
−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ及びＶＥＧＦ１２１で処理された２
９３／ＫＤＲの溶菌液（ライゼート）のウエスタンブロット分析により検出され
た。
ＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体（２９３／ＫＤＲ細胞）を過
度に発現する細胞において、ＶＥＧＦのためのＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロ
シン燐酸化を誘発することを例示している。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシ
ン燐酸化は、抗−ホスホチロシン抗体を用いて、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ
−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ及びＶＥＧＦ１２１で処理された２
９３／ＫＤＲの溶菌液（ライゼート）のウエスタンブロット分析により検出され
た。
【００２４】
図５は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤ
Ｒ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を標
的化する（中が白い円形）が、しかしＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現していな
い対照のＰＡＥ／Ｖ細胞に影響しない（中が黒い円形）ことを例示している。Ｐ
ＡＥ／ＫＤＲ細胞及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体が存在しない対照ＰＡＥ／Ｖ細
胞が、〜５，０００細胞／ウエルで平板培養され、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ（図５
、パネルＡ）又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ（図５、パネルＢ）で７２時間処理され
、そしてＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｌｙｓＳ宿主から単離された。図５において
示されるように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を
過度に発現しているＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を強く阻止した。触媒作用的に不
活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬｃｉはＰＡＥ／ＫＤＲ及びＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に
影響しないので、この効果はＳＬＴ部分のリボソーム不活性化活性に起因すると
考えられる（図５、パネルＣ）。
Ｒ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を標
的化する（中が白い円形）が、しかしＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現していな
い対照のＰＡＥ／Ｖ細胞に影響しない（中が黒い円形）ことを例示している。Ｐ
ＡＥ／ＫＤＲ細胞及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体が存在しない対照ＰＡＥ／Ｖ細
胞が、〜５，０００細胞／ウエルで平板培養され、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ（図５
、パネルＡ）又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ（図５、パネルＢ）で７２時間処理され
、そしてＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｌｙｓＳ宿主から単離された。図５において
示されるように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を
過度に発現しているＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を強く阻止した。触媒作用的に不
活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬｃｉはＰＡＥ／ＫＤＲ及びＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に
影響しないので、この効果はＳＬＴ部分のリボソーム不活性化活性に起因すると
考えられる（図５、パネルＣ）。
【００２５】
図６は、ＤＮＡ分解（図６、パネルＡ）及びα−ホドリンの開裂（図６、パネ
ルＢ）により判断されるように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ融合たんぱく質はＰＡＥ
／ＫＤＲ細胞におけるアポトーシスを迅速に活性化することを例示する。
ルＢ）により判断されるように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ融合たんぱく質はＰＡＥ
／ＫＤＲ細胞におけるアポトーシスを迅速に活性化することを例示する。
【００２６】
図７は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質が低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容
体（図７、パネルＡ）及び休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（図７、パネルＢ）
を有する内皮細胞を標的としないことを例示している。ウエスタンブロット分析
により評価されるように、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞は、細胞当たり３０
，０００〜５０，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現し、そしてＰＡＥ／Ｋ
ＤＲlow細胞は細胞当たり〜５，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する。
ＭＳｌ細胞は、細胞当たり〜２０，０００ＶＥＧＦＲ−２を発現した。ＨＵＶＥ
、ＰＡＥ／ＫＤＲlow及びＭＳｌ細胞は、５〜１０ｘ１０3細胞／ウエルの密度で
、２４個ウエルの平板上で平板培養され、そして２０時間後に２．５ｎＭのＳＬ
Ｔ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされ、そして７２時間後に計数された。集密ＰＡＥ／Ｋ
ＤＲは３日間、集密状態で維持され、次に７２時間２０ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｌで処理された。増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲは５分間２０ｎＭのＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｌにさらされ、次に、新しい培地に移され、７２時間後に計数された
。
体（図７、パネルＡ）及び休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（図７、パネルＢ）
を有する内皮細胞を標的としないことを例示している。ウエスタンブロット分析
により評価されるように、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞は、細胞当たり３０
，０００〜５０，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現し、そしてＰＡＥ／Ｋ
ＤＲlow細胞は細胞当たり〜５，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する。
ＭＳｌ細胞は、細胞当たり〜２０，０００ＶＥＧＦＲ−２を発現した。ＨＵＶＥ
、ＰＡＥ／ＫＤＲlow及びＭＳｌ細胞は、５〜１０ｘ１０3細胞／ウエルの密度で
、２４個ウエルの平板上で平板培養され、そして２０時間後に２．５ｎＭのＳＬ
Ｔ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされ、そして７２時間後に計数された。集密ＰＡＥ／Ｋ
ＤＲは３日間、集密状態で維持され、次に７２時間２０ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｌで処理された。増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲは５分間２０ｎＭのＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｌにさらされ、次に、新しい培地に移され、７２時間後に計数された
。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、本明細書においてＳＬＴ−ＶＥＧＦと称される融合たんぱく
質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸配列を提供することである。ＳＬ
Ｔ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は、リボソーム不活性化活性を与える志賀毒素様毒
素（Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎ）の全長、切形又
は突然変異Ａサブユニット、及びＶＥＧＦ受容体に結合する血管内皮成長因子（
ＶＥＧＦ）を含む。該３種の核酸配列及び結果として生ずるたんぱく質配列は、
スペーサー配列により分離されるのが好ましい。
質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸配列を提供することである。ＳＬ
Ｔ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は、リボソーム不活性化活性を与える志賀毒素様毒
素（Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎ）の全長、切形又
は突然変異Ａサブユニット、及びＶＥＧＦ受容体に結合する血管内皮成長因子（
ＶＥＧＦ）を含む。該３種の核酸配列及び結果として生ずるたんぱく質配列は、
スペーサー配列により分離されるのが好ましい。
【００２８】
志賀毒素様毒素についての核酸配列及びＶＥＧＦについての核酸配列はそれぞ
れ当業界において知られている。しかしながら、本発明者は、これらの２つの配
列の組み合わせが、特性のユニークな組み合わせを有する融合たんぱく質の生成
を提供することを驚くべきことに見い出した。その融合たんぱく質は、そのＶＥ
ＧＦ領域に基づいて特異的ＶＥＧＦ細胞受容体に結合することができる。その融
合たんぱく質はまた、志賀毒素様毒素領域に基づいてリボソーム類を不活性化し
、そしてＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現している内皮細胞においてアポ
トーシスを誘発することができる。組み合わせにおいて、これらの２つのたんぱ
く質領域は、血管形成に関連する疾患に対する有効な且つ高度に標的化した治療
を提供する。
れ当業界において知られている。しかしながら、本発明者は、これらの２つの配
列の組み合わせが、特性のユニークな組み合わせを有する融合たんぱく質の生成
を提供することを驚くべきことに見い出した。その融合たんぱく質は、そのＶＥ
ＧＦ領域に基づいて特異的ＶＥＧＦ細胞受容体に結合することができる。その融
合たんぱく質はまた、志賀毒素様毒素領域に基づいてリボソーム類を不活性化し
、そしてＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現している内皮細胞においてアポ
トーシスを誘発することができる。組み合わせにおいて、これらの２つのたんぱ
く質領域は、血管形成に関連する疾患に対する有効な且つ高度に標的化した治療
を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の目的は、内皮細胞増殖の阻止において使用するための医薬
組成物であって、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質及び医薬的に許容できる担体
を含有する医薬組成物を提供することである。有用な担体は、水、緩衝化塩水又
は当業界において知られている他の医薬的に許容できる担体を包含する。医薬組
成物のＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は効能のある細胞毒性薬剤又は細胞増殖
抑制薬剤であり、そして充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状
態並びに虚血性傷害のような、血管形成に依存する種々の病理生理学的症状の治
療において有用である。また、本発明のたんぱく質及び医薬組成物は単独で用い
られることができるか、あるいは血管形成に関連した疾患のための他の既知の治
療、特に前記たんぱく質及び医薬組成物により起こされる内皮への損傷から生ず
る酸素又は栄養補給における減少により効能が高められる治療と組み合わせて用
いることができる。
組成物であって、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質及び医薬的に許容できる担体
を含有する医薬組成物を提供することである。有用な担体は、水、緩衝化塩水又
は当業界において知られている他の医薬的に許容できる担体を包含する。医薬組
成物のＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は効能のある細胞毒性薬剤又は細胞増殖
抑制薬剤であり、そして充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状
態並びに虚血性傷害のような、血管形成に依存する種々の病理生理学的症状の治
療において有用である。また、本発明のたんぱく質及び医薬組成物は単独で用い
られることができるか、あるいは血管形成に関連した疾患のための他の既知の治
療、特に前記たんぱく質及び医薬組成物により起こされる内皮への損傷から生ず
る酸素又は栄養補給における減少により効能が高められる治療と組み合わせて用
いることができる。
【００３０】
本発明のなお他の目的は、新しいＤＮＡ配列を受け入れている組換え発現ベク
ター、及びそのような組換え発現ベクターを含有する形質転換された細菌細胞を
提供することである。融合たんぱく質ＳＬＴ−ＶＥＧＦをコードする核酸配列は
当業界において周知の材料及び方法を用いて、細菌プラスミド又はウイルスベク
ターのような既知のベクター中に挿入することができる。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合
たんぱく質をコードする核酸構築物は、その核酸構築物が誘導性プロモーター配
列、融合たんぱく質の精製及び定量化を簡潔にする標識をコードする配列、並び
に選ばれた宿主におけるターミネーター官能性に操作的に結合されるようにプラ
スミド中に挿入される。そのプラスミドはまた、プロモーターが誘導的に制御さ
れる、細菌細胞のような、宿主細胞中に導入されるのが好ましい。
ター、及びそのような組換え発現ベクターを含有する形質転換された細菌細胞を
提供することである。融合たんぱく質ＳＬＴ−ＶＥＧＦをコードする核酸配列は
当業界において周知の材料及び方法を用いて、細菌プラスミド又はウイルスベク
ターのような既知のベクター中に挿入することができる。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合
たんぱく質をコードする核酸構築物は、その核酸構築物が誘導性プロモーター配
列、融合たんぱく質の精製及び定量化を簡潔にする標識をコードする配列、並び
に選ばれた宿主におけるターミネーター官能性に操作的に結合されるようにプラ
スミド中に挿入される。そのプラスミドはまた、プロモーターが誘導的に制御さ
れる、細菌細胞のような、宿主細胞中に導入されるのが好ましい。
【００３１】
本発明の他の目的は、内皮細胞の増殖を阻止し、そして充実性腫瘍及び転移増
殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態、並びに虚血性傷害のような、血管形成に依
存する病理生理学的症状を患っている患者を治療するための方法である。
殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態、並びに虚血性傷害のような、血管形成に依
存する病理生理学的症状を患っている患者を治療するための方法である。
【００３２】
本発明に従う組換え核酸配列により発現された融合たんぱく質において、その
ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦの高い親和性受容体に結合することができる、ＶＥＧＦ１
２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０９の全長又は突然変異
体から適当に選ばれる。本発明の特に好ましい態様に従えば、ＶＥＧＦはＶＥＧ
Ｆ１２１又はその切形ＶＥＧＦ突然変異体により構成される。
ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦの高い親和性受容体に結合することができる、ＶＥＧＦ１
２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０９の全長又は突然変異
体から適当に選ばれる。本発明の特に好ましい態様に従えば、ＶＥＧＦはＶＥＧ
Ｆ１２１又はその切形ＶＥＧＦ突然変異体により構成される。
【００３３】
本明細書において用いられるものとして、（ＳＬＴとして本明細書において略
記する）志賀毒素様毒素Ａサブユニットとは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に
見い出されるアミノ酸配列、並びに実質的にリボソーム不活性化活性を依然とし
て発現する、アミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有する修飾された配列を有す
るポリペプチドを言う。種々の制御実験のような幾つかの適用のために、リボソ
ーム不活性化活性を欠いているＳＬＴを生成することが有益であろう。特に、そ
のような修飾されたＳＬＴ類は、１つ以上のアミノ酸を変化させるか、又は欠失
させるか、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質の所望の性質を達成させるため
に、より適当にすることができる１つ以上のアミノ酸を挿入することにより、本
明細書において開示されたＤＮＡを修飾することにより生成することができる。
そのような性質は、細菌宿主における組換えたんぱく質の生産、細胞ＶＥＧＦ受
容体に結合する能力、受容体媒介吸収を介する細胞に取り込まれる能力、細胞間
たんぱく質合成阻止活性、全体的な細胞毒性又は細胞増殖抑制性、薬物速度論、
薬動力学（薬力学）、及び種々の貯蔵及び使用条件下での安定性を包含するが、
しかしそれらに限定されない。標準のインビトロ又はインビボアッセイにおいて
、本明細書において記載されたとおりにしてＶＥＧＦに融合したときに、リボソ
ーム不活性化活性及び細胞ＶＥＧＦ受容体に結合する能力を示すような、任意の
たんぱく質又はその変換体が本発明において使用するために意図される。
記する）志賀毒素様毒素Ａサブユニットとは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に
見い出されるアミノ酸配列、並びに実質的にリボソーム不活性化活性を依然とし
て発現する、アミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有する修飾された配列を有す
るポリペプチドを言う。種々の制御実験のような幾つかの適用のために、リボソ
ーム不活性化活性を欠いているＳＬＴを生成することが有益であろう。特に、そ
のような修飾されたＳＬＴ類は、１つ以上のアミノ酸を変化させるか、又は欠失
させるか、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質の所望の性質を達成させるため
に、より適当にすることができる１つ以上のアミノ酸を挿入することにより、本
明細書において開示されたＤＮＡを修飾することにより生成することができる。
そのような性質は、細菌宿主における組換えたんぱく質の生産、細胞ＶＥＧＦ受
容体に結合する能力、受容体媒介吸収を介する細胞に取り込まれる能力、細胞間
たんぱく質合成阻止活性、全体的な細胞毒性又は細胞増殖抑制性、薬物速度論、
薬動力学（薬力学）、及び種々の貯蔵及び使用条件下での安定性を包含するが、
しかしそれらに限定されない。標準のインビトロ又はインビボアッセイにおいて
、本明細書において記載されたとおりにしてＶＥＧＦに融合したときに、リボソ
ーム不活性化活性及び細胞ＶＥＧＦ受容体に結合する能力を示すような、任意の
たんぱく質又はその変換体が本発明において使用するために意図される。
【００３４】
本明細書において用いられるものとして、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、Ｓ
ＬＴポリペプチド、及びＶＥＧＦ細胞表面受容体と反応性である、血管内皮成長
因子（ＶＥＧＦ）を含有している融合たんぱく質である。
ＬＴポリペプチド、及びＶＥＧＦ細胞表面受容体と反応性である、血管内皮成長
因子（ＶＥＧＦ）を含有している融合たんぱく質である。
【００３５】
結果として得られるＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は、内皮細胞の増殖を標
的化しそして阻止する細胞毒性又は細胞増殖抑制剤として有用であり、それによ
り充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態、並びに虚血性障害
を包含するが、それらに限定されない、血管形成依存性疾患を治療するために有
用である。
的化しそして阻止する細胞毒性又は細胞増殖抑制剤として有用であり、それによ
り充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態、並びに虚血性障害
を包含するが、それらに限定されない、血管形成依存性疾患を治療するために有
用である。
【００３６】
本明細書において用いられるものとして、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質が標的
とするとは、それを、ＶＥＧＦ受容体を発現する細胞に向けることを意味する。
その受容体に結合する際、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、その細胞に取り込ま
れ、そしてその細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性である。
とするとは、それを、ＶＥＧＦ受容体を発現する細胞に向けることを意味する。
その受容体に結合する際、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、その細胞に取り込ま
れ、そしてその細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性である。
【００３７】
本明細書において用いられるものとして、活性という用語、又はＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦたんぱく質の活性への言及、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質の細胞毒性及
び細胞増殖抑制作用への言及は、細胞によるＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質のＶＥ
ＧＦ受容体媒介取り込みの際に、インビボ又はインビトロのいずれか又はそれぞ
れにおいて、リボソームを不活性にし、細胞を死滅させ又は細胞増殖を阻止する
そのようなたんぱく質の能力を言う。そのような活性は、たんぱく質合成、受容
体結合、自動燐酸化及び細胞による取り込みを測定するアッセイ、及び細胞増殖
、アポトーシスについての及びたんぱく質合成についての試験化合物の作用を測
定することによる細胞毒性及び細胞増殖抑制作用を評価するアッセイを包含する
が、それらに限定されない当業者に知られている任意の方法により評価されるこ
とができる。
ＧＦたんぱく質の活性への言及、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質の細胞毒性及
び細胞増殖抑制作用への言及は、細胞によるＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質のＶＥ
ＧＦ受容体媒介取り込みの際に、インビボ又はインビトロのいずれか又はそれぞ
れにおいて、リボソームを不活性にし、細胞を死滅させ又は細胞増殖を阻止する
そのようなたんぱく質の能力を言う。そのような活性は、たんぱく質合成、受容
体結合、自動燐酸化及び細胞による取り込みを測定するアッセイ、及び細胞増殖
、アポトーシスについての及びたんぱく質合成についての試験化合物の作用を測
定することによる細胞毒性及び細胞増殖抑制作用を評価するアッセイを包含する
が、それらに限定されない当業者に知られている任意の方法により評価されるこ
とができる。
【００３８】
本明細書において用いられるものとして、ＶＥＧＦは天然ＶＥＧＦたんぱく質
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを言い、並びに該天然たんぱく質のアミノ
酸置換、欠失、挿入又は付加を有するが、しかしＶＥＧＦ受容体に結合し且つ細
胞取り込みされ能力を維持している修飾された配列を有するポリペプチドを言う
。そのようなポリペプチドは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８
９、ＶＥＧＦ２０９を包含するが、それらに限定されない。
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを言い、並びに該天然たんぱく質のアミノ
酸置換、欠失、挿入又は付加を有するが、しかしＶＥＧＦ受容体に結合し且つ細
胞取り込みされ能力を維持している修飾された配列を有するポリペプチドを言う
。そのようなポリペプチドは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８
９、ＶＥＧＦ２０９を包含するが、それらに限定されない。
【００３９】
アミノ酸配列における差は、異なる種のＶＥＧＦ類の中で、並びにそれぞれ生
体又は種からのＶＥＧＦ類の中で起こり得ることが理解される。ＶＥＧＦ類への
言及はまた、天然源から単離されたたんぱく質、並びに組換え体手段による又は
、ことによっては化学合成によるような、合成的に作られたたんぱく質を包含す
ることが意図される。ＶＥＧＦはまた、ＳＬＴに、ＶＥＧＦ−受容体発現細胞を
標的とさせる能力を有し、そして例えば該成長因子の活性又は安定性を維持し又
は増大させるために、ジスルフィドスクランブルを減少させるか又は排除させる
ために、あるいは種々の修飾用基（例えばポリエチレングリコール）を用いて反
応性を変えるために造られた、ＶＥＧＦの突然変異体を包含する。
体又は種からのＶＥＧＦ類の中で起こり得ることが理解される。ＶＥＧＦ類への
言及はまた、天然源から単離されたたんぱく質、並びに組換え体手段による又は
、ことによっては化学合成によるような、合成的に作られたたんぱく質を包含す
ることが意図される。ＶＥＧＦはまた、ＳＬＴに、ＶＥＧＦ−受容体発現細胞を
標的とさせる能力を有し、そして例えば該成長因子の活性又は安定性を維持し又
は増大させるために、ジスルフィドスクランブルを減少させるか又は排除させる
ために、あるいは種々の修飾用基（例えばポリエチレングリコール）を用いて反
応性を変えるために造られた、ＶＥＧＦの突然変異体を包含する。
【００４０】
本明細書において用いられるものとして、“ＶＥＧＦ受容体”という用語は、
ＶＥＧＦと特異的に相互作用し、それを細胞中に輸送する受容体に言及するため
に用いられる。これらの中に、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）、ｆｌｔ
−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）が包含されるが、それらに限定されない。
ＶＥＧＦと特異的に相互作用し、それを細胞中に輸送する受容体に言及するため
に用いられる。これらの中に、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）、ｆｌｔ
−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）が包含されるが、それらに限定されない。
【００４１】
本明細書において用いられるものとして、“ＶＥＧＦ受容体と反応性のポリペ
プチド”という用語は、ＶＥＧＦ受容体、好ましくは高い親和性のＶＥＧＦ受容
体と特異的に反応し、ＶＥＧＦ受容体とのその相互反応に基づいて細胞中に移送
される任意のポリペプチドを言う。
プチド”という用語は、ＶＥＧＦ受容体、好ましくは高い親和性のＶＥＧＦ受容
体と特異的に反応し、ＶＥＧＦ受容体とのその相互反応に基づいて細胞中に移送
される任意のポリペプチドを言う。
【００４２】
他のように定義されない限り、本明細書において用いられる追加の技術的且つ
科学的用語は、本明細書における当該事項が属する業界の当業者により通常理解
されている意味と同じ意味を有する。
科学的用語は、本明細書における当該事項が属する業界の当業者により通常理解
されている意味と同じ意味を有する。
【００４３】
本発明は、この点に関して決して限定されないけれども、志賀毒素様毒素の全
長Ａサブユニット（ＳＬＴ／Ｌ）、その切形変換体（ＳＬＴ／Ｓ）、又はその触
媒作用的に不活性な突然変異変換体（ＳＬＴ／Ｌｃｉ）に関して主として以下に
例示されるだろう。したがって、本発明は、融合たんぱく質が、特異ＶＥＧＦ受
容体を標的にする、ＳＬＴ／Ｌ、又はＳＬＴ／Ｓ、又はＳＬＴ／ＬｃｉとＶＥＧ
Ｆ分子との間の遺伝子融合たんぱく質の構造に関連して記載され、そして内皮細
胞上への細胞毒性及び／又は細胞増殖抑制作用を、ＳＬＴ／Ｌ又はＳＬＴ／Ｓを
含有する融合たんぱく質だけが示すが、しかしＳＬＴ／Ｌｃｉを含有する融合た
んぱく質は示さないことを本明細書において示すだろう。
長Ａサブユニット（ＳＬＴ／Ｌ）、その切形変換体（ＳＬＴ／Ｓ）、又はその触
媒作用的に不活性な突然変異変換体（ＳＬＴ／Ｌｃｉ）に関して主として以下に
例示されるだろう。したがって、本発明は、融合たんぱく質が、特異ＶＥＧＦ受
容体を標的にする、ＳＬＴ／Ｌ、又はＳＬＴ／Ｓ、又はＳＬＴ／ＬｃｉとＶＥＧ
Ｆ分子との間の遺伝子融合たんぱく質の構造に関連して記載され、そして内皮細
胞上への細胞毒性及び／又は細胞増殖抑制作用を、ＳＬＴ／Ｌ又はＳＬＴ／Ｓを
含有する融合たんぱく質だけが示すが、しかしＳＬＴ／Ｌｃｉを含有する融合た
んぱく質は示さないことを本明細書において示すだろう。
【００４４】
ＶＥＧＦ１２１に結合されたＳＬＴ／Ｌ又はＳＬＴ／Ｓからなる、ＳＬＴ−Ｖ
ＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓで表示される融合たんぱく質は、〜０．１
５ｎＭのＩＣ50を有する適用量依存方式で、ＶＥＧＦに対してＫＤＲ／ｆｌｋ−
１受容体を過度に発現するブタ内皮細胞ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を阻止する。
低いナノモルの濃度範囲で、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質は細胞毒性であり
、２．５ｎＭ程の低い濃度にさらされたときに実質的すべてのＰＡＥ／ＫＤＲ細
胞を死滅させる。これとは対照的に、低いナノモル濃度でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｓたんぱく質はほとんど細胞増殖抑制性である。触媒作用的に不活性なＶＥＧＦ
−ＳＬＴ／ＬｃｉがＰＡＥ／ＫＤＲ細胞増殖に影響しないので、これらの効果は
リボソームを不活性化する融合たんぱく質のＳＬＴ部分の触媒活性により左右さ
れる。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１
受容体を発現しないがしかし制御ベクターによりＤＮＡ感染されるブタ内皮細胞
ＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に影響しないので、これらの効果はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受
容体の発現により左右される。重要なことには、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく
質は、２０ｎＭほどの高さの濃度でさえ、低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体又
は休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を発現する内皮細胞に影響しない。それらの
結果は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＱＥＧＦ／Ｓ分子がＫＤＲ／ｆｌ
ｋ−１受容体を介して細胞に入ることができ、そして前記分子のＳＬＴ／Ｌ又は
ＳＬＴ／Ｓ部分が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつある
内皮細胞において細胞毒性及び／又は細胞増殖抑制作用を有効に生じさせること
ができるが、しかし低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞又は
休止（静止）内皮細胞においては該作用を生じさせることができないことを示し
ている。
ＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓで表示される融合たんぱく質は、〜０．１
５ｎＭのＩＣ50を有する適用量依存方式で、ＶＥＧＦに対してＫＤＲ／ｆｌｋ−
１受容体を過度に発現するブタ内皮細胞ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を阻止する。
低いナノモルの濃度範囲で、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質は細胞毒性であり
、２．５ｎＭ程の低い濃度にさらされたときに実質的すべてのＰＡＥ／ＫＤＲ細
胞を死滅させる。これとは対照的に、低いナノモル濃度でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｓたんぱく質はほとんど細胞増殖抑制性である。触媒作用的に不活性なＶＥＧＦ
−ＳＬＴ／ＬｃｉがＰＡＥ／ＫＤＲ細胞増殖に影響しないので、これらの効果は
リボソームを不活性化する融合たんぱく質のＳＬＴ部分の触媒活性により左右さ
れる。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１
受容体を発現しないがしかし制御ベクターによりＤＮＡ感染されるブタ内皮細胞
ＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に影響しないので、これらの効果はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受
容体の発現により左右される。重要なことには、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく
質は、２０ｎＭほどの高さの濃度でさえ、低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体又
は休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を発現する内皮細胞に影響しない。それらの
結果は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＱＥＧＦ／Ｓ分子がＫＤＲ／ｆｌ
ｋ−１受容体を介して細胞に入ることができ、そして前記分子のＳＬＴ／Ｌ又は
ＳＬＴ／Ｓ部分が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつある
内皮細胞において細胞毒性及び／又は細胞増殖抑制作用を有効に生じさせること
ができるが、しかし低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞又は
休止（静止）内皮細胞においては該作用を生じさせることができないことを示し
ている。
【００４５】
これらの結果は、ＶＥＧＦたんぱく質のための受容体は低い数で発現するか又
は発現しない、正常な内皮細胞又は他のタイプの細胞に影響せず、それにより標
的化されていない細胞との相互作用から生じ得る望ましくない副作用を最小にし
て、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現することが知られている血管形成の
部位で増殖しつつある内皮を選択的に標的にするためにＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及
びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質を使用することの可能性を示している。それ
故に、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、表面ＶＥ
ＧＦ受容体を過度に発現している細胞において表面ＶＥＧＦ受容体への特異的結
合を介して細胞相互作用の狭いスペクトルが与えられ、それにより血管形成の部
位で主として増殖しつつある内皮細胞を、ＳＬＴ／Ｌ及びＳＬＴ／Ｓが標的化す
る。
は発現しない、正常な内皮細胞又は他のタイプの細胞に影響せず、それにより標
的化されていない細胞との相互作用から生じ得る望ましくない副作用を最小にし
て、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現することが知られている血管形成の
部位で増殖しつつある内皮を選択的に標的にするためにＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及
びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質を使用することの可能性を示している。それ
故に、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、表面ＶＥ
ＧＦ受容体を過度に発現している細胞において表面ＶＥＧＦ受容体への特異的結
合を介して細胞相互作用の狭いスペクトルが与えられ、それにより血管形成の部
位で主として増殖しつつある内皮細胞を、ＳＬＴ／Ｌ及びＳＬＴ／Ｓが標的化す
る。
【００４６】
さらに、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ構築物を用いて、本
発明者は： （ｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、たんぱ
く質合成を阻止する能力を維持するが、しかしＳＴＬ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはその
能力を維持しない； （ｉｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦ／Ｓたんぱく質は、細胞ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に結合し、そして前記受
容体のチロシン自己燐酸化を誘発する； （ｉｉｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過
度に発現している増殖しつつある内皮細胞の死滅を誘導する細胞毒性たんぱく質
であるが、しかし低い数のＤＫＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現している内皮細胞又
は休止（静止）内皮細胞に対しては細胞毒性たんぱく質ではなく、一方では、Ｓ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、ほとんどの増殖阻止を生ずる細胞増殖抑制性たんぱく質
である：ことを示した。
発明者は： （ｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、たんぱ
く質合成を阻止する能力を維持するが、しかしＳＴＬ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはその
能力を維持しない； （ｉｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥ
ＧＦ／Ｓたんぱく質は、細胞ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に結合し、そして前記受
容体のチロシン自己燐酸化を誘発する； （ｉｉｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過
度に発現している増殖しつつある内皮細胞の死滅を誘導する細胞毒性たんぱく質
であるが、しかし低い数のＤＫＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現している内皮細胞又
は休止（静止）内皮細胞に対しては細胞毒性たんぱく質ではなく、一方では、Ｓ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、ほとんどの増殖阻止を生ずる細胞増殖抑制性たんぱく質
である：ことを示した。
【００４７】
血管形成を阻止するための内皮細胞増殖の阻止において使用するための組成物
は、医薬的に許容できる希釈剤又は担体と組合わせて融合たんぱく質を含む。本
発明に従う組成物は、実施にあたって、静脈内注射、連続注入により通常投与さ
れるけれども、非経口注射又は筋肉内注射のような他の方法も使用することがで
きる。
は、医薬的に許容できる希釈剤又は担体と組合わせて融合たんぱく質を含む。本
発明に従う組成物は、実施にあたって、静脈内注射、連続注入により通常投与さ
れるけれども、非経口注射又は筋肉内注射のような他の方法も使用することがで
きる。
【００４８】
注射のための組成物は、単位投与量形で提供することができ、溶液のような形
をとることができ、そして安定剤、緩衝剤、等のような配合用剤を含有すること
ができる。
をとることができ、そして安定剤、緩衝剤、等のような配合用剤を含有すること
ができる。
【００４９】
本発明は、以下の例によってさらに記載されるが、しかしそれらの例によって
限定されることを意図しない。他のように明瞭に記載されない限り、すべての部
及びパーセンテージは重量によるものであり、すべての温度は摂氏目盛りの度で
ある。
限定されることを意図しない。他のように明瞭に記載されない限り、すべての部
及びパーセンテージは重量によるものであり、すべての温度は摂氏目盛りの度で
ある。
【００５０】
例
例 １
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質をコードする
ＤＮＡ配列の構築
一般的な記載細菌の菌株、プラスミド、及び哺乳類の細胞
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．
（米国）から市販されている。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ
及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されてい
る。Ｈｉｓ−標識、Ｓ−標識、チオレドキシンを含有する末端延長を有する組換
えたんぱく質の細菌発現のためのベクターｐＥＴ３２（ａ）はＮｏｖａｇｅｎ（
米国）から市販されている。ヒトＶＥＧＦの１２１−残基形をコードするＤＮＡ
配列を含有するプラスミドｐＬｅｎ−１２１は米国特許第５，２１９，７３９号
（この特許をその全体において参照することにより本明細書に組み入れる）にお
いて記載されており、Ｄｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ（米国のＳｃｉｏｓ Ｎｏｖａ
，Ｉｎｃ．）から得られた。ＶＴｌ／ＳＬＴホロトキシンのための配列を含有す
るプラスミドｐＪＢ１４４はＤｒ．Ｊ．Ｂｒｕｎｔｏｎ（カナダ、トロントのＳ
ａｍｕｅｌ Ｌｕｎｅｎｆｉｅｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
から得られた。プラスミドｐＢａｌＰｓｔ（エンプティベクター）、及びＫＤＲ
／ｆｌｋ−１受容体をコードするｐＢａｌＰｓｔ／ＫＤＲは、Ｄｒ．Ｂ．Ｔｅｒ
ｍａｎ（米国、ニューヨーク市Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られた。ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞及び
２９３ヒト一次胚腎臓細胞（２９３）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）から得られた。細胞当たり２〜３ｘ
１０5ＫＤＲ／ｆｌｋ−１を発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＫＤＲ）、ｐＢａｌ
ＰｓｔプラスミドでＤＮＡ感染されたＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／Ｖ）、ヒト臍静脈内
皮（ＨＵＶＥ）細胞及びＭＳｌねずみ内皮細胞はＤｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（米国
のニューヨーク市Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）から得られた。ＶＥＧＦＲ−２を過度に発現する２９３細胞（２
９３／ＫＤＲ）及び低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１を発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ
／ＫＤＥlow）は、トランスＩＴ−ＬＴｌ試薬（米国のＰａｎＶｅｒａ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、対応する親細胞をｐＢａｌＰｓｔ／ＫＤＲプラス
ミドでＤＮＡ感染し、次に０．３７５ｇ／ｍｌのプロマイシンの存在下で選択す
ることにより構築された。この研究のために選択された２９３／ＫＤＲのクロー
ンは、125Ｉ−ＶＥＧＦ１６５結合のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）
分析に従って細胞当たり２．５ｘ１０6ＶＥＧＦＲ−２を発現した。ＰＡＥ／Ｋ
ＤＲ及びＰＡＥ／ＫＤＲlow細胞におけるＶＥＧＦＲ−２の発現水準は標準とし
て働く２９３／ＫＤＲ細胞を用いてウエスタンブロットにより評価された。免疫
ブロットはＤｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（米国ニューヨーク市のＡｌｂｅｒｔ Ｅｉ
ｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られたウサギ多
クローン抗−ＶＥＧＦＲ−２血清を用いて精査された。ＰＡＥ、２９３細胞及び
それらの誘導体は１０％のウシ胎児血清（米国、Ｇｅｒｍｉｎｉ，Ｉｎｃ．）、
２ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生物質を補充したＤＭＥＭにおいて維持された。
低い継代数のＨＵＶＥ細胞（第３〜第７の継代）は、２０％のＦＢＳ、５０ｎｇ
／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子、１００ｇ／ｍｌのヘパリン、２ｍＭのＬ−
グルタミン及び抗生物質を有するＤＭＥＭＵ中で、ゼラチンコーティングされた
フラスコにおいて増殖された。ＭＳ１細胞は５％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタ
ミン及び抗生物質を有するＤＭＥＭ中で増殖される。すべての細胞系は、３７℃
，５％ＣＯ2で培養された。
（米国）から市販されている。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ
及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されてい
る。Ｈｉｓ−標識、Ｓ−標識、チオレドキシンを含有する末端延長を有する組換
えたんぱく質の細菌発現のためのベクターｐＥＴ３２（ａ）はＮｏｖａｇｅｎ（
米国）から市販されている。ヒトＶＥＧＦの１２１−残基形をコードするＤＮＡ
配列を含有するプラスミドｐＬｅｎ−１２１は米国特許第５，２１９，７３９号
（この特許をその全体において参照することにより本明細書に組み入れる）にお
いて記載されており、Ｄｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ（米国のＳｃｉｏｓ Ｎｏｖａ
，Ｉｎｃ．）から得られた。ＶＴｌ／ＳＬＴホロトキシンのための配列を含有す
るプラスミドｐＪＢ１４４はＤｒ．Ｊ．Ｂｒｕｎｔｏｎ（カナダ、トロントのＳ
ａｍｕｅｌ Ｌｕｎｅｎｆｉｅｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
から得られた。プラスミドｐＢａｌＰｓｔ（エンプティベクター）、及びＫＤＲ
／ｆｌｋ−１受容体をコードするｐＢａｌＰｓｔ／ＫＤＲは、Ｄｒ．Ｂ．Ｔｅｒ
ｍａｎ（米国、ニューヨーク市Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られた。ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞及び
２９３ヒト一次胚腎臓細胞（２９３）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）から得られた。細胞当たり２〜３ｘ
１０5ＫＤＲ／ｆｌｋ−１を発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＫＤＲ）、ｐＢａｌ
ＰｓｔプラスミドでＤＮＡ感染されたＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／Ｖ）、ヒト臍静脈内
皮（ＨＵＶＥ）細胞及びＭＳｌねずみ内皮細胞はＤｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（米国
のニューヨーク市Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）から得られた。ＶＥＧＦＲ−２を過度に発現する２９３細胞（２
９３／ＫＤＲ）及び低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１を発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ
／ＫＤＥlow）は、トランスＩＴ−ＬＴｌ試薬（米国のＰａｎＶｅｒａ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、対応する親細胞をｐＢａｌＰｓｔ／ＫＤＲプラス
ミドでＤＮＡ感染し、次に０．３７５ｇ／ｍｌのプロマイシンの存在下で選択す
ることにより構築された。この研究のために選択された２９３／ＫＤＲのクロー
ンは、125Ｉ−ＶＥＧＦ１６５結合のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）
分析に従って細胞当たり２．５ｘ１０6ＶＥＧＦＲ−２を発現した。ＰＡＥ／Ｋ
ＤＲ及びＰＡＥ／ＫＤＲlow細胞におけるＶＥＧＦＲ−２の発現水準は標準とし
て働く２９３／ＫＤＲ細胞を用いてウエスタンブロットにより評価された。免疫
ブロットはＤｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（米国ニューヨーク市のＡｌｂｅｒｔ Ｅｉ
ｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られたウサギ多
クローン抗−ＶＥＧＦＲ−２血清を用いて精査された。ＰＡＥ、２９３細胞及び
それらの誘導体は１０％のウシ胎児血清（米国、Ｇｅｒｍｉｎｉ，Ｉｎｃ．）、
２ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生物質を補充したＤＭＥＭにおいて維持された。
低い継代数のＨＵＶＥ細胞（第３〜第７の継代）は、２０％のＦＢＳ、５０ｎｇ
／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子、１００ｇ／ｍｌのヘパリン、２ｍＭのＬ−
グルタミン及び抗生物質を有するＤＭＥＭＵ中で、ゼラチンコーティングされた
フラスコにおいて増殖された。ＭＳ１細胞は５％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタ
ミン及び抗生物質を有するＤＭＥＭ中で増殖される。すべての細胞系は、３７℃
，５％ＣＯ2で培養された。
【００５１】ＤＮＡ操作
本明細書において用いられた制限酵素及び修飾酵素は普通の供給業者から市販
されており、製造会社の説明書にしたがって使用された。異なるＤＮＡ構築物の
配列化はＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（米国Ｆｔ．Ｃｏ
ｌｌｉｎｓ，Ｃｏ．のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙの部門）で行われた。コンピテント細胞、形質転換及び細菌培
養液はＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及
びＴ．ＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９
）：ニューヨークのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒのＣｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓの実験マニュアル）
に従って、又は製造会社の説明書に従って作られた。プラスミド類の精製は、製
造会社の説明書に従って、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ
又はＭａｘｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われた。ＤＮＡの追加の精製ならびにアガ
ロースゲルからのＤＮＡの精製は製造会社の説明書に従って、Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ Ｓｐｉｎキット（米国、ＢＩＯ １０１）を用いて行われた。
されており、製造会社の説明書にしたがって使用された。異なるＤＮＡ構築物の
配列化はＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（米国Ｆｔ．Ｃｏ
ｌｌｉｎｓ，Ｃｏ．のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙの部門）で行われた。コンピテント細胞、形質転換及び細菌培
養液はＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及
びＴ．ＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９
）：ニューヨークのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒのＣｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓの実験マニュアル）
に従って、又は製造会社の説明書に従って作られた。プラスミド類の精製は、製
造会社の説明書に従って、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ
又はＭａｘｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われた。ＤＮＡの追加の精製ならびにアガ
ロースゲルからのＤＮＡの精製は製造会社の説明書に従って、Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ Ｓｐｉｎキット（米国、ＢＩＯ １０１）を用いて行われた。
【００５２】
Ａ ＰＥＴ３２（Ａ）発現ベクターへのヒトＶＥＧＦの１２１残基イソ形のサブ
クローニングヒトＶＥＧＦの１２１残基イソ形をコードするＤＮＡの増幅のためのプライマー ヒトＶＥＧＦ ＤＮＡ増幅のためのプライマーがＧｅｎｅＬｉｎｋ（米国）に
より合成された。“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対応するプライマ
ーはＶＥＧＦの成熟１２１−残基イソ形のアミノ酸−１のためのＤＮＡコドンの
直ぐ下流にＳｔｕ Ｉ制限部位を包含した。“アンチセンス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）に対応するプライマーは成熟ＶＥＧＦをコードする配列後に翻訳停
止コドンを包含する、成熟ペプチドのカルボキシル末端をコードするＤＮＡのコ
ード配列を補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）し、そしてＶＥＧＦをコードするＤＮ
Ａの下流にＸｈｏ Ｉ制限部位及び停止コドンを導入した。
クローニングヒトＶＥＧＦの１２１残基イソ形をコードするＤＮＡの増幅のためのプライマー ヒトＶＥＧＦ ＤＮＡ増幅のためのプライマーがＧｅｎｅＬｉｎｋ（米国）に
より合成された。“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対応するプライマ
ーはＶＥＧＦの成熟１２１−残基イソ形のアミノ酸−１のためのＤＮＡコドンの
直ぐ下流にＳｔｕ Ｉ制限部位を包含した。“アンチセンス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）に対応するプライマーは成熟ＶＥＧＦをコードする配列後に翻訳停
止コドンを包含する、成熟ペプチドのカルボキシル末端をコードするＤＮＡのコ
ード配列を補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）し、そしてＶＥＧＦをコードするＤＮ
Ａの下流にＸｈｏ Ｉ制限部位及び停止コドンを導入した。
【００５３】
【００５４】ヒトＶＥＧＦの１２１−残基イソ形をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ
ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡは、ヒトＶＥＧＦの１２１残基イソ形のための配列を
含有するｐＬｅｎ１２１プラスミドからＰＣＲにより増幅された。鋳型ＤＮＡの
ナノグラムはＰｆｕ緩衝液（米国のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の各々のオリゴヌ
クレオチドの１０ピコモル、各々ｄＮＴＰの０．２ｍＭ及びＰｆｕポリメラーゼ
の２Ｕを含有する０．１ｍｌの反応混合物中で混合された。インキュベーション
はＤＮＡ ＧｅｎＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（米国のＰｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）中で行われた。１つのサイクルは変性工程（１分
間９４℃）、アニーリング工程（１分間６５℃）及び延長工程（１分間７２℃）
を包含した。増幅されたＤＮＡはＳｔｕ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを用いて消化され、
そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）を用いて
精製された。
含有するｐＬｅｎ１２１プラスミドからＰＣＲにより増幅された。鋳型ＤＮＡの
ナノグラムはＰｆｕ緩衝液（米国のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の各々のオリゴヌ
クレオチドの１０ピコモル、各々ｄＮＴＰの０．２ｍＭ及びＰｆｕポリメラーゼ
の２Ｕを含有する０．１ｍｌの反応混合物中で混合された。インキュベーション
はＤＮＡ ＧｅｎＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（米国のＰｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）中で行われた。１つのサイクルは変性工程（１分
間９４℃）、アニーリング工程（１分間６５℃）及び延長工程（１分間７２℃）
を包含した。増幅されたＤＮＡはＳｔｕ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを用いて消化され、
そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）を用いて
精製された。
【００５５】ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１プラスミド構築
上記増幅されたＤＮＡ形は、ベクターの多クローン部位からＸｈｏ Ｉ部位、
及びＳｔｕ Ｉ部位を用いてｐＥＴ３２（ａ）に連結され、これは以下のとおり
にしてベクターを処理することにより構築された：ｐＥＴ３２（ａ）ＤＮＡは、
Ｎｃｏ １レストリクターゼ（制限酵素）を用いて線形化され、そして生成され
た凹んだ末端の１つはＤＮＡポリメラーゼ Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を
用いてシチジンで部分的に充てんされた。構築物はＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉ
ｎキット（米国のＢＩＯ １０１）を用いて精製され、１本鎖オーバハング（ｏ
ｖｅｒｈａｎｇｓ）は緑豆（ヤエナエ）ヌクレアーゼを用いて除去された。得ら
れた構築物はＸｈｏ ＳＩ制限酵素で消化され、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ
キット（米国のＢＩＯ １０１）で精製された。連結反応は、ＶＥＧＦの成熟１
２１−残基イソ形の第１アミノ酸がベクターにより提供されたエンテロキナーゼ
開裂部位の後の第１アミノ酸になるように、行われた。得られたプラスミドは、
ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１と称され、製造会社の説明書に従ってＤＨ５α
コンピテント細胞（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換さ
れた。上に記載された方法を用いて、単離されたプラスミドの大きな試料を得る
ために、所望のプラスミドを含有する細菌培養液がさらに増殖された。
及びＳｔｕ Ｉ部位を用いてｐＥＴ３２（ａ）に連結され、これは以下のとおり
にしてベクターを処理することにより構築された：ｐＥＴ３２（ａ）ＤＮＡは、
Ｎｃｏ １レストリクターゼ（制限酵素）を用いて線形化され、そして生成され
た凹んだ末端の１つはＤＮＡポリメラーゼ Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を
用いてシチジンで部分的に充てんされた。構築物はＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉ
ｎキット（米国のＢＩＯ １０１）を用いて精製され、１本鎖オーバハング（ｏ
ｖｅｒｈａｎｇｓ）は緑豆（ヤエナエ）ヌクレアーゼを用いて除去された。得ら
れた構築物はＸｈｏ ＳＩ制限酵素で消化され、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ
キット（米国のＢＩＯ １０１）で精製された。連結反応は、ＶＥＧＦの成熟１
２１−残基イソ形の第１アミノ酸がベクターにより提供されたエンテロキナーゼ
開裂部位の後の第１アミノ酸になるように、行われた。得られたプラスミドは、
ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１と称され、製造会社の説明書に従ってＤＨ５α
コンピテント細胞（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換さ
れた。上に記載された方法を用いて、単離されたプラスミドの大きな試料を得る
ために、所望のプラスミドを含有する細菌培養液がさらに増殖された。
【００５６】
チオレドキシン（ｔｘ）遺伝子は、制限酵素Ｎｄｅ Ｉを用いて精製プラスミ
ドＤＮＡの消化によりｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１から除去され、次にＴ４
リガーゼを用いて線形化プラスミドＤＮＡの分子間連結反応が行われた。得られ
たプラスミドはｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１と称され、そして製造会社の説明書
に従ってＤＨ５αコンピテント細胞（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）に形質転換された。上記方法を用いて単離されたプラスミドの大きな試料を
得るために、所望のプラスミドを含有すに細菌培養液がさらに増殖された。プラ
スミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１ＤＮＡは、Ｈｉｓ標識（６アミノ酸）、トロンビ
ン開裂部位（６アミノ酸）、Ｓ−標識（１５アミノ酸）を含有する３６アミノ酸
全長Ｎ−末端、エンテロキナーゼ開裂部位を含有する６アミノ酸全長連結ペプチ
ド、及び成熟ＶＥＧＦ１２１たんぱく質の１〜１２１アミノ酸をコードする（図
１）。
ドＤＮＡの消化によりｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１から除去され、次にＴ４
リガーゼを用いて線形化プラスミドＤＮＡの分子間連結反応が行われた。得られ
たプラスミドはｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１と称され、そして製造会社の説明書
に従ってＤＨ５αコンピテント細胞（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）に形質転換された。上記方法を用いて単離されたプラスミドの大きな試料を
得るために、所望のプラスミドを含有すに細菌培養液がさらに増殖された。プラ
スミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１ＤＮＡは、Ｈｉｓ標識（６アミノ酸）、トロンビ
ン開裂部位（６アミノ酸）、Ｓ−標識（１５アミノ酸）を含有する３６アミノ酸
全長Ｎ−末端、エンテロキナーゼ開裂部位を含有する６アミノ酸全長連結ペプチ
ド、及び成熟ＶＥＧＦ１２１たんぱく質の１〜１２１アミノ酸をコードする（図
１）。
【００５７】ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１ベクターへの、ＳＬＴサブユニットＡの全長、切形 及び突然変異形のサブクローニング
１． ＳＬＴ−サブユニットＡの全長（Ｌ）及び切形（Ｓ）形をコードするＤＮ
Ａの増幅のためのプライマー
ＳＬＴサブユニットＡのＬ及びＳ形をコードするＤＮＡのＤＮＡ増幅のための
プライマーはＧｅｎｅＬｉｎｋ（米国）により合成された。全長（２９３−残基
）ＳＬＴ形の“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び切形（２０２−残基
）ＳＬＴ形の“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に対応するプライマーは
、成熟ＳＬＴサブユニットＡの、（前者における）アミノ酸−１及び（後者にお
ける）アミノ酸６２のそれぞれ、のためのＤＮＡコドンの上流にＢｇｌ ＩＩ制
限部位を含んだ。ＶＥＧＦ１２１の第１Ｍｅｔを有するフレームにおけるＳＬＴ
分子をクローン化するために、追加のＧがＳＬＴの、Ｂｇｌ ＩＩ部位とＯＲＦ
ｓとの間に挿入された。
プライマーはＧｅｎｅＬｉｎｋ（米国）により合成された。全長（２９３−残基
）ＳＬＴ形の“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び切形（２０２−残基
）ＳＬＴ形の“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に対応するプライマーは
、成熟ＳＬＴサブユニットＡの、（前者における）アミノ酸−１及び（後者にお
ける）アミノ酸６２のそれぞれ、のためのＤＮＡコドンの上流にＢｇｌ ＩＩ制
限部位を含んだ。ＶＥＧＦ１２１の第１Ｍｅｔを有するフレームにおけるＳＬＴ
分子をクローン化するために、追加のＧがＳＬＴの、Ｂｇｌ ＩＩ部位とＯＲＦ
ｓとの間に挿入された。
【００５８】
【００５９】
全長ＳＬＴ形の“アンチセンス”鎖に対応するプライマーは停止コドンの右上
流の成熟ＳＬＴサブユニットＡのカルボキシル末端をコードするＳＬＴ ＤＮＡ
のコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を補足した。切形ＳＬＴ形の“アンチ
センス”鎖に対応するプライマーはＳＬＴサブユニットＡのアミノ酸２５８−２
６４のためのＤＮＡコドンをコードするＤＮＡのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：６）を補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）した。両方のプライマーは、ＳＬＴコ
ードＤＮＡの下流にＫｐｎ Ｉ制限部位を導入した。
流の成熟ＳＬＴサブユニットＡのカルボキシル末端をコードするＳＬＴ ＤＮＡ
のコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を補足した。切形ＳＬＴ形の“アンチ
センス”鎖に対応するプライマーはＳＬＴサブユニットＡのアミノ酸２５８−２
６４のためのＤＮＡコドンをコードするＤＮＡのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：６）を補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）した。両方のプライマーは、ＳＬＴコ
ードＤＮＡの下流にＫｐｎ Ｉ制限部位を導入した。
【００６０】
【００６１】ＳＬＴサブユニットＡの全長形及び切形を増幅するためのＰＣＲ
ＳＬＴサブユニットＡの全長形及び切形をコードするＤＮＡはＶＴｌ／ＳＬＴ
ホロトキシンを含有するプラスミドｐＪＢ１４４からのＰＣＲにより増幅された
。１０ナノグラムの鋳型ＤＮＡはＶｅｎｔ緩衝液中の、各々のオリゴヌクレオチ
ドの１０ピコモル、ｄＮＴＰの０．２ｍＭ及びＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（
米国のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の２Ｕを含有する０．１ｍｌ
の反応混合物中で混合された。インキュベーションは、ＤＮＡ ＧｅｎＡｍｐ
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（米国のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）において行われた。１つのサイクルは変性工程（３０秒間９４℃）、アニー
リング工程（１分間５８℃）、及び延長工程（１分２０秒間７２℃）を含んだ。
２５サイクル後、各々の反応混合物の１０μｌのアリコートを、１％アガロース
ゲル上で走らせて、増幅された生成物の正しい大きさを確認した。増幅されたＤ
ＮＡ形はＢｇｌ ＩＩ制限酵素及びＫｐｎ Ｉ制限酵素で消化され、Ｇｅｎｅｃ
ｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）で精製された。
ホロトキシンを含有するプラスミドｐＪＢ１４４からのＰＣＲにより増幅された
。１０ナノグラムの鋳型ＤＮＡはＶｅｎｔ緩衝液中の、各々のオリゴヌクレオチ
ドの１０ピコモル、ｄＮＴＰの０．２ｍＭ及びＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（
米国のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の２Ｕを含有する０．１ｍｌ
の反応混合物中で混合された。インキュベーションは、ＤＮＡ ＧｅｎＡｍｐ
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（米国のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）において行われた。１つのサイクルは変性工程（３０秒間９４℃）、アニー
リング工程（１分間５８℃）、及び延長工程（１分２０秒間７２℃）を含んだ。
２５サイクル後、各々の反応混合物の１０μｌのアリコートを、１％アガロース
ゲル上で走らせて、増幅された生成物の正しい大きさを確認した。増幅されたＤ
ＮＡ形はＢｇｌ ＩＩ制限酵素及びＫｐｎ Ｉ制限酵素で消化され、Ｇｅｎｅｃ
ｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）で精製された。
【００６２】ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−Ｓ ＬＴ／Ｓプラスミド構築
上記増幅されたＳＬＴ ＤＮＡ形は、Ｂｇｌ ＩＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で処
理されたｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１ベクターに連結され、そして上に記載され
たとおりにして精製された。全長ＳＬＴ形及び切形ＳＬＴ形をコードするＤＮＡ
を含有する得られたプラスミドは、それぞれｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬ
Ｔ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓと称され、そして製造会社
の説明書に従ってＤＨ５αコンピテント細胞（米国のＧｉｂｃｏ）に形質転換さ
れた。それらのクローンは、上に記載されたとおりにしてスクリーンにかけられ
、精製され、特性化され、そして増殖された。ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−Ｓ
ＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／ＳプラスミドにおけるＤＮ
Ａ断片は、それらが予期されたＳＬＴ ＤＮＡ配列を含有していることを確認す
るためにＳＬＴのコード配列においてＴ７プロモーターからヌクレオチド２０３
まで配列化された。
理されたｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１ベクターに連結され、そして上に記載され
たとおりにして精製された。全長ＳＬＴ形及び切形ＳＬＴ形をコードするＤＮＡ
を含有する得られたプラスミドは、それぞれｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬ
Ｔ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓと称され、そして製造会社
の説明書に従ってＤＨ５αコンピテント細胞（米国のＧｉｂｃｏ）に形質転換さ
れた。それらのクローンは、上に記載されたとおりにしてスクリーンにかけられ
、精製され、特性化され、そして増殖された。ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−Ｓ
ＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／ＳプラスミドにおけるＤＮ
Ａ断片は、それらが予期されたＳＬＴ ＤＮＡ配列を含有していることを確認す
るためにＳＬＴのコード配列においてＴ７プロモーターからヌクレオチド２０３
まで配列化された。
【００６３】
ブラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ ＤＮＡは、Ｈｉｓ標識（６
アミノ酸）、トロンビン開裂部位（６アミノ酸）、Ｓ−標識（１５アミノ酸）を
含有する３６アミノ酸全長Ｎ−末端、全体のＳＬＴサブユニットＡ（２９３アミ
ノ酸）、エンテロキナーゼ開裂部位を含有する６アミノ酸全長連結ペプチド、及
び成熟ＶＥＧＦ１２１たんぱく質の１〜１２１アミノ酸をコードする（図１）。
プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓは、全体のＳＬＴサブユニット
ＡをコードするＤＮＡの代わりに、それがアミノ酸６２からアミノ酸２６４まで
のこのサブユニットの２０２アミノ酸断片をコードするＤＮＡを含有する以外は
、該プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌと同一である（図１）。
アミノ酸）、トロンビン開裂部位（６アミノ酸）、Ｓ−標識（１５アミノ酸）を
含有する３６アミノ酸全長Ｎ−末端、全体のＳＬＴサブユニットＡ（２９３アミ
ノ酸）、エンテロキナーゼ開裂部位を含有する６アミノ酸全長連結ペプチド、及
び成熟ＶＥＧＦ１２１たんぱく質の１〜１２１アミノ酸をコードする（図１）。
プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓは、全体のＳＬＴサブユニット
ＡをコードするＤＮＡの代わりに、それがアミノ酸６２からアミノ酸２６４まで
のこのサブユニットの２０２アミノ酸断片をコードするＤＮＡを含有する以外は
、該プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌと同一である（図１）。
【００６４】触媒作用的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉたんぱく質の発現のためのプラ スミドの構築
ｐＥＴ３２／ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬによりコードされたＳＬＴ−１Ａサブユニ
ットの部位−特異性突然変異誘発は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒTM インビトロＳｉ
ｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）を用いて行われた。２種の突然変異誘発性プライマーは、（下線が引かれ
た）３点の突然変異を導入するために明示された：Ｙ１１４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７）、及びＥ１６７Ｑ、及びＲ１７０Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
ットの部位−特異性突然変異誘発は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒTM インビトロＳｉ
ｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）を用いて行われた。２種の突然変異誘発性プライマーは、（下線が引かれ
た）３点の突然変異を導入するために明示された：Ｙ１１４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７）、及びＥ１６７Ｑ、及びＲ１７０Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
【００６５】
【００６６】
Ｙ１１４Ｓ及びＲ１７０Ｌ突然変異は２つのクローンから単離された突然変異
化ＤＮＡの配列化により確認された。Ｅ１６７Ｑ突然変異はどちらのクローンに
も検出されなかった。ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌｃｉと称される
得られたプラスミドは、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌと同一
であるが、野性型ＳＬＴサブユニットＡをコードするＤＮＡの代わりに、このサ
ブユニットの二重突然変異体（Ｙ１１４Ｓ及びＲ１７０Ｌ）をコードするＤＮＡ
を含有する（図１）。
化ＤＮＡの配列化により確認された。Ｅ１６７Ｑ突然変異はどちらのクローンに
も検出されなかった。ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌｃｉと称される
得られたプラスミドは、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌと同一
であるが、野性型ＳＬＴサブユニットＡをコードするＤＮＡの代わりに、このサ
ブユニットの二重突然変異体（Ｙ１１４Ｓ及びＲ１７０Ｌ）をコードするＤＮＡ
を含有する（図１）。
【００６７】
例 ２
組換えＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｓの融合たんぱく質の発現及び精製 Ａ．ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ Ｓたんぱく質の発現 １．Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ 及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの発現 ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／
Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（米国のＮｏ
ｖａｇｅｎ）は、融合たんぱく質の発現が対数増殖期において、又はその中点で
Ｏ．Ｄ．へのラクトース抑制物質（ｌａｃリプレッサー）により抑制される条件
下で増殖され、その後にＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド：米国
のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が加えられて、融合たんぱく質コード
ＤＮＡの発現が誘発された。
／Ｓの融合たんぱく質の発現及び精製 Ａ．ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ Ｓたんぱく質の発現 １．Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ 及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの発現 ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／
Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（米国のＮｏ
ｖａｇｅｎ）は、融合たんぱく質の発現が対数増殖期において、又はその中点で
Ｏ．Ｄ．へのラクトース抑制物質（ｌａｃリプレッサー）により抑制される条件
下で増殖され、その後にＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド：米国
のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が加えられて、融合たんぱく質コード
ＤＮＡの発現が誘発された。
【００６８】
ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／
Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の大きな回分の培養を生成するために、５０
ｍｇ／ｌのアンピシリン及び３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有する、
ＬＢブロス中の、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−
ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓのそれぞれで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐ
ＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の（約１６時間続けての）一夜培養液が、５０ｍｇ
／ｌのアンピシリン及び３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを有する、１００
ｍｌのＬＢブロスを含有するフラスコ中に１：１００に希釈された。分光光度計
（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ １０００：米国のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
）において測光されたとき、６００ｎｍでの光学濃度が０．５に到達するまで３
７℃で振り混ぜながら細胞は増殖された。
Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の大きな回分の培養を生成するために、５０
ｍｇ／ｌのアンピシリン及び３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有する、
ＬＢブロス中の、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−
ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓのそれぞれで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐ
ＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の（約１６時間続けての）一夜培養液が、５０ｍｇ
／ｌのアンピシリン及び３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを有する、１００
ｍｌのＬＢブロスを含有するフラスコ中に１：１００に希釈された。分光光度計
（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ １０００：米国のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
）において測光されたとき、６００ｎｍでの光学濃度が０．５に到達するまで３
７℃で振り混ぜながら細胞は増殖された。
【００６９】
第２工程において、１ｍＭの最終濃度にまでＩＰＴＧ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｌｏｇｉｅｓ）の添加により、融合たんぱく質の発現が誘発された。誘発
された培養は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌについて追加の３．５時間で増殖され、Ｓ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓについて追加の２時間増殖され、次に遠心分離（２５分、５
０００ｘｇ）により採取された。細胞のペレットは氷冷された緩衝液Ａ（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ＭのＭｇＣｌ2、１％Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ Ｐ４０、０．１ＭのＤＴＴ、２００ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ、２５ｍｇ／ｌの抗
トリプシン、５０ｍｇ／ｌのロイペプチン、２５ｍｇ／ｌのアプロチニン）に再
懸濁された。凍結及び解凍の５サイグル後、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレア
ーゼ）は、５０Ｕ／ｍｌまで細胞懸濁液の各々に加えられた。懸濁液は室温で２
０分間インキュベートされ、次に４℃で３０分間５，０００ｘｇで遠心単離され
た。ＩＰＴＧ誘発された細菌の可溶性分画と封入体との間での、ＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓとして示される融合たんぱく質の分布の分析は
、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質が封入体中に
存在したことを示した（図２、パネルＡ）。
ｃｈｎｌｏｇｉｅｓ）の添加により、融合たんぱく質の発現が誘発された。誘発
された培養は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌについて追加の３．５時間で増殖され、Ｓ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓについて追加の２時間増殖され、次に遠心分離（２５分、５
０００ｘｇ）により採取された。細胞のペレットは氷冷された緩衝液Ａ（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ＭのＭｇＣｌ2、１％Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ Ｐ４０、０．１ＭのＤＴＴ、２００ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ、２５ｍｇ／ｌの抗
トリプシン、５０ｍｇ／ｌのロイペプチン、２５ｍｇ／ｌのアプロチニン）に再
懸濁された。凍結及び解凍の５サイグル後、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレア
ーゼ）は、５０Ｕ／ｍｌまで細胞懸濁液の各々に加えられた。懸濁液は室温で２
０分間インキュベートされ、次に４℃で３０分間５，０００ｘｇで遠心単離され
た。ＩＰＴＧ誘発された細菌の可溶性分画と封入体との間での、ＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓとして示される融合たんぱく質の分布の分析は
、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質が封入体中に
存在したことを示した（図２、パネルＡ）。
【００７０】
封入体ペレットは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａ
Ｃｌ、５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄され、８Ｍの尿素中に溶解
化され、次に、氷冷水音波処理装置（ＦＣ１４：米国のＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）
中で５〜１０分間、その溶液は音波処理された。たんぱく質溶液は、４℃で１０
分間１４ｘｇで遠心分離することにより清澄化され、上澄液は集められ、そして
４℃で１６時間、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含有する緩衝液の１０００倍容量
に対して透析された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たん
ぱく質溶液は、１０％グリセロールで補充され、−２０℃で数アリコートで貯蔵
された。組換えたんぱく質の濃度は製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイ
キット（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
Ｃｌ、５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄され、８Ｍの尿素中に溶解
化され、次に、氷冷水音波処理装置（ＦＣ１４：米国のＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）
中で５〜１０分間、その溶液は音波処理された。たんぱく質溶液は、４℃で１０
分間１４ｘｇで遠心分離することにより清澄化され、上澄液は集められ、そして
４℃で１６時間、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含有する緩衝液の１０００倍容量
に対して透析された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たん
ぱく質溶液は、１０％グリセロールで補充され、−２０℃で数アリコートで貯蔵
された。組換えたんぱく質の濃度は製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイ
キット（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
【００７１】
２．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいてのＳＬＴ−Ｖ
ＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの発現
ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びｐＥＴ
−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞Ｏｒｉｇａｍｉ
（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（米国のＮｏｖａｇｅｎ）は融合たんぱく質の発現が対数
増殖期において又はその中点で、Ｏ．Ｄ．へのラクトース抑制物質（ｌａｃリプ
レーサー）により抑制される、条件下で増殖され、その後にＩＰＴＧ（米国のＬ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が加えられて、融合たんぱく質コードＤＮ
Ａの発現を誘発させた。
−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞Ｏｒｉｇａｍｉ
（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（米国のＮｏｖａｇｅｎ）は融合たんぱく質の発現が対数
増殖期において又はその中点で、Ｏ．Ｄ．へのラクトース抑制物質（ｌａｃリプ
レーサー）により抑制される、条件下で増殖され、その後にＩＰＴＧ（米国のＬ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が加えられて、融合たんぱく質コードＤＮ
Ａの発現を誘発させた。
【００７２】
ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ、ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ
ｃｉ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞
の大きな回分の培養を生成するために、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３４ｍｇ
／ｌのクロラムフェニコール、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン及び１５ｍ
ｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬＢブロス中の、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ
１２１−ＳＬＴ／Ｌ又はｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌｃｉ又はｐＥＴ−
ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓのそれぞれで形質転換されたＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の（約１６時間続けての）一夜培養液が、５
０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール、１２．５ｍ
ｇ／ｌのテトラサイクリン及び１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを有する、１００ｍ
ｌのＬＢブロスを含有するフラスコ中に１：１００に希釈された。分光光度計（
Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ １０００：米国のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
において測定されて、６００ｎｍでの光学濃度が０．４に到達するまで、細胞は
３７℃で振り混ぜながら増殖された。
ｃｉ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞
の大きな回分の培養を生成するために、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３４ｍｇ
／ｌのクロラムフェニコール、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン及び１５ｍ
ｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬＢブロス中の、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ
１２１−ＳＬＴ／Ｌ又はｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌｃｉ又はｐＥＴ−
ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓのそれぞれで形質転換されたＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の（約１６時間続けての）一夜培養液が、５
０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール、１２．５ｍ
ｇ／ｌのテトラサイクリン及び１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを有する、１００ｍ
ｌのＬＢブロスを含有するフラスコ中に１：１００に希釈された。分光光度計（
Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ １０００：米国のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
において測定されて、６００ｎｍでの光学濃度が０．４に到達するまで、細胞は
３７℃で振り混ぜながら増殖された。
【００７３】
第２工程において、１ｍＭの最終濃度にまでＩＰＴＧ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の添加により、融合たんぱく質発現が誘発された。誘発
された培養は、３０℃で追加の４時間で増殖され、次に遠心分離（２５分、５０
００ｘｇ）により採取された。細胞ペレットは氷冷された緩衝液Ａ（５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ＭのＭｇＣｌ2、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ
Ｐ４０、０．１ＭのＤＴＴ、２００ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ、２５ｍｇ／ｌの抗トリ
プシン、５０ｍｇ／１のロイペプチン、２５ｍｇ／ｌのアプロチニン）に再懸濁
された。凍結及び解凍の５サイクルの後、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアー
ゼ）は、５０Ｕ／ｍｌまで細胞懸濁液の各々に加えられた。懸濁液は室温で２０
分間インキュベートされ、次に、４℃で３０分間５，０００ｘｇで遠心単離され
た。ＩＰＴＧ誘発された細菌の可溶性分画と封入体との間での、ＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓとして示される融
合たんぱく質の分布の分析は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ
のこれらのたんぱく質が封入体中に存在したことを示した（ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓについて、図２、パネルＢ）。
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の添加により、融合たんぱく質発現が誘発された。誘発
された培養は、３０℃で追加の４時間で増殖され、次に遠心分離（２５分、５０
００ｘｇ）により採取された。細胞ペレットは氷冷された緩衝液Ａ（５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ＭのＭｇＣｌ2、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ
Ｐ４０、０．１ＭのＤＴＴ、２００ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ、２５ｍｇ／ｌの抗トリ
プシン、５０ｍｇ／１のロイペプチン、２５ｍｇ／ｌのアプロチニン）に再懸濁
された。凍結及び解凍の５サイクルの後、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアー
ゼ）は、５０Ｕ／ｍｌまで細胞懸濁液の各々に加えられた。懸濁液は室温で２０
分間インキュベートされ、次に、４℃で３０分間５，０００ｘｇで遠心単離され
た。ＩＰＴＧ誘発された細菌の可溶性分画と封入体との間での、ＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓとして示される融
合たんぱく質の分布の分析は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ
のこれらのたんぱく質が封入体中に存在したことを示した（ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓについて、図２、パネルＢ）。
【００７４】
封入体ペレットは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａ
Ｃｌ、５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄され、８Ｍの尿素中に溶解
化され、次に出力４０〜５０％で操作される音波処理装置ＶｉｒＳｏｎｉｃ４７
５（米国のＶｉｒＴｉｓ）において２０〜３０秒間その氷冷溶液は音波処理され
た。たんぱく質溶液は、４℃で１０分間１４，０００ｘｇで遠心分離することに
より清澄化され、上澄液は集められ、そして４℃で２時間、１０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢｒｉｊ−３５を
含有する緩衝液の１０００倍容量に対して透析され、次に、同じ緩衝液の新しい
１０００倍容量に対して４℃で１６時間透析された。この方法により得られたＳ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合
たんぱく質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特性化された（図２、パネルＣ）。ＳＬＴ
−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たん
ぱく質溶液は５％グリセロールで補充され、−７０℃で数分別量で貯蔵された。
組換えたんぱく質の濃度は、製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイキット
（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
Ｃｌ、５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄され、８Ｍの尿素中に溶解
化され、次に出力４０〜５０％で操作される音波処理装置ＶｉｒＳｏｎｉｃ４７
５（米国のＶｉｒＴｉｓ）において２０〜３０秒間その氷冷溶液は音波処理され
た。たんぱく質溶液は、４℃で１０分間１４，０００ｘｇで遠心分離することに
より清澄化され、上澄液は集められ、そして４℃で２時間、１０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢｒｉｊ−３５を
含有する緩衝液の１０００倍容量に対して透析され、次に、同じ緩衝液の新しい
１０００倍容量に対して４℃で１６時間透析された。この方法により得られたＳ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合
たんぱく質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特性化された（図２、パネルＣ）。ＳＬＴ
−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たん
ぱく質溶液は５％グリセロールで補充され、−７０℃で数分別量で貯蔵された。
組換えたんぱく質の濃度は、製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイキット
（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
【００７５】
Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおけるＶＥＧＦ１２１の
発現
ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞ＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳは増殖され、ＶＥＧＦ１２１として示される組換えＶＥＧＦの発
現が上に記載された条件下に誘発された。組換えＶＥＧＦ１２１は上に記載され
たとおりにして封入体から回収れれ、そして上澄み液は、４℃で１６時間１０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液の
１０００倍容量に対して透析された。ＶＥＧＦ１２１たんぱく質溶液は１０％グ
リセロールで補充され、そして−２０℃で数分別量で貯蔵された。組換えＶＥＧ
Ｆ１２１たんぱく質の濃度は製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイキット
（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
３）ｐＬｙｓＳは増殖され、ＶＥＧＦ１２１として示される組換えＶＥＧＦの発
現が上に記載された条件下に誘発された。組換えＶＥＧＦ１２１は上に記載され
たとおりにして封入体から回収れれ、そして上澄み液は、４℃で１６時間１０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液の
１０００倍容量に対して透析された。ＶＥＧＦ１２１たんぱく質溶液は１０％グ
リセロールで補充され、そして−２０℃で数分別量で貯蔵された。組換えＶＥＧ
Ｆ１２１たんぱく質の濃度は製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイキット
（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
【００７６】
例 ３
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質の生化学的活性
Ａ．無細胞たんぱく質合成に対するＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ ／Ｓ融合たんぱく質の阻止作用 たんぱく質合成を阻止するための、上に得られたＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ組換え体融合たんぱく質能力は核分解酵素処理されたウサギ
網状赤血球溶解産物（米国のＰｒｏｍｅｇａ）においての無細胞たんぱく質合成
を測定するインビトロアッセイで試験された。５μｌのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ、ＶＥＧＦ１２１溶液、又は１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、
１５０ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭの尿素、１０％グリセロールを含有する貯蔵緩衝
液は１８μｌのウサギ網状赤血球溶解産物、１ｍＭのアミノ酸完全混合体、９０
ｍＭのＫＣｌ、及び１アッセイ当たり０．５μｇの蛍ルシフェラーゼ（発光酵素
）を含んでいる２０μｌの反応混合物に、氷上で加えられた。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの最終濃度は１００ｎＭであり、ＶＥＧＦ１２１の
最終濃度は１０００ｎＭであった。適用量依存性実験におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの最終濃度は図３、パ
ネルＢにおいて示されるとおりであった。３０℃で９０分のインキュベーション
後、反応混合物は、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する水で２０倍容量に希釈し、
そして２μｌの各々の混合物は、製造会社の説明書に従ってＬｕｍｉＯｎｅルミ
ノメーター（輝度計）（米国のＢｉｏｓｃａｎ，Ｉｎｃ．）を用いてルシフェラ
ーゼ反応緩衝液（米国のＰｒｏｍｅｇａ）において蛍ルシフェラーゼ活性につい
てアッセイされた。１００ｎＭのＶＥＧＦ１２１を含有する対照反応液のルシフ
ェラーゼ活性が１００％として採用された。
Ａ．無細胞たんぱく質合成に対するＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ ／Ｓ融合たんぱく質の阻止作用 たんぱく質合成を阻止するための、上に得られたＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ組換え体融合たんぱく質能力は核分解酵素処理されたウサギ
網状赤血球溶解産物（米国のＰｒｏｍｅｇａ）においての無細胞たんぱく質合成
を測定するインビトロアッセイで試験された。５μｌのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ、ＶＥＧＦ１２１溶液、又は１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、
１５０ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭの尿素、１０％グリセロールを含有する貯蔵緩衝
液は１８μｌのウサギ網状赤血球溶解産物、１ｍＭのアミノ酸完全混合体、９０
ｍＭのＫＣｌ、及び１アッセイ当たり０．５μｇの蛍ルシフェラーゼ（発光酵素
）を含んでいる２０μｌの反応混合物に、氷上で加えられた。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの最終濃度は１００ｎＭであり、ＶＥＧＦ１２１の
最終濃度は１０００ｎＭであった。適用量依存性実験におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの最終濃度は図３、パ
ネルＢにおいて示されるとおりであった。３０℃で９０分のインキュベーション
後、反応混合物は、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する水で２０倍容量に希釈し、
そして２μｌの各々の混合物は、製造会社の説明書に従ってＬｕｍｉＯｎｅルミ
ノメーター（輝度計）（米国のＢｉｏｓｃａｎ，Ｉｎｃ．）を用いてルシフェラ
ーゼ反応緩衝液（米国のＰｒｏｍｅｇａ）において蛍ルシフェラーゼ活性につい
てアッセイされた。１００ｎＭのＶＥＧＦ１２１を含有する対照反応液のルシフ
ェラーゼ活性が１００％として採用された。
【００７７】
１００ｎＭの濃度でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合た
んぱく質は、対照の０．０１％及び１．２％の水準にたんぱく質合成を阻止した
（図３、パネルＡ）。比較のために１０００ｎＭほどの高さの濃度での組換えＶ
ＥＧＦ１２１たんぱく質は、対照の４８％の水準にたんぱく質合成を阻止した（
図３、パネルＡ）。適用量依存性実験は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−Ｖ
ＥＧＦ／Ｓがそれぞれ、０．０４ｎＭ及び２ｎＭの濃度で９０％だけたんぱく質
合成を阻止し、一方では、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはたんぱく質合成を阻止し
なかった。（図３、パネルＣ）。
んぱく質は、対照の０．０１％及び１．２％の水準にたんぱく質合成を阻止した
（図３、パネルＡ）。比較のために１０００ｎＭほどの高さの濃度での組換えＶ
ＥＧＦ１２１たんぱく質は、対照の４８％の水準にたんぱく質合成を阻止した（
図３、パネルＡ）。適用量依存性実験は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−Ｖ
ＥＧＦ／Ｓがそれぞれ、０．０４ｎＭ及び２ｎＭの濃度で９０％だけたんぱく質
合成を阻止し、一方では、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはたんぱく質合成を阻止し
なかった。（図３、パネルＣ）。
【００７８】
Ｂ．ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｓ融合たんぱく質により細胞ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化の
誘発
細胞ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化を誘発するための、上で得ら
れたＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｓ組換え体融合たんぱく質の能力は、２９３／ＫＤＲ細胞として示されるＫＤＲ
／ｆｌｋ−１で安定に形質移入された２９３細胞を用いて試験された。ウエル当
たり約５０，０００の２９３／ＫＤＲ細胞は、１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅ
ｍｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）中に２４個のウエルの平板上に平板培養され、そして３７℃，５％Ｃ
Ｏ2で一夜インキュベートされた。次の日に、細胞は燐酸塩緩衝化塩水で１度洗
浄され、そして３７℃で４時間無血清ＤＭＥＭに移された。次に培地は、０．１
ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、
２５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２で補充された無血清ＤＭＥＭに変えられ、そ
して細胞は３７℃で２０分間インキュベートされ、次に４℃で２０分間インキュ
ベートされた。次に細胞は４℃で１時間ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、又はＳＬＴ−Ｖ
ＥＧＦ／Ｌｃｉ、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ、又はＶＥＧＦ１２１でインキュベ
ートされ、次に３７℃で８分間インキュベートされた。次に細胞は、０．１ｍＭ
のオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷燐酸塩緩衝化塩水で１度リンスさ
れ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、２．５％のＳＤＳ、７．５％
のグリセロール、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＤＴＴ、０．０２５％のブロム
フェノールブルーを含有するサンプル緩衝液に可溶化され、そしてウエスタンブ
ロット法により分析された。細胞たんぱく質は、７．５％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分別化され、製造者により記載されたとおりにしてセミ−ドライシス
テム２１１７ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ（スェーデンのＬＫＢ）を用いてニト
ロセルロース（米国のＢｉｏＲａｄ）に移された。製造会社の説明書に従って、
１：２０００の希釈で抗−ホスホチロシンＲＣ２０：ＨＲＰ共役体（米国のＴｒ
ａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂ）を用いて処理され且つ精査された。化学発光を
ベースとするシステム（ＥＣＬ：米国のＡｍｅｒｓｈａｍ）はバンド検出のため
に用いられた。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、ＶＥＧＦ１２１と同じ濃度範囲で適用量依存性方法
でＫＤＲ／ｆｌｋ−１チロシン燐酸化を誘発した（図４）。
れたＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｓ組換え体融合たんぱく質の能力は、２９３／ＫＤＲ細胞として示されるＫＤＲ
／ｆｌｋ−１で安定に形質移入された２９３細胞を用いて試験された。ウエル当
たり約５０，０００の２９３／ＫＤＲ細胞は、１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅ
ｍｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）中に２４個のウエルの平板上に平板培養され、そして３７℃，５％Ｃ
Ｏ2で一夜インキュベートされた。次の日に、細胞は燐酸塩緩衝化塩水で１度洗
浄され、そして３７℃で４時間無血清ＤＭＥＭに移された。次に培地は、０．１
ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、
２５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２で補充された無血清ＤＭＥＭに変えられ、そ
して細胞は３７℃で２０分間インキュベートされ、次に４℃で２０分間インキュ
ベートされた。次に細胞は４℃で１時間ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、又はＳＬＴ−Ｖ
ＥＧＦ／Ｌｃｉ、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ、又はＶＥＧＦ１２１でインキュベ
ートされ、次に３７℃で８分間インキュベートされた。次に細胞は、０．１ｍＭ
のオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷燐酸塩緩衝化塩水で１度リンスさ
れ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、２．５％のＳＤＳ、７．５％
のグリセロール、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＤＴＴ、０．０２５％のブロム
フェノールブルーを含有するサンプル緩衝液に可溶化され、そしてウエスタンブ
ロット法により分析された。細胞たんぱく質は、７．５％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分別化され、製造者により記載されたとおりにしてセミ−ドライシス
テム２１１７ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ（スェーデンのＬＫＢ）を用いてニト
ロセルロース（米国のＢｉｏＲａｄ）に移された。製造会社の説明書に従って、
１：２０００の希釈で抗−ホスホチロシンＲＣ２０：ＨＲＰ共役体（米国のＴｒ
ａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂ）を用いて処理され且つ精査された。化学発光を
ベースとするシステム（ＥＣＬ：米国のＡｍｅｒｓｈａｍ）はバンド検出のため
に用いられた。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、ＶＥＧＦ１２１と同じ濃度範囲で適用量依存性方法
でＫＤＲ／ｆｌｋ−１チロシン燐酸化を誘発した（図４）。
【００７９】
例 ４
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質の細胞毒性及び
細胞増殖抑制作用 Ａ．ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつある内皮細胞に対す る及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現しない増殖しつつある内皮細胞に対 するＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ及びＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｓ融合たんぱく質の作用 増殖しつつある内皮細胞に作用するための、上で得られたＶＥＧＦ−ＳＬＴ／
Ｌ及びＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｓ融合たんぱく質の能力は、（ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞と
して示される）ＫＤＲ／ｆｌｋ−１で安定にＤＮＡ感染されたブタ大動脈内皮細
胞及び（ＰＡＥ／Ｖ細胞として示される）エンプテイベクターで安定にＤＮＡ感
染されたブタ大動脈内皮細胞を用いて試験された。ウエル当たり約５，０００細
胞は、１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅｍｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥ
Ｍ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において２４個のウエルの平
板上で平板培養され、そして３７℃，５％ＣＯ2で一夜インキュベートされた。
次の日に、培地は、１０％ウシ胎児血清及び０．０７８ｎＭ〜２．５ｎＭの最終
濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓで補充された新しいＤＭ
ＥＭに変えられた。平板は３７℃，５％ＣＯ2で７２時間インキュベートされた
。インキュベーションの後に、ウエルは燐酸塩緩衝化塩水で洗浄され、細胞はト
リプシン溶液（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離され、そし
て製造会社の説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（米国のＣｏｕｌ
ｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ
及びＳＬＴ−ＶＧＥＦ／Ｓ融合たんぱく質は、ＩＣ50〜０．１５ｎＭを有する適
用量依存方法でＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を阻止し、一方ではＫＤＲ／ｆｌｋ−
１受容体を発現しないＰＡＥ／Ｖの増殖は影響されなかった（図５）。低いナノ
モル濃度範囲で、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ−／Ｌたんぱく質は細胞毒性であって、２．
５ｎＭほどの低さの濃度に一夜さらした後に実質的にすべてのＰＡＥ／ＫＤＲ細
胞を死滅させた。対照的に、低いナノモルの濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱ
く質は２．５ｎＭの濃度でわずかに死滅させた細胞を有して、ほとんど細胞増殖
抑制の状態にあった。
細胞増殖抑制作用 Ａ．ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつある内皮細胞に対す る及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現しない増殖しつつある内皮細胞に対 するＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ及びＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｓ融合たんぱく質の作用 増殖しつつある内皮細胞に作用するための、上で得られたＶＥＧＦ−ＳＬＴ／
Ｌ及びＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｓ融合たんぱく質の能力は、（ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞と
して示される）ＫＤＲ／ｆｌｋ−１で安定にＤＮＡ感染されたブタ大動脈内皮細
胞及び（ＰＡＥ／Ｖ細胞として示される）エンプテイベクターで安定にＤＮＡ感
染されたブタ大動脈内皮細胞を用いて試験された。ウエル当たり約５，０００細
胞は、１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅｍｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥ
Ｍ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において２４個のウエルの平
板上で平板培養され、そして３７℃，５％ＣＯ2で一夜インキュベートされた。
次の日に、培地は、１０％ウシ胎児血清及び０．０７８ｎＭ〜２．５ｎＭの最終
濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓで補充された新しいＤＭ
ＥＭに変えられた。平板は３７℃，５％ＣＯ2で７２時間インキュベートされた
。インキュベーションの後に、ウエルは燐酸塩緩衝化塩水で洗浄され、細胞はト
リプシン溶液（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離され、そし
て製造会社の説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（米国のＣｏｕｌ
ｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ
及びＳＬＴ−ＶＧＥＦ／Ｓ融合たんぱく質は、ＩＣ50〜０．１５ｎＭを有する適
用量依存方法でＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を阻止し、一方ではＫＤＲ／ｆｌｋ−
１受容体を発現しないＰＡＥ／Ｖの増殖は影響されなかった（図５）。低いナノ
モル濃度範囲で、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ−／Ｌたんぱく質は細胞毒性であって、２．
５ｎＭほどの低さの濃度に一夜さらした後に実質的にすべてのＰＡＥ／ＫＤＲ細
胞を死滅させた。対照的に、低いナノモルの濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱ
く質は２．５ｎＭの濃度でわずかに死滅させた細胞を有して、ほとんど細胞増殖
抑制の状態にあった。
【００８０】
触媒的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ融合たんぱく質はＰＡＥ／ＫＤＲ
及びＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に影響せず（図５、パネルＣ）、このことはＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの細胞毒性及び細胞増殖抑制作用は、Ｓ
ＬＴ部分のリボソーム不活性化活性に起因していることを示している。
及びＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に影響せず（図５、パネルＣ）、このことはＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの細胞毒性及び細胞増殖抑制作用は、Ｓ
ＬＴ部分のリボソーム不活性化活性に起因していることを示している。
【００８１】
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌの細胞毒性活性は、ＤＮＡ断片化及び −ホドリンの開
裂のようなアポトーシスのホールマークにより判断されるようにＰＡＥ／ＫＤＲ
細胞におけるアポトーシスの迅速な誘発において、自ずから明白である（図６）
。アポトーシス性ＤＮＡ断片化を検出するために、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は、２ｘ
１０5細胞／ウエルの密度で６個のウエルの平板上に平板培養され、そして２４
時間後に、５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた。示された時間の後に、
ＤＮＡは細胞溶解産物から分離され、そして１．５％アガロースゲル上で分別化
された。１５０ｋＤａ及び１２０ｋＤａ断片への ｋＤａ −ホドリンの開裂を
検出するために、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は、４ｘ１０4細胞／ウエルの密度で２４
個のウエルの平板上で平板培養され、２０時間後に示された時間にわたって２．
５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた。 −ホドリン及びその断片は抗−
−ホドリン抗体（米国のＣｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、処理された細胞の溶解
産物のウエスタンブロット分析により検出された。
裂のようなアポトーシスのホールマークにより判断されるようにＰＡＥ／ＫＤＲ
細胞におけるアポトーシスの迅速な誘発において、自ずから明白である（図６）
。アポトーシス性ＤＮＡ断片化を検出するために、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は、２ｘ
１０5細胞／ウエルの密度で６個のウエルの平板上に平板培養され、そして２４
時間後に、５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた。示された時間の後に、
ＤＮＡは細胞溶解産物から分離され、そして１．５％アガロースゲル上で分別化
された。１５０ｋＤａ及び１２０ｋＤａ断片への ｋＤａ −ホドリンの開裂を
検出するために、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は、４ｘ１０4細胞／ウエルの密度で２４
個のウエルの平板上で平板培養され、２０時間後に示された時間にわたって２．
５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた。 −ホドリン及びその断片は抗−
−ホドリン抗体（米国のＣｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、処理された細胞の溶解
産物のウエスタンブロット分析により検出された。
【００８２】
Ｂ．低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞に対する及び休止内
皮細胞に対するＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ融合たんぱく質の作用
正常な血管系における内皮細胞は低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現す
る。潜在的なネガティブな副作用を最小にするために、有用な毒素−ＶＥＧＦ融
合たんぱく質は、正常な血管系を構成する、低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体
の内皮細胞に対して又は休止内皮細胞に対して毒性であってはならない。低い数
のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞に作用するための、上に得られ
たＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ融合たんぱく質の能力は、細胞当たり３０，０００〜５
０，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現するヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細
胞、細胞当たり〜５，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現するＰＡＥ／ＫＤ
Ｒlowブタ大動脈内皮細胞、及び細胞当たり〜２０，０００ＶＥＧＦＲ−２を発
現するＭＳＩネズミ内皮細胞を用いて試験された。ＨＵＶＥ、ＰＡＥ／ＫＤＲlo w 、及びＭＳＩ細胞は５〜１０ｘ１０3細胞／ウエルの密度で２４個のウエルの平
板上で平板培養され、そして２０時間後に２．５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌに
さらされた。平板は３７℃，５％ＣＯ2で７２時間インキュベートされた。イン
キュベーション時間後に、ウエルは燐酸塩緩衝化塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、細
胞はトリプシン溶液（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離され
、そして製造会社の説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（米国のＣ
ｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｌ融合たんぱく質は、増殖しつつあるヒトＨＵＶＥ、ネズミＭＳＩ、及びブ
タＰＡＥ／ＫＤＲlow内皮細胞に作用せず、このことは高い水準のＫＤＲ／ｆｌ
ｋ−１受容体発現だけが、内皮細胞に対してＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ融合たんぱく
質に感受性を与えることができることを示している（図７、パネルＡ）。
る。潜在的なネガティブな副作用を最小にするために、有用な毒素−ＶＥＧＦ融
合たんぱく質は、正常な血管系を構成する、低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体
の内皮細胞に対して又は休止内皮細胞に対して毒性であってはならない。低い数
のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞に作用するための、上に得られ
たＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ融合たんぱく質の能力は、細胞当たり３０，０００〜５
０，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現するヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細
胞、細胞当たり〜５，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現するＰＡＥ／ＫＤ
Ｒlowブタ大動脈内皮細胞、及び細胞当たり〜２０，０００ＶＥＧＦＲ−２を発
現するＭＳＩネズミ内皮細胞を用いて試験された。ＨＵＶＥ、ＰＡＥ／ＫＤＲlo w 、及びＭＳＩ細胞は５〜１０ｘ１０3細胞／ウエルの密度で２４個のウエルの平
板上で平板培養され、そして２０時間後に２．５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌに
さらされた。平板は３７℃，５％ＣＯ2で７２時間インキュベートされた。イン
キュベーション時間後に、ウエルは燐酸塩緩衝化塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、細
胞はトリプシン溶液（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離され
、そして製造会社の説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（米国のＣ
ｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧ
Ｆ／Ｌ融合たんぱく質は、増殖しつつあるヒトＨＵＶＥ、ネズミＭＳＩ、及びブ
タＰＡＥ／ＫＤＲlow内皮細胞に作用せず、このことは高い水準のＫＤＲ／ｆｌ
ｋ−１受容体発現だけが、内皮細胞に対してＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ融合たんぱく
質に感受性を与えることができることを示している（図７、パネルＡ）。
【００８３】
休止（静止）内皮細胞に作用するための、上で得られたＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ
融合たんぱく質の能力は、休止ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を用いて試験された。ウエル
当たり約５，０００のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅｍ
ｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）中で、２４個のウエルの平板上で平板培養され、そして３７℃，５％Ｃ
Ｏ2でインキュベートされた。約１週間後に細胞は集密化状態に達し、そしてさ
らに３日間、休止（静止）状態として維持された。その後に、培地は、１０％の
ウシ胎児血清及び２０ｎＭの最終濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌで補充された新し
いＤＭＥＭに変えられた。平板は３７℃，５％ＣＯ2で７２時間インキュベート
された。比較のために増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲは５分間２０ｎＭのＳＬＴ
−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた；次に新しい培養地に移され、そして７２時間後に
計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質は７２時間露出後でさえ、休止Ｐ
ＡＥ／ＫＤＲ内皮細胞に作用せず、一方では５分間のさらされた後でさえ、増殖
しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲに劇的に作用した。
融合たんぱく質の能力は、休止ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を用いて試験された。ウエル
当たり約５，０００のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅｍ
ｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）中で、２４個のウエルの平板上で平板培養され、そして３７℃，５％Ｃ
Ｏ2でインキュベートされた。約１週間後に細胞は集密化状態に達し、そしてさ
らに３日間、休止（静止）状態として維持された。その後に、培地は、１０％の
ウシ胎児血清及び２０ｎＭの最終濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌで補充された新し
いＤＭＥＭに変えられた。平板は３７℃，５％ＣＯ2で７２時間インキュベート
された。比較のために増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲは５分間２０ｎＭのＳＬＴ
−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた；次に新しい培養地に移され、そして７２時間後に
計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質は７２時間露出後でさえ、休止Ｐ
ＡＥ／ＫＤＲ内皮細胞に作用せず、一方では５分間のさらされた後でさえ、増殖
しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲに劇的に作用した。
【００８４】参考文献
・Ａｉｅｌｌｏ，Ｌ．Ｐ．、Ｎｏｒｔｈｒｕｐ，Ｊ．Ｍ．、Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ
．、 Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．及びＩｗａｍｏｔｏ，Ｍ．Ａ．（１９９５）によ
るＡｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１３，１５３８−１５４４
（網膜細胞における血管内皮成長因子の低酸素調節）。
・Ａｌ−Ｊａｕｆｙ，Ａ．Ｙ．、Ｈａｄｄａｄ，Ｊ．Ｅ．、Ｋｉｎｇ，Ｓ．
Ｒ．、ＭｃＰｈｅｅ，Ｒ．Ａ．及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．（１９９４）
によるＩｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．，６２，９５６−９６０
（ヒト免疫不全ウイルス感染細胞に対する志賀毒素（シガトキシン）Ａサブ
ユニット−
ＣＤ４融合たんぱく質の細胞毒性）。
・Ａｌ−Ｊａｕｆｙ，Ａ．Ｙ．、Ｋｉｎｇ，Ｓ．Ｒ．及びＪａｃｋｓｏｎ，
Ｍ．Ｐ．（１９９５）によるＩｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．６３，
３０７３−３０７８（ヒト免疫不全ウイルス感染細胞に対する志賀毒素（シ
ガトキシン）Ａサブユニット−ＣＤ４融合たんぱく質毒性の精製及び特性化
）。
・Ａｒｏｒａ，Ｎ．、Ｍａｏｏｄ，Ｒ．、Ｚｈｅｎｇ，Ｔ．、Ｃａｉ，Ｊ．、
Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．及びＧｉｌｌ，Ｐ．Ｓ．（１９９９）による
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９，１８３−１８８（血管内皮成長因子キメラ
毒素は内皮細胞に対して高度に活性である）。
・Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．、Ｃｈｅｎ，Ｄ．、Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｙ．、
Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｍ．、Ｒｏｓｓｏｗ，Ｓ．、Ｐａｓｓｅｒｉ，Ｊ．、
Ｓｙｍｅｓ，Ｊ．Ｆ．及びＩｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）による
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４，３２９１〜３３０２
（ｐｈＶＥＧＦ１６５遺伝子伝達後の内皮完全性及び内皮依存性機能の
促進された復旧）。
・Ｂｉｋｆａｌｖｉ，Ａ．、Ｓａｕｚｅａｕ，Ｃ．、Ｍｏｕｋａｄｒｉ，
Ｈ．、Ｍａｃｌｏｕｆ，Ｊ．、Ｂｕｓｓｏ，Ｎ．、Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ，
Ｍ．、Ｐｌｏｕｅｔ，Ｊ．及びＴｏｂｅｌｅｍ，Ｇ．（１９９１）による
Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４９，５０−５９
（ヒト臍静脈内皮細胞との血管トロピン／血管内皮細胞成長因子の相互作用
：結合、取り込み、分解及び生物学的作用）。
・Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．、Ｂｅｒｓｅ，Ｂ．、Ｊａｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、
Ｔｏｇｎａｚｚｉ，Ｋ．、Ｇｕｉｄｉ，Ａ．Ｊ．、Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．
、 Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ｌ．及び
Ｓｃｈｎｉｔｔ，Ｓ．Ｊ（１９９５）によるＨｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，
２６，８６−９１（乳癌における血管透過性因子（血管内皮成長因子）及び
その受容体の発現）。
・Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．、Ｂｅｒｓｅ，Ｂ．、Ｊａｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、
Ｔｏｇｎａｚｚｉ，Ｋ．、Ｍａｎｓｅａｕ，Ｅ．Ｊ．、Ｄｖｏｒａｋ，
Ｈ．Ｆ．及びＳｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９３）による
Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４３，１２５５−１２６２（腎臓及び膀胱癌
における血管透過因子（血管内皮成長因子）及びその受容体の増大した
発現）。
・Ｃａｏ，Ｃ．、Ｋｕｒａｚｏｎｏ，Ｈ．、Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｓ．、
Ｋａｓｈｉｗａｇｉ，Ｋ．、Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｋ．及びＴａｋｅｄａ，
Ｙ．（１９９４）によるＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３８，
４４１−４４７（Ｅ．ｃｏｌｉの非毒性ベロトキシン２変異体（ＶＴ２
ｖｐ１）のための突然変異遺伝子の構築及び精製された突然変異体毒素の
特性化）。
・Ｃｌａｆｆｅｙ，Ｋ．Ｐ．及びＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９６）
によるＣａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．，１５，１６５−１７６
（腫瘍及び転移増殖及び転移についての因果関係）。
・Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．、Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｍ．、Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃ
ｈｅｒ，Ｂ．、Ｃｈｅｎ，Ｄ．、Ｍｕｒｏｈａｒａ，Ｔ．、Ｌｏｓｏｒｄｏ
，Ｄ．Ｗ．、Ｓｙｍｅｓ，Ｊ．及びＩｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）に
よるＡｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０，１６７３−１６８５
（正常な及び動脈硬化性ヒト動脈における血管内皮成長因子／血管透過性
因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ））。
・Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚ，．Ｌ．、Ａｕｓｔｉｎ，Ｐ．Ｒ．、及び
Ｈｏｖｄｅ，Ｃ．Ｊ．（１９９３）によるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，
２４１，４６７−４７３（志賀毒素様毒素ＩＡ−鎖の酵素活性におけるチロ
シン−１１４の役割）。
・Ｄｅｔｍａｒ，Ｍ．、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．、Ｃｌａｆｆｅｙ，Ｋ．Ｐ．、
Ｙｅｏ，Ｋ．Ｔ．、Ｋｏｈｅｒ，Ｏ．、Ｊａｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、
Ｂｅｒｓｅ，Ｂ．及びＤｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．（１９９４）による
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０，１１４１−１１４６（乾癬における血管透
過性因子／血管内皮成長因子及びその受容体の過度発現）。
・Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）によるＮａｔｕｒｅ，Ｍｅｄ．，１，
２７−３１（癌、血管、リウマチ疾患及び他の疾患における血管形成）。
・Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．及びＳｈｉｎｇ，Ｙ．（１９９２）による
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０９３１−１０９３４（血管形成）
。
・Ｈａｄｄａｄ，Ｊ．Ｅ．、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ，Ａ．Ｙ．及びＪａｃｋｓｏｎ
，Ｍ．Ｐ．（１９９３）によるＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，
４９７０−４９７８（酵素活性のために必要とされる志賀毒素（シガトキシ
ン）Ａサブユニットの最小領域）。
・Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９９７）によるＳｃｉｅｎｃｅ，２７７，
４８−６０（血管形態形成及び維持の信号）。
・Ｉｏｒｄａｎｏｖ，Ｍ．Ｓ．、Ｐｒｉｂｎｏｗ，Ｄ．、Ｍａｇｕｎ，Ｊ．
Ｌ．、Ｄｉｎｈ，Ｔ．Ｈ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．
及びＭａｇｕｎ，Ｂ．Ｅ．（１９９７）によるＭｅｄ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，１７，３３７３−３３８１（リボ毒性ストレス応答：２８Ｓ
ｒＲＮＡにおけるペプチジルトランスフェラーゼ応答の阻害剤により及び
α−サルシン／リシンループに対する配列特異性ＲＮＡ損傷によりストレス
活性化たんぱく質キナーゼＪＮＫ１の活性化）。
・Ｋａｐｌａｎ，Ｂ．Ｓ．、Ｃｌｅａｒｙ，Ｔ．Ｇ．及びＯｂｒｉｇ，Ｔ．
Ｇ．（１９９０）によるＰｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，４，２７６−
２８３（溶血性尿毒症症候群の病因を理解するにあたっての最近の進歩）。
・Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．、Ｌｉ，Ｂ．、Ｗｉｎｅｒ，Ｊ．、Ａｒｍａｎｉｎｉ，
Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｎ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｓ．及び
Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．（１９９３）によるＮａｔｕｒｅ（ロンドン），
３６２，８４１−８４４（血管内皮成長因子誘発された血管形成の阻止は
インビボにおける腫瘍増殖を抑制する）。
・Ｍｉｌｌａｕｅｒ，Ｂ．、Ｓｈａｗｖｅｒ，Ｌ．Ｋ．、Ｐｌａｔｅ，Ｋ．
Ｈ．、Ｒｉｓａｕ，Ｗ．及びＵｌｒｉｃｈ，Ａ．（１９９４）による
Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン），３６７，５７６−５７９（優性−陰性Ｆｌｋ−
１突然変異体によりインビボにおいて阻止された神経膠芽細胞の増殖）。
・Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．、Ｇｅｎｇｒｉｎｏｖｉｔｃｈ，
Ｓ．及びＰｏｌｔｏｒａｋ，Ｚ．（１９９９）によるＦＡＳＥＢ Ｊ．，
１３，９−２２。
・Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．、Ｔｅｓｓｌｅｒ，Ｓ．、Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎ，
Ｈ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．及びＬｅｖｉ，Ｂ．Ｚ．（１９９４）による
Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．，５，８９−９７
（血管内皮成長因子及びその受容体）。
・Ｏｂｒｉｇ，Ｔ．Ｇ．、Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ，Ｐ．Ｊ．、
Ｋａｒｍａｌｉ，Ｍ．Ａ．、Ｐｅｔｒｉｃ，Ｍ．、Ｍｏｒａｎ，Ｔ．Ｐ．
及びＪｕｄｇｅ，Ｔ．Ｋ．（１９８７）によるＬａｎｃｅｔ ２，６８７
（溶血性尿毒症症候群の病因論）。
・Ｏｂｒｉｇ，Ｔ．、Ｌｏｕｉｓｅ，Ｃ．、Ｌｉｎｇｗｏｏｄ，Ｃ．、
Ｂｏｙｄ，Ｂ．、Ｂａｒｌｅｙ−Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｌ．及びＤａｎｉｅｌ，
Ｔ．（１９９３）によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１５４８４−
１５４８８（志賀毒素（シガトキシン）受容体及び応答における内皮不均質
性）。
・Ｏｌｓｎｅｓ，Ｓ．、Ｒｅｉｓｂｉｇ，Ｒ．及びＥｉｋｌｉｄ，Ｋ．
（１９８１）によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，４８７３２−
８７３８（赤痢菌細胞毒素のサブユニットの構造）。
・Ｏｌｓｏｎ，Ｔ．Ａ．、Ｍｏｈａｎｒａｊ，Ｄ．、Ｒｏｙ，Ｓ．及び
Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．（１９９７）によるＩｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，７３，８６５−８７０（血管内皮成長因子−毒素共役体に
よる腫瘍及び転移増殖の阻止）。
・Ｐｌａｔｅ，Ｋ．Ｈ．、Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ．、Ｍｉｌｌａｕｅｒ，Ｂ．、
Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．及びＲｉｓａｕ，Ｗ．（１９９３）による
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，５８２２−５８２７（腫瘍血管形成のラッ
ト神経膠腫モデルにおける血管内皮成長因子及びその同系受容体のアップレ
ギュレーション）。
・Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．、Ｏｌａｏｎ，Ｔ．Ａ．、Ｂａｕｃｈ，
Ｖ．Ｌ．及びＭｏｈａｎｒａｊ，Ｄ．（１９９６）による
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，１３２４−１３３０（血管内皮成長因子−
毒素共役体はインビトロにおける血管形成を特異的に阻止する）。
・Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．、Ｋａｒｍａｌｉ，Ｍ．Ａ．、
Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌ．Ｅ．及びＳｍｉｔｈ，Ｃ．Ｒ．（１９８８）による
Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９，１１０２−１１０８（ベロ細胞毒素生成性
Ｅ．ｃｏｌｉ感染に伴う溶血性尿毒症症候群の組織病理学）。
・Ｓａｌｅｈ，Ｍ．、Ｓｔａｃｋｅｒ，Ｓ．Ａ．及びＷｉｌｋｓ，Ａ．Ｆ．
（１９９６）によるＣａｎｃｅｒ，Ｒｅｓ．，５６，３９３−４０１
（アンチセンス血管内皮成長因子配列の発現によりインビボにおいてＣ６
神経膠腫細胞の増殖の阻止）。
・Ｓａｘｅｎａ，Ｓ．Ｋ．、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ａ．Ｄ．及びＡｃｋｅｒｍａｎ
，Ｅ．Ｊ．（１９８９）によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，５９６
−６０１（志賀毒素（シガトキシン）、志賀毒素様毒素ＩＩ変異体、及びリ
シンはすべてＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに微小注入された場合の２８
Ｓ ＲＮＡの単点ＲＮＡ Ｎ−グルコシダーゼである）。
・Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．及びＤｏｕｇｈｅｒ−Ｖｅｒｍａｚｅｎ，Ｍ．
（１９９６）によるＣａｎｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．，１５，１５９−
１６３（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ受容体の生物学的性質）。
・Ｖｅｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．、Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ，
Ａ．及びＢｌａｚｚａｒ，Ｂ．Ｒ．（１９９７）によるＰｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．，１０，１０７１−１０７６（腎臓機能不全はＤＴ３９０抗−
ＣＤ３ｓＦｖ、潜在的新組換え抗−ＧＶＨＤ免疫毒素の適用量制限性を説明
する）。
・Ｖｅｉｋｋｏｌａ，Ｔ．及びＡｌｉｔａｌｏ，Ｋ．（１９９９）による
Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，９，２１１−２２０
（受容体及び血管形成）。
【図１】
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、触媒的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、及びＳ
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の概要表現図である。
ＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の概要表現図である。
【図２】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の発現、各々の宿主から単離された封入体におけるそれ
らの蓄積を例示する。
３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−
ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の発現、各々の宿主から単離された封入体におけるそれ
らの蓄積を例示する。
【図３】
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が無細胞翻訳系に
おいてたんぱく質合成を阻止することを例示する。
おいてたんぱく質合成を阻止することを例示する。
【図４】
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ
たんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−受容体を過度に発現する細胞（２９３／ＫＤＲ
）において、ＶＥＧＦのためのＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化を誘
発することを例示する。
たんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−受容体を過度に発現する細胞（２９３／ＫＤＲ
）において、ＶＥＧＦのためのＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化を誘
発することを例示する。
【図５】
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌ
ｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を標的化する
（中が白い円形）が、しかしｆｌｋ−１受容体を発現しない対照のＰＡＥ／Ｖ細
胞に影響しない（中が黒い円形）ことを例示する。
ｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を標的化する
（中が白い円形）が、しかしｆｌｋ−１受容体を発現しない対照のＰＡＥ／Ｖ細
胞に影響しない（中が黒い円形）ことを例示する。
【図６】
ＤＮＡ分解（パネルＡ）及びα−ホドリンの開裂（パネルＢ）により判断され
るように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／融合たんぱく質はＰＡＴ／ＫＤＲ細胞におけるア
ポトーシスを迅速に活性化することを例示する。
るように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／融合たんぱく質はＰＡＴ／ＫＤＲ細胞におけるア
ポトーシスを迅速に活性化することを例示する。
【図７】
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質が低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体（パネ
ルＡ）及び休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（パネルＢ）を有する内皮細胞を標
的としないことを例示する。
ルＡ）及び休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（パネルＢ）を有する内皮細胞を標
的としないことを例示する。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 35/02
35/00 35/04
35/02 43/00 １０５
35/04 １１１
43/00 １０５ １２１
１１１ Ｃ０７Ｋ 14/25
１２１ 14/52
Ｃ０７Ｋ 14/25 19/00
14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15
19/00 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02
1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
5/10 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＪＰ
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA38 CA04 CA07
DA06 EA04 GA11 HA01
4B063 QA01 QQ08 QR48 QS31
4B065 AA26X AA99Y AB01 AC14
BA02 CA24 CA44
4C084 AA01 AA07 BA44 CA04 CA18
DA33 DC50 MA01 MA02 NA14
ZA331 ZA361 ZA441 ZB111
ZB261 ZC412 ZC752
4H045 AA10 BA10 BA41 CA11 CA40
DA01 DA83 EA23 EA28 FA74
Claims (19)
- 【請求項１】 （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しく
は突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異
体；を含む融合たんぱく質をコードする単離された核酸であって、前記融合たん
ぱく質がリボソーム不活性化活性を有している上記単離された核酸。 - 【請求項２】 前記融合たんぱく質が血管内皮成長因子受容体に特異的に結
合する、請求項１の単離された核酸。 - 【請求項３】 前記融合たんぱく質が、前記受容体を発現する細胞により取
り込まれる、請求項２の単離された核酸。 - 【請求項４】 前記取り込みがエンドサイトーシスにより起こる、請求項３
の単離された核酸。 - 【請求項５】 （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しく
は突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異
体；を含む単離されたポリペプチドであって、リボソーム不活性化活性を有して
いる単離されたポリペプチド。 - 【請求項６】 前記単離されたポリペプチドが血管内皮成長因子受容体に特
異的に結合する、請求項５の単離されたポリペプチド。 - 【請求項７】 前記単離されたポリペプチドが、前記受容体を発現する細胞
により取り込まれる、請求項６の単離されたポリペプチド。 - 【請求項８】 前記取り込みがエンドサイトーシスにより起こる、請求項５
の単離されたポリペプチド。 - 【請求項９】 （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しく
は突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体；を
含む融合たんぱく質をコードする核酸；及び （２）前記核酸に操作的に結合されて、前記核酸の発現を可能にする、プロモ
ーター配列； を含む発現ベクター。 - 【請求項１０】 前記融合たんぱく質が血管内皮成長因子受容体に特異的に
結合する、請求項９の発現ベクター。 - 【請求項１１】 前記融合たんぱく質が、前記受容体を発現する細胞により
取り込まれる、請求項１０の発現ベクター。 - 【請求項１２】 請求項１０の発現ベクターで形質転換された細菌細胞。
- 【請求項１３】 細胞におけるリボソームを不活性化する方法であって、 （ａ）細胞を、 （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しくは突然変異体；及
び （２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体； を含むポリペプチドと、該ポリペプチドが前記細胞中に取り込まれ、そして前記
細胞中のリボソームを不活性化することを可能にする条件下で、接触させる、工
程を含む、上記方法。 - 【請求項１４】 前記融合たんぱく質が血管内皮成長因子受容体と特異的に
結合する、請求項１３の方法。 - 【請求項１５】 前記融合たんぱく質が、前記受容体を発現する細胞により
取り込まれる、請求項１４の方法。 - 【請求項１６】 （Ａ）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若し
くは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体；
を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有している融合たん
ぱく質；及び （Ｂ）医薬的に許容できる担体； を含む、患者における内皮細胞増殖を阻止するための組成物。 - 【請求項１７】 志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しくは突
然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体；を含む
融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有している融合たんぱく質
；及び医薬的に許容できる担体を含む組成物の有効な量を下記患者に与えること
を含む、血管形成に依存する病理生理学的症状を患っている患者を治療する方法
。 - 【請求項１８】 前記方法が、前記病理生理学的症状に対する他の治療と組
合わせて使用される、請求項１７の方法。 - 【請求項１９】 前記治療の効能が、前記たんぱく質及び医薬組成物により
起こされる内皮に対する損傷から生ずる酸素又は栄養補給における減少により高
められる、請求項１７の方法。
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