JP4671574B2 - 志賀毒素様毒素及び血管内皮成長因子断片を含有する組換えたんぱく質 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、組換え核酸分子及び組換え融合たんぱく質に関し、さらに特定的には志賀毒素様毒素−血管内皮成長因子融合たんぱく質、及びそのような融合たんぱく質をコードする組換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた、上記組換え核酸分子を含有する細菌ベクター、上記融合たんぱく質を製造する方法、及び治療的処置におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
２．関連技術の記載
血管形成は、新しい血管を成長させる厳重に制御された過程である（概説としてＦｏｌｋｍａｎ＆Ｓｈｉｎｇ（１９９２）；Ｈａｎａｈａｎ（１９９７）を参照）。正常な状況下では、血管形成は胚発生、傷の治癒及び黄体の発達中にのみ起こる。しかしながら、血管形成は充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態、及び虚血性傷害のような多くの症状において起こる（概説としてＦｏｌｋｍａｎ（１９９５）参照）。したがって、増殖しつつある内皮細胞は幾つかの主要な症状の治療のためのユニークな標的を提供する。
【０００３】
血管形成の極めて重要な正のレギュレーターは血管透過性因子としても知られている血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である（概説としてＮｅｕｆｅｌｄ等（１９９９）を参照）。ＶＥＧＦは選び得るスプライシングの結果として、１２１、１４５、１６５、１８９及び２０６アミノ酸残基を有するポリペプチド類からなり得る、分泌された二量体糖たんぱく質である。ＶＥＧＦは正常な細胞及び腫瘍細胞により発現され、そしてＶＥＧＦ発現の制御は、幾つかの水準で調節されると思われる（概説としてＣｌａｆｆｅｙ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９９６）、Ｖｅｉｋｋｏｌａ＆Ａｌｉｔａｌｏ（２０００）参照）。ＶＥＧＦの発現は、腫瘍と転移増殖との間のフィードバックループを示唆する低酸素及び栄養欠如、及び宿主血管形成応答に対する腫瘍細胞の能力に応じてアプレギュレーションされる（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。
【０００４】
内皮細胞に対するＶＥＧＦの作用はＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２としてまた知られている、チロシンキナーゼ−ｆｌｔ−１受容体及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体により仲介される（概説としてＴｅｒｍａｎ＆Ｄｏｕｇｈｅｒ−Ｖｅｒｍａｚｅｎ（１９９６）、Ｖｅｉｋｋｏｌａ等（２０００）参照）。これらの受容体は内皮細胞上で優先的に発現される。血管形成の部位での内皮細胞が、休止性（静止性）内皮細胞よりも、有意義に高い数のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を発現するという報告がある（Ｂｒｏｗｎ等（１９９３）、Ｂｒｏｗｎ等（１９９５）、Ｐｌａｔｅ等（１９９３）、Ｄｅｔｍａｒ等（１９９４）、Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ等（１９９７））。それらの受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞外領域に７つのＩｇ様ループを含有し、そして血小板由来の成長因子のための受容体と相同性を共有する単一スパンの膜通過たんぱく質チロシンキナーゼである。これらの受容体に結合するＶＥＧＦは、受容体二量体化、次の二量体におけるＳＨ２及びＳＨ３のチロシン燐酸化を誘発する（概説としてＮｅｕｆｅｌｄ等（１９９４）参照）。ＫＤＲ／Ｆｌｋ１−ＶＥＧＦ複合体は受容体媒介エンドサイトーシス（細胞飲食作用：細胞が外環境から種々の物質を取り込む機構）を介して取り込まれる（Ｂｉｋｆａｌｖｉ等（１９９１））。
【０００５】
幾つかのグループは、ＶＥＧＦ又はＫＤＲ／ｆｌｋ−１のいずれかの標的化が血管形成及び血管形成に依存する過程を阻止することを報告した（Ｋｉｍ等（１９９３）、Ｍｉｌｌａｕｅｒ等（１９９４）、Ｓａｌｅｈ等（１９９６）、Ａｉｅｌｌｏ等（１９９５））。他方、モデルシテスムにおいて虚血性組織中へのＶＥＧＦ又はＶＥＧＦをコードするプラスミドの直接注入は、微小血管系の発生を促進し、そして虚血傷害又はバルーン血管形成術後の回復を改良した（Ａｓａｈａｒａ等（１９９６））。一緒に考慮して、これらの結果は、ＶＥＧＦ及びＫＤＲ／Ｆｌｔ１が血管形成においてきわめて重要な役割を演じていることに、殆ど疑念を残さない。これらの実験は、ＶＥＧＦ−毒素共役体又は融合たんぱく質がインビボで働くことができることの原理証明を提供したけれども、ＤＴ含有融合たんぱく質の腎臓及び肝臓毒性の故に、ＤＴ−ＶＥＧＦの構築物の追加の開発は疑わしい。
【０００６】
ＶＥＧＦは内皮細胞に特異的に結合するので、この成長因子は、血管形成部位に標的化医薬送り込みのためのユニークな機会を提供する。組換えＶＥＧＦ１６５及び／又はＶＥＧＦ１２１に、組換えＤＮＡ技術を介して共有的に結合又は融合されたジフテリア毒素の触媒作用的に活性な形態がＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する細胞に対して選択的に毒性であり、そしてまたインビボで血管形成を抑制したことが示された（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ等（１９９６）、Ｏｌｓｏｌｏｎ等（１９９７）、Ａｒｏｒａ等（１９９９））。
【０００７】
内皮細胞の“ナチュラルキラー”である毒素を標的化するためにＶＥＧＦを使用することが有利である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７により生産された志賀毒素様毒素１は内皮細胞に対するそのような“ナチュラルキラー”である。志賀毒素様毒素１により起こされた内皮細胞への損傷は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７により誘発された出血性大腸炎（ＨＣ）及び溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の病因において、原因となる役割を演じている（Ｏｂｒｉｇ等（１９８７）、Ｏｂｒｉｇ等（１９９３）、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等（１９８８）、Ｋａｐｌａｎ等（１９９０））。
【０００８】
志賀毒素様毒素１（ＳＬＴ−１）は受容体結合７ｋＤａＢ−サブユニットの環状五量体と組合わされた３２ｋＤａＡ−サブユニットの単一コピーから構成されている。Ｂ−サブユニットはＧｂ₃として知られている細胞受容体グロボトリアオシルセラミドにＳＬＴ類を結合させる（Ｏｂｒｉｇ等（１９９３））。この受容体は内皮細胞を包含する多くの細胞のタイプ上に見い出される（Ｏｂｒｉｇ等（１９９３））。細胞表面受容体に結合後にＳＬＴは細胞内部に取り込まれ、そしてＡ−サブユニットは、ジスルフィド結合により結合されるＡ₁（２７．５ｋＤａ）型とＡ₂（４．５ｋＤａ）型とに開裂される（Ｏｌｓｎｅｓ（１９８１））。処理されたＡサブユニットは６０Ｓリボソームサブユニットの２８ＳｒＲＮＡの５’末端から位置４３２４において単一アデニン残基を開裂することによりリボソーム類を不活性化する特異性Ｎ−グリコシダーゼである（Ｓａｘｅｎａ等（１９８９））。２８ＳｒＲＮＡからのＡ₄₃₂₄の開裂は、リボソーム類への延長因子（ＥＦ−１）／アミノアシル−ｔＲＮＡ複合体の結合を阻止して、たんぱく質合成の抑制を生ずることによりリボソーム類を不活性化する。他のリボソーム−不活性化剤に関して、後に続く細胞増殖抑制性及び細胞毒性作用はリボ毒性ストレス応答により比較的小割合のリボソームの不活性化への細胞の応答として生ずるだろう（Ｉｏｒｄａｎｏｖ等（１９９７））。あるいは、細胞増殖抑制性及び細胞毒性作用は、多数のリボソーム類の不活性化に起因するたんぱく質合成の大きな崩壊への細胞応答として生ずるだろう。処理されていない全長のＡサブユニット並びに種々の切形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ａサブユニットは有意義なＮ−グリコシダーゼ活性を維持していることは重要である（Ｈａｄｄａｄ等（１９９３）、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９４）、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９５））。さらに、処理されていない全長のＡサブユニットを含有する融合たんぱく質ならびにＣＤ４のＮ−末端に融合された種々の切形ＡサブユニットはＮ−グリコシダーゼ活性を維持し、そしてＨＩＶ−１ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体を発現する細胞に対して細胞毒性である（Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９４）、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ等（１９９５））。
【０００９】
志賀毒素様毒素は、内皮細胞の“ナチュラル”キラーであるので、内皮細胞の増殖を阻止し、及び／又は内皮細胞を死滅させるために、酵素的に活性な全長、切形又は突然変異形Ａサブユニットを内皮細胞に送り込むことは有利である。他の細胞タイプへの損傷を避けるために、酵素的に活性な全長、切形又は突然変異形ＡサブユニットはＶＥＧＦのような内皮細胞特異性成長因子により標的細胞に送り込まれるべきである。それ故に、ＶＥＧＦ受容体に結合するための能力を維持している、全長、切形又は突然変異形ＶＥＧＦに融合された酵素的に活性な全長、切形又は突然変異形Ａサブユニットを含有する融合たんぱく質の生産のために有効な組換えＤＮＡ方法を提供することが本発明における目的である。
【００１０】
発明の概要
１つの面において、本発明は（１）志賀毒素様細菌毒素（Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎ）のＡサブユニット又はその切形若しくは突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体、を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融合たんぱく質をコードする単離された核酸に向けられている。
【００１１】
他の面において、本発明は（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しくは突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体を含む単離されたポリペプチドであって、リボソーム不活性化活性を有する単離されたポリペプチドに向けられている。
【００１２】
他の面において、本発明は（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体を含む融合たんぱく質をコードする核酸；及び（２）該核酸に操作的に結合されて、核酸の発現を可能にしているプロモーター配列を含む、発現ベクターに向けられている。
【００１３】
他の面において、本発明は上記発現ベクターで形質転換された細菌細胞に向けられている。
【００１４】
なお他の面において、本発明は、細胞中のリボソームを不活性化する方法であって、（ａ）細胞を、（１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しくは突然変異体；及び（２）ヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体、を含むポリペプチドと、該ポリペプチドが前記細胞中に取り込まれ、そして前記細胞中のリボソームを不活性化することを可能にする条件下で、接触させる工程を含む、上記方法に向けられている。
【００１５】
なお他の面において、本発明は、（Ａ）志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融合たんぱく質；及び（Ｂ）医薬的に許容できる担体を含む、患者における内皮細胞増殖を阻止するための組成物に向けられている。
【００１６】
なお他の面において、本発明は、志賀毒素様毒素のＡサブユニット又はその切形若しくは突然変異体；及びヒト血管内皮成長因子又はその切形若しくは突然変異体を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有する融合たんぱく質；及び医薬的に許容できる担体を含む組成物の有効な量を患者に与えることを含む、血管形成に依存する病理生理学的症状を患っている患者を治療する方法に向けられている。
【００１７】
また、本発明のたんぱく質類及び医薬組成物は、単独で用いることができるか、あるいは血管形成に関連する疾患のための他の治療、特に前記たんぱく質及び医薬組成物により起こされる内皮に対する損傷から生ずるであろう酸素又は栄養供給における減少により効能が高められる治療と組み合わせて用いることができる。
【００１８】
これらの及び他の面は、本発明の以下の詳細な記載においてより詳細に記載されるだう。
【００１９】
本発明は添付図面と一緒にして以下の詳細な記載からより十分に理解されるだろう。図面において：
【００２０】
図１は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、触媒作用的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の概要表現図である。触媒作用的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉは、組換えＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質により誘発されることができる他の作用から、リボソーム不活性化の作用を分離するために構築された。このたんぱく質は、独立してＳＬＴ−１Ａ−サブユニットの酵素的活性を非常に減少させる一方で、変化していない抗原の性質により判断されるように、その折りたたみ（フォールディング）に影響しない、Ｙ１１４Ｓ及びＲ１７０Ｌアミノ酸置換基を有する二重突然変異体Ａサブユニットを含有する（Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚ等（１９９３）、Ｃａｏ等（１９９４））。精製及び定量化のためのＨｉｓ−標識及びＳ−標識が用いられる。Ａ１−Ａ２二量体に結合されたジスルフィド結合にＡサブユニットを開裂する細胞間プロテアーゼフリンについての開裂部位が示される。対照実験において用いられる組換えＶＥＧＦ１２１たんぱく質はまた、Ｈｉｓ−標識及びＳ−標識を含有する。
【００２１】
図２はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（ＢＬ２１と呼ばれる）及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（Ｏｒｉｇａｍｉと呼ばれる）におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓのたんぱく質の発現、及び各々の宿主から単離された封入体においてのそれらの蓄積を例示する（図２、パネルＡ及びＢ）。図２はまた、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株からの精製後に得られたＶＥＧＦ１２１（レーンＶ）、ＳＬＴ−ＶＥＧＥ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の最終標品の品質を例示する（図２、パネルＣ）。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質の発現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘発された。３７℃で、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬについてＩＰＴＧ誘発の３．５時間後に採取され、そしてＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＳについてＩＰＴＧ誘発の２時間後に、採取された。Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は３０℃で両方のたんぱく質についてＩＰＴＧ誘発の４時間後に採取された。可溶性区分（Ｓ）、封入体（Ｉ）、及び封入体から精製された再生（リフォールドされた）たんぱく質は１５％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。レーンＭにおける標識の分子量はｋＤａで示される。
【００２２】
図３はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質（しかし触媒的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉなし）が無細胞翻訳系においてたんぱく質合成を阻止することを例示する。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は１００ｎＭの濃度で、それぞれ９９．９９％及び９９％だけ蛍ルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳を阻止する（図３、パネルＡ）。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質と同じ方法により単離された組換えＶＥＧＦ１２１たんぱく質は、１，０００ｎＭほどの高さの濃度で〜５０％だけ翻訳を阻止する（図３、パネルＡ）。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、前者が０．０４ｎＭの濃度で、後者が２ｎＭの濃度で、適用量依存性様式で、９０％阻止でたんぱく質合成を阻止し、その一方でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはたんぱく質合成を阻止しなかった（図３、パネルＢ）。ＶＥＧＦ１２１対照のパーセントで検出されたルシフェラーゼ活性が示される。
【００２３】
図４は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体（２９３／ＫＤＲ細胞）を過度に発現する細胞において、ＶＥＧＦのためのＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化を誘発することを例示している。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化は、抗−ホスホチロシン抗体を用いて、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ及びＶＥＧＦ１２１で処理された２９３／ＫＤＲの溶菌液（ライゼート）のウエスタンブロット分析により検出された。
【００２４】
図５は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を標的化する（中が白い円形）が、しかしＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現していない対照のＰＡＥ／Ｖ細胞に影響しない（中が黒い円形）ことを例示している。ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体が存在しない対照ＰＡＥ／Ｖ細胞が、〜５，０００細胞／ウエルで平板培養され、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ（図５、パネルＡ）又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ（図５、パネルＢ）で７２時間処理され、そしてＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｌｙｓＳ宿主から単離された。図５において示されるように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現しているＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を強く阻止した。触媒作用的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬｃｉはＰＡＥ／ＫＤＲ及びＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に影響しないので、この効果はＳＬＴ部分のリボソーム不活性化活性に起因すると考えられる（図５、パネルＣ）。
【００２５】
図６は、ＤＮＡ分解（図６、パネルＡ）及びα−ホドリンの開裂（図６、パネルＢ）により判断されるように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ融合たんぱく質はＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるアポトーシスを迅速に活性化することを例示する。
【００２６】
図７は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質が低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体（図７、パネルＡ）及び休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（図７、パネルＢ）を有する内皮細胞を標的としないことを例示している。ウエスタンブロット分析により評価されるように、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞は、細胞当たり３０，０００〜５０，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現し、そしてＰＡＥ／ＫＤＲ_low細胞は細胞当たり〜５，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する。ＭＳｌ細胞は、細胞当たり〜２０，０００ＶＥＧＦＲ−２を発現した。ＨＵＶＥ、ＰＡＥ／ＫＤＲ_low及びＭＳｌ細胞は、５〜１０ｘ１０³細胞／ウエルの密度で、２４個ウエルの平板上で平板培養され、そして２０時間後に２．５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされ、そして７２時間後に計数された。集密ＰＡＥ／ＫＤＲは３日間、集密状態で維持され、次に７２時間２０ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌで処理された。増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲは５分間２０ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされ、次に、新しい培地に移され、７２時間後に計数された。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、本明細書においてＳＬＴ−ＶＥＧＦと称される融合たんぱく質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸配列を提供することである。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は、リボソーム不活性化活性を与える志賀毒素様毒素（Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎ）の全長、切形又は突然変異Ａサブユニット、及びＶＥＧＦ受容体に結合する血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む。該３種の核酸配列及び結果として生ずるたんぱく質配列は、スペーサー配列により分離されるのが好ましい。
【００２８】
志賀毒素様毒素についての核酸配列及びＶＥＧＦについての核酸配列はそれぞれ当業界において知られている。しかしながら、本発明者は、これらの２つの配列の組み合わせが、特性のユニークな組み合わせを有する融合たんぱく質の生成を提供することを驚くべきことに見い出した。その融合たんぱく質は、そのＶＥＧＦ領域に基づいて特異的ＶＥＧＦ細胞受容体に結合することができる。その融合たんぱく質はまた、志賀毒素様毒素領域に基づいてリボソーム類を不活性化し、そしてＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現している内皮細胞においてアポトーシスを誘発することができる。組み合わせにおいて、これらの２つのたんぱく質領域は、血管形成に関連する疾患に対する有効な且つ高度に標的化した治療を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の目的は、内皮細胞増殖の阻止において使用するための医薬組成物であって、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質及び医薬的に許容できる担体を含有する医薬組成物を提供することである。有用な担体は、水、緩衝化塩水又は当業界において知られている他の医薬的に許容できる担体を包含する。医薬組成物のＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は効能のある細胞毒性薬剤又は細胞増殖抑制薬剤であり、そして充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態並びに虚血性傷害のような、血管形成に依存する種々の病理生理学的症状の治療において有用である。また、本発明のたんぱく質及び医薬組成物は単独で用いられることができるか、あるいは血管形成に関連した疾患のための他の既知の治療、特に前記たんぱく質及び医薬組成物により起こされる内皮への損傷から生ずる酸素又は栄養補給における減少により効能が高められる治療と組み合わせて用いることができる。
【００３０】
本発明のなお他の目的は、新しいＤＮＡ配列を受け入れている組換え発現ベクター、及びそのような組換え発現ベクターを含有する形質転換された細菌細胞を提供することである。融合たんぱく質ＳＬＴ−ＶＥＧＦをコードする核酸配列は当業界において周知の材料及び方法を用いて、細菌プラスミド又はウイルスベクターのような既知のベクター中に挿入することができる。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質をコードする核酸構築物は、その核酸構築物が誘導性プロモーター配列、融合たんぱく質の精製及び定量化を簡潔にする標識をコードする配列、並びに選ばれた宿主におけるターミネーター官能性に操作的に結合されるようにプラスミド中に挿入される。そのプラスミドはまた、プロモーターが誘導的に制御される、細菌細胞のような、宿主細胞中に導入されるのが好ましい。
【００３１】
本発明の他の目的は、内皮細胞の増殖を阻止し、そして充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態、並びに虚血性傷害のような、血管形成に依存する病理生理学的症状を患っている患者を治療するための方法である。
【００３２】
本発明に従う組換え核酸配列により発現された融合たんぱく質において、そのＶＥＧＦは、ＶＥＧＦの高い親和性受容体に結合することができる、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０９の全長又は突然変異体から適当に選ばれる。本発明の特に好ましい態様に従えば、ＶＥＧＦはＶＥＧＦ１２１又はその切形ＶＥＧＦ突然変異体により構成される。
【００３３】
本明細書において用いられるものとして、（ＳＬＴとして本明細書において略記する）志賀毒素様毒素Ａサブユニットとは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に見い出されるアミノ酸配列、並びに実質的にリボソーム不活性化活性を依然として発現する、アミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有する修飾された配列を有するポリペプチドを言う。種々の制御実験のような幾つかの適用のために、リボソーム不活性化活性を欠いているＳＬＴを生成することが有益であろう。特に、そのような修飾されたＳＬＴ類は、１つ以上のアミノ酸を変化させるか、又は欠失させるか、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質の所望の性質を達成させるために、より適当にすることができる１つ以上のアミノ酸を挿入することにより、本明細書において開示されたＤＮＡを修飾することにより生成することができる。そのような性質は、細菌宿主における組換えたんぱく質の生産、細胞ＶＥＧＦ受容体に結合する能力、受容体媒介吸収を介する細胞に取り込まれる能力、細胞間たんぱく質合成阻止活性、全体的な細胞毒性又は細胞増殖抑制性、薬物速度論、薬動力学（薬力学）、及び種々の貯蔵及び使用条件下での安定性を包含するが、しかしそれらに限定されない。標準のインビトロ又はインビボアッセイにおいて、本明細書において記載されたとおりにしてＶＥＧＦに融合したときに、リボソーム不活性化活性及び細胞ＶＥＧＦ受容体に結合する能力を示すような、任意のたんぱく質又はその変換体が本発明において使用するために意図される。
【００３４】
本明細書において用いられるものとして、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、ＳＬＴポリペプチド、及びＶＥＧＦ細胞表面受容体と反応性である、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含有している融合たんぱく質である。
【００３５】
結果として得られるＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は、内皮細胞の増殖を標的化しそして阻止する細胞毒性又は細胞増殖抑制剤として有用であり、それにより充実性腫瘍及び転移増殖、種々の眼の疾患、慢性炎症状態、並びに虚血性障害を包含するが、それらに限定されない、血管形成依存性疾患を治療するために有用である。
【００３６】
本明細書において用いられるものとして、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質が標的とするとは、それを、ＶＥＧＦ受容体を発現する細胞に向けることを意味する。その受容体に結合する際、ＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質は、その細胞に取り込まれ、そしてその細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性である。
【００３７】
本明細書において用いられるものとして、活性という用語、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質の活性への言及、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質の細胞毒性及び細胞増殖抑制作用への言及は、細胞によるＳＬＴ−ＶＥＧＦたんぱく質のＶＥＧＦ受容体媒介取り込みの際に、インビボ又はインビトロのいずれか又はそれぞれにおいて、リボソームを不活性にし、細胞を死滅させ又は細胞増殖を阻止するそのようなたんぱく質の能力を言う。そのような活性は、たんぱく質合成、受容体結合、自動燐酸化及び細胞による取り込みを測定するアッセイ、及び細胞増殖、アポトーシスについての及びたんぱく質合成についての試験化合物の作用を測定することによる細胞毒性及び細胞増殖抑制作用を評価するアッセイを包含するが、それらに限定されない当業者に知られている任意の方法により評価されることができる。
【００３８】
本明細書において用いられるものとして、ＶＥＧＦは天然ＶＥＧＦたんぱく質のアミノ酸配列を有するポリペプチドを言い、並びに該天然たんぱく質のアミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有するが、しかしＶＥＧＦ受容体に結合し且つ細胞取り込みされ能力を維持している修飾された配列を有するポリペプチドを言う。そのようなポリペプチドは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０９を包含するが、それらに限定されない。
【００３９】
アミノ酸配列における差は、異なる種のＶＥＧＦ類の中で、並びにそれぞれ生体又は種からのＶＥＧＦ類の中で起こり得ることが理解される。ＶＥＧＦ類への言及はまた、天然源から単離されたたんぱく質、並びに組換え体手段による又は、ことによっては化学合成によるような、合成的に作られたたんぱく質を包含することが意図される。ＶＥＧＦはまた、ＳＬＴに、ＶＥＧＦ−受容体発現細胞を標的とさせる能力を有し、そして例えば該成長因子の活性又は安定性を維持し又は増大させるために、ジスルフィドスクランブルを減少させるか又は排除させるために、あるいは種々の修飾用基（例えばポリエチレングリコール）を用いて反応性を変えるために造られた、ＶＥＧＦの突然変異体を包含する。
【００４０】
本明細書において用いられるものとして、“ＶＥＧＦ受容体”という用語は、ＶＥＧＦと特異的に相互作用し、それを細胞中に輸送する受容体に言及するために用いられる。これらの中に、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）、ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）が包含されるが、それらに限定されない。
【００４１】
本明細書において用いられるものとして、“ＶＥＧＦ受容体と反応性のポリペプチド”という用語は、ＶＥＧＦ受容体、好ましくは高い親和性のＶＥＧＦ受容体と特異的に反応し、ＶＥＧＦ受容体とのその相互反応に基づいて細胞中に移送される任意のポリペプチドを言う。
【００４２】
他のように定義されない限り、本明細書において用いられる追加の技術的且つ科学的用語は、本明細書における当該事項が属する業界の当業者により通常理解されている意味と同じ意味を有する。
【００４３】
本発明は、この点に関して決して限定されないけれども、志賀毒素様毒素の全長Ａサブユニット（ＳＬＴ／Ｌ）、その切形変換体（ＳＬＴ／Ｓ）、又はその触媒作用的に不活性な突然変異変換体（ＳＬＴ／Ｌｃｉ）に関して主として以下に例示されるだろう。したがって、本発明は、融合たんぱく質が、特異ＶＥＧＦ受容体を標的にする、ＳＬＴ／Ｌ、又はＳＬＴ／Ｓ、又はＳＬＴ／ＬｃｉとＶＥＧＦ分子との間の遺伝子融合たんぱく質の構造に関連して記載され、そして内皮細胞上への細胞毒性及び／又は細胞増殖抑制作用を、ＳＬＴ／Ｌ又はＳＬＴ／Ｓを含有する融合たんぱく質だけが示すが、しかしＳＬＴ／Ｌｃｉを含有する融合たんぱく質は示さないことを本明細書において示すだろう。
【００４４】
ＶＥＧＦ１２１に結合されたＳＬＴ／Ｌ又はＳＬＴ／Ｓからなる、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓで表示される融合たんぱく質は、〜０．１５ｎＭのＩＣ₅₀を有する適用量依存方式で、ＶＥＧＦに対してＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現するブタ内皮細胞ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を阻止する。低いナノモルの濃度範囲で、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質は細胞毒性であり、２．５ｎＭ程の低い濃度にさらされたときに実質的すべてのＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を死滅させる。これとは対照的に、低いナノモル濃度でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質はほとんど細胞増殖抑制性である。触媒作用的に不活性なＶＥＧＦ−ＳＬＴ／ＬｃｉがＰＡＥ／ＫＤＲ細胞増殖に影響しないので、これらの効果はリボソームを不活性化する融合たんぱく質のＳＬＴ部分の触媒活性により左右される。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現しないがしかし制御ベクターによりＤＮＡ感染されるブタ内皮細胞ＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に影響しないので、これらの効果はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体の発現により左右される。重要なことには、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質は、２０ｎＭほどの高さの濃度でさえ、低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体又は休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を発現する内皮細胞に影響しない。それらの結果は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＱＥＧＦ／Ｓ分子がＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を介して細胞に入ることができ、そして前記分子のＳＬＴ／Ｌ又はＳＬＴ／Ｓ部分が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつある内皮細胞において細胞毒性及び／又は細胞増殖抑制作用を有効に生じさせることができるが、しかし低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞又は休止（静止）内皮細胞においては該作用を生じさせることができないことを示している。
【００４５】
これらの結果は、ＶＥＧＦたんぱく質のための受容体は低い数で発現するか又は発現しない、正常な内皮細胞又は他のタイプの細胞に影響せず、それにより標的化されていない細胞との相互作用から生じ得る望ましくない副作用を最小にして、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現することが知られている血管形成の部位で増殖しつつある内皮を選択的に標的にするためにＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質を使用することの可能性を示している。それ故に、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、表面ＶＥＧＦ受容体を過度に発現している細胞において表面ＶＥＧＦ受容体への特異的結合を介して細胞相互作用の狭いスペクトルが与えられ、それにより血管形成の部位で主として増殖しつつある内皮細胞を、ＳＬＴ／Ｌ及びＳＬＴ／Ｓが標的化する。
【００４６】
さらに、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ構築物を用いて、本発明者は：
（ｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、たんぱく質合成を阻止する能力を維持するが、しかしＳＴＬ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはその能力を維持しない；
（ｉｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、細胞ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に結合し、そして前記受容体のチロシン自己燐酸化を誘発する；
（ｉｉｉ）ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現している増殖しつつある内皮細胞の死滅を誘導する細胞毒性たんぱく質であるが、しかし低い数のＤＫＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現している内皮細胞又は休止（静止）内皮細胞に対しては細胞毒性たんぱく質ではなく、一方では、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓは、ほとんどの増殖阻止を生ずる細胞増殖抑制性たんぱく質である：ことを示した。
【００４７】
血管形成を阻止するための内皮細胞増殖の阻止において使用するための組成物は、医薬的に許容できる希釈剤又は担体と組合わせて融合たんぱく質を含む。本発明に従う組成物は、実施にあたって、静脈内注射、連続注入により通常投与されるけれども、非経口注射又は筋肉内注射のような他の方法も使用することができる。
【００４８】
注射のための組成物は、単位投与量形で提供することができ、溶液のような形をとることができ、そして安定剤、緩衝剤、等のような配合用剤を含有することができる。
【００４９】
本発明は、以下の例によってさらに記載されるが、しかしそれらの例によって限定されることを意図しない。他のように明瞭に記載されない限り、すべての部及びパーセンテージは重量によるものであり、すべての温度は摂氏目盛りの度である。
【００５０】
例
例 １
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質をコードする
ＤＮＡ配列の構築
一般的な記載
細菌の菌株、プラスミド、及び哺乳類の細胞
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国）から市販されている。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている。Ｈｉｓ−標識、Ｓ−標識、チオレドキシンを含有する末端延長を有する組換えたんぱく質の細菌発現のためのベクターｐＥＴ３２（ａ）はＮｏｖａｇｅｎ（米国）から市販されている。ヒトＶＥＧＦの１２１−残基形をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＬｅｎ−１２１は米国特許第５，２１９，７３９号（この特許をその全体において参照することにより本明細書に組み入れる）において記載されており、Ｄｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ（米国のＳｃｉｏｓ Ｎｏｖａ，Ｉｎｃ．）から得られた。ＶＴｌ／ＳＬＴホロトキシンのための配列を含有するプラスミドｐＪＢ１４４はＤｒ．Ｊ．Ｂｒｕｎｔｏｎ（カナダ、トロントのＳａｍｕｅｌ Ｌｕｎｅｎｆｉｅｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から得られた。プラスミドｐＢａｌＰｓｔ（エンプティベクター）、及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体をコードするｐＢａｌＰｓｔ／ＫＤＲは、Ｄｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（米国、ニューヨーク市Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られた。ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞及び２９３ヒト一次胚腎臓細胞（２９３）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）から得られた。細胞当たり２〜３ｘ １０⁵ＫＤＲ／ｆｌｋ−１を発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＫＤＲ）、ｐＢａｌＰｓｔプラスミドでＤＮＡ感染されたＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／Ｖ）、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞及びＭＳｌねずみ内皮細胞はＤｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（米国のニューヨーク市Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られた。ＶＥＧＦＲ−２を過度に発現する２９３細胞（２９３／ＫＤＲ）及び低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１を発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＫＤＥ_low）は、トランスＩＴ−ＬＴｌ試薬（米国のＰａｎＶｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、対応する親細胞をｐＢａｌＰｓｔ／ＫＤＲプラスミドでＤＮＡ感染し、次に０．３７５ｇ／ｍｌのプロマイシンの存在下で選択することにより構築された。この研究のために選択された２９３／ＫＤＲのクローンは、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ１６５結合のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析に従って細胞当たり２．５ｘ１０⁶ＶＥＧＦＲ−２を発現した。ＰＡＥ／ＫＤＲ及びＰＡＥ／ＫＤＲ_low細胞におけるＶＥＧＦＲ−２の発現水準は標準として働く２９３／ＫＤＲ細胞を用いてウエスタンブロットにより評価された。免疫ブロットはＤｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（米国ニューヨーク市のＡｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られたウサギ多クローン抗−ＶＥＧＦＲ−２血清を用いて精査された。ＰＡＥ、２９３細胞及びそれらの誘導体は１０％のウシ胎児血清（米国、Ｇｅｒｍｉｎｉ，Ｉｎｃ．）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生物質を補充したＤＭＥＭにおいて維持された。低い継代数のＨＵＶＥ細胞（第３〜第７の継代）は、２０％のＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子、１００ｇ／ｍｌのヘパリン、２ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生物質を有するＤＭＥＭＵ中で、ゼラチンコーティングされたフラスコにおいて増殖された。ＭＳ１細胞は５％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生物質を有するＤＭＥＭ中で増殖される。すべての細胞系は、３７℃，５％ＣＯ₂で培養された。
【００５１】
ＤＮＡ操作
本明細書において用いられた制限酵素及び修飾酵素は普通の供給業者から市販されており、製造会社の説明書にしたがって使用された。異なるＤＮＡ構築物の配列化はＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（米国Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｏ．のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの部門）で行われた。コンピテント細胞、形質転換及び細菌培養液はＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．ＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）：ニューヨークのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓの実験マニュアル）に従って、又は製造会社の説明書に従って作られた。プラスミド類の精製は、製造会社の説明書に従って、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ又はＭａｘｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われた。ＤＮＡの追加の精製ならびにアガロースゲルからのＤＮＡの精製は製造会社の説明書に従って、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国、ＢＩＯ １０１）を用いて行われた。
【００５２】
Ａ ＰＥＴ３２（Ａ）発現ベクターへのヒトＶＥＧＦの１２１残基イソ形のサブクローニング
ヒトＶＥＧＦの１２１残基イソ形をコードするＤＮＡの増幅のためのプライマー
ヒトＶＥＧＦ ＤＮＡ増幅のためのプライマーがＧｅｎｅＬｉｎｋ（米国）により合成された。“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対応するプライマーはＶＥＧＦの成熟１２１−残基イソ形のアミノ酸−１のためのＤＮＡコドンの直ぐ下流にＳｔｕ Ｉ制限部位を包含した。“アンチセンス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に対応するプライマーは成熟ＶＥＧＦをコードする配列後に翻訳停止コドンを包含する、成熟ペプチドのカルボキシル末端をコードするＤＮＡのコード配列を補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）し、そしてＶＥＧＦをコードするＤＮＡの下流にＸｈｏ Ｉ制限部位及び停止コドンを導入した。
【００５３】

【００５４】
ヒトＶＥＧＦの１２１−残基イソ形をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ
ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡは、ヒトＶＥＧＦの１２１残基イソ形のための配列を含有するｐＬｅｎ１２１プラスミドからＰＣＲにより増幅された。鋳型ＤＮＡのナノグラムはＰｆｕ緩衝液（米国のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の各々のオリゴヌクレオチドの１０ピコモル、各々ｄＮＴＰの０．２ｍＭ及びＰｆｕポリメラーゼの２Ｕを含有する０．１ｍｌの反応混合物中で混合された。インキュベーションはＤＮＡ ＧｅｎＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（米国のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）中で行われた。１つのサイクルは変性工程（１分間９４℃）、アニーリング工程（１分間６５℃）及び延長工程（１分間７２℃）を包含した。増幅されたＤＮＡはＳｔｕ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを用いて消化され、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）を用いて精製された。
【００５５】
ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１プラスミド構築
上記増幅されたＤＮＡ形は、ベクターの多クローン部位からＸｈｏ Ｉ部位、及びＳｔｕ Ｉ部位を用いてｐＥＴ３２（ａ）に連結され、これは以下のとおりにしてベクターを処理することにより構築された：ｐＥＴ３２（ａ）ＤＮＡは、Ｎｃｏ １レストリクターゼ（制限酵素）を用いて線形化され、そして生成された凹んだ末端の１つはＤＮＡポリメラーゼ Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いてシチジンで部分的に充てんされた。構築物はＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）を用いて精製され、１本鎖オーバハング（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）は緑豆（ヤエナエ）ヌクレアーゼを用いて除去された。得られた構築物はＸｈｏ ＳＩ制限酵素で消化され、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）で精製された。連結反応は、ＶＥＧＦの成熟１２１−残基イソ形の第１アミノ酸がベクターにより提供されたエンテロキナーゼ開裂部位の後の第１アミノ酸になるように、行われた。得られたプラスミドは、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１と称され、製造会社の説明書に従ってＤＨ５αコンピテント細胞（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換された。上に記載された方法を用いて、単離されたプラスミドの大きな試料を得るために、所望のプラスミドを含有する細菌培養液がさらに増殖された。
【００５６】
チオレドキシン（ｔｘ）遺伝子は、制限酵素Ｎｄｅ Ｉを用いて精製プラスミドＤＮＡの消化によりｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１から除去され、次にＴ４リガーゼを用いて線形化プラスミドＤＮＡの分子間連結反応が行われた。得られたプラスミドはｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１と称され、そして製造会社の説明書に従ってＤＨ５αコンピテント細胞（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換された。上記方法を用いて単離されたプラスミドの大きな試料を得るために、所望のプラスミドを含有すに細菌培養液がさらに増殖された。プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１ＤＮＡは、Ｈｉｓ標識（６アミノ酸）、トロンビン開裂部位（６アミノ酸）、Ｓ−標識（１５アミノ酸）を含有する３６アミノ酸全長Ｎ−末端、エンテロキナーゼ開裂部位を含有する６アミノ酸全長連結ペプチド、及び成熟ＶＥＧＦ１２１たんぱく質の１〜１２１アミノ酸をコードする（図１）。
【００５７】
ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１ベクターへの、ＳＬＴサブユニットＡの全長、切形及び突然変異形のサブクローニング
１． ＳＬＴ−サブユニットＡの全長（Ｌ）及び切形（Ｓ）形をコードするＤＮＡの増幅のためのプライマー
ＳＬＴサブユニットＡのＬ及びＳ形をコードするＤＮＡのＤＮＡ増幅のためのプライマーはＧｅｎｅＬｉｎｋ（米国）により合成された。全長（２９３−残基）ＳＬＴ形の“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び切形（２０２−残基）ＳＬＴ形の“センス”鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に対応するプライマーは、成熟ＳＬＴサブユニットＡの、（前者における）アミノ酸−１及び（後者における）アミノ酸６２のそれぞれ、のためのＤＮＡコドンの上流にＢｇｌ ＩＩ制限部位を含んだ。ＶＥＧＦ１２１の第１Ｍｅｔを有するフレームにおけるＳＬＴ分子をクローン化するために、追加のＧがＳＬＴの、Ｂｇｌ ＩＩ部位とＯＲＦｓとの間に挿入された。
【００５８】

【００５９】
全長ＳＬＴ形の“アンチセンス”鎖に対応するプライマーは停止コドンの右上流の成熟ＳＬＴサブユニットＡのカルボキシル末端をコードするＳＬＴ ＤＮＡのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を補足した。切形ＳＬＴ形の“アンチセンス”鎖に対応するプライマーはＳＬＴサブユニットＡのアミノ酸２５８−２６４のためのＤＮＡコドンをコードするＤＮＡのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）した。両方のプライマーは、ＳＬＴコードＤＮＡの下流にＫｐｎ Ｉ制限部位を導入した。
【００６０】

【００６１】
ＳＬＴサブユニットＡの全長形及び切形を増幅するためのＰＣＲ
ＳＬＴサブユニットＡの全長形及び切形をコードするＤＮＡはＶＴｌ／ＳＬＴホロトキシンを含有するプラスミドｐＪＢ１４４からのＰＣＲにより増幅された。１０ナノグラムの鋳型ＤＮＡはＶｅｎｔ緩衝液中の、各々のオリゴヌクレオチドの１０ピコモル、ｄＮＴＰの０．２ｍＭ及びＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（米国のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の２Ｕを含有する０．１ｍｌの反応混合物中で混合された。インキュベーションは、ＤＮＡ ＧｅｎＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（米国のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）において行われた。１つのサイクルは変性工程（３０秒間９４℃）、アニーリング工程（１分間５８℃）、及び延長工程（１分２０秒間７２℃）を含んだ。２５サイクル後、各々の反応混合物の１０μｌのアリコートを、１％アガロースゲル上で走らせて、増幅された生成物の正しい大きさを確認した。増幅されたＤＮＡ形はＢｇｌ ＩＩ制限酵素及びＫｐｎ Ｉ制限酵素で消化され、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎキット（米国のＢＩＯ １０１）で精製された。
【００６２】
ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓプラスミド構築
上記増幅されたＳＬＴ ＤＮＡ形は、Ｂｇｌ ＩＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で処理されたｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１ベクターに連結され、そして上に記載されたとおりにして精製された。全長ＳＬＴ形及び切形ＳＬＴ形をコードするＤＮＡを含有する得られたプラスミドは、それぞれｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓと称され、そして製造会社の説明書に従ってＤＨ５αコンピテント細胞（米国のＧｉｂｃｏ）に形質転換された。それらのクローンは、上に記載されたとおりにしてスクリーンにかけられ、精製され、特性化され、そして増殖された。ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／ＳプラスミドにおけるＤＮＡ断片は、それらが予期されたＳＬＴ ＤＮＡ配列を含有していることを確認するためにＳＬＴのコード配列においてＴ７プロモーターからヌクレオチド２０３まで配列化された。
【００６３】
ブラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ ＤＮＡは、Ｈｉｓ標識（６アミノ酸）、トロンビン開裂部位（６アミノ酸）、Ｓ−標識（１５アミノ酸）を含有する３６アミノ酸全長Ｎ−末端、全体のＳＬＴサブユニットＡ（２９３アミノ酸）、エンテロキナーゼ開裂部位を含有する６アミノ酸全長連結ペプチド、及び成熟ＶＥＧＦ１２１たんぱく質の１〜１２１アミノ酸をコードする（図１）。プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓは、全体のＳＬＴサブユニットＡをコードするＤＮＡの代わりに、それがアミノ酸６２からアミノ酸２６４までのこのサブユニットの２０２アミノ酸断片をコードするＤＮＡを含有する以外は、該プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌと同一である（図１）。
【００６４】
触媒作用的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉたんぱく質の発現のためのプラスミドの構築
ｐＥＴ３２／ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／ＬによりコードされたＳＬＴ−１Ａサブユニットの部位−特異性突然変異誘発は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ^TM インビトロＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われた。２種の突然変異誘発性プライマーは、（下線が引かれた）３点の突然変異を導入するために明示された：Ｙ１１４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、及びＥ１６７Ｑ、及びＲ１７０Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
【００６５】

【００６６】
Ｙ１１４Ｓ及びＲ１７０Ｌ突然変異は２つのクローンから単離された突然変異化ＤＮＡの配列化により確認された。Ｅ１６７Ｑ突然変異はどちらのクローンにも検出されなかった。ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌｃｉと称される得られたプラスミドは、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌと同一であるが、野性型ＳＬＴサブユニットＡをコードするＤＮＡの代わりに、このサブユニットの二重突然変異体（Ｙ１１４Ｓ及びＲ１７０Ｌ）をコードするＤＮＡを含有する（図１）。
【００６７】
例 ２
組換えＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの融合たんぱく質の発現及び精製
Ａ．ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｓたんぱく質の発現
１．Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ
及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの発現
ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（米国のＮｏｖａｇｅｎ）は、融合たんぱく質の発現が対数増殖期において、又はその中点でＯ．Ｄ．へのラクトース抑制物質（ｌａｃリプレッサー）により抑制される条件下で増殖され、その後にＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド：米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が加えられて、融合たんぱく質コードＤＮＡの発現が誘発された。
【００６８】
ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の大きな回分の培養を生成するために、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン及び３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有する、ＬＢブロス中の、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓのそれぞれで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の（約１６時間続けての）一夜培養液が、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン及び３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを有する、１００ｍｌのＬＢブロスを含有するフラスコ中に１：１００に希釈された。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ １０００：米国のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）において測光されたとき、６００ｎｍでの光学濃度が０．５に到達するまで３７℃で振り混ぜながら細胞は増殖された。
【００６９】
第２工程において、１ｍＭの最終濃度にまでＩＰＴＧ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｌｏｇｉｅｓ）の添加により、融合たんぱく質の発現が誘発された。誘発された培養は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌについて追加の３．５時間で増殖され、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓについて追加の２時間増殖され、次に遠心分離（２５分、５０００ｘｇ）により採取された。細胞のペレットは氷冷された緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ＭのＭｇＣｌ₂、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．１ＭのＤＴＴ、２００ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ、２５ｍｇ／ｌの抗トリプシン、５０ｍｇ／ｌのロイペプチン、２５ｍｇ／ｌのアプロチニン）に再懸濁された。凍結及び解凍の５サイグル後、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ）は、５０Ｕ／ｍｌまで細胞懸濁液の各々に加えられた。懸濁液は室温で２０分間インキュベートされ、次に４℃で３０分間５，０００ｘｇで遠心単離された。ＩＰＴＧ誘発された細菌の可溶性分画と封入体との間での、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓとして示される融合たんぱく質の分布の分析は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質が封入体中に存在したことを示した（図２、パネルＡ）。
【００７０】
封入体ペレットは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄され、８Ｍの尿素中に溶解化され、次に、氷冷水音波処理装置（ＦＣ１４：米国のＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）中で５〜１０分間、その溶液は音波処理された。たんぱく質溶液は、４℃で１０分間１４ｘｇで遠心分離することにより清澄化され、上澄液は集められ、そして４℃で１６時間、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含有する緩衝液の１０００倍容量に対して透析された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質溶液は、１０％グリセロールで補充され、−２０℃で数アリコートで貯蔵された。組換えたんぱく質の濃度は製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイキット（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
【００７１】
２．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいてのＳＬＴ−Ｖ
ＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの発現
ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（米国のＮｏｖａｇｅｎ）は融合たんぱく質の発現が対数増殖期において又はその中点で、Ｏ．Ｄ．へのラクトース抑制物質（ｌａｃリプレーサー）により抑制される、条件下で増殖され、その後にＩＰＴＧ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が加えられて、融合たんぱく質コードＤＮＡの発現を誘発させた。
【００７２】
ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ、ｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌｃｉ及びｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の大きな回分の培養を生成するために、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン及び１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬＢブロス中の、プラスミドｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌ又はｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌｃｉ又はｐＥＴ−ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｓのそれぞれで形質転換されたＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の（約１６時間続けての）一夜培養液が、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン及び１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを有する、１００ｍｌのＬＢブロスを含有するフラスコ中に１：１００に希釈された。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ １０００：米国のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）において測定されて、６００ｎｍでの光学濃度が０．４に到達するまで、細胞は３７℃で振り混ぜながら増殖された。
【００７３】
第２工程において、１ｍＭの最終濃度にまでＩＰＴＧ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の添加により、融合たんぱく質発現が誘発された。誘発された培養は、３０℃で追加の４時間で増殖され、次に遠心分離（２５分、５０００ｘｇ）により採取された。細胞ペレットは氷冷された緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ＭのＭｇＣｌ₂、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．１ＭのＤＴＴ、２００ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ、２５ｍｇ／ｌの抗トリプシン、５０ｍｇ／１のロイペプチン、２５ｍｇ／ｌのアプロチニン）に再懸濁された。凍結及び解凍の５サイクルの後、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ）は、５０Ｕ／ｍｌまで細胞懸濁液の各々に加えられた。懸濁液は室温で２０分間インキュベートされ、次に、４℃で３０分間５，０００ｘｇで遠心単離された。ＩＰＴＧ誘発された細菌の可溶性分画と封入体との間での、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓとして示される融合たんぱく質の分布の分析は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓのこれらのたんぱく質が封入体中に存在したことを示した（ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓについて、図２、パネルＢ）。
【００７４】
封入体ペレットは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄され、８Ｍの尿素中に溶解化され、次に出力４０〜５０％で操作される音波処理装置ＶｉｒＳｏｎｉｃ４７５（米国のＶｉｒＴｉｓ）において２０〜３０秒間その氷冷溶液は音波処理された。たんぱく質溶液は、４℃で１０分間１４，０００ｘｇで遠心分離することにより清澄化され、上澄液は集められ、そして４℃で２時間、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢｒｉｊ−３５を含有する緩衝液の１０００倍容量に対して透析され、次に、同じ緩衝液の新しい１０００倍容量に対して４℃で１６時間透析された。この方法により得られたＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特性化された（図２、パネルＣ）。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質溶液は５％グリセロールで補充され、−７０℃で数分別量で貯蔵された。組換えたんぱく質の濃度は、製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイキット（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
【００７５】
Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおけるＶＥＧＦ１２１の
発現
ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは増殖され、ＶＥＧＦ１２１として示される組換えＶＥＧＦの発現が上に記載された条件下に誘発された。組換えＶＥＧＦ１２１は上に記載されたとおりにして封入体から回収れれ、そして上澄み液は、４℃で１６時間１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液の１０００倍容量に対して透析された。ＶＥＧＦ１２１たんぱく質溶液は１０％グリセロールで補充され、そして−２０℃で数分別量で貯蔵された。組換えＶＥＧＦ１２１たんぱく質の濃度は製造会社の説明書に従ってＳ−標識アッセイキット（米国のＮｏｖａｇｅｎ）を用いて決定された。
【００７６】
例 ３
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質の生化学的活性Ａ．無細胞たんぱく質合成に対するＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ
／Ｓ融合たんぱく質の阻止作用
たんぱく質合成を阻止するための、上に得られたＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ組換え体融合たんぱく質能力は核分解酵素処理されたウサギ網状赤血球溶解産物（米国のＰｒｏｍｅｇａ）においての無細胞たんぱく質合成を測定するインビトロアッセイで試験された。５μｌのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ、ＶＥＧＦ１２１溶液、又は１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭの尿素、１０％グリセロールを含有する貯蔵緩衝液は１８μｌのウサギ網状赤血球溶解産物、１ｍＭのアミノ酸完全混合体、９０ｍＭのＫＣｌ、及び１アッセイ当たり０．５μｇの蛍ルシフェラーゼ（発光酵素）を含んでいる２０μｌの反応混合物に、氷上で加えられた。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの最終濃度は１００ｎＭであり、ＶＥＧＦ１２１の最終濃度は１０００ｎＭであった。適用量依存性実験におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの最終濃度は図３、パネルＢにおいて示されるとおりであった。３０℃で９０分のインキュベーション後、反応混合物は、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する水で２０倍容量に希釈し、そして２μｌの各々の混合物は、製造会社の説明書に従ってＬｕｍｉＯｎｅルミノメーター（輝度計）（米国のＢｉｏｓｃａｎ，Ｉｎｃ．）を用いてルシフェラーゼ反応緩衝液（米国のＰｒｏｍｅｇａ）において蛍ルシフェラーゼ活性についてアッセイされた。１００ｎＭのＶＥＧＦ１２１を含有する対照反応液のルシフェラーゼ活性が１００％として採用された。
【００７７】
１００ｎＭの濃度でのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質は、対照の０．０１％及び１．２％の水準にたんぱく質合成を阻止した（図３、パネルＡ）。比較のために１０００ｎＭほどの高さの濃度での組換えＶＥＧＦ１２１たんぱく質は、対照の４８％の水準にたんぱく質合成を阻止した（図３、パネルＡ）。適用量依存性実験は、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓがそれぞれ、０．０４ｎＭ及び２ｎＭの濃度で９０％だけたんぱく質合成を阻止し、一方では、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉはたんぱく質合成を阻止しなかった。（図３、パネルＣ）。
【００７８】
Ｂ．ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／
Ｓ融合たんぱく質により細胞ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化の
誘発
細胞ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化を誘発するための、上で得られたＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ組換え体融合たんぱく質の能力は、２９３／ＫＤＲ細胞として示されるＫＤＲ／ｆｌｋ−１で安定に形質移入された２９３細胞を用いて試験された。ウエル当たり約５０，０００の２９３／ＫＤＲ細胞は、１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅｍｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に２４個のウエルの平板上に平板培養され、そして３７℃，５％ＣＯ₂で一夜インキュベートされた。次の日に、細胞は燐酸塩緩衝化塩水で１度洗浄され、そして３７℃で４時間無血清ＤＭＥＭに移された。次に培地は、０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２で補充された無血清ＤＭＥＭに変えられ、そして細胞は３７℃で２０分間インキュベートされ、次に４℃で２０分間インキュベートされた。次に細胞は４℃で１時間ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ、又はＶＥＧＦ１２１でインキュベートされ、次に３７℃で８分間インキュベートされた。次に細胞は、０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷燐酸塩緩衝化塩水で１度リンスされ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、２．５％のＳＤＳ、７．５％のグリセロール、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＤＴＴ、０．０２５％のブロムフェノールブルーを含有するサンプル緩衝液に可溶化され、そしてウエスタンブロット法により分析された。細胞たんぱく質は、７．５％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別化され、製造者により記載されたとおりにしてセミ−ドライシステム２１１７ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ（スェーデンのＬＫＢ）を用いてニトロセルロース（米国のＢｉｏＲａｄ）に移された。製造会社の説明書に従って、１：２０００の希釈で抗−ホスホチロシンＲＣ２０：ＨＲＰ共役体（米国のＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂ）を用いて処理され且つ精査された。化学発光をベースとするシステム（ＥＣＬ：米国のＡｍｅｒｓｈａｍ）はバンド検出のために用いられた。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は、ＶＥＧＦ１２１と同じ濃度範囲で適用量依存性方法でＫＤＲ／ｆｌｋ−１チロシン燐酸化を誘発した（図４）。
【００７９】
例 ４
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓ融合たんぱく質の細胞毒性及び細胞増殖抑制作用
Ａ．ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつある内皮細胞に対す
る及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現しない増殖しつつある内皮細胞に対
するＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ及びＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｓ融合たんぱく質の作用
増殖しつつある内皮細胞に作用するための、上で得られたＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ及びＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｓ融合たんぱく質の能力は、（ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞として示される）ＫＤＲ／ｆｌｋ−１で安定にＤＮＡ感染されたブタ大動脈内皮細胞及び（ＰＡＥ／Ｖ細胞として示される）エンプテイベクターで安定にＤＮＡ感染されたブタ大動脈内皮細胞を用いて試験された。ウエル当たり約５，０００細胞は、１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅｍｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において２４個のウエルの平板上で平板培養され、そして３７℃，５％ＣＯ₂で一夜インキュベートされた。次の日に、培地は、１０％ウシ胎児血清及び０．０７８ｎＭ〜２．５ｎＭの最終濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ又はＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓで補充された新しいＤＭＥＭに変えられた。平板は３７℃，５％ＣＯ₂で７２時間インキュベートされた。インキュベーションの後に、ウエルは燐酸塩緩衝化塩水で洗浄され、細胞はトリプシン溶液（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離され、そして製造会社の説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（米国のＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＧＥＦ／Ｓ融合たんぱく質は、ＩＣ₅₀〜０．１５ｎＭを有する適用量依存方法でＰＡＥ／ＫＤＲ細胞の増殖を阻止し、一方ではＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現しないＰＡＥ／Ｖの増殖は影響されなかった（図５）。低いナノモル濃度範囲で、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ−／Ｌたんぱく質は細胞毒性であって、２．５ｎＭほどの低さの濃度に一夜さらした後に実質的にすべてのＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を死滅させた。対照的に、低いナノモルの濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質は２．５ｎＭの濃度でわずかに死滅させた細胞を有して、ほとんど細胞増殖抑制の状態にあった。
【００８０】
触媒的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ融合たんぱく質はＰＡＥ／ＫＤＲ及びＰＡＥ／Ｖ細胞の増殖に影響せず（図５、パネルＣ）、このことはＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓの細胞毒性及び細胞増殖抑制作用は、ＳＬＴ部分のリボソーム不活性化活性に起因していることを示している。
【００８１】
ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌの細胞毒性活性は、ＤＮＡ断片化及び −ホドリンの開裂のようなアポトーシスのホールマークにより判断されるようにＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるアポトーシスの迅速な誘発において、自ずから明白である（図６）。アポトーシス性ＤＮＡ断片化を検出するために、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は、２ｘ１０⁵細胞／ウエルの密度で６個のウエルの平板上に平板培養され、そして２４時間後に、５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた。示された時間の後に、ＤＮＡは細胞溶解産物から分離され、そして１．５％アガロースゲル上で分別化された。１５０ｋＤａ及び１２０ｋＤａ断片への ｋＤａ −ホドリンの開裂を検出するために、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は、４ｘ１０⁴細胞／ウエルの密度で２４個のウエルの平板上で平板培養され、２０時間後に示された時間にわたって２．５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた。 −ホドリン及びその断片は抗− −ホドリン抗体（米国のＣｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、処理された細胞の溶解産物のウエスタンブロット分析により検出された。
【００８２】
Ｂ．低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞に対する及び休止内
皮細胞に対するＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ融合たんぱく質の作用
正常な血管系における内皮細胞は低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する。潜在的なネガティブな副作用を最小にするために、有用な毒素−ＶＥＧＦ融合たんぱく質は、正常な血管系を構成する、低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体の内皮細胞に対して又は休止内皮細胞に対して毒性であってはならない。低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する内皮細胞に作用するための、上に得られたＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ融合たんぱく質の能力は、細胞当たり３０，０００〜５０，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現するヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞、細胞当たり〜５，０００ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現するＰＡＥ／ＫＤＲ_lowブタ大動脈内皮細胞、及び細胞当たり〜２０，０００ＶＥＧＦＲ−２を発現するＭＳＩネズミ内皮細胞を用いて試験された。ＨＵＶＥ、ＰＡＥ／ＫＤＲ_low、及びＭＳＩ細胞は５〜１０ｘ１０³細胞／ウエルの密度で２４個のウエルの平板上で平板培養され、そして２０時間後に２．５ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた。平板は３７℃，５％ＣＯ₂で７２時間インキュベートされた。インキュベーション時間後に、ウエルは燐酸塩緩衝化塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、細胞はトリプシン溶液（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離され、そして製造会社の説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（米国のＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ融合たんぱく質は、増殖しつつあるヒトＨＵＶＥ、ネズミＭＳＩ、及びブタＰＡＥ／ＫＤＲ_low内皮細胞に作用せず、このことは高い水準のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体発現だけが、内皮細胞に対してＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ融合たんぱく質に感受性を与えることができることを示している（図７、パネルＡ）。
【００８３】
休止（静止）内皮細胞に作用するための、上で得られたＶＥＧＦ−ＳＬＴ／Ｌ融合たんぱく質の能力は、休止ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を用いて試験された。ウエル当たり約５，０００のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は１０％ウシ胎児血清（米国のＧｅｍｉｎｉ）で補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（米国のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、２４個のウエルの平板上で平板培養され、そして３７℃，５％ＣＯ₂でインキュベートされた。約１週間後に細胞は集密化状態に達し、そしてさらに３日間、休止（静止）状態として維持された。その後に、培地は、１０％のウシ胎児血清及び２０ｎＭの最終濃度でＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌで補充された新しいＤＭＥＭに変えられた。平板は３７℃，５％ＣＯ₂で７２時間インキュベートされた。比較のために増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲは５分間２０ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌにさらされた；次に新しい培養地に移され、そして７２時間後に計数された。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質は７２時間露出後でさえ、休止ＰＡＥ／ＫＤＲ内皮細胞に作用せず、一方では５分間のさらされた後でさえ、増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲに劇的に作用した。
【００８４】
参考文献
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・Ｂｉｋｆａｌｖｉ，Ａ．、Ｓａｕｚｅａｕ，Ｃ．、Ｍｏｕｋａｄｒｉ，
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（ヒト臍静脈内皮細胞との血管トロピン／血管内皮細胞成長因子の相互作用
：結合、取り込み、分解及び生物学的作用）。
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、Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ｌ．及び
Ｓｃｈｎｉｔｔ，Ｓ．Ｊ（１９９５）によるＨｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，
２６，８６−９１（乳癌における血管透過性因子（血管内皮成長因子）及び
その受容体の発現）。
・Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．、Ｂｅｒｓｅ，Ｂ．、Ｊａｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、
Ｔｏｇｎａｚｚｉ，Ｋ．、Ｍａｎｓｅａｕ，Ｅ．Ｊ．、Ｄｖｏｒａｋ，
Ｈ．Ｆ．及びＳｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９３）による
Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４３，１２５５−１２６２（腎臓及び膀胱癌
における血管透過因子（血管内皮成長因子）及びその受容体の増大した
発現）。
・Ｃａｏ，Ｃ．、Ｋｕｒａｚｏｎｏ，Ｈ．、Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｓ．、
Ｋａｓｈｉｗａｇｉ，Ｋ．、Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｋ．及びＴａｋｅｄａ，
Ｙ．（１９９４）によるＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３８，
４４１−４４７（Ｅ．ｃｏｌｉの非毒性ベロトキシン２変異体（ＶＴ２
ｖｐ１）のための突然変異遺伝子の構築及び精製された突然変異体毒素の
特性化）。
・Ｃｌａｆｆｅｙ，Ｋ．Ｐ．及びＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９６）
によるＣａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．，１５，１６５−１７６
（腫瘍及び転移増殖及び転移についての因果関係）。
・Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．、Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｍ．、Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃ
ｈｅｒ，Ｂ．、Ｃｈｅｎ，Ｄ．、Ｍｕｒｏｈａｒａ，Ｔ．、Ｌｏｓｏｒｄｏ
，Ｄ．Ｗ．、Ｓｙｍｅｓ，Ｊ．及びＩｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）に
よるＡｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０，１６７３−１６８５
（正常な及び動脈硬化性ヒト動脈における血管内皮成長因子／血管透過性
因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ））。
・Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚ，．Ｌ．、Ａｕｓｔｉｎ，Ｐ．Ｒ．、及び
Ｈｏｖｄｅ，Ｃ．Ｊ．（１９９３）によるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，
２４１，４６７−４７３（志賀毒素様毒素ＩＡ−鎖の酵素活性におけるチロ
シン−１１４の役割）。
・Ｄｅｔｍａｒ，Ｍ．、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．、Ｃｌａｆｆｅｙ，Ｋ．Ｐ．、
Ｙｅｏ，Ｋ．Ｔ．、Ｋｏｈｅｒ，Ｏ．、Ｊａｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、
Ｂｅｒｓｅ，Ｂ．及びＤｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．（１９９４）による
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０，１１４１−１１４６（乾癬における血管透
過性因子／血管内皮成長因子及びその受容体の過度発現）。
・Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）によるＮａｔｕｒｅ，Ｍｅｄ．，１，
２７−３１（癌、血管、リウマチ疾患及び他の疾患における血管形成）。
・Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．及びＳｈｉｎｇ，Ｙ．（１９９２）による
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０９３１−１０９３４（血管形成）
。
・Ｈａｄｄａｄ，Ｊ．Ｅ．、Ａｌ−Ｊａｕｆｙ，Ａ．Ｙ．及びＪａｃｋｓｏｎ
，Ｍ．Ｐ．（１９９３）によるＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，
４９７０−４９７８（酵素活性のために必要とされる志賀毒素（シガトキシ
ン）Ａサブユニットの最小領域）。
・Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９９７）によるＳｃｉｅｎｃｅ，２７７，
４８−６０（血管形態形成及び維持の信号）。
・Ｉｏｒｄａｎｏｖ，Ｍ．Ｓ．、Ｐｒｉｂｎｏｗ，Ｄ．、Ｍａｇｕｎ，Ｊ．
Ｌ．、Ｄｉｎｈ，Ｔ．Ｈ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．
及びＭａｇｕｎ，Ｂ．Ｅ．（１９９７）によるＭｅｄ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，１７，３３７３−３３８１（リボ毒性ストレス応答：２８Ｓ
ｒＲＮＡにおけるペプチジルトランスフェラーゼ応答の阻害剤により及び
α−サルシン／リシンループに対する配列特異性ＲＮＡ損傷によりストレス
活性化たんぱく質キナーゼＪＮＫ１の活性化）。
・Ｋａｐｌａｎ，Ｂ．Ｓ．、Ｃｌｅａｒｙ，Ｔ．Ｇ．及びＯｂｒｉｇ，Ｔ．
Ｇ．（１９９０）によるＰｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，４，２７６−
２８３（溶血性尿毒症症候群の病因を理解するにあたっての最近の進歩）。
・Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．、Ｌｉ，Ｂ．、Ｗｉｎｅｒ，Ｊ．、Ａｒｍａｎｉｎｉ，
Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｎ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｓ．及び
Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．（１９９３）によるＮａｔｕｒｅ（ロンドン），
３６２，８４１−８４４（血管内皮成長因子誘発された血管形成の阻止は
インビボにおける腫瘍増殖を抑制する）。
・Ｍｉｌｌａｕｅｒ，Ｂ．、Ｓｈａｗｖｅｒ，Ｌ．Ｋ．、Ｐｌａｔｅ，Ｋ．
Ｈ．、Ｒｉｓａｕ，Ｗ．及びＵｌｒｉｃｈ，Ａ．（１９９４）による
Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン），３６７，５７６−５７９（優性−陰性Ｆｌｋ−
１突然変異体によりインビボにおいて阻止された神経膠芽細胞の増殖）。
・Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．、Ｇｅｎｇｒｉｎｏｖｉｔｃｈ，
Ｓ．及びＰｏｌｔｏｒａｋ，Ｚ．（１９９９）によるＦＡＳＥＢ Ｊ．，
１３，９−２２。
・Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．、Ｔｅｓｓｌｅｒ，Ｓ．、Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎ，
Ｈ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．及びＬｅｖｉ，Ｂ．Ｚ．（１９９４）による
Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．，５，８９−９７
（血管内皮成長因子及びその受容体）。
・Ｏｂｒｉｇ，Ｔ．Ｇ．、Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ，Ｐ．Ｊ．、
Ｋａｒｍａｌｉ，Ｍ．Ａ．、Ｐｅｔｒｉｃ，Ｍ．、Ｍｏｒａｎ，Ｔ．Ｐ．
及びＪｕｄｇｅ，Ｔ．Ｋ．（１９８７）によるＬａｎｃｅｔ ２，６８７
（溶血性尿毒症症候群の病因論）。
・Ｏｂｒｉｇ，Ｔ．、Ｌｏｕｉｓｅ，Ｃ．、Ｌｉｎｇｗｏｏｄ，Ｃ．、
Ｂｏｙｄ，Ｂ．、Ｂａｒｌｅｙ−Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｌ．及びＤａｎｉｅｌ，
Ｔ．（１９９３）によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１５４８４−
１５４８８（志賀毒素（シガトキシン）受容体及び応答における内皮不均質
性）。
・Ｏｌｓｎｅｓ，Ｓ．、Ｒｅｉｓｂｉｇ，Ｒ．及びＥｉｋｌｉｄ，Ｋ．
（１９８１）によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，４８７３２−
８７３８（赤痢菌細胞毒素のサブユニットの構造）。
・Ｏｌｓｏｎ，Ｔ．Ａ．、Ｍｏｈａｎｒａｊ，Ｄ．、Ｒｏｙ，Ｓ．及び
Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．（１９９７）によるＩｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，７３，８６５−８７０（血管内皮成長因子−毒素共役体に
よる腫瘍及び転移増殖の阻止）。
・Ｐｌａｔｅ，Ｋ．Ｈ．、Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ．、Ｍｉｌｌａｕｅｒ，Ｂ．、
Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．及びＲｉｓａｕ，Ｗ．（１９９３）による
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，５８２２−５８２７（腫瘍血管形成のラッ
ト神経膠腫モデルにおける血管内皮成長因子及びその同系受容体のアップレ
ギュレーション）。
・Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．、Ｏｌａｏｎ，Ｔ．Ａ．、Ｂａｕｃｈ，
Ｖ．Ｌ．及びＭｏｈａｎｒａｊ，Ｄ．（１９９６）による
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，１３２４−１３３０（血管内皮成長因子−
毒素共役体はインビトロにおける血管形成を特異的に阻止する）。
・Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．、Ｋａｒｍａｌｉ，Ｍ．Ａ．、
Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌ．Ｅ．及びＳｍｉｔｈ，Ｃ．Ｒ．（１９８８）による
Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９，１１０２−１１０８（ベロ細胞毒素生成性
Ｅ．ｃｏｌｉ感染に伴う溶血性尿毒症症候群の組織病理学）。
・Ｓａｌｅｈ，Ｍ．、Ｓｔａｃｋｅｒ，Ｓ．Ａ．及びＷｉｌｋｓ，Ａ．Ｆ．
（１９９６）によるＣａｎｃｅｒ，Ｒｅｓ．，５６，３９３−４０１
（アンチセンス血管内皮成長因子配列の発現によりインビボにおいてＣ６
神経膠腫細胞の増殖の阻止）。
・Ｓａｘｅｎａ，Ｓ．Ｋ．、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ａ．Ｄ．及びＡｃｋｅｒｍａｎ
，Ｅ．Ｊ．（１９８９）によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，５９６
−６０１（志賀毒素（シガトキシン）、志賀毒素様毒素ＩＩ変異体、及びリ
シンはすべてＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに微小注入された場合の２８
Ｓ ＲＮＡの単点ＲＮＡ Ｎ−グルコシダーゼである）。
・Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．及びＤｏｕｇｈｅｒ−Ｖｅｒｍａｚｅｎ，Ｍ．
（１９９６）によるＣａｎｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．，１５，１５９−
１６３（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ受容体の生物学的性質）。
・Ｖｅｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．、Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ，
Ａ．及びＢｌａｚｚａｒ，Ｂ．Ｒ．（１９９７）によるＰｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．，１０，１０７１−１０７６（腎臓機能不全はＤＴ３９０抗−
ＣＤ３ｓＦｖ、潜在的新組換え抗−ＧＶＨＤ免疫毒素の適用量制限性を説明
する）。
・Ｖｅｉｋｋｏｌａ，Ｔ．及びＡｌｉｔａｌｏ，Ｋ．（１９９９）による
Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，９，２１１−２２０
（受容体及び血管形成）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、触媒的に不活性なＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ、及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の概要表現図である。
【図２】 ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株及びＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株におけるＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質の発現、各々の宿主から単離された封入体におけるそれらの蓄積を例示する。
【図３】 ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が無細胞翻訳系においてたんぱく質合成を阻止することを例示する。
【図４】 ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌｃｉ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−受容体を過度に発現する細胞（２９３／ＫＤＲ）において、ＶＥＧＦのためのＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン燐酸化を誘発することを例示する。
【図５】 ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌ及びＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｓたんぱく質が、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過度に発現する増殖しつつあるＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を標的化する（中が白い円形）が、しかしｆｌｋ−１受容体を発現しない対照のＰＡＥ／Ｖ細胞に影響しない（中が黒い円形）ことを例示する。
【図６】 ＤＮＡ分解（パネルＡ）及びα−ホドリンの開裂（パネルＢ）により判断されるように、ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／融合たんぱく質はＰＡＴ／ＫＤＲ細胞におけるアポトーシスを迅速に活性化することを例示する。
【図７】 ＳＬＴ−ＶＥＧＦ／Ｌたんぱく質が低い数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体（パネルＡ）及び休止（静止）ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（パネルＢ）を有する内皮細胞を標的としないことを例示する。
【配列表】

Claims (17)

1. （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット及び（２）ヒト血管内皮成長因子を含む融合たんぱく質をコードする単離された核酸であって、前記融合たんぱく質がリボソーム不活性化活性を有している上記単離された核酸。
2. 前記融合たんぱく質が血管内皮成長因子受容体に特異的に結合する、請求項１の単離された核酸。
3. 前記融合たんぱく質が、前記受容体を発現する細胞により取り込まれる、請求項２の単離された核酸。
4. 前記取り込みがエンドサイトーシスにより起こる、請求項３の単離された核酸。
5. （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット及び（２）ヒト血管内皮成長因子を含む単離されたポリペプチドであって、リボソーム不活性化活性を有している上記単離されたポリペプチド。
6. 前記単離されたポリペプチドが血管内皮成長因子受容体に特異的に結合する、請求項５の単離されたポリペプチド。
7. 前記単離されたポリペプチドが、前記受容体を発現する細胞により取り込まれる、請求項６の単離されたポリペプチド。
8. 前記取り込みがエンドサイトーシスにより起こる、請求項５の単離されたポリペプチド。
9. （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット及びヒト血管内皮成長因子を含む融合たんぱく質をコードする核酸であって、前記融合たんぱく質がリボソーム不活性化活性を有している上記核酸及び
   （２）前記核酸に操作的に結合されて、前記核酸の発現を可能にする、プロモーター配列
   を含む発現ベクター。
10. 前記融合たんぱく質が血管内皮成長因子受容体に特異的に結合する、請求項９の発現ベクター。
11. 前記融合たんぱく質が、前記受容体を発現する細胞により取り込まれる、請求項１０の発現ベクター。
12. 請求項１０の発現ベクターで形質転換された細菌細胞。
13. ヒト血管内皮成長因子受容体を発現する細胞におけるリボソームを不活性化するインビトロの方法であって、
    （ａ）細胞をインビトロで、
    （１）志賀毒素様毒素のＡサブユニット及び
    （２）ヒト血管内皮成長因子
    を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有している該融合たんぱく質と、
    該融合たんぱく質が前記細胞中に取り込まれ、そして前記細胞中のリボソームを不活性化することを可能にする条件下で、接触させる工程を含む、上記方法。
14. 前記融合たんぱく質が血管内皮成長因子受容体と特異的に結合する、請求項１３の方法。
15. 前記融合たんぱく質が、前記受容体を発現する細胞により取り込まれる、請求項１４の方法。
16. （Ａ）志賀毒素様毒素のＡサブユニット及びヒト血管内皮成長因子を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有している該融合たんぱく質；及び
    （Ｂ）医薬的に許容できる担体；
    を含む、患者における内皮細胞増殖を阻止するための組成物。
17. 志賀毒素様毒素のＡサブユニット及びヒト血管内皮成長因子を含む融合たんぱく質であって、リボソーム不活性化活性を有している該融合たんぱく質；及び医薬的に許容できる担体を含む、血管形成に依存する病理生理学的症状を患っている患者を治療するための医薬組成物。

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